CN106432203A - 基于四乙烯基的 Gemini 型两亲性化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物及其制备方法和用途。本发明公开的化合物主要通过McMurry偶联反应、亲核取代反应和Click反应制备，其结构也通过红外、核磁和质谱确认；在水溶液中，本发明公开的化合物的衍生物分子自组装形成聚集诱导荧光增强的胶束(AIE micelles)；而与核酸作用后会共聚集形成易于细胞摄取的纳米颗粒；绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luciferase)表达实验证明了这种化合物本身以及与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成的脂质体可以作为非病毒基因载体；同时我们利用这类化合物自组装和与DNA的共组装的可逆性转变成功的将此种衍生物用于示踪pGL‑3和FAM‑DNA的细胞摄取和释放过程。

Description

基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明所述涉及一种基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物，特别涉及一种基于四苯乙烯基的Gemini型类两亲化合物的制备及其作为非病毒基因载体、DNA分子荧光探针、生物显影剂以及基因示踪剂中的应用。
背景技术
基因治疗是将外援正常基因导入病体细胞以替换或修补缺陷的基因，从而达到治疗相应疾病的目的。在细胞膜上有很多带有负电荷的糖蛋白和糖脂化合物，核酸的骨架结构中的磷酸基团也带有负电荷，并且核酸本身具有较大的体积，因此裸露的核酸难以被细胞吞噬。为了解决裸露核酸难以被细胞摄取的难题，科研工作者们发展了基因载体。基因载体可以有效的将细胞外的核酸带入细胞内，并可以一定程度上保护核酸在细胞核不被核酸酶水解。另外，基因载体在运输核酸进入细胞后，也可以将核酸释放，而被释放的核酸又可以进入细胞核进行相应的蛋白表达，最终达到基因治疗的目的。
基因载体一般可分为两类，一类是病毒型载体，一类是非病毒载体。通常，病毒型载体的转染效率很高，并且可进行迅速表达，因而病毒型载体在临床试验中被广发使用。但是，病毒型载体也要其固有的缺陷，如：潜在的免疫原性和致瘤性；携带的核酸尺寸有限(通常为2-3kb)；制备和存储困难复杂等。而非病毒型载体不仅仅可以完全避免上述缺陷，且其本身还有很多其他优点，如结构可调、可大规模生产和具有靶标性。这些特性更利于非病毒载体在基因治疗中的应用。但是，非病毒基因载体也有缺陷，其中最重要的，也是最亟待克服的是如何解决其转染效率低的难题。
目前，非病毒类载体有很多种，包括阳离子化合物，阳离子脂质体，阳离子聚合物，功能纳米粒子，无机配合物以及量子点等。在阳离子化合物中，具有Gemini型结构的脂质由于具有较高的荷质比(电荷/质量)，可以更有效的凝聚DNA。因而发展Gemini型脂质作为非病毒基因载体也被广泛研究。在大量的Gemini型非病毒基因载体中，已经有一些具有不错的转染效果。但是它们的转染效率与病毒型载体还相差甚远，并且目前所报道的Gemini型载体功能单一，只是作为DNA凝聚和运输工具。发展具有高转染效率的具有 荧光性质Gemini型基因载体可以同时满足运输基因和研究基因表达机制的两方面需求。基于此，设计对DNA具有荧光响应的新型Gemini型基因载体具有非常重要的研究价值。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物及其制备方法和用途，本发明所涉及到的化合物是以四苯乙烯为核心，在四苯乙烯的两侧分别接上亲水的[12]aneN3单元和疏水的长碳链单元，形成两亲性化合物；这种化合物可以在水溶液中自组装形成AIE胶束，并可以有效凝聚DNA形成纳米颗粒；胶束和纳米颗粒可以相互转换；而胶束和纳米颗粒被细胞摄取后，在细胞中以不同的形态分布，利用这种特性，可以将本发明的化合物应用于示踪基因转染的过程。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物，其特征在于，由式(Ⅰ)表示，
R表示直链直链烷基或直链单烯基。
优选的是，所述的基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物中，R表示C8、C12或C18直链烷基。
优选的是，所述的基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物中，R表示C18直链单烯基。
优选的是，所述的基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物中，该Gemini型两亲性化合物作为DNA分子荧光探针的应用。
优选的是，所述的基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物中，该Gemini型两亲性化合物作为非病毒基因载体的应用。
优选的是，所述的基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物中，该Gemini型两亲性化合物作为基因示踪剂中有效成分的应用。
优选的是，所述的基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物中，该Gemini型两亲性化 合物作为生物显影剂中有效成分的应用。
一种合成权利要求1～3任意一项化合物的方法，包括以下步骤：(1)通过McMurry偶联反应制备式(Ⅱ)所示的双羟基双溴四苯乙烯；(2)在通过对式(Ⅱ)进行亲核取代反应制备式(Ⅲ)所示的化合物；(3)式(Ⅲ)通过与炔基修饰的[12]aneN3的Click反应合成式(Ⅰ)的化合物；
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明的化合物是以四苯乙烯为核心单元，两端修饰亲水的[12]aneN3单元和疏水的长碳链单元，形成具有聚集诱导发光特性的两亲性化合物；
第二、本发明的化合物可自组装形成胶束，也可凝聚DNA形成纳米颗粒；
第三、本发明的化合物可作为非病毒基因载体，其中实施例中给出的化合物1和2的转染效率接近，甚至在某些情况下超过了商业化的转染试剂Lipofectamine 2000。
