CN110776498A - 基于dedpp-2tpa的大环多胺化合物及其制备方法与用途 - Google Patents

基于dedpp-2tpa的大环多胺化合物及其制备方法与用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110776498A
CN110776498A CN201911079752.0A CN201911079752A CN110776498A CN 110776498 A CN110776498 A CN 110776498A CN 201911079752 A CN201911079752 A CN 201911079752A CN 110776498 A CN110776498 A CN 110776498A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
tpa
formula
macrocyclic polyamine
dedpp
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911079752.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110776498B (zh
Inventor
卢忠林
马乐乐
刘名轩
刘旭英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Normal University
Original Assignee
Beijing Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Normal University filed Critical Beijing Normal University
Priority to CN201911079752.0A priority Critical patent/CN110776498B/zh
Publication of CN110776498A publication Critical patent/CN110776498A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110776498B publication Critical patent/CN110776498B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1007—Non-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1014—Carbocyclic compounds bridged by heteroatoms, e.g. N, P, Si or B
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1059—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing three nitrogen atoms as heteroatoms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于DEDPP‑2TPA的大环多胺化合物及其制备方法与用途。本发明公开的化合物主要由Suzuki偶联、缩合反应、酯化反应以及Click反应制备合成，其结构也通过核磁和质谱确认；本发明的化合物具有大Stock位移，双光子荧光的性质，聚集诱导效应(AIE)；本发明的化合物与核酸作用后会共聚集形成易于细胞摄取的纳米颗粒；绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luciferase)表达实验证明了该化合物本身以及与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成的脂质体可以作为非病毒基因载体；通过单光子和双光子示踪细胞摄取和释放过程。

Description

基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物及其制备方法与用途
技术领域
本发明涉及大环多胺类化合物化合物，具体涉及一种可用于制备转基因载体的基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物及其制备方法与用途。
背景技术
基因治疗是将外源正常基因或具有治疗功能的基因导入靶细胞，用于纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗目的。基因治疗可以为某些特殊的、慢性的疾病提供新的、强大的治疗方法，包括遗传的或后天的疾病。由于核酸中的磷酸基团存在使得核酸带电负性，以及细胞膜上有很多带负电荷的蛋白以及糖脂化合物，阻碍核酸通过胞吞作用进入细胞，因此通过基因载体使核酸顺利的进入细胞是研究的关键。
用于基因治疗的基因载体主要分为两类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体在基因治疗领域的应用最为广泛，大约70％的治疗方案采用了病毒载体，早期临床试验中，病毒载体如腺病毒和逆转录病毒载体在癌症基因治疗等方面取得了一些成功。但因为它们存在诸如不良的免疫反应、不能大规模生产、载量小、靶向性差、成本高等缺点，人们将目光转向了更有效、更安全的非病毒基因载体。与病毒载体相比，非病毒载体具备许多病毒载体没有的优点，比如无传染性，载体容量没有限制，载体材料来源广泛，化学结构可以调节，且易于大量制备，在基因治疗中，有着病毒载体不可替代的作用。但是非病毒基因载体也有其自身缺点，与毒性基因载体相比，非病毒基因载体一般转染性能不高，这限制了许多非病毒基因载体在基因转染上的应用，因此，解决影响转染过程的关键因素，找到转染过程中的关键步骤，提高非病毒基因载体的转染效率是极其重要的。因此，通过荧光示踪的方法来监测整个转染过程，找出影响转染的关键步骤。