CN110527072A

CN110527072A - 基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物及其制备方法与用途

Info

Publication number: CN110527072A
Application number: CN201910852650.1A
Authority: CN
Inventors: 卢忠林; 刘旭英; 杨静波; 马乐乐; 刘名轩
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2019-09-10
Filing date: 2019-09-10
Publication date: 2019-12-03
Anticipated expiration: 2039-09-10
Also published as: CN110527072B

Abstract

本发明公开了一种基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物及其制备方法与用途。本发明公开的化合物主要由Michael反应、ROP反应、thio‑ene click反应制备，其结构也通过核磁和质谱确认。本发明的聚戊内酯型双亲性聚合物具有聚集诱导荧光发射效应(AIE)，该聚合物通过凝胶电泳、动态光散射、SEM等测试手段证实其能凝聚DNA，且形成的纳米粒子直径均小于200nm。通过体外转染实验，证明本发明的聚戊内酯型双亲性聚合物与二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成的脂质体可以作为非病毒基因载体。

Description

基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及聚合物的设计及其制备，具体涉及一种基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物及其制备方法与用途。

背景技术

基因治疗在基因缺陷、癌症等疾病方面受到很大关注。因DNA与细胞膜都带负电，存在静电排斥，且细胞质中存在核酸水解酶，所以裸露DNA被细胞摄取是很困难的。因此开发安全有效的基因运输工具，即基因载体，显得尤为重要。目前，非病毒基因载体相较于病毒载体得到了更多的重视。非病毒载体包括脂质体、聚合物、纳米粒子等。阳离子聚合物具有良好的生物相容性和安全性以及易于修饰和可大规模生产的优点。但由于转染效率低而受到限制。

目前，阳离子聚合物载体有很多种，包括聚酯，聚赖氨酸，聚乙烯亚胺等。聚酯由于具有可降解性而被广泛研究。在大量的聚酯类非病毒基因载体中，已经有一些具有不错的转染效果。但是它们的转染效率与病毒型载体还相差甚远，并且目前所报道的聚酯型载体功能较为单一，作为DNA凝聚和运输工具。发展具有高转染效率的具有荧光性质聚酯型基因载体可以同时满足运输基因和研究基因表达机制的两方面需求。基于此，设计对DNA具有荧光响应的新型聚酯型基因载体具有非常重要的研究价值。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物，本发明所涉及到的化合物是以四苯乙烯为引发剂，戊内酯衍生物为单体将其开环聚合，并在其一端支链上接上正电单元[12]aneN₃，形成两亲性聚合物。这种聚合物可以在水溶液中自组装形成AIE胶束，且能与辅助试剂(DOPE)、DNA形成纳米粒子。这种聚合物与DNA结合后，可以运载DNA进入细胞，并且具有荧光，利用这一特点可以对基因的转染过程进行示踪。

本发明还有一个目的是提供基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物的制备方法以及该化合物的用途。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物，所述可降解聚合物的结构式(I)如下：

式(I)中R₁为含硫取代基，R₂为取代的大环多胺[12]aneN₃基团，m，n为正整数。

优选的是，其中，R₁为含硫烷氧基链或含硫烷基链，R₂为

优选的是，其中，R₁为a为正整数，R₂为

优选的是，其中，a为6或10。

优选的是，其中，n＝20，m＝10。本发明的目的还可以进一步由基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物的制备方法来实现，包括以下步骤：

1)通过Michael加成反应制备式(II)所示的戊内酯衍生物；

2)通过对式(II)进行开环聚合反应制备式(III)所示的聚合物；

3)式(III)通过与巯基修饰的[12]aneN₃的Click反应制备得到基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物(I)；

本发明的目的还可以进一步由基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物在非病毒基因载体中的应用来实现。

本发明的目的还可以进一步由基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物对pH刺激响应中的应用。

本发明的目的还可以进一步由基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物作为DNA分子荧光探针的应用。

本发明的目的还可以进一步由基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物作为基因示踪剂有效成分的应用。

本发明至少包括以下有益效果：

1、本发明的聚合物是以四苯乙烯为引发剂，戊内酯衍生物为单体将其开环聚合，并在其一端支链上接上正电单元[12]aneN₃，形成具有聚集诱导发光特性的两亲性聚合物；

2、本发明的聚合物可自组装形成胶束，且能与辅助试剂(DOPE)、DNA形成纳米粒子；

3、本发明的聚合物和DNA凝聚后发光，可以作为DNA探针；

4、本发明的聚合物可作为非病毒基因载体，其中实施例中给出的聚合物2在一定条件下转染效率与PEI 25k持平；

5、本发明的聚合物可以对基因转染的过程进行示踪，以便研究基因转染的机理，从而为研发新型转染试剂打下基础。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1A为本发明实施例2中聚合物1-3的紫外吸收光谱图。