第四、本发明公开的化合物实现了胶束和纳米颗粒在体外可相互转化；利用这种特性，可将本发明的化合物应用于示踪基因转染过程，便于研究转染机制，从而为设计新型的脂质类非病毒基因载体提供有价值的信息。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1A为本发明实施例2中化合物1自组装胶束的临界胶束浓度测定结果图；
图1B为本发明实施例2中化合物2自组装胶束的临界胶束浓度测定结果图；
图1C为本发明实施例2中化合物3自组装胶束的临界胶束浓度测定结果图；
图1D为本发明实施例2中化合物4自组装胶束的临界胶束浓度测定结果图；
图1E为本发明实施例2中化合物1自组装胶束的扫描显微镜图；
图1F为本发明实施例2中化合物2自组装胶束的扫描显微镜图；
图1G为本发明实施例2中化合物3自组装胶束的扫描显微镜图；
图1H为本发明实施例2中化合物4自组装胶束的扫描显微镜图；
图2A为本发明实施例3中化合物1对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；
图2B为本发明实施例3中化合物2对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；
图2C为本发明实施例3中化合物3对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；
图2D为本发明实施例3中化合物4对pGL-3的琼脂糖凝胶阻滞实验图；
图3A为本发明实施例4中细胞对化合物1形成的胶束的摄取图；
图3B为本发明实施例4中细胞对化合物2形成的胶束的摄取图；
图3C为本发明实施例4中细胞对化合物3形成的胶束的摄取图；
图3D为本发明实施例4中细胞对化合物4形成的胶束的摄取图；
图3E为本发明实施例4中细胞对化合物1凝聚DNA的纳米颗粒的细胞摄图；
图3F为本发明实施例4中细胞对化合物2凝聚DNA的纳米颗粒的细胞摄图；
图3G为本发明实施例4中细胞对化合物3凝聚DNA的纳米颗粒的细胞摄图；
图3H为本发明实施例4中细胞对化合物4凝聚DNA的纳米颗粒的细胞摄图；
图4A为本发明实施例5中化合物1本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；
图4B为本发明实施例5中化合物2本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；
图4C为本发明实施例5中化合物3本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；
图4D为本发明实施例5中化合物4本身转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；
图4E为本发明实施例5中化合物1与DOPE形成的脂质体转染pEGFP基因的绿色荧光蛋白表达图；
图4F为本发明实施例5中化合物2与DOPE形成的脂质体转染pEGFP基因的绿色荧光蛋白表达图；
图4G为本发明实施例5中化合物3与DOPE形成的脂质体转染pEGFP基因的绿色荧光蛋白表达图；
图4H为本发明实施例5中化合物4与DOPE形成的脂质体转染pEGFP基因的绿色荧光蛋白表达图；
图4I为本发明实施例5中Lip2000转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；
图4J为本发明实施例5中pEGFP的绿色荧光蛋白表达图；
图4K为本发明实施例5中DOPE转染pEGFP基因的绿色荧光蛋白表达图；
图4L为本发明实施例5中空白对照组的绿色荧光蛋白表达图；
图5A为本发明实施例6中不同浓度的化合物1～4在HepG2细胞中的荧光素酶表达结果；
图5B为本发明实施例6中化合物1与DOPE在不同配比下形成的脂质体转染pGL-3基因的荧光素酶表达结果；
图5C为本发明实施例6中化合物2与DOPE在不同配比下形成的脂质体转染pGL-3基因的荧光素酶表达结果；
图5D为本发明实施例6中化合物3与DOPE在不同配比下形成的脂质体转染pGL-3基因的荧光素酶表达结果；
图5E为本发明实施例6中化合物4与DOPE在不同配比下形成的脂质体转染pGL-3基因的荧光素酶表达结果；
图5F为本发明实施例6中化合物1～4以及化合物1～4与DOPE形成的脂质体在HepG2、Hela、A549和HEK293T中的转染pGL-3基因的荧光素酶表达结果；
图6A为本发明实施例7中细胞摄取化合物2凝聚的pUC18 DNA在0.5h的BF图；
图6B为本发明实施例7中细胞摄取化合物2凝聚的pUC18 DNA在2.0h的BF图；
图6C为本发明实施例7中细胞摄取化合物2凝聚的pUC18 DNA在4.0h的BF图；
图6D为本发明实施例7中细胞摄取化合物2凝聚的pUC18 DNA在24h的BF图；
图6E为本发明实施例7中细胞摄取化合物2凝聚的pUC18 DNA在0.5h的DAPI图；
图6F为本发明实施例7中细胞摄取化合物2凝聚的pUC18 DNA在2.0h的DAPI图；
图6G为本发明实施例7中细胞摄取化合物2凝聚的pUC18 DNA在4.0h的DAPI图；
图6H为本发明实施例7中细胞摄取化合物2凝聚的pUC18 DNA在24h的DAPI图；
图6I为本发明实施例7中细胞摄取化合物2凝聚的pUC18 DNA在0.5h的BF和DAPI的合并图；
图6J为本发明实施例7中细胞摄取化合物2凝聚的pUC18 DNA在2.0h的BF和DAPI的合并图；
图6K为本发明实施例7中细胞摄取化合物2凝聚的pUC18 DNA在4.0h的BF和DAPI的合并图；
图6L为本发明实施例7中细胞摄取化合物2凝聚的pUC18 DNA在24h的BF和DAPI的合并图；
图7A、图7E、图7I、图7M、图7Q和图7U分别为本发明实施例8中DAPI图像中HepG2细胞对化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h细胞摄取结果图；
图7B、图7F、图7J、图7N、图7R和图7V分别为本发明实施例8中FITC图像中HepG2细胞对化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h细胞摄取结果图；
图7C、图7G、图7K、图7O、图7S和图7W分别为本发明实施例8中DAPI+FITC图像中HepG2细胞对化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h细胞摄取结果图；
图7D、图7H、图7L、图7P、图7T和图7X分别为本发明实施例8中DAPI+FITC+BF图像中HepG2细胞对化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h细胞摄取结果图；