开发出高转染效率且能进入细胞核的非病毒基因载体具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物，本发明所涉及到的化合物是以5,6-双(4'-(二苯氨基)-[1,1'-联苯]-4-基)吡嗪-2,3-二酯衍生物(简称DEDPP-2TPA)为核心，通过不同长度的烷基链与含三氮唑的亲水[12]aneN3单元连接，形成两亲性化合物；该种化合物具有大Stock位移以及双光子荧光的性质；该化合物具有聚集诱导效应(AIE)；本发明所提供的化合物与核酸作用后会共聚集形成易于细胞摄取的纳米颗粒；绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luciferase)表达实验证明了这种化合物本身以及与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成的脂质体可以作为非病毒基因载体；通过单光子和双光子示踪细胞摄取和释放过程。
本发明还有一个目的是提供基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物的制备方法以及该化合物的用途。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物，所述化合物的结构式(I)如下：
Figure BDA0002263578870000021
式(I)中R为大环多胺[12]aneN3结构单元，n为正整数。
优选的是，其中，R为三氮唑连接的大环多胺[12]aneN3结构单元。
优选的是，其中，R的结构式(II)如下：
Figure BDA0002263578870000031
优选的是，其中，n为4、6或者8。
本发明的目的还可以进一步由基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物的制备方法来实现，包括以下步骤：
步骤一、通过式(III)为起始原料通过Suzuki偶联制备式(IV)所示的化合物；
步骤二、通过对式(IV)进行缩合、水解以及酯化反应得到式(V)化合物；
步骤三、式(V)化合物通过与大环多胺[12]aneN3结构单元反应制备得到基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物(I)；
Figure BDA0002263578870000032
Figure BDA0002263578870000041
优选的是，其中，所述步骤一具体包括：向溶解有式(III)化合物的四氢呋喃溶液中加入TPA-B(OH)2，KCO3水溶液(2M)和Pd(PPh3)4，80℃回流反应8h，加入氯化钠水溶液与二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥，减压浓缩除去溶剂后，经柱色谱层析分离得到式(IV)化合物。
优选的是，其中，所述步骤二中，缩合反应的条件为：式(IV)化合物与二氨基马来氰加入单口瓶中，氮气保护，加入乙酸130℃回流反应8小时，冷却至室温，倒入冰水中，固体析出，过滤烘干后用甲醇重结晶；水解反应的条件为：缩合反应得到的化合物溶解在乙醇中，滴加KOH溶液回流48小时，冷却至室温，加入盐酸酸化，固体析出，抽滤；酯化反应的条件为：水解反应得到的化合物与3当量叠氮基不同长度的烷基醇溶于无水DMF中，通入氩气保护，然后向反应体系中加入HOBT，NMM，搅拌使其充分溶解，冰浴下加入EDCI，然后室温反应8～10小时，向反应体系中加入水，直到黄色固体析出，抽滤，柱层析得式(V)化合物。
优选的是，其中，所述步骤三具体包括：式(V)化合物与保护的炔丙基[12]aneN3溶于无水三氯甲烷中，通入氩气保护，然后向反应体系中加入催化量的CuBr，室温反应8～10小时，过滤并减压除去溶剂，柱层析得到黄色的Boc保护产物，将Boc保护产物溶于乙酸乙酯中，冰浴下加入2M的盐酸乙酸乙酯溶液，反应4小时后有黄色固体析出，抽滤并用乙酸乙酯洗涤，得到式(I)基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物。
本发明的目的还可以进一步由基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物在制备转基因载体中的应用，其中，转基因载体由权利要求1所述化合物与二油酰磷脂酰乙醇胺以摩尔比为1:1，1:2或1:3制成。
本发明的目的还可以进一步由基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物在DNA基因示踪剂中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明的化合物以DEDPP-2TPA为核心单元，通过不同长度的烷基链与含三氮唑的的大环多胺[12]aneN3连接形成两亲性的化合物，在水和四氢呋喃中具有聚集诱导效应(AIE)；
2、本发明的化合物具有大Stoke位移和双光子效应，具有长波激发，低自发光的特点；
3、本发明的化合物可以有效地凝聚DNA，与其形成规整的纳米颗粒；
4、本发明的化合物可以对酯酶进行刺激响应，在酯酶的作用下可以释放凝聚的DNA；
5、本发明的化合物可以作为非病毒基因载体，其中示例图中给出的化合物n为6时在一定条件下转染效率超过商业化的转染试剂Lipofectamine 2000，这为含[12]aneN3单元化合物作为基因载体的进一步研究奠定了基础；
6、本发明的化合物应用于示踪基因转染过程，便于研究转染机制，从而为设计新型非病毒基因载体提供有意义的参考。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明实施例1中化合物的最大荧光强度随THF含量的变化图；
其中，图1A为化合物1的最大荧光强度随THF含量的变化图；图1B为化合物2的最大荧光强度随THF含量的变化图；图1C为化合物3的最大荧光强度随THF含量的变化图；
图2为本发明实施例1中化合物的紫外吸收光谱和荧光发射光谱图；
其中，图2A化合物1的紫外吸收光谱图；图2B化合物2的紫外吸收光谱图；图2C化合物3的紫外吸收光谱图；图2D化合物1的荧光发射光谱图；图2E化合物2的荧光发射光谱图；图2F化合物3的荧光发射光谱图；