图1B为本发明实施例2中聚合物1的最大荧光强度随THF比例变化图；

图1C为本发明实施例2中聚合物2的最大荧光强度随THF比例变化图；

图1D为本发明实施例2中聚合物3的最大荧光强度随THF比例变化图；

图2A为本发明实施例3中聚合物1/DOPE对pGL-3DNA的琼脂糖凝胶阻滞实验图；

图2B为本发明实施例3中聚合物2/DOPE对pGL-3DNA的琼脂糖凝胶阻滞实验图；

图2C为本发明实施例3中聚合物3/DOPE对pGL-3DNA的琼脂糖凝胶阻滞实验图；

图3A为本发明实施例4中聚合物1与DOPE形成的阳离子脂质体对pGL-3基因在HeK293T细胞中的荧光素酶表达结果；

图3B为本本发明实施例4中聚合物2与DOPE形成的阳离子脂质体对pGL-3基因在Hela细胞中的荧光素酶表达结果；

图3C为本发明实施例4中聚合物3与DOPE形成的阳离子脂质体对pGL-3基因在HepG2细胞中的荧光素酶表达结果；

图4A为本发明实施例5中pEGFP的绿色荧光蛋白表达图；

图4B为本发明实施例5中聚合物1与DOPE形成的阳离子脂质体转染pEGFP基因的绿色荧光蛋白表达图；

图4C为本发明实施例5中聚合物2与DOPE形成的阳离子脂质体转染pEGFP基因的绿色荧光蛋白表达图；

图4D为本发明实施例5中聚合物3与DOPE形成的阳离子脂质体转染pEGFP基因的绿色荧光蛋白表达图；

图4E为本发明实施例5中PEI 25k转染pEGFP基因的绿色荧光蛋白表达图；

图5为本发明实施例6中在不同时间段细胞摄取聚合物1-3/DOPE凝聚FAM-DNA的共聚焦图；

图6为本发明实施例7中ctDNA对聚合物1-3的荧光滴定结果；

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

<实施例1>

一种基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物，所述化合物的结构式(I)如下：

式(I)中，R₁为含硫取代基，R₂为取代的大环多胺[12]aneN₃基团，m，n为正整数。

其中，当R₁为R₂为记为聚合物1；

当R₁为a＝6，R₂为记为聚合物2；

当R₁为a＝10，R₂为记为聚合物3；

具体合成路线如下：

化合物1-1的合成步骤：向溶解有3.0g(16.5mmol)[12]aneN₃前体的30.0mL乙腈溶液中加入10.0mL 1,3-二溴丙烷(98.5mmol)，搅拌回流过夜；待瓶中有大量白色固体出现时停止反应。将乙腈减压旋蒸除去，得到黄色固液混合物。向得到的黄色固液混合物中加入15.0mL乙醇和15.0mL氢溴酸，搅拌回流7-8小时；反应结束后，待反应温度降为室温，静置，反应溶液分层，收集水相，将下层有机相用水萃取3次，合并水层，采用乙醇减压旋蒸将大部分水除去，得到浅黄色或白色固体，将固体进行减压抽滤，用冷的乙醇洗涤两次后将白色固体放入真空干燥箱中50℃干燥过夜，得到白色固体8.0g，产率：90％。取上述白色固体7.2g(13.5mmol)，加入80.0mL四氢呋喃溶解，在冰水浴下向混合液中加入8.0g三乙胺(79.1mmol,6.0equiv.)与7.0g叔丁氧羰基酸(32.1mmol,2.4equiv.)，室温下反应过夜。停止反应，减压抽滤，将滤饼用四氢呋喃洗涤3次，合并有机相，浓缩后得到粗产物，柱层析分离提纯(乙酸乙酯:石油醚＝1:10)，得到亮黄色固体5.4g，产率82％。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ3.34(t,J＝6.4Hz,2h,BrCH₂(CH₂)₂-),3.33(dd,J＝11.3,6.0Hz,8H,Boc-N(CH₂)₂CH₂(CH₂)₂N-Boc),2.54(t,J＝6.4Hz,2h,Br(CH₂)₂CH₂-),2.41(t,J＝6.2Hz 4H,-N(CH₂CH₂)₂),1.94(m,2h,BrCH₂CH₂CH₂-),1.84(m,2h,Boc-NCH₂CH₂CH₂N-Boc),1.81-1.75(m,4H,-NCH₂CH₂CH₂CH₂N-Boc),1.45(s,18H,2Boc).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃),δ156.38,79.42,51.47,50.09,45.12,43.89,32.19,29.25,28.60,27.41,26.68.IR(KBr,cm^-1):3120,2976,2928,2796,1688,1470,1407,1368,1248,1164,1056,981,865,768,694.ESI-MS(m/z)calcd.for C_22h42BrN₃O₄[M+H]⁺:492.2,found:492.8.