图8为本发明实施例9中ctDNA对10μM化合物1、2、3和4的荧光滴定结果；
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明的目的在于提供一种可作为新型的Gemini型非病毒基因载体的化合物的制备及其在基因转染中的应用。本发明所涉及到的化合物是以四苯乙烯为核心，在四苯乙烯的两侧分别接上亲水的[12]aneN3单元和疏水的长碳链单元，形成两亲性化合物。这种化合物可以在水溶液中自组装形成AIE胶束，并可以有效凝聚DNA形成纳米颗粒。胶束和纳米颗粒可以相互转换。而胶束和纳米颗粒被细胞摄取后，在细胞中以不同的形态分布，利用这种特性，可以将本发明的化合物应用于示踪基因转染的过程。
实施例1、
合成式(Ⅰ)所示的基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物，
R表示直链烷基或直链单烯基；在本实施例中以R表示C8、C12和C18的直链烷基，以及(E)-9-十八烯基为例；R表示C8直链烷基时为化合物1，R表示C12直链烷基时为化合物2，R表示C18直链烷基时为化合物3，R表示(E)-9-十八烯基时为化合物4。
合成路线为：
路线1化合物1，2，3和4的制备流程：(i)锌粉，四氯化钛，四氢呋喃，-78℃至60℃，过夜；(ii)碳酸钾，碘化钾，丙酮，回流，48小时；(iii)正丁基锂，四氢呋喃，-78℃至室温；(iv)a：五水硫酸铜，抗坏血酸钠，四氢呋喃/水，氩气，室温过夜；b：氯化氢饱和乙酸乙酯溶液，室温30分钟；c：氢氧化钠，水，室温30分钟。
路线2化合物14，15和16的制备流程：(i)叠氮钠，丙酮/水，0℃至室温，过夜；(ii)炔丙基溴，三乙胺，乙腈，回，过夜；(iii)四溴化碳，三苯基膦，二氯甲烷，0℃至室温，过夜。
具体合成步骤为：
(1)、在惰性气氛和-78℃条件下，将等当量的4,4’-二羟基二苯甲酮和4,4’-二溴二苯甲酮，和8.0当量的锌粉加入至三口烧瓶中，Ar气换气三次后，用注射器注入无水四氢呋喃；再用Ar气换气三次后，用注射器缓慢注入4.0当量的四氯化钛；将溶液移至室温反应30min后，升温至60℃，反应过夜；将反应溶液降低至室温，浓缩，然后加入30mL 10％的碳酸钾水溶液；30mL乙酸乙酯萃取三次后，合并有机相，无水硫酸钠干燥；过滤，浓缩得到粗产物；通过柱色谱纯化，得到化合物5，产率26％；
FT-IR(KBr,cm-1):3364(s),3027(w),2926(w),1607(s),1590(m),1508(vs),1429(m),1254(s),1170(s),1070(m),1009(s),827(s),798(m).1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ(ppm)9.40(s,2H),7.30(d,J＝8.5Hz,4H),6.83(d,J＝8.4Hz,4H),6.72(d,J＝8.5Hz,4H),6.50(d,J＝8.5Hz,4H).13C NMR(DMSO-d6,101MHz):δ(ppm)155.72,142.47,141.53,134.54,132.95,132.40,131.54,130.30,118.76,114.21.ESI-MS:cald.For[C26H18Br2O2]521.9653,found 521.9664。
(2)、向化合物5的丙酮溶液中，加入3.0当量的1-溴-烷烃，4.0当量的碳酸钾和催化量的碘化钾；反应液搅拌回流48h后，冷却至室温；过滤收集滤液，硅胶吸附，柱色谱得到纯化合物6～9，产率50～92％；
化合物6：1.20g，1.40mmol；产率：73％。FT-IR(KBr,cm-1):3062(w),3036(w),2953(vs),2925(vs),2854(vs),1604(vs),1571(m),1508(vs),1486(vs),1469(vs),1391(s),1292(s),1245(vs),1173(vs),1070(s),1010(vs),823(vs),790(s).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ(ppm)7.25(d,J＝8.5Hz,2H),6.94-6.85(m,4H),6.67(d,J＝8.8Hz,2H),3.92(t,J＝6.6Hz,2H),1.82-1.70(m,2H),1.45(m,2H),1.36-1.25(m,8H),0.92(t,J＝6.7Hz,3H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ(ppm)157.00,141.90,140.65,135.31,134.39,132.05,131.53,130.00,119.22,112.70,66.86,30.85,28.42,28.32,28.28,25.10,21.70,13.17.MALDI-TOF-MS:m/z calcd.for[C42H50Br2O2+H]+747.224；found 746.687.
化合物7：1.51g，1.75mmol；产率：91％。FT-IR(KBr,cm-1):3062(w),3033(w),2920(vs),2850(vs),1604(vs),1507(vs),1468(vs),1392(s),1286(s),1244(vs),1173(vs),1070(s),1010(vs),834(s),792(s).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ(ppm)7.22(d,J＝8.1Hz,2H),6.87(m,4H),6.64(d,J＝8.3Hz,2H),3.88(t,J＝6.5Hz,2H),1.75(m,2H),1.42(m,2H),1.27(s,16H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ(ppm)157.00,141.91,140.66,135.31,134.39,132.06,131.54,130.01,119.23,112.71,66.86,30.97,28.72,28.69,28.66,28.63, 28.48,28.41,28.33,25.11,21.75,13.20.MALDI-TOF-MS:m/z calcd.for[C50H66Br2O2+H]+859.349；found 858.885.