图3为本发明实施例1中化合物以及实施例1中化合物与DOPE形成阳离子脂质体的琼脂糖凝胶阻滞实验图；
其中，图3A为化合物1对pUC 18DNA的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图3B为化合物1/DOPE对pUC 18DNA的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图3C为化合物2对pUC 18DNA的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图3D为化合物2/DOPE对pUC 18DNA的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图3E为化合物3对pUC 18DNA的琼脂糖凝胶阻滞实验图；图3F为化合物3/DOPE对pUC 18DNA的琼脂糖凝胶阻滞实验图；
图4为由本发明的化合物制备的阳离子脂质体对pUC 18DNA释放的琼脂糖凝胶电泳实验图；
图5为由本发明的化合物对pUC 18DNA凝聚后扫描电镜形貌实验图；
其中，图5A是化合物1对pUC 18DNA的凝聚形貌图；图5B是化合物2对pUC 18DNA的凝聚形貌图；图5C是化合物3对pUC 18DNA的凝聚形貌图；
图6为本发明不同浓度的化合物1～3以及其与不同比例DOPE形成的阳离子脂质体对pGL-3基因在Hela细胞中的荧光素酶表达结果图；
其中，图6A是化合物1与不同比例DOPE形成的阳离子脂质体对pGL-3基因在Hela细胞中的荧光素酶表达结果图；图6B是化合物2与不同比例DOPE形成的阳离子脂质体对pGL-3基因在Hela细胞中的荧光素酶表达结果图；图6C是化合物3与不同比例DOPE形成的阳离子脂质体对pGL-3基因在Hela细胞中的荧光素酶表达结果图；
图7为本发明中化合物1～3以及其与DOPE形成的阳离子脂质体对pGL-3基因在不同细胞中的荧光素酶表达结果图；
图8为阳离子脂质体1/DOPE～3/DOPE转染pEGFP-N1基因的绿色荧光蛋白表达图；
图9为在不同时间段细胞摄取本发明阳离子脂质体2/DOPE凝聚FAM-DNA的共聚焦图；
图10为在不同时间段细胞摄取本发明阳离子脂质体2/DOPE凝聚FAM-DNA的双光子共聚焦图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实施例1>
一种基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物，所述化合物的结构式(I)如下：
Figure BDA0002263578870000071
式(I)中R为大环多胺[12]aneN3结构单元，n为正整数。
其中，当R为
Figure BDA0002263578870000072
n＝4时，记为化合物1；
当R为n＝6时，记为化合物2；
当R为
Figure BDA0002263578870000074
n＝8时，记为化合物3；
具体合成路线如下：
具体合成步骤如下：
1)、将化合物4(1.1g,3mmol),TPA-B(OH)2(2.17g,7.5mmol)，Pd(PPh3)4(0.312g,0.27mmol)加入双口瓶中，氮气保护，注入无氧THF 100mL和KCO3水溶液(2M,50mL)，80℃回流反应8h，减压除去THF，DCM萃取干燥，以石油醚/乙酸乙酯(v/v＝15:1)为洗脱剂，柱层析分离得到黄色固体化合物5(1.63g,2.3mmol)产率：78％。
2)、将化合物5(0.67g,1.00mmol)、二氨基马来氰(0.13g,1.20mmol)加入单口瓶中，氮气保护，加入乙酸5mL 130℃回流反应8小时，冷却至室温，倒入冰水中，有红棕色固体析出，过滤烘干得到暗红色固体粉末，固体粉末用甲醇重结晶得到化合物6(0.67g,0.88mmol)，产率：88％。
3)、将化合物6(1.20g,1.56mmol)溶解在20mL乙醇中，滴加60mL 6MKOH溶液中，回流搅拌48小时，冷却至室温，然后加入10M盐酸50mL酸化，固体析出，抽滤得到淡黄色固体7(0.82g,1.01mmol)，产率：65％。
4)、将化合物7(2.02g,2.5mmol)和3当量叠氮基不同长度的烷基醇溶于30mL无水DMF中，通入氩气保护，然后向反应体系中加入HOBT(0.85g,6.3mmol)，NMM(1.01g,10.0mmol)，搅拌使其充分溶解，冰浴下加入EDCI(1.44g,7.5mmol)，然后室温反应8～10小时，向反应体系中加入300mL水，有黄色固体析出，抽滤，滤饼以石油醚/乙酸乙酯(v/v＝10:1～20:1)为洗脱剂，过硅胶柱得到黄色固体化合物8(1.50mg,1.42mmol)，产率56％；化合物9(1.7g,1.53mmol)，产率61％；化合物10(1.90g,1.62mmol)，产率65％。
5)、将化合物8-10(1mmol)和Boc保护的炔丙基[12]aneN3(0.90g,2.20mmol)溶于30mL无水三氯甲烷中，通入氩气保护，然后向反应体系中加入催化量的CuBr，室温反应8～10小时，过滤并减压除去溶剂，以石油醚/乙酸乙酯(v/v＝10:1～15:1)为洗脱剂，柱层析得到黄色的Boc保护产物。将Boc保护产物溶于10mL乙酸乙酯中，冰浴下加入3mL 2M的盐酸乙酸乙酯溶液，反应四小时后有黄色固体析出，抽滤并用5mL乙酸乙酯洗涤，得到黄色固体化合物1(1.10g,0.75mmol)，产率75％；化合物2(1.26g,0.82mmol)，产率82％；化合物3(1.35g,0.85mmol)，产率85％。
其中，炔丙基[12]aneN3的制备方法参考文献Bioorganic&MedicinalChemistry20(2012)801–808。
化合物5：
Figure BDA0002263578870000091