化合物1-2的合成步骤：将化合物1-1(0.49g，1mmol，2equiv.)、KI(0.083g，0.5mmol，1equiv.)和硫脲(0.11g，1.5mmol，3equiv.)加到50mL双口瓶中，并加入10mL的乙醇，搅拌回流24h，旋干溶剂，然后再加入NaOH(0.06g，1.5mmol，3equiv.)溶液(1mL水)，继续搅拌回流1h。冷却，用稀盐酸调pH＝7，用DCM萃取，收集有机相，并合并，加入无水Na2SO4干燥，旋干溶剂，过柱子(DCM：MeOH＝20:1)得到无色液体0.23g，产率为50％。¹H NMR(600MHz,CDCl3)δ3.32(d,J＝6.3Hz,8H),2.58–2.44(m,4H),2.41(m,4H),1.91–1.77(m,2H),1.76(m,4H),1.71(d,J＝6.5Hz,2H),1.44(s,18H).¹³C NMR(151MHz,CDCl₃)：δ(ppm))156.50,79.50,77.57,77.35,77.14,51.90,50.25,45.28,44.03,30.48,28.73,22.86.ESI-MS:cald.For[C₂₂H₄₃N₃O₄S]445.66,found 446.3051.

上述反应流程中涉及的中间化合物4，5，6，2-6和TPE-OH的合成步骤参考文献：Org.Biomol.Chem.,2017,15,6567–6574；Organic Letters,17(2),322-325；2015；Macromolecules,51(14),5234-5244；2018。

聚合物7-9的合成：在手套箱内，将化合物4、5、6(2mmol，20equiv.)、TPE-OH(36.2μg，0.1mmol，1.0equiv.)、DPP(0.025g，0.1mmol，1.0equiv.)加入到10mL茄形瓶中，并加入0.5mL DCM，搅拌，反应48h，取样核磁检测，单体转化率达80％左右，然后将化合物2-7(0.224g，2mmol，10equiv.)，补加催化剂DPP(0.025g，0.1mmol，1.0equiv.)，并补加100μLDCM，继续反应48h后取样核磁检测，转化率90％。从手套箱中取出反应瓶，用Et₃N猝灭反应，旋干溶剂。用乙醇渗析(截留分子量3000)，将小分子量杂质除去。

聚合物10-12的合成：手套箱中，将聚合物7-9(0.019mmol)，1-2(0.58mmol，3equiv.)，DMAP(0.095mmol，0.5equiv.)溶于0.5mL无水DCM，Ar气氛围，室温搅拌，紫外灯照射(λ＝365nm)4h，停止反应。从手套箱中取出，旋干溶剂，用乙醇渗析(截留分子量8000-14000)，将小分子量杂质除去。

聚合物1-3的合成：将聚合物10-12(0.01mmol)加入到10mL茄型瓶中，加入1.5mL三氟乙酸和2mL DCM，室温搅拌4h，旋干溶剂，用乙醇渗析(截留分子量8000-14000)，将小分子量杂质除去。

<实施例2>

将聚合物1、2和3配置成不同浓度的水溶液，测定聚合物1～3的水溶液的荧光强度；将荧光强度的最大值随浓度(10^-6～10^-1mg/mL)的变化趋势作图，得到图1A～图1C，在图1A～1C中，X轴为溶液浓度，Y轴为荧光强度。

图1A～1C分别是聚合物1～3对临界胶束浓度测定图，从图1A～1C可以看出化合物1～3的临界胶束浓度均非常低，化合物1～3临界胶束浓度分别为9.6μg/mL，0.5μg/mL,1.1μg/mL

<实施例3>

分别配置不同浓度1/DOPE、2/DOPE和3/DOPE(1:2,摩尔比)的溶液，将其与pGL-3质粒DNA形成复合物，在37℃条件下孵育0.5小时，然后将其加入到不同的凝胶孔内，进行DNA琼脂糖凝胶阻滞实验，得到不同浓度聚合物对DNA的凝聚情况。