化合物8：1.42g，1.38mmol；产率：72％。FT-IR(KBr,cm-1):3061(w),3031(w),2952(vs),2923(vs),2850(vs),1604(s),1507(vs),1468(vs),1392(m),1285(m),1244(vs),1174(s),1070(s),1010(s),834(s),792(s).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ(ppm)7.23(d,J＝8.5Hz,2H),6.88(m,4H),6.64(d,J＝8.3Hz,2H),3.89(t,J＝6.6Hz,2H),1.81-1.68(m,2H),1.50-1.40(m,2H),1.26(s,28H),0.89(t,J＝6.7Hz,3H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ(ppm)157.00,141.89,140.64,135.31,134.38,132.04,131.52,129.90,119.21,112.70,66.87,30.96,28.73,28.69,28.64,28.61,28.46,28.40,28.32,25.09,21.73,13.17.MALDI-TOF-MS:m/z calcd.for[C62H90Br2O2+H]+1027.537；found 1027.192.
化合物9：0.97g，0.95mmol；Yield：50％。FT-IR(KBr,cm-1):2923(s),2852(s),1650(w),1605(s),1507(s),1486(m),1467(m),1391(m),1292(m),1245(vs),1173(s),1010(s),1010(s),824(vs),791(s).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ(ppm)7.22(d,J＝8.4Hz,2H),6.87(m,4H),6.64(d,J＝8.8Hz,2H),5.42–5.28(m,2H),3.88(t,J＝6.6Hz,2H),2.00(m,4H),1.75(m,2H),1.44(m,2H),1.36–1.25(m,20H),0.88(t,J＝6.9Hz,3H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ(ppm)157.01,141.89,140.66,135.32,134.39,132.03,131.51,129.99,128.98,128.83,119.21,112.71,66.85,31.63,30.93,28.79,28.77,28.72,28.68,28.59,28.55,28.48,28.45,28.42,28.34,28.31,26.21,25.93,25.08,21.71,21.68,13.15.MALDI-TOF-MS:m/zcalcd.for[C62H86Br2O2+H]+1023.505；found 1023.126.
(3)将6～9溶于无水四氢呋喃中，冷却至-78℃，并用Ar气换气三次；用注射器缓慢注入2.5当量的正丁基锂四氢呋喃溶液(2.5M)；保持-78℃搅拌2小时后，用注射器缓慢注入3.0当量的化合物15的四氢呋喃溶液；继续保持-78℃反应1小时后，自然升温至室温反应过夜；次日，缓慢加入30mL饱和氯化铵水溶液淬灭反应；然后用30mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗产物；柱色谱分离得到纯化合物10～13；
化合物10：产率：39％。FT-IR(KBr,cm-1):3033(w),2954(m),2928(m),2857(m),2121(s),2088(s),1604(s),1506(vs),1462(m),1291(vs),1244(vs),1174(s),1111(m),1028(m),831(vs).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ(ppm)6.99(d,J＝8.1Hz,2H),6.91(d,J＝8.3Hz,2H),6.78(d,J＝8.2Hz,2H),6.65(d,J＝8.4Hz,2H),3.89(t,J＝6.6Hz,2H),1.75(m,2H),1.43(m,2H),1.37–1.20(m,8H),0.89(t,J＝6.7Hz,3H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ(ppm)156.86,140.63,139.98,136.64,135.80,134.75,131.82,131.57,117.47,112.66,66.85,30.85,28.43,28.34,28.28,25.10,21.71,13.17.
化合物11：产率：24％。FT-IR(KBr,cm-1):3033(w),2954(s),2924(vs),2853(s),2120 (vs),2090(s),1604(s),1508(vs),1467(m),1292(s),1254(vs),1173(m),1112(w),1029(w),830(m).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ(ppm)6.99(d,J＝8.1Hz,2H),6.90(d,J＝8.2Hz,2H),6.78(d,J＝8.1Hz,2H),6.64(d,J＝8.4Hz,2H),3.89(t,J＝6.7Hz,2H),1.75(m,2H),1.42(m,2H),1.29(s,16H),0.89(t,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ(ppm)156.85,140.02,139.96,136.63,135.70,134.73,131.79,131.55,117.46,112.65,66.81,30.94,28.73,28.69,28.66,28.63,28.60,28.45,28.38,28.32,25.09,21.72,13.17.
化合物12：产率：27％。FT-IR(KBr,cm-1):3033(w),2924(vs),2853(vs),2102(vs),2089(vs),1604(vs),1570(m),1507(vs),1466(s),1292(vs),1244(vs),1173(s),1111(m),1028(m),831(s).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ(ppm)6.98(d,J＝8.5Hz,2H),6.90(d,J＝8.8Hz,2H),6.77(d,J＝8.7Hz,2H),6.63(d,J＝8.7Hz,2H),3.88(t,J＝6.6Hz,2H),1.81–1.69(m,2H),1.42(m,2H),1.26(s,28H),0.88(t,J＝6.7Hz,3H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ(ppm)156.85,140.02,139.96,136.63,135.79,134.73,131.80,131.55,117.46,112.64,66.85,30.95,28.73,28.69,20.63,28.61,28.46,28.40,28.33,25.92,25.09,21.72,13.17.
化合物13：产率：53％。FT-IR(KBr,cm-1):3034(w),2952(vs),2919(vs),2853(vs),2120(vs),2089(vs),1604(s),1507(vs),1466(s),1292(vs),1244(vs),1174(s),1029(m),831(vs). 1H NMR(CDCl3,400MHz):δ(ppm)6.98(d,J＝8.5Hz,2H),6.90(d,J＝8.7Hz,2H),6.77(d,J＝8.7Hz,2H),6.63(d,J＝8.7Hz,2H),5.46–5.24(m,2H),3.88(t,J＝6.5Hz,2H),2.01(m,4H),1.83–1.66(m,2H),1.42(m,2H),1.37–1.15(m,20H),0.87(t,J＝6.7Hz,3H).13CNMR(CDCl3,101MHz):δ(ppm)156.87,140.04,136.66,134.76,131.81,131.56,129.30,128.99,128.83,125.58,117.47,112.67,66.83,30.94,28.80,28.78,28.56,28.49,28.43,28.36,28.33,28.26,26.25,26.22,25.09,21.72,13.16.