结构表征：1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.03(d,J＝8.1Hz,4H),7.69(d,J＝8.2Hz,4H),7.50(d,J＝8.4Hz,4H),7.27(q,J＝6.7,5.6Hz,8H),7.13(dd,J＝8.2,5.6Hz,12H),7.06(t,J＝7.3Hz,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3):δ194.26,148.68,147.38,147.08,132.59,131.30,130.69,129.51,128.14,126.91,125.06,123.65,123.06.HRMS-ESI:m/z calcd.[M+H]+for[C50H37N2O2]+,697.2850；found 697.2854
化合物6：
结构表征：1H NMR(600MHz,CDCl3):δ7.67(d,J＝8.2Hz,4H),7.58(d,J＝8.3Hz,4H),7.48(d,J＝8.5Hz,4H),7.27(t,J＝7.7Hz,8H),7.16–7.10(m,12H),7.05(t,J＝7.2Hz,4H).13C NMR(101MHz,CDCl3):δ154.89,148.35,147.46,143.47,133.54,132.73,130.45,129.48,127.83,126.82,124.88,123.50,123.38,113.40.HRMS-ESI:m/z calcd.[M+H]+for[C54H37N6]+,769.3074；found769.3070
化合物7：
Figure BDA0002263578870000102
结构表征：1H NMR(600MHz,DMSO-d6):δ.7.55(dt,J＝20.8,8.0Hz,12H),7.24(s,8H),6.97(dt,J＝21.8,11.0Hz,16H).13C NMR(101MHz,CDCl3):δ.166.41,151.81,147.75,147.44,142.84,140.76,136.05,133.08,130.81,130.13,128.15,126.34,124.83,123.93,123.51.HRMS-ESI:m/z calcd.[M+H]+for[C54H39N4O4]+,807.2966；found 807.2970.
化合物8：
Figure BDA0002263578870000103
结构表征：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.63(d,J＝8.4Hz,4H),7.54(d,J＝8.4Hz,4H),7.48(d,J＝8.7Hz,4H),7.26(dd,J＝8.4,7.5Hz,12H),7.13–7.10(m,12H),7.03(t,J＝7.3Hz,4H),4.44(t,J＝6.7Hz,4H),3.27(t,J＝6.9Hz,4H),1.83(dt,J＝14.3,7.0Hz,4H),1.63(dt,J＝14.1,7.0Hz,4H),1.53–1.41(m,12H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.99,152.72,147.88,147.62,141.88,141.67,135.46,133.68,130.45,129.41,127.78,126.59,124.69,123.71,123.25,66.41,51.41,28.84,28.45,26.45,25.57.HRMS-ESI:m/z calcd.[M+Na]+for[C66H60N10NaO4]+,1079.4691；found 1079.4703.
化合物9：
结构表征：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.63(d,J＝8.4Hz,4H),7.54(d,J＝8.5Hz,4H),7.47(d,J＝8.4Hz,4H),,7.27–7.24(d,J＝7.4Hz,12H),7.13–7.10(m,4H),7.03(t,J＝7.3Hz,4H),4.42(t,J＝6.8Hz,4H),3.24(t,J＝6.9Hz,4H),1.81(dd,J＝14.5,7.3Hz,4H),1.61–1.56(m,4H),1.48–1.42(m,4H),1.40–1.34(m,12H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.00,152.67,147.87,147.62,141.85,141.73,135.48,133.69,130.46,129.41,127.77,126.58,124.68,123.72,123.24,66.63,51.52,29.17,29.12,28.90,28.53,26.71,25.86.HRMS-ESI:m/z calcd.[M+Na]+for[C70H68N10NaO4]+,1135.5317；found 1135.5323.
化合物10：
结构表征：1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.64(d,J＝8.4Hz,4H),7.54(d,J＝8.4Hz,4H),7.48(d,J＝8.7Hz,4H),7.29–7.21(m,12H),7.14–7.09(m,4H),7.04(d,J＝7.4Hz,4H),4.43(t,J＝6.8Hz,4H),3.24(t,J＝7.0Hz,4H),1.85–1.73(m,4H),1.64–1.54(m,4H),1.50–1.41(m,4H),1.36(s),1.31(d,J＝1.0Hz,16H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ164.99,152.64,147.86,147.61,141.82,141.74,135.49,129.41,127.77,124.68,123.71,123.25,66.71,51.56,31.53,29.78,29.50,29.48,29.30,29.22,28.93,28.57,26.80,25.94.HRMS-ESI:m/zcalcd.[M+Na]+for[C74H76N10NaO4]+,1191.5943；found 1191.5948.