图2A～2C分别是本发明聚合物1/DOPE、2/DOPE和3/DOPE的pGL-3DNA的琼脂糖凝胶阻滞实验结果；图2可以得出，本发明的基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物可以有效凝聚DNA形成纳米颗粒，聚合物1～3的最低阻滞浓度分别为：40μg/mL，30μg/mL和40μg/mL。

<实施例4>

将聚合物1～3与DOPE为1/2的摩尔比所形成的阳离子脂质体与PGL-3DNA在37℃条件下孵育30分钟后给药，加入培养好的Hek293T,Hela和HepG2细胞中，作用5h，吸出化合物，然后将细胞的培养液换成新鲜的含有10％FBS的DMEM培养液培养48h。除去培养基后，加入120μL的细胞裂解液，将细胞裂解，测定其发光强度以及蛋白含量，以PEI 25k为标样，每毫克蛋白的发光强度(RLU/mg protein)表示脂质体1～3/DOPE的转染效率。

图3A～3C为聚合物1～3/DOPE为1/2所形成的阳离子脂质体在Hek293T,Hela和HepG2中的荧光素酶表达结果；Y轴表示荧光素酶表达量；由图3可以得出结论，在不同细胞中其转染效果不同；聚合物2在Hek293T细胞系中转染效率为PEI 25k的100％，而在Hela和HepG2细胞系中转染效率低于PEI25k。

<实施例5>

将聚合物1～3与DOPE形成的脂质体与pEGFP孵育30分钟后，将其加入到Hek 293T细胞中进行培养，作用5h，然后将培养基吸去，加入含有10％FBS的完全培养基孵育24h；最后，吸出培养基并用PBS洗3～5次，用激光共聚焦扫描显微镜进行拍照；

对裸露的pEGFP基因采用上述同样的实验方法，作为空白对照组；

对商业转染试剂lipofectamine 2000的绿色荧光蛋白表达图采用上述同样的实验方法，作为效果对照组；

图4A为pEGFP的绿色荧光蛋白表达图，图4B～4D为聚合物1～3/DOPE为1/2所形成的阳离子脂质体的绿色荧光蛋白表达图，图4E为商业转染试剂PEI 25k的绿色荧光蛋白表达图。从图4可以得出结论脂质体2/DOPE和3/DOPE的转染效果比脂质体1/DOPE好。

<实施例6>

将脂质体2/DOPE与FAM-DNA孵育30分钟后，加入HeLa细胞中培养不同时间，吸出培养基，用PBS洗3-5次，通过激光共聚焦扫描显微镜进行拍照，观察细胞的跨膜情况。

图5是将阳离子脂质体2/DOPE凝聚FAM-DNA加入到HeLa细胞中，然后在不同时间段获取的细胞摄取图。由实施例6可以得出，0.5h时，脂质体2/DOPE携带FAM-DNA集中在细胞膜；2h时，脂质体2/DOPE携带的FAM-DNA集中在细胞质，4h时，脂质体2/DOPE携带的FAM-DNA进入细胞核且释放FAM-DNA。

<实施例7>

向聚合物1-3的溶液中加入ctDNA，测试其荧光强度并作图，得到图8A～8C。

图6A～6C是ctDNA对阳聚合物1～3的荧光滴定结果；其中，X轴为ctDNA的浓度，Y轴表示荧光强度。由实施例7可以得出，本发明对DNA具有好的响应，可以作为DNA探针。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims

1.一种基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物，所述可降解聚合物的结构式(I)如下：

2.如权利要求1所述的基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物，其中，R₁为烷氧基链或烷基链，R₂为

3.如权利要求2所述的基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物，其中，R₁为或a为正整数，R₂为

4.如权利要求3所述的基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物，其中，a为6或10。

5.如权利要求1所述的基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物，其中，且n＝20，m＝10。

6.一种制备权利要求1～5任一项所述的基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物的方法，包括以下步骤：

1)通过Michael加成反应制备式(II)所示的戊内酯衍生物；

2)通过对式(II)进行开环聚合反应制备式(III)所示的聚合物；

7.权利要求1所述的基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物在非病毒基因载体中的应用。

8.权利要求1所述的基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物对pH刺激响应中的应用。

9.权利要求1所述的基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物作为DNA分子荧光探针的应用。

10.权利要求1所述的基于四苯乙烯的聚戊内酯型双亲性聚合物作为基因示踪剂有效成分的应用。