(4)、在氩气氛围下，向化合物10～13的四氢呋喃溶液中加入2.5当量的化合物15，0.2当量的五水硫酸铜和0.4当量的抗坏血酸钠水溶液；室温反应过夜后，浓缩，用30mL二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到粗产物，柱色谱得到相应化合物1～4的Boc(叔丁氧羰基)保护产物。将上述化合物溶于5mL饱和氯化氢的乙酸乙酯溶液，室温搅拌30min后，过滤得到相应化合物1～4的盐酸盐产物；再将上述产物溶于10mL的1mol/mL的氢氧化钠水溶液，室温搅拌30min；然后用30mL二氯甲烷溶液萃取三次，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到纯产物化合物1～4。
化合物1：产率：76％。FT-IR(KBr,cm-1):3431(m),3253(m),3044(m),2925(vs),2853(s),1061(s),1506(s),1471(s),1387(m),1291(m),1244(vs),1169(s),1113(m),1054(s),981(s),830(s).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ(ppm)8.18(s,1H),7.53(d,J＝8.3Hz,2H),7.13(d,J＝8.2Hz,2H),6.91(d,J＝8.3Hz,2H),6.61(d,J＝8.2Hz,2H),3.84(m,4H),2.99(t,J＝5.4Hz,4H),2.85(t,J＝5.5Hz,4H),2.66(t,J＝5.7Hz,4H),2.10–1.73(m,6H),1.69(m, 2H),1.43–1.35(m,2H),1.28–1.08(m,8H),0.82(t,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ(ppm)157.18,143.57,142.76,141.80,134.90,134.12,133.79,131.69,131.58,120.37,118.70,112.79,66.87,51.87,48.32,46.27,44.40,30.76,28.34,28.26,28.18,25.03,23.04,22.59,21.61,13.09.HRMS:cald.[C66H96N12O2+H]+1089.7851,found1089.7853.
化合物2：产率：83％。FT-IR(KBr,cm-1):3431(m),3246(m),3038(m),2924(vs),2859(s),1608(s),1509(vs),1468(s),1387(m),1289(m),1238(vs),1172(s),1113(m),1047(s),988(s),833(s).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ(ppm)8.19(s,1H),7.53(d,J＝8.3Hz,2H),7.12(d,J＝8.3Hz,2H),6.90(d,J＝8.4Hz,2H),6.60(d,J＝8.3Hz,2H),3.81(m,4H),2.95(t,J＝5.3Hz,4H),2.82(t,J＝5.4Hz,4H),2.63(t,J＝5.7Hz,4H),2.08–1.72(m,6H),1.68(m,2H),1.36(m,2H),1.21(s,16H),0.81(t,J＝6.7Hz,3H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ(ppm)157.16,143.54,142.87,141.79,134.79,134.11,133.79,131.68,131.57,120.32,118.67,112.77,66.86,52.04,48.49,46.35,44.56,30.87,28.66,28.61,28.59,28.55,28.52,28.39,28.30,28.26,25.03,23.15,22.70,21.65,13.11.HRMS:cald.[C74H112N12O2+2H]2+/2 601.4588,found601.4587.
化合物3：Yield：90％。FT-IR(KBr,cm-1):3425(m),3250 9m),3044(m),2928(vs),2853(s),1608(s),1512(vs),1465(m),1384(m),1286(m),1244(vs),1172(s),1119(m),1041(s),981(s),833(s).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ(ppm)8.20(s,1H),7.52(d,J＝8.2Hz,2H),7.10(d,J＝8.2Hz,2H),6.88(d,J＝8.2Hz,2H),6.58(d,J＝8.2Hz,2H),3.81(m,4H),3.06-2.89(m,4H),2.81(t,J＝5.3Hz,4H),2.63(t,J＝5.7Hz,4H),2.06–1.74(m,6H),1.66(m,2H),1.35(m,2H),1.18(s,28H),0.80(t,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ(ppm)157.13,143.52,142.78,141.76,134.76,134.09,133.77,131.67,131.56,120.35,118.64,112.74,66.83,51.93,48.38,46.29,44.44,30.87,28.65,28.61,28.56,28.53,28.40,28.32,28.26,25.03,23.09,22.61,21.65,13.11.HRMS:cald.[C86H136N12O2+2H]2+/2685.5527,found 685.5522.
化合物4：产率：71％。FT-IR(KBr,cm-1):3360(m),3193(m),2963(vs),2918(vs),2853(s),1720(m),1690(m),1595(w),1512(w),1453(s),1381(s),1244(s),1172(m),1059(s),1024(s),958(w).1H NMR(CDCl3,400MHz):δ(ppm)7.92(s,1H),7.47(d,J＝8.4Hz,2H),7.11(d,J＝8.3Hz,2H),6.89(d,J＝8.4Hz,2H),6.59(d,J＝8.4Hz,2H),5.36–5.16(m,2H),3.81(t,J＝6.6Hz,2H),3.76(s,2H),2.76(t,J＝5.2Hz,4H),2.76(t,J＝5.2Hz,4H),2.56(t,J＝5.6Hz,4H),2.00–1.84(m,4H),1.75–1.59(m,8H),1.34(m,2H),1.28–1.17(m,20H),0.80(t,J＝6.7Hz,3H).13C NMR(CDCl3,101MHz):δ(ppm)157.16,143.65,143.45,141.77,134.78,134.10,133.94,131.65,128.89,128.74,119.53,118.72,112.75,66.79,51.53,48.57,46.24,44.78,31.56,38.86,28.71,28.69,28.65,28.62,28.56,28.52,28.48,28.41,28.35,28.27,28.17,28.13,28.08,26.16,26.14,25.02,24.70,24.44,21.64,21.61,13.11.HRMS:cald.[C86H132N12O2+2H]2+/2 683.5370,found 683.5373.