化合物1：
Figure BDA0002263578870000121
结构表征：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.56(d,J＝7.7Hz,4H),7.52(d,J＝8.1Hz,4H),7.47(d,J＝7.6Hz,4H),7.22(t,J＝7.2Hz,8H),6.99(t,J＝7.1Hz,4H),6.95(d,J＝7.5Hz,8H),6.91(d,J＝7.7Hz,4H),4.37(s,4H),4.30(s,4H),4.15(s,8H),3.50–3.30(m,12H),3.21(s,4H),3.04(s,4H),2.08(d,J＝73.7Hz,12H),1.81(s,4H),1.66(s,4H),1.43–1.03(m,12H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.80,152.89,147.79,147.38,141.60,141.00,135.64,132.89,130.85,130.22,128.23,126.43,124.87,124.06,123.44,66.82,50.42,49.61,47.26,42.83,41.79,30.26,28.41,26.90,26.11,25.35,23.10.HRMS-ESI:m/zcalcd.[M+H]+for[C90H107N16O4]+,1475.8656；found 1475.8619.
化合物2：
Figure BDA0002263578870000122
结构表征：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.61(d,J＝8.0Hz,4H),7.57(d,J＝8.3Hz,4H),7.51(d,J＝7.8Hz,4H),7.26(t,J＝7.6Hz,8H),7.02(t,J＝7.2Hz,4H),6.98(d,J＝7.8Hz,8H),6.95(d,J＝8.1Hz,4H),4.35(s,4H),4.31(s,4H),4.19(s,8H),3.55–3.28(m,12H),3.22(s,4H),3.04(s,4H),2.08(d,J＝62.2Hz,12H),1.78(s,4H),1.66(s,4H),1.40–1.10(m,20H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.81,152.92,147.82,147.42,141.63,141.04,135.70,132.95,130.85,130.20,128.23,126.42,124.88,124.03,123.46,66.77,50.29,49.26,47.04,43.24,41.57,30.25,29.03,28.88,28.56,28.47,26.89,26.36,25.79.HRMS-ESI:m/z calcd.[M+H]+for[C94H116N16O4]+,1532.9360；found 1532.9282.
化合物3：
Figure BDA0002263578870000131
结构表征：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.62(d,J＝8.0Hz,4H),7.58(d,J＝8.2Hz,4H),7.51(d,J＝7.9Hz,4H),7.27(t,J＝7.6Hz,8H),7.02(t,J＝7.5Hz,4H),6.99(d,J＝7.9Hz,8H),6.95(d,J＝8.2Hz,4H),4.38–4.24(m,8H),3.80(s,8H),3.53–3.29(m,12H),3.23–3.20(m,4H),3.03(s,4H),2.08(d,J＝61.3Hz,12H),1.75(s,4H),1.65(s,4H),1.36–1.06(m,28H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ164.81,152.91,147.82,147.42,141.64,141.04,135.71,132.96,130.84,130.19,128.22,126.41,124.87,124.01,123.46,66.76,50.17,49.13,47.00,43.18,41.45,30.28,30.24,29.42,29.37,29.16,28.95,28.51,28.49,26.39,25.87.HRMS-ESI:m/z calcd.[M+H]+for[C98H123N16O4]+,1587.9908；found1587.9887.
<实施例2>
配置四氢呋喃和水不同比例(0-99％)的溶液，加入化合物1、2和3配制成相同浓度的溶液(10μM)，测定不同溶剂比例时化合物1、2和3的荧光发射强度；将荧光强度的最大值和四氢呋喃比例的变化趋势作图，得到图1A～1C，在图1A～1C中，X轴为四氢呋喃的浓度，Y轴为荧光强度。由图1可以得出，本发明的基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物具有优良的AIE性能。
<实施例3>
分别在不同溶剂中配置10μM的化合物1、2和3，对其紫外吸收和荧光发射进行测试，图谱处理得到图2A～2F。由图2可得出，本发明的基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物具有大Stoke位移，长波激发，低自发光的特点。
<实施例4>
分别配置不同浓度(0-18μM)的化合物1、2和3，以及1/DOPE、2/DOPE和3/DOPE(1:2,摩尔比)，将其与pUC 18质粒DNA形成复合物，在37℃条件下孵育45分钟，然后将其加入到不同的凝胶孔内，进行DNA琼脂糖凝胶阻滞实验，得到不同浓度化合物对DNA的凝聚情况，如图3A～3F，从图3中可以看出加入DOPE凝聚性能有所提高。由图3可以得出，本发明的基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物可以有效凝聚DNA形成纳米颗粒，可以作为非病毒基因载体。
<实施例5>
配置10μM浓度的1/DOPE～3/DOPE(1:2,摩尔比)，将其与pUC 18质粒DNA形成复合物，在37℃孵育45分钟，在pH为7.4的条件下，加入酯酶孵育1小时，再进行DNA琼脂糖释放实验，得到1/DOPE、2/DOPE和3/DOPE(1:2,摩尔比)，对酯酶刺激响应的情况。
图4是相应化合物对酯酶响应情况；从图中可以看出，1/DOPE、2/DOPE和3/DOPE(1:2,摩尔比)在1小时以内可以释放DNA，说明本发明的基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物均对酯酶条件可以刺激响应。
<实施例6>
分别配置不同浓度的化合物1(10μM)、2(14μM)和3(16μM)，将其与pUC 18质粒DNA形成复合物，在37℃条件下孵育45分钟，然后将其滴在硅片上晾干，进行扫描电镜实验，得到不同浓度化合物对DNA完全凝聚时形貌情况。
图5A～5C是本发明化合物1、2和3对pUC18DNA凝聚后扫描电镜结果；从图中可以看出化合物1、2和3和pUC18DNA凝聚后形成大小均匀，形貌规整的纳米颗粒。
<实施例7>
将5-30μM的化合物1～3及其与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成1:1,1:2,1:3(摩尔比)的阳离子脂质体与PGL-3DNA在37℃条件下孵育30分钟后给药，加入培养好的Hela细胞中，作用4小时，吸出含脂质体的培养液，用1mL DMEM漂洗，再加入完全培养基培养细胞48小时。最后加入120μL的细胞裂解液，加入底物测定裂解后的发光强度以及蛋白含量，以商业转染试剂lipofectamine 2000为基准，每毫克蛋白的发光强度(RLU/mg protein)表示化合物1、2、和3的转染效率。
图6是本发明化合物1～3以及其与DOPE形成的脂质体作为非病毒基因载体，在不同浓度，不同化合物/DOPE比在Hela细胞中的荧光素酶表达结果；以商业化转染试剂Lipofectamine 2000为参照。图6中X轴为化合物与DOPE不同比例以及Lipo 2000的荧光素酶表达量；由图6可以得出结论，2/DOPE(1:2,摩尔比)转染效果最好，在Hela细胞中是商业化Lipo 2000的154％。
<实施例8>
以上述方法，分别对1～3以及其与DOPE形成的阳离子脂质体在HeK293T,HepG2和Hela细胞中的转染效率进行了探究。以商业转染试剂lipofectamine 2000为基准，每毫克蛋白的发光强度(RLU/mg protein)表示化合物1、2和3的最佳转染效率。
图7中为化合物1～3及其与DOPE(1:2,摩尔比，两者比例关系下同)形成的脂质体在HEK293T、HepG2以及Hela中的荧光表达结果；Y轴表示荧光素酶表达量；由图6，图7可以得出结论，2/DOPE的转染效率最高，在HeK 293T、HepG2和Hela中的转染效率分别为商业化Lipo 2000的130％，87％和154％。
<实施例9>
将浓度为10μM化合物1～3与DOPE形成的脂质体与pEGFP孵育30分钟后，将其加入到Hela细胞中进行培养，然后将给药后的培养基吸出，加入含有FBS的完全培养基培养细胞24h；最后，吸出培养基并用PBS洗3～5次，用激光共聚焦扫描显微镜进行拍照；以商业转染试剂lipofectamine 2000为对照组。
图8为化合物1/DOPE～3/DOPE的绿色荧光蛋白实验，由图8可以得出2/DOPE转染效率最高。
<实施例10>
将阳离子脂质体2/DOPE与FAM-DNA孵育30分钟后，加入Hela细胞中培养不同时间，吸出培养基，用PBS洗3-5次，通过激光共聚焦扫描显微镜进行拍照，观察细胞的跨膜情况。
图9是将阳离子脂质体2/DOPE凝聚FAM-DNA加入到Hela细胞中，然后在不同时间段获取细胞摄取图。由图9可以得出，0.5h DNA通过细胞膜，1.5h一部分DNA进入细胞核，4hDNA完全进入细胞核。
<实施例11>
按照上述方法进行实验，通过双光子共聚焦显微镜进行拍照，观察细胞跨膜情况。
图10是将阳离子脂质体2/DOPE凝聚FAM-DNA加入到Hela细胞中，获取在不同时间段的细胞摄取图。由图10可以得出，该阳离子脂质体可以进行生物体内的双光子成像。
综上所述，本发明中的基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物在水中具有聚集诱导效应(AIE)，具有大Stoke位移和双光子效应，具有长波激发，低自发光的特点；可以有效地凝聚DNA，与其形成纳米颗粒；可以对脂肪酶进行刺激响应；和DNA凝聚后形成规整的纳米颗粒；可以作为非病毒基因载体，其中实施例中化合物2在一定条件下转染效率超过商业化的转染试剂Lipofectamine 2000；可以通过单光子和双光子对基因转染的过程进行示踪，以便研究基因转染的机理。本发明的基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物作为基因载体其制备方法简单、成熟、易于掌控，从而为研发新型转染试剂打下基础。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (10)