上述反应流中涉及的中间化合物14，15和16的制备参见：Chem.Eur.J.,2014,20,12421–12425；Org.Biomol.Chem.,2011,9,6788–6796；J.Phys.Chem.B,2007,111,1384–1392。
实施例2、
将化合物1、2、3和4配置成不同浓度的水溶液，测定化合物1～4的水溶液的荧光强度；将荧光强度的最大值随浓度(10-9-10-3M)的变化趋势作图，得到图1A～图1D，在图1A～1D中，X轴为溶液浓度，Y轴为荧光强度。
图1A～1D分别是化合物1～4对临界胶束浓度测定图和胶束形貌图，从图1A～1D可以看出化合物1～4的临界胶束浓度均非常低，化合物1～4临界胶束浓度分别为4.62×10- 6M、4.58×10-6M、4.02×10-6M和4.94×10-6M。
取2μL浓度为5μM的混合物1～4水溶液，分别滴到200目的铜网上，自然干燥后，图1E～1H透射电镜观察胶束形貌。
化合物1～4形成的胶束形貌为圆形，且分散性较好。
实施例3、
分别配制不同浓度化合物1～4的溶液，将不同浓度的化合物1～4的溶液和pUC18质粒DNA(9μg/mL)置于37℃水浴中，作用1h，进行DNA琼脂糖凝胶阻滞实验得到不同浓度的化合物1～4对pUC18 DNA的凝胶阻滞结果。
图2A～2D分别是本发明化合物1～4的pUC18 DNA的琼脂糖凝胶阻滞实验结果；图2A～2D上标注的数值为测试浓度(μM)；图2A～2D表明化合物1～4均可在较低浓度下完全阻滞DNA在琼脂糖中迁移；化合物1～4的最低阻滞浓度分别为：16μM、16μM、12μM和30μM。
由实施例2可以得出，本发明制备的基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物在水中具有良好的自组装性，其可自组装成胶束，实施例3表明其可以有效凝聚DNA形成纳米颗粒，可以作为非病毒基因载体。
实施例4、
HepG2细胞对化合物1～4本身以及其所凝聚的DNA的纳米颗粒的摄取实验
将浓度为20μM的化合物1～4与HepG2细胞作用30min，对细胞进行共聚焦显影得到相应的细胞显像图；化合物1～4的细胞显像图分别为图3A～3D；
将浓度为20μM的化合物1～3和浓度为30μM的化合物4，独立与pUC18质粒DNA (9μg/mL)形成的复合物，将形成的复合物与HepG2细胞一起培养30min，进行共聚焦显影得到相应的共聚焦荧光图；化合物1～4的共聚焦荧光图分别为图3E～3F；
由图3A～图3D和图3E～3F表明，无论是化合物1～4本身或者化合物1～4与DNA的凝聚颗粒都可以被细胞有效摄取；
由图3A～图3D可以看出，化合物1～4本身形成的胶束所发生的特征性的聚集态荧光可以照亮细胞，是优良的细胞显像材料；
由图3E～3F可以看出，化合物1～4与DNA凝聚颗粒的也可被细胞摄取，是优良的非病毒基因载体材料；
另外化合物1～4以及其与DNA凝聚的颗粒被摄取后，胶束在细胞质中均匀分散，而摄取的凝聚体不均匀的分布在细胞质或者细胞核中的某一处。
实施例5、
配制浓度为30μM的化合物1～4，选用化合物1与其等当量DOPE形成的脂质体1/DOPE、化合物2与其等当量DOPE形成的脂质体2/DOPE、化合物3与其等当量DOPE形成的脂质体3/DOPE以及化合物4与其等当量DOPE形成的脂质体4/DOPE，分别与pEGFP(9μg/mL)，在37℃条件下作用30min，加入到HepG2细胞中培养4h，然后将HepG2细胞的培养液换成新鲜的含有10％FBS的DMEM培养液培养24h；用1mL PBS将HepG2细胞洗涤五次后，将细胞置于共聚焦显微镜下进行拍照(10倍放大)；
对裸露的pEGFP基因和pEGFP/DOPE形成复合物空白对照采用上述同样的实验方法，作为空白对照组；
对商业转染试剂lipofectamine 2000的绿色荧光蛋白表达图采用上述同样的实验方法，作为效果对照组；
图4A为化合物1的绿色荧光蛋白表达图；图4B为化合物2的绿色荧光蛋白表达图；图4C为化合物3的绿色荧光蛋白表达图；图4D为化合物4的绿色荧光蛋白表达图；图4E为脂质体1/DOPE的绿色荧光蛋白表达图；图4F为脂质体2/DOPE的绿色荧光蛋白表达图；图4G为脂质体3/DOPE的绿色荧光蛋白表达图；图4H为脂质体4/DOPE的绿色荧光蛋白表达图；图4I为商业转染试剂lipofectamine 2000的绿色荧光蛋白表达图；图4J为pEGFP的绿色荧光蛋白表达图；图4K为pEGFP/DOPE形成的聚合物的绿色荧光蛋白表达图；图4L为空白对照的绿色荧光蛋白表达图；
图4A～4H是本发明化合物1～4本身以及其与DOPE形成的脂质体1/DOPE～4/DOPE作为非病毒基因载体，在HepG2细胞中对pEGFP质粒基因的表达荧光显微镜观察结果图；
由图4J～图4K可以看出，pEGFP、pEGFP/DOPE和空白参照几乎没有观察到绿色荧光蛋白表达；
由图4A～图4H可以看出，化合物1～4本身和脂质体1/DOPE～4/DOPE都观察到了绿色荧光蛋白的表达；表明本发明公开的化合物本身以及它们形成的脂质体不仅可以作为优良的细胞显像材料，而且可以作为非病毒基因载体；另外，分析结果可以看出，化合物1和2以及它们的脂质体1/DOPE和2/DOPE的转染效果比相应的化合物3和4及3/DOPE和4/DOPE好。
实施例6
将不同浓度的化合物1～4(10～70μM)以及其与DOPE以不同摩尔比形成的脂质体1/DOPE～4/DOPE与pGL-3质粒DNA在37℃条件下，作用30min后，加入到HepG2、Hela、A549和HEK293T细胞中培养4h；然后将细胞的培养液换成新鲜的含有10％FBS的DMEM培养液培养24h；除去培养基后，加入20μL细胞裂解液将细胞裂解细胞，再分别测定相对发光强度和蛋白含量，最终以每毫克蛋白的相对发光强度(RLU/mg protein)和商业转染试剂lipofectamine 2000的百分比(％of Lipo2000)表示化合物1、2、3和4对pGL-3的转染效率。
图5A～5F是本发明化合物1～4以及其与DOPE形成的脂质体1/DOPE～4/DOPE作为非病毒基因载体，在不同浓度，不同化合物/DOPE比和不同细胞中的荧光素酶表达结果；以商业化转染试剂Lipofectamine 2000为参照。
图5A为不同浓度的化合物1～4在HepG2、Hela、A549和HEK293T中的荧光表达结果；
图5A中X轴为表示不同的化合物，在整个图5A中由左到右，五组条形柱组分别表示化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和Lipo2000；Y轴表示荧光素酶表达量；
在第一组条形柱组中，由左到右依次表示化合物1在浓度为10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM和70μM时的荧光素酶表达量；在第二组条形柱组中，由左到右依次表示化合物2在浓度为10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM和70μM时的荧光表达；在第三组条形柱组中，由左到右依次表示化合物3在浓度为10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM和70μM时的荧光素酶表达量；在第四组条形柱组中，由左到右依次表示化合物4在浓度为10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM和70 μM时的荧光素酶表达量；最后一个表示Lipo2000在和10μg/mL时的荧光素酶表达量；
图5B～5E分别为化合物1～4与DOPE在不同配比下形成的脂质体的荧光素酶表达结果；
图5B～5E中的X轴表示化合物1～4的浓度，Y轴表示荧光素酶表达量；
图5F表示化合物1～4以及化合物1～4与DOPE形成的脂质体在HepG2、HeLa、A549和HEK293T中的荧光素酶表达结果；
图5F中X轴为表示不同的化合物，在整个图5F中由左到右，八组条形柱组分别表示化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物1与DOPE形成的脂质体、化合物2与DOPE形成的脂质体、化合物3与DOPE形成的脂质体和化合物4与DOPE形成的脂质体，分别在HepG2、HeLa、A549和HEK293T中的荧光素酶表达结果；Y轴表示荧光素酶表达量；
(1)结果表明在HepG2细胞中，化合物1～4的最佳转染效率分别是Lipofectamine2000的55％，60％，1.4％和4.9％。
(2)化合物1和2与DOPE形成脂质体后可以有效的提高转染性能；化合物1与DOPE的最佳比例为2/1，最佳浓度为30μM，转染效率为Lipofectamine 2000的98％；化合物2与DOPE的最佳比例为1/1，最佳浓度为30μM，Lipofectamine 2000的175％；化合物3和4与DOPE形成脂质体后转染效果仍然较差，不到Lipofectamine 2000的1％。
(3)在不同细胞中的转染效果也不一样；化合物1～4本身以及他们形成的脂质体，在HEK293T细胞中转染效果最好，其次是HeLa，接着是A549和HepG2细胞。
实施例7
将化合物2(20μM)与pUC18 DNA(9μg/mL)在37℃条件下作用30min后，加入到HepG2细胞中培养不同时间(0.5，2.0，4.0和24h)后，除去培养基，用1mL PBS将HepG2细胞洗涤五次后，用共聚焦显微镜拍照得到图6A～6K结果。注：24h的结果是在培养4h后将培养液置换成新鲜的含有10％FBS的DMEM培养液继续培养至24h得到的。
图6A～6K是HepG2细胞对化合物2凝聚的pUC18 DNA的不同时间的细胞摄取结果图。
图6A～6D是BF(明场)图片在0.5h、2.0h、4.0h和24h时，化合物2凝聚的pUC18DNA的不同时间的细胞摄取结果图；
图6E～6H是DAPI(DAPI通道)图片在0.5h、2.0h、4.0h和24h时，化合物2凝聚的pUC18 DNA的不同时间的细胞摄取结果图；
图6I～6L是Merged(表示BF和DAPI图的合并图)图片在0.5h、2.0h、4.0h和24h时，化合物2凝聚的pUC18 DNA的不同时间的细胞摄取结果图；
0.5，2.0和4.0h的CLSM都是化合物2凝聚pUC18 DNA后培养响应的时间后观察。24h的CLSM是培养4h后用0.5mL PBS洗涤10次后，在利用新鲜的培养基继续培养至24h。
(1)0.5h:进入细胞的凝聚体很少，细胞的荧光很弱。大多数凝聚颗粒基本都聚集在细胞膜周围；
(2)2.0h：进入细胞的凝聚体明显增多，几乎所有的细胞中都能明显看到蓝色荧光的凝聚颗粒；这些凝聚体大多数都停留在细胞质中，有些聚集在细胞核附近，只有少数凝聚颗粒进入细胞核；
(3)4.0h：进入细胞的凝聚体进一步增多，并且可以看出大多数凝聚体进入了细胞核；