1.一种基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物，所述化合物的结构式(I)如下：
Figure FDA0002263578860000011
式(I)中R为大环多胺[12]aneN3结构单元，n为正整数，其中，DEDPP-2TPA为5,6-双(4'-(二苯氨基)-[1,1'-联苯]-4-基)吡嗪-2,3-二酯衍生物的缩写。
2.如权利要求1所述的基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物，其中，R为三氮唑连接的大环多胺[12]aneN3结构单元。
3.如权利要求2所述的基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物，其中，R的结构式(II)如下：
4.如权利要求1所述的基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物，其中，n为4、6或者8。
5.一种制备权利要求1～4任一项所述的基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物的方法，包括以下步骤：
步骤一、通过式(III)为起始原料通过Suzuki偶联制备式(IV)所示的化合物；
步骤二、通过对式(IV)进行缩合、水解以及酯化反应得到式(V)化合物；
步骤三、式(V)化合物通过与大环多胺[12]aneN3结构单元反应制备得到基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物(I)；
Figure FDA0002263578860000021
6.如权利要求5所述的制备基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物的方法，其中，所述步骤一具体包括：向溶解有式(III)化合物的四氢呋喃溶液中加入TPA-B(OH)2，KCO3水溶液(2M)和Pd(PPh3)4，80℃回流反应8h，加入氯化钠水溶液与二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥，减压浓缩除去溶剂后，经柱色谱层析分离得到式(IV)化合物。
7.如权利要求5所述的制备基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物的方法，其中，所述步骤二中，缩合反应的条件为：式(IV)化合物与二氨基马来氰加入单口瓶中，氮气保护，加入乙酸130℃回流反应8小时，冷却至室温，倒入冰水中，固体析出，过滤烘干后用甲醇重结晶；水解反应的条件为：缩合反应得到的化合物溶解在乙醇中，滴加KOH溶液回流48小时，冷却至室温，加入盐酸酸化，固体析出，抽滤；酯化反应的条件为：水解反应得到的化合物与3当量叠氮基不同长度的烷基醇溶于无水DMF中，通入氩气保护，然后向反应体系中加入HOBT，NMM，搅拌使其充分溶解，冰浴下加入EDCI，然后室温反应8～10小时，向反应体系中加入水，直到黄色固体析出，抽滤，柱层析得式(V)化合物。
8.如权利要求5所述的制备基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物的方法，其中，所述步骤三具体包括：式(V)化合物与保护的炔丙基[12]aneN3溶于无水三氯甲烷中，通入氩气保护，然后向反应体系中加入催化量的CuBr，室温反应8～10小时，过滤并减压除去溶剂，柱层析得到黄色的Boc保护产物，将Boc保护产物溶于乙酸乙酯中，冰浴下加入2M的盐酸乙酸乙酯溶液，反应4小时后有黄色固体析出，抽滤并用乙酸乙酯洗涤，得到式(I)DEDPP-2TPA的大环多胺[12]aneN3化合物。
9.权利要求1所述的基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物在制备转基因载体中的应用，其中，转基因载体由权利要求1所述化合物与二油酰磷脂酰乙醇胺以摩尔比为1:1，1:2或1:3制成。
10.权利要求1所述的基于DEDPP-2TPA的大环多胺化合物在DNA基因示踪剂中的应用。
CN201911079752.0A 2019-11-07 2019-11-07 基于dedpp-2tpa的大环多胺化合物及其制备方法与用途 Active CN110776498B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911079752.0A CN110776498B (zh) 2019-11-07 2019-11-07 基于dedpp-2tpa的大环多胺化合物及其制备方法与用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911079752.0A CN110776498B (zh) 2019-11-07 2019-11-07 基于dedpp-2tpa的大环多胺化合物及其制备方法与用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110776498A true CN110776498A (zh) 2020-02-11
CN110776498B CN110776498B (zh) 2020-08-25

Family

ID=69389953

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911079752.0A Active CN110776498B (zh) 2019-11-07 2019-11-07 基于dedpp-2tpa的大环多胺化合物及其制备方法与用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110776498B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115073437A (zh) * 2021-03-11 2022-09-20 北京师范大学 基于二氰基吡喃的大环多胺[12]aneN3化合物及其制备方法与用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105461646A (zh) * 2016-01-13 2016-04-06 北京师范大学 含大环多胺[12]aneN3的阳离子脂质、转基因载体及其制备方法