(4)24h：留在细胞质中的蓝色荧光均匀的分布在整个细胞中(主要在细胞质，由于细胞核中的化合物数量很少，导致难以拍摄明显的荧光)；这种变化主要是由于DNA与凝聚颗粒解离后，凝聚体回复至胶束状态，因而蓝色荧光在细胞中的分布特性发生明显改变，由明显的凝聚颗粒转变为均匀分散的胶束。
因而，利用这种化合物本身以及与DNA分子之间的超分子组装的改变可以有效的示踪细胞摄取和释放非标记的DNA的过程，这也是第一次利用这种自组装的改变而导致的形貌和分散特性用作分析非病毒基因作为DNA载体运载DNA进入细胞的过程。
实施例8、
图7A～7X是HepG2细胞对化合物2凝聚的FAM-DNA的不同时间的细胞摄取结果图；
图7A、图7E、图7I、图7M、图7Q和图7U分别表示DAPI(DAPI通道图)中HepG2细胞对化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h细胞摄取结果图；
图7B、图7F、图7J、图7N、图7R和图7V分别表示FITC(FITC通道图)像中HepG2细胞对化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h细胞摄取结果图；
图7C、图7G、图7K、图7O、图7S和图7W分别表示DAPI+FITC(表示DAPI图和FITC图的合并图)中HepG2细胞对化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h细胞摄取结果图；
图7D、图7H、图7L、图7P、图7T和图7X分别表示DAPI+FITC+BF图像中HepG2细胞对化合物2凝聚的FAM-DNA在0.5h、1.0h、2.0h、4.0h、6.0h和24h细胞摄取结果图；
(1)0.5h:少量聚集在细胞膜周围，还未进入细胞；
(2)1.0h：聚集在细胞膜周围的凝聚体增多，荧光变亮，并且可以看出有少数部分已近开始进入细胞；
(3)2.0h:明显有很多的凝聚体进入了细胞，基本都分布在细胞质中，少量在细胞核周围；
(4)4.0h：进入细胞的凝聚体有很多都聚集在细胞核周围，并且有些聚集体已经进入了细胞核；
(5)6.0h:进入细胞的凝聚体持续增多，分布在整个细胞内，并且有少部分FAM-DNA开始从凝聚体中解离，也有很多进入了细胞核；
(6)24h：停留在细胞内的荧光分散形态明显发生变化，无论是蓝色还是绿色，不再有明显的凝聚颗粒，而是均匀的分散在细胞中，表明FAM-DAN基本与凝聚体解离。
以上结果表明化合物2可以凝聚FAM-DNA形成纳米颗粒，并进入细胞。进入细胞后不会只是停留于细胞质，而且还能够进入细胞核。随着时间的增长，进入细胞的颗粒明显增多，并且不均匀的分布在细胞中。在到达6h后，已有部分FAM-DNA开始于凝聚颗粒解离。24h后，FAM-DNA基本与凝聚体解离，从而使得TPE8C的蓝色荧光以及FAM-DAN的绿色荧光均匀分布在整个细胞，表明化合物2载入DNA后，还可以在细胞中顺利释放DNA，这些都是作为优良非病毒DNA载体的必要条件。
实施例9、
向10μM化合物1、2、3和4的溶液中滴加ctDNA并测试相应的荧光光谱；将荧光最大值与ctDNA的含量作图即可。
图8是ctDNA对10μM化合物1、2、3和4的荧光滴定结果；其中，X轴为ctDNA的浓度，Y轴表示荧光强度；
结果表明化合物1～4对ctDNA都有荧光响应，并且随着ctDNA含量的增加，荧光强度逐渐增大；当加入10μg/mL的ctDNA后，化合物1、2、3和4荧光增强倍数分别为1.6，2.0，2.4和2.1倍，这化合物1～4对ctDNA的荧光响应性能顺序为3＞4＞2＞1。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (8)

1.一种基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物，其特征在于，由式(Ⅰ)表示，
R表示直链直链烷基或直链单烯基。
2.如权利要求1所述的基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物，其特征在于，R表示C8、C12或C18直链烷基。
3.如权利要求1所述的基于四乙烯基的Gemini型两亲性化合物，其特征在于，R表示C18直链单烯基。
4.权利要求1～3任意一项所述的Gemini型两亲性化合物，其特征在于，该Gemini型两亲性化合物作为DNA分子荧光探针的应用。
5.权利要求1～3任意一项所述的Gemini型两亲性化合物，其特征在于，该Gemini型两亲性化合物作为非病毒基因载体的应用。
6.权利要求1～3任意一项所述的Gemini型两亲性化合物，其特征在于，该Gemini型两亲性化合物作为基因示踪剂中有效成分的应用。
7.权利要求1～3任意一项所述的Gemini型两亲性化合物，该Gemini型两亲性化合物作为生物显影剂中有效成分的应用。
8.一种合成权利要求1～3任意一项化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)通过McMurry偶联反应制备式(Ⅱ)所示的双羟基双溴四苯乙烯；(2)在通过对式(Ⅱ)进行亲核取代反应制备式(Ⅲ)所示的化合物；(3)式(Ⅲ)通过与炔基修饰的[12]aneN3的Click反应合成式(Ⅰ)的化合物；
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