CN105541799A (zh) * 2015-12-10 2016-05-04 北京师范大学 含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质、转基因载体及其制备方法
CN106432203A (zh) * 2016-09-05 2017-02-22 北京师范大学 基于四乙烯基的 Gemini 型两亲性化合物及其制备方法和用途
CN108395411A (zh) * 2018-04-20 2018-08-14 西北工业大学 树枝状分子类阳离子脂质、转基因载体及其制备方法
CN108440426A (zh) * 2018-04-20 2018-08-24 西北工业大学 多胺类阳离子脂质、转基因载体及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105541799A (zh) * 2015-12-10 2016-05-04 北京师范大学 含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质、转基因载体及其制备方法
CN105461646A (zh) * 2016-01-13 2016-04-06 北京师范大学 含大环多胺[12]aneN3的阳离子脂质、转基因载体及其制备方法
CN106432203A (zh) * 2016-09-05 2017-02-22 北京师范大学 基于四乙烯基的 Gemini 型两亲性化合物及其制备方法和用途
CN108395411A (zh) * 2018-04-20 2018-08-14 西北工业大学 树枝状分子类阳离子脂质、转基因载体及其制备方法
CN108440426A (zh) * 2018-04-20 2018-08-24 西北工业大学 多胺类阳离子脂质、转基因载体及其制备方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115073437A (zh) * 2021-03-11 2022-09-20 北京师范大学 基于二氰基吡喃的大环多胺[12]aneN3化合物及其制备方法与用途
CN115073437B (zh) * 2021-03-11 2023-07-18 北京师范大学 基于二氰基吡喃的大环多胺[12]aneN3化合物及其制备方法与用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN110776498B (zh) 2020-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Novel imidazole-functionalized cyclen cationic lipids: synthesis and application as non-viral gene vectors
CN109369621B (zh) 基于TPA-BI的大环多胺[12]aneN3化合物及其制备方法和用途
Shi et al. Developing a chitosan supported imidazole Schiff-base for high-efficiency gene delivery
CN110746599B (zh) 具有高效基因递送能力的UV光响应性超支化聚β-氨基酯及其制备方法与应用
CN114163345B (zh) 一种可离子化脂质化合物及核酸体外细胞转染试剂
CN105541799B (zh) 含有靶向基团及荧光基团的[12]aneN3类阳离子脂质、转基因载体及其制备方法
CN110003185B (zh) 基于绿色荧光蛋白生色团bi的大环多胺类两亲化合物及其制备方法和用途
WO2017063131A1 (zh) 一种氧化响应去正电荷的阳离子聚合物、制备方法和应用
CN113121381A (zh) 一种神经酰胺类化合物及其阳离子脂质体、制备方法和应用
Illescas et al. Multivalent cationic dendrofullerenes for gene transfer: Synthesis and DNA complexation
CN110776498B (zh) 基于dedpp-2tpa的大环多胺化合物及其制备方法与用途
CN108059619B (zh) 一种碱基乙酰胺甘油醚分子，其化学合成方法及其在基因治疗领域的应用
CN116199646A (zh) 一种基于Tris的可电离脂质及其制备方法与应用
CN107308113B (zh) 基于四苯乙烯含大环多胺[12]aneN3的阳离子脂质、转基因载体及其制备方法
CN105461646B (zh) 含大环多胺[12]aneN3的阳离子脂质、转基因载体及其制备方法
WO2023179463A1 (zh) 阳离子脂质化合物及其制备方法和应用、以及mRNA递送系统
CN110840839A (zh) 一种联合输送光敏剂和基因编辑体系的多功能聚合物胶束及其制备方法和应用
CN108395411B (zh) 树枝状分子类阳离子脂质、转基因载体及其制备方法
CN115073437B (zh) 基于二氰基吡喃的大环多胺[12]aneN3化合物及其制备方法与用途
CN110627846B (zh) 半乳糖苷-四苯乙烯类化合物及其制备方法以及其作为药物载体的应用
CN105085292B (zh) 3‑((2‑(二甲氨基)乙烷基)(甲基)氨基)丙酸的两亲性衍生物及其用途
CN108753829B (zh) 骨靶向肽与萘酰亚胺修饰的树形高分子转基因载体、其制备方法及应用
CN113750226A (zh) 一种阳离子脂质核酸疫苗组合物及其制备方法
CN110732028A (zh) 一种可限制激活CRISPR/Cas13a的双锁纳米粒子的制备方法和应用
CN113527672B (zh) 一种胍基衍生物及其基因递释系统

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant