CN107530354A

CN107530354A - 使用syk抑制剂对慢性移植物抗宿主病的治疗

Info

Publication number: CN107530354A
Application number: CN201680023400.1A
Authority: CN
Inventors: J.A.迪保罗; J.H-L.林; S-L.林
Original assignee: Gilead Sciences Inc
Current assignee: Gilead Sciences Inc
Priority date: 2015-04-21
Filing date: 2016-04-19
Publication date: 2018-01-02
Also published as: EP3285808A1; KR20170137200A; JP2018513173A; EA201791946A1; US20160375019A1; MX2017013496A; AU2016252387A1; SG11201708075RA; HK1244453A1; WO2016172117A1; TW201711685A; BR112017022323A2; CA2983611A1; HK1249054A1

Abstract

本公开提供了利用Syk抑制化合物治疗人类中的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述移植物抗宿主病包括急性移植物抗宿主病(aGVHD)和慢性移植物抗宿主病(cGVHD)，所述方法包括使用选自下式(I)和(II)的化合物。

Description

使用SYK抑制剂对慢性移植物抗宿主病的治疗

技术领域

本公开涉及利用Syk抑制化合物治疗人中移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述移植物抗宿主病包括急性移植物抗宿主病(aGVHD)和慢性移植物抗宿主病(cGVHD)。

背景技术

蛋白激酶(人类酶的最大家族)包括超过500种人类蛋白质。脾酪氨酸激酶(Syk)为酪氨酸激酶的Syk家族的一员，且为早期B细胞发育以及成熟B细胞活化、信号传导和存活的调节子。

急性移植物抗宿主病(aGVHD)也被称为暴发性移植物抗宿主病，通常在同种异体造血干细胞移植后的前100天内出现症状，其一般特征在于对皮肤、肝脏、粘膜和胃肠道的选择性损伤。慢性移植物抗宿主病(cGVHD)发生在同种异体造血干细胞移植(HSCT)的接受者中。GVHD在移植后>100天时发生被认为是慢性的，尽管cGVHD的方面可能在100天之前自行显现出来，并且与aGVHD的要素重叠。在美国，该病累计发生率为移植患者的35-70％，年发病率约为3,000-5,000人，在约10,000人中存在。cGVHD难以治疗，与没有cGVHD的那些患者相比，cGVHD与更差的结果相关。目前的护理标准包括各种方法，包括通常与钙调神经磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、霉酚酸酯、或利妥昔单抗组合的全身皮质类固醇。尽管治疗、应答率差(40-50％)，cGVHD与显著的发病率如严重感染和生活质量受损相关；5年死亡率为30-50％(Blazar等人,Nature Reviews Immunology 12,443-458,2012年6月)。

人类和动物模型已经证明异常的B-淋巴细胞信号传导和存活在cGVHD的发病机制中是重要的。B细胞靶向药物，包括SYK抑制剂(fostamatinib–Sarantopoulos等人,Biologyof Blood and Marrow Transplantation,21(2015)S11-S18)和BTK抑制剂(ibrutinib–Nakasone等人,Int.J.Hematol.-2015年3月27日)显示出可以选择性地降低体外异常GVHDB细胞群的功能和频率。

仍然需要新的方法、药物组合物和治疗GVHD(包括aGVHD和cGVHD)的方案。

发明概述

因此，本公开提供了在人类中治疗移植物抗宿主病(GVHD)的方法中用作Syk抑制剂的化合物，所述移植物抗宿主病包括急性移植物抗宿主病(aGVHD)和慢性移植物抗宿主病(cGVHD)，所述方法包括向有需要的人给药药学上有效量的Syk抑制剂。应当理解，术语Syk抑制化合物、Syk抑制剂化合物和Syk抑制剂是本文使用的同义词。

可以在这些用于治疗人的cGVHD的这些方法中独立使用的Syk抑制化合物的实例包括选自下列结构的那些，或其药学上可接受的盐或共晶：

其中，在式(II)中：

R¹选自：其中＊表示R¹所连接的式I的所示苯环的碳原子；

R²为H或2-羟基乙氧基；

R³为H或甲基；和

R⁴为H或甲基。

附图说明

图1表示在人cGVHD和非-cGVHD B细胞中用entospletinib处理观察到的细胞凋亡诱导的原始值。

图2表示用entospletinib处理的人cGVHD B细胞中增加的细胞凋亡的值。

发明详述

一个实施方案提供了治疗人类移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向需要的人给药药学上有效量的式(II)化合物、或其药学上可接受的盐或共晶：

其中R¹、R²、R³和R⁴如上所定义。式(II)化合物的制备可参见US 2015/0175616 A1(Blomgren等人)。

另一个实施方案提供了一种治疗人类急性移植物抗宿主病(aGVHD)的方法，所述方法包括向有需要的人给药药学上有效量的如上所定义的式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶。

另一个实施方案提供了一种治疗人类慢性移植物抗宿主病(cGVHD)的方法，所述方法包括向有需要的人给药药学上有效量的如上定义的式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶。

在每个本文涉及的实施方案(其包括涉及式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的治疗方法、药物组合物或治疗方案)中，应当理解在每个实施方案中具有进一步的实施方案，其中在式(II)化合物中，每个R²、R³和R⁴为H，且R¹如上所定义。

在每个本文涉及的实施方案(其包括涉及式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的治疗方法、药物组合物或治疗方案)中，应当理解在每个实施方案中具有进一步的实施方案，其中在式(II)化合物中，R²为H，R³为甲基，且R⁴为H，以及R¹如上所定义。

在每个本文涉及的实施方案(其包括涉及式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的治疗方法、药物组合物或治疗方案)中，应当理解在每个实施方案中具有进一步的实施方案，其中在式(II)化合物中，R²为H，R³为H，且R⁴为甲基，以及R¹如上所定义。

在每个本文涉及的实施方案(其包括涉及式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的治疗方法、药物组合物或治疗方案)中，应当理解在每个实施方案中具有进一步的实施方案，其中在式(II)化合物中，R²为2-羟基乙氧基，R³为甲基，且R⁴为H，以及R¹如上所定义。

在每个本文涉及的实施方案(其包括涉及式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的治疗方法、药物组合物或治疗方案)中，应当理解在每个实施方案中具有进一步的实施方案，其中在式(II)化合物中，R²为2-羟基乙氧基，R³为H，且R⁴为甲基，以及R¹如上所定义。

在每个本文涉及的实施方案(其包括涉及式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的治疗方法、药物组合物或治疗方案)中，应当理解在每一种中存在单独的治疗，药物组合物或治疗方案，其中式(II)化合物独立地包括：

6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺；

6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺；

(R)-(4-(4-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)苯基)吗啉-2-基)甲醇；

6-(6-氨基吡嗪-2-基)-5-甲基-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺；

2-(5-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-2-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯氧基)乙醇；

2-((4-(4-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)甲基)丙-1,3-二醇；或

2-(5-((6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-2-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯氧基)乙醇；

或其共晶的药学上可接受的盐。

对于本文公开的每个实施方案，包括治疗方法、药物组合物、试剂盒、方案和涉及式(I)或式(II)化合物的其它用途，包括本文公开的式(II)化合物的具体实例，应当理解，对于式(I)或式(II)化合物或其共晶的药学上可接受的盐，还包括该化合物的药学上可接受的酯、药学上可接受的溶剂合物、水合物、异构体(包括光学异构体、外消旋体或它们的其它混合物)、互变异构体、同位素、多晶型物和药学上可接受的前药。

单独的实施方案提供了用于治疗人类中的移植物抗宿主病(GVHD)的方法，所述方法包括向需要的人给药药学上有效量的6-(1H-吲唑-6-基)-N-(4-吗啉代苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(式I)，其具有下列结构：

或其药学上可接受的盐或共晶。上述式I化合物也可称为entospletinib或GS-9973。

另一个实施方案提供了治疗人类急性移植物抗宿主病(aGVHD)的方法，所述方法包括向需要的人给药药学上有效量的6-(1H-吲唑-6-基)-N-(4-吗啉代苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(式I)、或其药学上可接受的盐或共晶。

另一个实施方案提供了治疗人类慢性移植物抗宿主病(cGVHD)的方法，所述方法包括向需要的人给药药学上有效量的6-(1H-吲唑-6-基)-N-(4-吗啉代苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(式I)、或其药学上可接受的盐或共晶。

一个实施方案提供了式(I)或式(II)化合物、或其药学上可接受的盐或共晶在制备用于治疗人类中的移植物抗宿主病(GVHD)的药物中的用途：

其中，在式(II)中：

R¹选自：其中＊表示R¹所连接的式I的所示苯环的碳原子；

R²为H或2-羟基乙氧基；

R³为H或甲基；和

R⁴为H或甲基。

另一个实施方案提供了抑制GVHD(包括aGVHD和cGVHD)症状发作的方法，所述方法包括给药于同种异体造血干细胞移植的人类受体，所述方法包括向有需要的人给药药学上有效量的6-(1H-吲唑-6-基)-N-(4-吗啉代苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(式I)、或其药学上可接受的盐或共晶。同样地，另一个实施方案提供了抑制aGVHD症状发作的方法，所述方法包括给药于同种异体造血干细胞移植的人类受体，所述方法包括向有需要的人给药药学上有效量的6-(1H-吲唑-6-基)-N-(4-吗啉代苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(式I)、或其药学上可接受的盐或共晶。同样地，另一个实施方案提供了抑制cGVHD症状发作的方法，所述方法包括给药于同种异体造血干细胞移植的人类受体，所述方法包括向有需要的人给药药学上有效量的6-(1H-吲唑-6-基)-N-(4-吗啉代苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(式I)、或其药学上可接受的盐或共晶。在本文所述的每个实施方案(包括式(I)化合物的用途)中，具有进一步的实施方案，其中式(I)化合物作为甲磺酸盐使用。在本文所述的每个实施方案(包括式(I)化合物的用途)中，具有进一步的实施方案，其中式(I)化合物作为双甲磺酸盐使用。在本文所述的每个实施方案(包括式(I)化合物的用途)中，具有进一步的实施方案，其中式(I)化合物作为文中所述的双甲磺酸盐的晶型3使用。在本文所述的每个实施方案(包括式(I)化合物的用途)中，还具有进一步的实施方案，其中式(I)化合物作为文中所述的双甲磺酸盐的晶型7使用。式(I)化合物的甲磺酸盐(包括晶型3和晶型7)由Elford等人,美国专利申请公开号2015/0038505 A1教导，将其内容引入本文作为参考。

另一个实施方案提供了抑制GVHD(包括aGVHD和cGVHD)症状发作的方法，所述方法包括给予同种异体造血干细胞移植的人类受体药学上有效量的式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶。一个实施方案提供了抑制aGVHD症状发作的方法，所述方法包括给予同种异体造血干细胞移植的人类受体药学上有效量的式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶。另一个实施方案提供了抑制cGVHD症状发作的方法，所述方法包括给予同种异体造血干细胞移植的人类受体药学上有效量的式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶。

另一个实施方案提供了治疗人类中的GVHD(包括aGVHD和cGVHD)的方法，所述方法包括向有需要的人给药药学上有效量的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶形式，与药学上有效量的另一种可用于治疗人类GVHD(包括aGVHD和cGVHD)的药物的组合。另一个实施方案提供了治疗人类中的aGVHD的方法，所述方法包括向有需要的人给药药学上有效量的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶形式，与药学上有效量的另一种可用于治疗人类aGVHD的药物的组合。另一个实施方案提供了治疗人类中的cGVHD的方法，所述方法包括向有需要的人给药药学上有效量的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶形式，与药学上有效量的另一种可用于治疗人类cGVHD的药物的组合。可用于治疗GVHD的药物包括免疫抑制剂、抗增殖剂(例如抗生素)、抗炎药、止痛药等。

另一个实施方案提供了抑制GVHD(包括aGVHD和cGVHD)症状发作的方法，所述方法包括给予同种异体造血干细胞移植的人类受体药学上有效量的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶形式，与药学上有效量的另一种可用于治疗人类GVHD(包括aGVHD和cGVHD)的药物的组合。

另一个实施方案提供了抑制同种异体造血干细胞移植的人类受体中的aGVHD症状发作的方法，所述方法包括向所述人给药药学上有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐或共晶形式，与药学上有效量的另一种可用于治疗人类aGVHD的药物的组合。

另一个实施方案提供了抑制同种异体造血干细胞移植的人类受体中的cGVHD症状发作的方法，所述方法包括向所述人给药药学上有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐或共晶形式，与药学上有效量的另一种可用于治疗人类cGVHD的药物的组合。

另一个实施方案提供了抑制同种异体造血干细胞移植的人类受体中的aGVHD症状发作的方法，所述方法包括向所述人给药药学上有效量的式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶形式，与药学上有效量的另一种可用于治疗人类aGVHD的药物的组合。

另一个实施方案提供了抑制同种异体造血干细胞移植的人类受体中的cGVHD症状发作的方法，所述方法包括向所述人给药药学上有效量的式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶形式，与药学上有效量的另一种可用于治疗人类cGVHD的药物的组合。

可以在本文的方法中与式(I)和(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶形式组合的试剂的实例包括类固醇，例如泼尼松和甲基泼尼松，口服不可吸收的皮质类固醇，例如布地奈德或二丙酸倍氯米松，免疫调节剂，例如环孢菌素他克莫司西罗莫司霉酚酸酯噻氯咪索，依木巯(imuthiol)，抗胸腺细胞球蛋白(ATG)，抗-TNF剂，硫唑嘌呤(或其他肌苷5'-单磷酸脱氢酶抑制剂)，azodiacarbonide，双吲哚基马来酰亚胺VIII(bisindolyl maleimide VIII)，布喹那，苯丁酸氮芥，CTLA4-Ig，皮质类固醇，环磷酰胺，脱氧精胍菌素，地塞米松，糖皮质激素，来氟米特，巯嘌呤，6-巯基嘌呤(6-MP)，甲氨蝶呤，甲基泼尼松龙，咪唑立宾，咪唑立宾单磷酸盐，莫罗单抗CD3，霉酚酸酯，OKT3，泼尼松，西罗莫司，雷帕霉素，rho(D)免疫球蛋白，他克莫司(FK506)，维生素D类似物(例如MC1288)等，单克隆抗体如达珠单抗英夫利昔单抗利妥昔单抗(或)，托珠单抗和阿仑珠单抗甲氨蝶呤，抗胸腺细胞球蛋白(兔ATG，)，地尼白介素Campath-1H，角质化细胞生长因子(KGF)，阿巴他塞remestemcel-L辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)，喷司他丁(脱氧助间型霉素(deoxycoformycin)、)，沙利度胺甲磺酸伊马替尼环磷酰胺，氟达拉滨，OKT3(Muromorab)，美法仑，噻替哌和(淋巴细胞免疫球蛋白，抗胸腺细胞，球蛋白[马]无菌溶液)。

应当理解，上述方法可以包括向需要GVHD治疗的人给药药学上有效量的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶形式，与一种或多种可用于治疗GVHD的其它药剂的组合。例如药学上有效量的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶形式可与药学上有效量的一种或多种类固醇如泼尼松、甲基泼尼松、布地奈德或二丙酸倍氯米松、以及药学上有效量的免疫调节剂如环孢菌素他克莫司西罗莫司或霉酚酸酯组合给药。

还应当理解，在组合疗法或方案中单独或组合给药的每种药剂可以初始剂量给药，然后该初始剂量可以随时间被医疗专业人员减少以达到较低的有效剂量。例如，在本文的组合和方案中，可以约1-2mg/kg/天的剂量向人类患者给药全身性糖皮质激素(皮质类固醇)，例如泼尼松、甲基泼尼松。mTOR试剂的初始日剂量包括给予2-40mg的西罗莫司，给予每日一次，依维莫司以0.25-1mg给予，每天两次。钙调神经磷酸酶药剂的初始日剂量包括约0.025-0.2mg/kg/天的他克莫司和约2.5-9mg/kg/天的环孢菌素。霉酚酸酯可以以约250-3,000mg/天的初始日剂量施用。在造血细胞移植后，这些药剂中的每一种可以与所述的药学上有效量的Syk抑制剂组合施用。在本文的不同实施方案中，可用于治疗GVHD的药剂可以局部施用于需要这种治疗的人，例如以局部软膏或乳膏的形式或滴眼剂制剂。

还提供了式I化合物或其药学上可接受的盐或共晶在制备用于治疗人类中的移植物抗宿主病(GVHD)的药物中的用途，所述移植物抗宿主病包括急性移植物抗宿主病(aGVHD)和慢性移植物抗宿主病(cGVHD)。还提供了式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶在制备用于治疗人类中的移植物抗宿主病(GVHD)的药物中的用途，所述移植物抗宿主病包括急性移植物抗宿主病(aGVHD)和慢性移植物抗宿主病(cGVHD)。

可用于本文所述的方法和组合疗法中的式(I)化合物的形式的实例包括本领域已知的那些，包括在U.S.2015/0038505和WO 2015/017460中描述的那些，其内容通过引入本文作为参考。这种形式包括式(I)化合物的双甲磺酸盐形式或其水合物，并且包括多晶型物晶型3和多晶型物晶型7。在本文所述的涉及治疗方法、药物组合物、试剂盒、方案和其它用途的每个实施方案中，其中所用的Syk化合物是式(I)化合物entospletinib，具有进一步的实施方案，其中式(I)化合物为双甲磺酸盐形式的多晶型物3。在本文所述的涉及治疗方法、药物组合物、试剂盒、方案和其它用途的每个实施方案中，其中所用的Syk化合物是式(I)化合物entospletinib，还具有进一步的实施方案，其中式(I)化合物为双甲磺酸盐形式的多晶型物7。

定义

如本文所用，“药学上可接受的”是指不是生物学上或其他不期望的物质，例如，可将该物质并入给予患者的药物组合物中，而不引起任何显著的不良生物效应或以有害的方式与包含其的组合物的任何其它组分相互作用。药学上可接受的媒介物(例如载体，辅料和/或其它赋形剂)优选满足所要求的毒理学和制造测试的标准和/或包括在由美国食品和药物管理局编写的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)中。

“药学上可接受的盐”包括例如与无机酸形成的盐和与有机酸形成的盐。盐的实例可包括盐酸盐、磷酸盐、二磷酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、亚磺酸盐、硝酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、2-羟基乙基磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐和烷酸盐(例如乙酸盐，HOOC-(CH₂)_n-COOH，其中n为0-4)。此外，如果本申请所述化合物作为酸加成盐得到，那么游离碱可通过将酸盐溶液碱化得到。相反，如果产物为游离碱，那么加成盐(特别是药学上可接受的加成盐)可通过以下方法产生：按照从碱化合物制备酸加成盐的常规操作，将游离碱溶解在适合的有机溶剂中并用酸处理溶液。本领域技术人员将认识到可用于制备无毒的药学上可接受的加成盐的各种合成方法。

术语“有效量”、“药学上有效量”和“治疗有效量”指的是可有效产生所需的生物或者药物响应的量，包括当给药于用于治疗疾病的受试者时足以实现该疾病治疗的化合物的量。该有效量将根据化合物、待治疗受试者的疾病及其严重程度以及年龄、体重等而变化。有效量可以包括一定范围的量。药学上有效量包括与其它试剂组合时有效的试剂的量。

“治疗(Treatment)”或“治疗(treating)”是用于得到有益的或者希望的结果(包括临床结果)的途径。有益的或者希望的临床结果可包括以下中的一个或者多个：

(i)减少疾病导致的一种或多种症状；

(ii)减少疾病的程度和/或稳定疾病(例如延缓疾病的恶化)；

(iii)延缓疾病的传播；

(iv)延缓或减慢疾病的发作或复发和/或疾病的进展；

(v)改善疾病状态和/或提供疾病的缓解(不管是部分还是全部)和/或减少治疗疾病所需的一种或多种其它药物的剂量；

(vi)提高生命质量，和/或

(vii)延长存活。

“延缓”疾病或者病症的发展意味着延迟、阻碍、减慢、迟滞、稳定和/或推迟疾病或者病症的发展。取决于疾病或者病症的历史和/或治疗的受试者，这种延缓可为时间长度的改变。“延缓”疾病或者病症的发展的方法为这样的方法：当与不使用所述方法比较时，其在给定的时间长度内减少疾病或者病症发展的概率和/或在给定的时间长度内降低疾病或者病症的程度。这种比较通常基于临床研究，使用统计学上显著数目的受试者。疾病或者病症发展可使用标准方法检测，例如常规体检、乳房X线照相术、成像或者活组织检查。发展也可表示最初可为不可检测的疾病或者病症进展并包括发生、复发和发作。

为了用于本文所述的方法，式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶可存在于药物组合物中，该药物组合物包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶，以及至少一种药学上可接受的媒介物。药学上可接受的媒介物可以包括药学上可接受的载体、辅料和/或其它赋形剂，并且其它成分可以被认为是药学上可接受的，只要它们与制剂的其它成分相容并且对其接受者无害。

本文所述的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的药物组合物可使用任意常规方法制备，例如，混合、溶解、制粒、制锭、研磨、乳化、包封、包埋、熔纺、喷雾干燥或冻干工艺。最佳药物制剂可由本领域技术人员根据给药途径和所需剂量进行确定。这种制剂可影响所施用的药物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除率。根据所治疗的病症，可配制这些药物组合物并全身或局部给药。

术语“载体”是指与化合物一起施用的稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂和其它赋形剂和媒介物。载体在本申请中和在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中被一般性描述。载体的实例包括但不限于单硬脂酸铝、硬脂酸铝、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、交聚维酮、异硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、羟基乙基纤维素、羟基乙基纤维素、羟基甲基纤维素、羟基硬脂酸羟基二十八酯、羟基丙基纤维素、羟基丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、乳糖、乳糖一水合物、硬脂酸镁、甘露醇、微晶纤维素、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆407、聚维酮、二氧化硅、胶体二氧化硅、硅酮、硅酮胶粘剂4102和硅酮乳液。然而，应理解的是，选择用于药物组合物的载体和这种载体在组合物中的量可取决于制剂(例如，干法制粒制剂、固体分散制剂)的方法而改变。

术语“稀释剂”通常是指用于在递送之前稀释感兴趣的化合物的物质。稀释剂也可用于稳定化合物。稀释剂的实例可包括淀粉、糖、二糖、蔗糖、乳糖、多糖、纤维素、纤维素醚、羟基丙基纤维素、糖醇、木糖醇、山梨醇、麦芽糖醇、微晶纤维素、碳酸钙或者碳酸钠、乳糖、乳糖一水合物、磷酸二钙、纤维素、可压缩糖、脱水磷酸氢钙、甘露醇、微晶纤维素和磷酸三钙。

术语“崩解剂”通常是指这样的物质，其在添加至固体制剂后促进固体制剂在给药之后的碎裂或者崩解，并允许活性成分尽可能有效率地释放以允许活性成分快速溶出。崩解剂的实例可包括玉米淀粉、淀粉羟乙酸钠、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、微晶纤维素、改性玉米淀粉、羧甲基淀粉钠、聚维酮、预胶化淀粉和海藻酸。

术语“沉淀抑制剂”通常是指防止或抑制活性剂从过饱和溶液中析出的物质。沉淀抑制剂的一个实例包括羟丙基甲基纤维素(HPMC)。

术语“表面活性剂”通常是指降低液体和固体之间的表面张力，能改善活性剂的湿润性或提高该活性剂的溶解度的物质。表面活性剂的实例包括泊洛沙姆和十二烷基硫酸钠。

术语“助流剂”通常是指用在片剂和胶囊制剂中提高压片过程中的流动性并产生抗结块效果的物质。助流剂的实例可包括胶体二氧化硅、滑石、烟雾硅胶、淀粉、淀粉衍生物和膨润土。

术语“粘合剂”通常是指任何药学上可接受的膜，其可用于将载体的活性成分和惰性成分粘合到一起以维持内聚和离散部分。粘合剂的实例可包括羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮、共聚维酮和乙基纤维素。

术语“润滑剂”通常是指被添加至粉末共混物以预防在压片或包囊处理过程中该压实的粉块粘到设备上的物质。润滑剂可帮助从模具排出片剂，并提高粉末流动。润滑剂的实例可包括硬脂酸镁、硬脂酸、二氧化硅、脂肪、硬脂酸钙、聚乙二醇、硬脂酰富马酸钠或滑石；和增溶剂，例如脂肪酸，包括月桂酸、油酸和C8/C10脂肪酸。

在本申请提供的方法中，式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶或其药物组合物以治疗有效量给药以实现预期目的。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内，尤其是鉴于本申请提供的详细公开。在一些实施方案(治疗GVHD的方法)中，治疗有效量的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶可(i)降低GVHD的严重程度；(ii)减慢GVHD症状的发作；(iii)抑制、延缓、在一定程度上减慢，并优选停止GVHD症状在受体身上的扩散；(iv)GVHD症状的延迟发生和/或复发；和/或(v)在一定程度上减轻与GVHD相关联的一种或者多种症状。在各种实施方案中，所述量足以改善、缓和、减轻和/或延迟GVHD(包括aGVHD和cGVHD)的一种或者多种症状。

所述治疗有效量可取决于受试者和治疗的疾病或者病症、受试者的体重和年龄、疾病或者病症的严重性和给药方式而改变，其可由本领域普通技术人员容易地确定。

在本申请提供的方法中，式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的给药方案可取决于例如适应症、给药途径和病症严重性而改变。取决于给药途径，适合的剂量可根据体重、身体表面积或者器官尺寸计算。最终给药方案由主治医师鉴于充分的医疗实践、考虑改变药物作用的各种因素确定，所述因素例如为化合物的具体活性、疾病的鉴定和严重性、受试者的应答性、受试者的年龄、状况、体重、性别和饮食，和任何感染的严重性。可考虑的另外的因素包括给药时间和频率、药物组合、反应严重性，和对疗法的耐受/应答。涉及本申请提及的任何制剂的适用于治疗的剂量的进一步细微改变常规地由本领域医师在不进行过度实验的情况下进行，尤其是根据公开的剂量信息和测试，以及在人的临床试验中观察到的药代动力学数据。适合的剂量可通过使用确立的测试以及剂量应答数据确定，所述测试用于测定药物在体液或其它样品中的浓度。

选择的制剂和给药途径可针对个体受试者、受试者中的待治疗的病症的性质，和通常主治医师的判断来调整。

式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的药学上有效量或治疗有效量可在单一剂量或者多个剂量中提供，以实现希望的治疗终点。本申请使用的“剂量”是指由受试者(例如，人)每次接受的活性成分(例如，式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶)的总量。给药的剂量(例如，上述的用于口服给药的剂量)可每日一次(QD)、每日两次(BID)、每日三次、每日四次，或者每日超过四次给药。在一些实施方案中，将式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的剂量每日一次给药。在一些实施方案中，将式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的剂量每日两次给药。

在一些实施方案中，用于人类受试者的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的示例性剂量可以为约1mg至约5000mg，约1mg至约4000mg，约1mg至约3000mg，约1mg至约2000mg，约2mg至约2000mg，约5mg至约2000mg，约10mg至约2000mg，约1mg至约1000mg，约2mg至约1000mg，约5mg至约1000mg，约10mg至约1000mg，约25mg至约1000mg，约50mg至约1000mg，约75mg至约1000mg，约100mg至约1000mg，约125mg至约1000mg，约150mg至约1000mg，约175mg至约1000mg，约200mg至约1000mg，约225mg至约1000mg，约250mg至约1000mg，约300mg至约1000mg，约350mg至约1000mg，约400mg至约1000mg，约450mg至约1000mg，约500mg至约1000mg，约550mg至约1000mg，约600mg至约1000mg，约650mg至约1000mg，约700mg至约1000mg，约750mg至约1000mg，约800mg至约1000mg，约850mg至约1000mg，约900mg至约1000mg，约950mg至约1000mg，约1mg至约750mg，约2mg至约750mg，约5mg至约750mg，约10mg至约750mg，约25mg至约750mg，约50mg至约750mg，约75mg至约750mg，约100mg至约750mg，约125mg至约750mg，约150mg至约750mg，约175mg至约750mg，约200mg至约750mg，约225mg至约750mg，约250mg至约750mg，约300mg至约750mg，约350mg至约750mg，约400mg至约750mg，约450mg至约750mg，约500mg至约750mg，约550mg至约750mg，约600mg至约750mg，约650mg至约750mg，约700mg至约750mg，约1mg至约500mg，约2mg至约500mg，约5mg至约500mg，约10mg至约500mg，约25mg至约500mg，约50mg至约500mg，约75mg至约500mg，约100mg至约500mg，约125mg至约500mg，约150mg至约500mg，约175mg至约500mg，约200mg至约500mg，约225mg至约500mg，约250mg至约500mg，约300mg至约500mg，约350mg至约500mg，约400mg至约500mg，约450mg至约500mg，约1mg至约400mg，约2mg至约400mg，约5mg至约400mg，约10mg至约400mg，约25mg至约400mg，约50mg至约400mg，约75mg至约400mg，约100mg至约400mg，约125mg至约400mg，约150mg至约400mg，约175mg至约400mg，约200mg至约400mg，约225mg至约400mg，约250mg至约400mg，约300mg至约400mg，约350mg至约400mg，约1mg至约300mg，约2mg至约300mg，约5mg至约300mg，约10mg至约300mg，约25mg至约300mg，约50mg至约300mg，约75mg至约300mg，约100mg至约300mg，约125mg至约300mg，约150mg至约300mg，约175mg至约300mg，约200mg至约300mg，约225mg至约300mg，约250mg至约300mg，约1mg至约250mg，约2mg至约250mg，约5mg至约250mg，约10mg至约250mg，约25mg至约250mg，约50mg至约250mg，约75mg至约250mg，约100mg至约250mg，约125mg至约250mg，约150mg至约250mg，约175mg至约250mg，约200mg至约250mg，约225mg至约250mg，约1mg至约225mg，约2mg至约225mg，约5mg至约225mg，约10mg至约225mg，约25mg至约225mg，约50mg至约225mg，约75mg至约225mg，约100mg至约225mg，约125mg至约225mg，约150mg至约225mg，约175mg至约225mg，约200mg至约225mg，约1mg至约200mg，约2mg至约200mg，约5mg至约200mg，约10mg至约200mg，约25mg至约200mg，约50mg至约200mg，约75mg至约200mg，约100mg至约200mg，约125mg至约200mg，约150mg至约200mg，约175mg至约200mg，约180mg至约200mg，约1mg至约175mg，约2mg至约175mg，约5mg至约175mg，约10mg至约175mg，约25mg至约175mg，约50mg至约175mg，约75mg至约175mg，约100mg至约175mg，约125mg至约175mg，约150mg至约175mg，约1mg至约150mg，约2mg至约150mg，约5mg至约150mg，约10mg至约150mg，约25mg至约150mg，约50mg至约150mg，约75mg至约150mg，约100mg至约150mg，约125mg至约150mg，约1mg至约125mg，约2mg至约125mg，约5mg至约125mg，约10mg至约125mg，约25mg至约125mg，约50mg至约125mg，约75mg至约125mg，约100mg至约125mg，约1mg至约100mg，约2mg至约100mg，约5mg至约100mg，约10mg至约100mg，约25mg至约100mg，约50mg至约100mg，约60mg至约100mg或约75mg至约100mg。

在一些实施方案中，用于人类受试者的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的示例性剂量可以是约1mg，约2mg，约5mg，约10mg，约15mg，约20mg，约25mg，约30mg，约35mg，约40mg，约45mg，约50mg，约60mg，约65mg，约70mg，约75mg，约100mg，约125mg，约150mg，约175mg，约180mg，约190mg，约200mg，约225mg，约250mg，约300mg，约350mg，约400mg，约450mg，约500mg，约550mg，约600mg，约650mg，约700mg，约750mg，约800mg，约850mg，约900mg，约950mg，约1000mg，约1200mg，约1400mg，约1600mg，约1800mg，约2000mg，约2200mg，约2400mg，约2600mg，约2800mg，约3000mg，约3200mg，约3400mg，约3600mg，约3800mg，约4000mg，约4200mg，约4400mg，约4600mg，约4800mg或约5000mg。

在其它实施方案中，所提供的方法包括通过给药式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的剂量，所述剂量达到临床疗效或者通过逐步将剂量减少到可以维持效力的水平，来继续治疗受试者(例如，人)。在一些实施方案中，提供的方法包括向受试者(例如，有需要的人)给药50mg至约500mg的初始日剂量的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或共晶，或在替代的实施方案中，给药100mg至1000mg的式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或共晶，并且给药随后的每日剂量的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶至少6天，其中每个随后的每日剂量增加25mg至300mg，或增加50mg至约400mg。因此，还应当理解，式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的剂量可以按增量增加直至达到临床疗效。按约10mg，约25mg，约50mg，约100mg或约125mg或约150mg或约200mg或约250mg或约300mg的增量来增加剂量。所述剂量可每日增加，每隔一日增加，每周两次、三次、四次、五次或六次增加，或者每周一次增加。式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的初始剂量可选自250mg，300mg，350mg，400mg，450mg或500mg，每种每天给药一次、两次或三次。

给药频率将依赖于给药的化合物的药代动力学参数、给药途径和治疗的特定疾病。给药的剂量和频率也可依赖于药代动力学数据和药效数据以及毒性和治疗有效性数据。例如，关于式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的药代动力学和药效信息可通过临床前体外和体内研究收集，然后在临床试验期间在人中验证。因此，对于在本申请提供的方法中使用的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶，治疗有效剂量最初可从生物化学和/或基于细胞的测试估计。然后，剂量可在动物模型中配制以实现调节Syk表达或者活性的希望的循环浓度范围。随着人体研究进行，关于各种疾病和病症的适当的剂量水平和治疗持续时间的进一步信息将出现。

式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的毒性和治疗有效性可在细胞培养物或者实验动物中通过标准药学操作确定，例如，用于确定LD₅₀(群体的50％致死剂量)和ED₅₀(群体的50％治疗有效剂量)。在毒性和治疗效果之间的剂量比率为“治疗指数”，其通常表达为比率LD₅₀/ED₅₀。呈现大的治疗指数(即，中毒剂量显著高于有效剂量)的化合物是优选的。可在配制用于人的剂量范围中使用从这种细胞培养测试和另外的动物研究得到的数据。这种化合物的剂量优选处于包括具有极少或者无毒性的ED₅₀的循环浓度范围内。

可将包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的组合物(包括例如制剂和单位剂量)制备并置于适当的容器内，并标记用于治疗示出的病症。因此，还提供了一种制品，例如包含单位剂量形式的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的容器，以及含有化合物的使用说明的标签。在一些实施方案中，所述制品为容器，其包含单位剂量形式的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶以及至少一种药学上可接受的媒介物。该制品可为含有本发明所提供的药物组合物的瓶子、小瓶、安瓿、一次性使用的可丢弃涂药器(applicator)等。所述容器可由多种材料制成，例如玻璃或塑料，且在一个方面也含有在该容器上或与容器相连的标签，其指示了治疗癌症或炎性病症的使用说明。应当理解，活性成分可被包装于任一能够增加化学和物理稳定性的材料中，例如铝箔袋。在一些实施方案中，在标签上示出的疾病或者病症可包括例如癌症的治疗。

另一个实施方案提供了用于治疗人类GVHD的药物试剂盒，包括治疗aGVHD和/或cGVHD，该试剂盒包含药学上有效量的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐、共晶、酯、溶剂合物、水合物、异构体、互变异构体、同位素、多晶型物或前药，以及使用式(I)或式(II)化合物治疗GVHD(包括aGVHD和/或cGVHD)的说明书。例如，试剂盒可以包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的一种或多种单位剂型，以及包含包装说明书，其包含用于治疗GVHD(包括aGVHD和/或cGVHD)的组合物的指示。在一些实施方案中，试剂盒包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶以及至少一种药学上可接受的媒介物的一种或多种单位剂型，及其使用说明书。在其它实施方案中，试剂盒包含式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的一种或多种单位剂型，用于治疗GVHD的另一种药剂(例如本文所述的那些药剂)的至少一种单位剂型，以及它们的使用说明书。

合成

应当理解，式(I)或式(II)的化合物或其药学上可接受的盐或共晶可以通过本领域已知的方法制备。例如，式(I)化合物或其药学上可接受的盐或共晶，以及包含它的药物制剂可以通过美国专利号8,748,607和8,450,321,J.Med Chem.,Vol.57,Issue 9,pp.3856-3873,US 2015/0038504,以及US 2015/0038505中所公开的方法制备。

本公开的化合物可以使用本文公开的方法和其常规修饰来制备，考虑到本文的公开内容和本领域熟知的方法中这将是显而易见的。除了本文的教导之外，可以使用常规和公知的合成方法。式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的合成可以如以下实施例中所述来完成。如果可得的话，试剂可以商购获得，例如得自Sigma Aldrich或其他化学品供应商。

一般合成

根据本公开的式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的典型实施方案可以利用下面描述的通用反应方案合成。鉴于本申请的描述显而易见的是，该一般方案可以通过用具有类似结构的其他原料替换起始原料，从而相应地得到不同的产物而进行变化。下面的合成描述给出了起始原料可如何变化得到相应产物的多个实例。在给定的取代基团限定的所需产物的情况下，必须的起始原料通常可通过检查确定。起始原料典型地自商业来源得到或利用公开的方法合成。为了合成本发明实施方案的化合物，检查需要合成的化合物的结构会提供各个取代基的鉴定。最终产物的鉴定通常通过简单的检查程序使得必需原料的确定变得显而易见(鉴于本申请所给实施例)。

合成反应参数

式(I)和(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶可以由便利可得的起始原料，利用例如下面的通用方法和步骤而制备。可以理解，在给出典型的或优选的方法条件(即，反应温度、时间、试剂的摩尔比、溶剂、压力等)时，其他的方法条件也可以使用，除非另有说明。优化的反应条件可以随着所使用的具体试剂或溶剂而变化，但是此类条件可以由本领域技术人员通过常规优化步骤而确定。

此外，对本领域技术人员显而易见的是，常规的保护基团可能是必须的以防止某些官能团进行不需要的反应。对于各种官能团的合适的保护基团以及用于保护和脱保护具体官能团的条件是本领域中公知的。例如，多种保护基团描述于T.W.Greene and G.M.Wuts(1999)Protecting Groups in Organic Synthesis,第3版,Wiley,New York，将其在此引入作为参考。

此外，本发明的化合物可以包含手性中心。因此，如果需要，此类化合物可以被制备或分离为纯的立体异构体，即，为单个对映异构体或立体异构体富集的混合物。所有的此类立体异构体(和富集的混合物)均在本发明的范围内，除非另有指定。纯的立体异构体(或富集的混合物)可以被制备，例如利用本领域中公知的光学活性起始原料或立体选择性试剂。或者，此类化合物的外消旋混合物可以被分离，例如利用手性柱色谱、手性拆分试剂等。

下列反应的起始原料通常为已知的化合物或可以通过已知的方法或其显而易见的变化而制备。例如，很多起始原料可以从供应商如Aldrich Chemical Co.(Milwaukee,Wisconsin,USA)商购得到。其他的原料可以通过描述于标准的参考教科书中的步骤或其显而易见的变化而制备，如Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis,Volumes 1-15(John Wiley,and Sons,1991),Rodd's Chemistry of Carbon Compounds,Volumes 1-5,and Supplementals(Elsevier Science Publishers,1989)organicReactions,Volumes1-40(John Wiley,and Sons,1991),March's Advanced OrganicChemistry,(John Wiley,and Sons,5th Edition,2001),和Larock's ComprehensiveOrganic Transformations(VCH Publishers Inc.,1989)。

术语“溶剂”、“惰性有机溶剂”或“惰性溶剂”指的是在与其一起描述的反应条件下为惰性的溶剂(包括，例如，苯、甲苯、乙腈、四氢呋喃(“THF”)、二甲基甲酰胺(“DMF”)、氯仿、二氯甲烷(mehylene chloride或dichloromethane))、乙醚、甲醇、吡啶等)。除非有相反指示，本发明反应中使用的溶剂为惰性有机溶剂，且反应在惰性气体(优选氮气)中进行。

术语“q.s.”表示加入足以达到所述功能的量，例如，将溶液调节至所需体积(即100％)。

包括下面的实施例以说明涉及式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的制备和测试的本公开的实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术，其代表了发明人发现的能够良好实施本发明的代表性技术，因此可以理解为它们构成了用于其实施的优选方式。但是，本领域技术人员会理解，基于本发明的公开内容，在公开的具体实施方案中可以进行很多变化，且仍然可以得到相同或类似的结果而不偏离本发明的精神和范围。

缩写和缩略词列表

缩写含义

℃ 摄氏度

anal 分析的

ATP 腺苷-5'-三磷酸

ATX II 地中海槽沟海葵毒素(Anemonia sulcata toxin)

AcOH 乙酸

ACN 乙腈

CAN 硝酸铈铵

CDI 1,1’-羰基二咪唑

缩写含义

CHO 中国仓鼠卵巢

conc. 浓的

d 二重峰

DABCO 1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷

DAST (二乙基氨基)三氟化硫

dd 双二重峰

DCE 1,2-二氯乙烷

DCM 二氯甲烷

DEAD 偶氮二甲酸二乙酯

DIPEA N,N-二异丙基乙胺

DMAP 4-二甲基氨基吡啶

DME 1,2-二甲氧基乙烷

DMF 二甲基甲酰胺

DMSO 二甲基亚砜

dppf 1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁

EA 乙醇

ECF 细胞外液

EDTA 乙二胺四乙酸

EGTA 乙二醇四乙酸

equiv/eq 当量

ESI 电喷雾离子化

Ac 乙酸盐/酯

Et 乙基

EtOAc 乙酸乙酯

g 克

HEPES (4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)

HATU 2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

hERG 人Ether-à-go-go相关基因

HMDS 六甲基二硅氮烷(叠氮化物)

缩写含义

HPLC 高效液相色谱

h 小时

Hz 赫兹

IPA 异丙醇

IC₅₀ 半数最大抑制浓度

IMR-32 人神经母细胞瘤细胞系

J 耦合常数

Kg 千克

kHz 千赫兹

LAH 氢化锂铵

LCMS/LC-MS 液相色谱–质谱

M 摩尔浓度

m 多重峰

m/z 质荷比

M⁺ 质量峰

M+H 加氢质量峰

mCPBA 3-氯过氧苯甲酸

Me 甲基

MeOH 甲醇

mg 毫克

MHz 兆赫兹

min/m 分钟

ml/mL 毫升

mM 毫摩尔浓度

mmol 毫摩尔

nmol 纳摩尔

mOsmol 毫渗摩尔

MRM 磁共振显微技术

MS 质谱

ms 毫秒

缩写含义

mV 毫伏

mw 微波

N 当量

mol 摩尔

NMP N-甲基吡咯烷酮

NMR 核磁共振

pA 皮安

Ph 苯基

ppm 百万分率

prep 制备型

q.s. 足以达到所述功能的量

Rf 保留因子

RP 反相

RT/rt 室温

s 秒

s 单峰

SEM 2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基

t 三重峰

TB 张力性阻滞(Tonic Block)

TEA 三乙胺

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

TLC 薄层色谱

TMS 三甲基甲硅烷基

TTX 河豚毒素

UDB 使用依赖性阻滞

WT 野生型

δ 化学位移

μg 微克

μL/μl 微升

缩写含义

μM 微摩尔浓度

μm 微米

μmol 微摩尔

实施例

共同中间体的制备

中间体1.01.(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯IV和4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基(6-(三丁基锡烷基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基甲酸叔丁酯V的制备

1-(4-硝基苯基)-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪I：在500mL圆底烧瓶中，将1-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪(3.02g,21.26毫摩尔)、碳酸钾(5.87g,42.52毫摩尔)、1-氟-4-硝基苯(3.00g,21.26毫摩尔)在乙腈(33mL)中混合，并在氮气下在100℃搅拌过夜。将混合物用水(100mL)稀释，并用DCM(100mL x 3)萃取，经无水碳酸钠干燥，过滤并浓缩滤液。使用超声发生器将残留物溶解在最少量DCM中并用己烷析出。将析出物过滤，用己烷洗涤并干燥，得到标题化合物I。

4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯胺II：在氢化容器中，将1-(4-硝基苯基)-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪I(4.70g,17.85毫摩尔)尽可能多地溶解在MeOH(26mL)和DCM(5mL)中。添加Pd/C(10％)(2.85g,2.68毫摩尔)，并将反应混合物贮存在氮气下。将反应混合物在Parr氢化器上以45PSI振摇。在15分钟之后，将反应混合物完全再充至45PSI并再振摇1小时。将所述物质经硅藻土过滤，用25％MeOH/DCM洗涤并浓缩，得到标题化合物II。

6-溴-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺III：向4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯胺II(2.00g,8.57毫摩尔)中添加在DMF(43mL)中的hunig碱(3.29mL)和6,8-二溴咪唑并[1,2-a]吡嗪(2.37g,8.57毫摩尔)。将反应混合物在85℃在压力管中搅拌过夜。将物质用饱和碳酸氢钠淬灭，用DCM(120mL x 3)萃取，将有机层合并，并用水(120mL x 3)洗涤，经无水碳酸钠干燥并浓缩。将粗物质使用120gIsco柱纯化并使用0-60％(10％MeOH/DCM)的阶梯式梯度洗脱。将所需的级分合并，并浓缩，得到标题化合物III。

(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯IV：将6-溴-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺III(1000mg,2.33mmol)、二碳酸二叔丁酯(1016.72mg,4.66mmol)和N,N-二甲基吡啶-4-胺(21.34mg,0.17mmol)在DCM(1.01ml)中搅拌并在65℃回流3小时。将反应混合物用100mL DCM稀释，用H₂O洗涤(x3)，干燥，过滤并浓缩。将粗物质溶解在最少量DCM中，加载至预加载的氧化硅加载器上并使用0-30％MeOH/DCM历经20柱体积从40g柱上洗脱下来。将所需的级分合并，并浓缩，得到标题化合物。将该化合物在实施例2中使用。

4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基(6-(三丁基锡烷基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基甲酸叔丁酯V：在350mL p-管中，将6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯IV(8150mg,15.39mmol)、1,1,1,2,2,2-六丁基二锡烷(11.67ml,23.09mmol)、四(三苯基膦)钯(889.43mg,0.77mmol)和四丁基碘化铵(5686.03mg,15.39mmol)在二噁烷(62ml)中混合，并加热至110℃过夜。根据LCMS，无起始物质剩余。将反应混合物吸附至硅藻土上，并使用0-10-20-30-100％(50％EtOAc/Hex-Hex)梯度(在50％保持10-15柱体积)历经50-60柱体积从160g氧化铝柱上洗脱下来，得到标题化合物V。将该化合物在实施例1和2中使用。

中间体1.02.(6-溴-5-甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯X的制备

6-甲基吡嗪-2-胺VI：在0℃，向无水氯化锌(II)(26.3g,193mmol)在THF(150mL)中的溶液滴加3M甲基溴化镁的乙醚溶液(129mL)，历时1小时。然后添加[1,3-双(二苯基膦基)丙烷]氯化镍(II)(2.08g,3.85mmol)，并将混合物温热至室温。向上面的混合物添加6-氯-2-氨基吡嗪(5.00g,38.6mmol)在无水THF(25mL)中的溶液，并将反应混合物在氮气气氛下在回流下搅拌6小时。然后，将混合物冷却至室温，然后冷却至0℃并用饱和氯化铵水溶液(50mL)小心淬灭。将有机层分离并经硫酸钠干燥。将干燥剂过滤并在减压下浓缩滤液，得到粗的6-甲基吡嗪-2-胺VI，其不经纯化就用于后续步骤中：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ：7.63(s,1H),7.53(s,1H),4.96(bs,2H),2.16(s,3H)。

3,5-二溴-6-甲基吡嗪-2-胺VII：在10℃，历时15分钟向6-甲基吡嗪-2-胺VI(2.00g,18.3mmol)在THF(40mL)中的溶液分批添加N-溴琥珀酰亚胺(6.70g,37.6mmol)，并在搅拌下将混合物温热至室温。在2小时之后，将反应混合物在减压下浓缩，并将所得残留物通过柱色谱法(硅胶,梯度,己烷至EtOAc)纯化，得到3,5-二溴-6-甲基吡嗪-2-胺VII：¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ：4.93(bs,2H),2.38(s,3H)。

6,8-二溴-5-甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪VIII：将2-溴-1,1-二乙氧基乙烷(3.21mL,20.7mmol)和48％氢溴酸水溶液(1.0mL)的混合物在回流下搅拌2小时。然后将反应混合物冷却至室温并用碳酸氢钠处理，直到气体逸出停止。过滤混合物，并将滤液用乙醇(15mL)稀释。向此混合物添加3,5-二溴-6-甲基吡嗪-2-胺VII(3.00g,11.2mmol)，并将反应混合物在回流下搅拌16小时。然后，将反应混合物冷却至室温并在减压下浓缩至约10mL的体积。将悬浮液过滤并用冷乙醇(5mL)洗涤滤饼。然后将滤饼吸收至水(50mL)中并用碳酸钾将pH调节至～8。将所得悬浮液过滤，并将滤饼在真空下干燥至恒定重量，得到6,8-二溴-5-甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪VIII：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ：7.90(s,1H),7.72(s,1H),2.74(s,3H)。

6-溴-5-甲基-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺IX：化合物IX是从6,8-二溴-5-甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪VIII制备的，使用如在中间体实施例1.01中对于制备6-溴-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺III所述的方法。

(6-溴-5-甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯X：化合物X是从6-溴-5-甲基-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺IX制备的，使用如在中间体实施例1.01中对于制备(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯IV所述的方法。将该化合物在实施例4中使用。

实施例1-7的合成

实施例1 6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(1)的制备

2-双(叔丁氧基羰基)氨基-6-溴-3-氯吡嗪XI：将6-溴-3-氯吡嗪-2-胺(2000mg,9.59mmol)、三乙胺(3.99ml,28.78mmol)、二碳酸二叔丁酯(4188.12mg,19.19mmol)和N,N-二甲基吡啶-4-胺(87.91mg,0.72mmol)相继溶解在DCM(48ml)中。将反应混合物在室温搅拌过夜。将粗物质用水洗涤，干燥，过滤并浓缩。将粗物质溶解在最少的DCM中并加载至25g预填充硅胶加载器上并使用0-30％MeOH/DCM从40g柱上洗脱下来。将标题化合物XI分离并通过LCMS和NMR鉴别。通过NMR观察，产物为单和双boc-保护的物质的混合物，主要为双boc-保护的物质。

叔丁氧基羰基(6-(8-((叔丁氧基羰基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)-3-氯吡嗪-2-基)氨基甲酸叔丁酯XII：将在1,4-二噁烷(11.27ml)中的4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基(6-(三丁基锡烷基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基甲酸叔丁酯V(1000mg,1.4mmol)、2-双(叔丁氧基羰基)氨基-6-溴-3-氯吡嗪XI(552mg,1.35mmol)和PdCl₂(PPh₃)₂(142.77mg,0.20mmol)在微波中在140℃辐射20分钟。将反应混合物吸附至硅藻土上并使用0-10-100％(30％MeOH/DCM)历经20柱体积从40g Gold Isco柱上洗脱下来。将级分34-39收集并浓缩。根据NMR，将标题化合物XII鉴别并分离。

(6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XIII：在微波小瓶中，将叔丁氧基羰基(6-(8-((叔丁氧基羰基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)-3-氯吡嗪-2-基)氨基甲酸叔丁酯XII(300mg,0.44mmol)、甲基硼酸(794.39mg,13.27mmol)、四(三苯基膦)钯(51.12mg,0.04mmol)和2M Na₂CO₃(0.44ml)在DME(1.77ml)中混合，并在微波中在150℃辐射20分钟。使用25％MeOH/DCM和水对反应实施后处理。将有机层合并，干燥，过滤并浓缩。将粗物质加载至硅胶上，并使用0-5-15-25-50％(30％MeOH/DCM)历经45柱体积从40g Gold柱上洗脱下来。浓缩所需的级分，得到作为次要产物的(6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XIII和作为不可分离的混合物的所需的最终化合物1(总共208mg)，并用于TFA反应中。

6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(1)：向6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XIII(48mg,0.09mmol)和6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(1,160mg,0.35mmol)在DCM(2.5ml)中的溶液中添加TFA(0.16ml,2.15mmol)。向反应混合物中加入另外的TFA(0.48ml，6.5mmol)以确保反应完成。然后将反应混合物冷却至0℃并用饱和NaHCO₃淬灭，然后用DCM(5ml x 3)萃取，并将合并的有机层用水(5ml x 2)、盐水(5ml x 1)洗涤，干燥(Na₂SO₄)，并浓缩得到粗产物。将粗物质吸附至硅胶上，并使用0-15-25-40-100％(30％MeOH/DCM)从24g Gold Isco柱上洗脱下来。将所需的级分合并，并浓缩，得到所需的化合物。LCMS-ESI⁺(m/z)：[M+H]⁺：458.22.¹H NMR(300MHz,d₆-DMSO)δ：9.48(s,1H),8.54(s,1H),8.41(s,1H),8.11(s,1H),7.95(d,2H),7.6(s,1H),6.98(d,2H),6.2(s,2H),4.58-4.45(dt,4H),3.3(m,1H),3.14(t,4H),2.50-2.4(dt,4H),2.33(s,1H)。或者，可将化合物XII直接用于该步骤并类似地进行脱保护以提供5-氯吡嗪取代的类似物。

实施例2.6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(2)的制备

2-双(叔丁氧基羰基)氨基-6-溴吡嗪XIV：向6-溴吡嗪-2-胺(5g,28.7mmol)和二碳酸二叔丁酯(25.09g,114.94mmol)的混合物中加入DCM(10ml)，随后加入DMAP(0.351g,29mmol)。将该加热至55℃保持1小时，冷却至室温，将反应混合物在水和DCM之间分配，在硅胶上纯化并浓缩，得到2-双(叔丁氧基羰基)氨基-6-溴吡嗪XIV。LCMS-ESI⁺(m/z)：[M+H]⁺：374.14.¹H NMR(DMSO)δ：8.84(d,2H),1.39(s,18H)。

(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XVI–化学A路线：将4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基(6-(三丁基锡烷基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基甲酸叔丁酯V(215mg,0.291mmol)与2-双(叔丁氧基羰基)氨基-6-溴吡嗪XIV(217.58mg,0.581mmol)、双(三苯基膦)二氯化钯(II)(30.61mg,0.044mmol)和1,4-二噁烷(5ml)混合。将反应混合物在微波反应器中在120℃搅拌30分钟。将反应混合物用饱和KF淬灭，用EtOAc萃取，在硅胶上纯化，用EtOAc洗脱。将所需的级分合并，并浓缩，得到100mg(46％收率)的(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XVI。LCMS-ESI⁺(m/z)：[M+H]⁺：744.4.¹H NMR(300MHz d₆-DMSO)δ：9.37(s,1H),9.18(s,1H),8.77(s,1H),8.33(d,1H),7.87(d,1H),7.28-7.25(d,2H),6.92-6.89(d,2H),4.55-4.41(m,4H),3.4(m,1H),3.14-3.11(m,4H),2,37-2.34(m,4H),1.37(s,18H),1.3(s,9H)。

(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XVI–化学B路线：步骤1：向干燥的250mL圆底烧瓶添加2-双(叔丁氧基羰基)氨基-6-溴吡嗪XIV(1.0g,1.0当量,2.67mmol)、KOAc(790mg,8.02mmol,3.0当量)、4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-二(1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷)(750mg,2.94mmol,1.1当量)、Pd(dba)(171mg,0.187mmol,0.07当量)和X-phos(128mg,0.267mmol,0.1当量)，然后添加1,4-二噁烷(25mL)，并将溶液超声处理5分钟，然后用氮气吹洗5分钟。然后将具有内容物的烧瓶置于氮气气氛下并在110℃加热90分钟。一旦通过LCMS观察到实现了向硼酸频哪醇酯的完全转化，则将反应混合物从热源移除并冷却至室温。一旦冷却，将反应内容物通过硅藻土过滤，并用3x 20mL EtOAc洗涤滤饼。然后将所得溶液浓缩至深红色-橙色浆液，从而得到N,N-双(叔丁氧羰基)6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡嗪-2-胺XV，其直接用于后续步骤中。

步骤2：将新鲜形成的N,N-双(叔丁氧羰基)6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡嗪-2-胺XV(2.67mmol，基于100％转化，2.0当量，基于溴化物)溶解在20ml 1,2-二甲氧基乙烷中，并向此溶液添加(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯IV(707mg,1.34mmol,1.0当量)、Na₂CO₃(283mg,2.67mmol,2.0当量)、Pd(PPh₃)₄(155mg,0.134mmol,0.1当量)和水(10mL)，并将溶液使用氮气脱气5分钟。然后将反应置于N₂气氛下并在110℃加热90分钟。LCMS显示溴化物起始物质完全消耗，将反应混合物从热源移除并冷却至室温。将反应混合物用100mL水和100mL 20％MeOH/DCM稀释，将有机层回收，用1x饱和NaHCO₃、1x饱和盐水萃取，然后经Na₂SO₄干燥。然后将溶液过滤并浓缩至橙色-红色固体。然后将样品在温热MeOH中浆化，超声处理，然后过滤，用2x 20mL冷MeOH洗涤，然后将奶油色固体在高真空下干燥过夜，得到905mg的(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XVI。

6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(2)：向(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XVI(200mg,0.269mmol)在DCM(2ml)中的溶液添加TFA(0.5ml,6.578mmol)。将反应混合物在室温搅拌16小时，添加饱和碳酸氢钠，用EtOAC萃取并在硅胶上纯化，用5％MeOH/EtOAc,20％MeOH/EtOAc洗脱。将所需的级分合并，并浓缩，得到标题化合物2。LCMS-ESI⁺(m/z)：[M+H]⁺：444.2.¹H NMR(300MHzd₆-DMSO)δ：9.5(s,1H),8.588(s,1H),8.47(s,1H),8.12(d,1H),7.95-7.92(d,2H),7.88(s,1H),7.62(s,1H),6.99-6.96(d,2H),6.46(s,2H),4.57-4.53(m,2H),4.48-4.44(m,2H),3.43(m,1H),3.15-3.12(m,4H),2.41-2.38(m,4H)。

实施例2–可替代的合成

{6-[8-({4-[4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基]苯基}氨基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基]吡嗪-2-基}亚氨基二碳酸二叔丁酯：

向720L反应器中加入(6-溴吡嗪-2-基)亚氨基二碳酸二叔丁酯(18.5kg,1.41当量,49mol)、双(频哪醇)二硼(13.8kg,1.56当量,54mol)、丙酸钾(11.9kg,3.02当量,106mol)和双(二叔丁基(4-二甲基氨基苯基)膦)二氯化钯(1.07kg,0.0043当量,1.5mol)，随后加入脱气的甲苯(173L)。将混合物脱气，然后在65℃下加热直到通过UPLC认为反应完全(0％2-((6-溴吡嗪-2-基)(叔丁氧基羰基)氨基)-2-氧代乙酸叔丁酯)。反应完成后，将反应冷却至23℃。一旦冷却，加入6-溴-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(15.0kg,1.00当量,35mol)，将混合物脱气。然后将使用水(54L)和碳酸钾(20.6g，4.26当量，149mol)制备的脱气碳酸钾水溶液加入到反应混合物中，并将反应器内容物脱气。将反应器内容物在65℃下加热直到通过UPLC认为反应完全(1％6-溴-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺)。反应完成后，将反应冷却至24℃。

将冷却的混合物浓缩，然后用二氯甲烷(300L)稀释，转移至1900L反应器中，并用二氯甲烷(57L)冲洗。加入N-乙酰基-L-半胱氨酸(3.8kg)，将混合物搅拌15小时。然后加入水(135L)，将混合物过滤并用二氯甲烷(68L)冲洗。回收有机层，并用水(68L)和氯化钠(7.5kg)制备的盐水溶液洗涤。

将所得有机层经过精密过滤(polish filtered)，然后浓缩，缓慢加入叔丁基甲基醚(89.9kg)，保持温度为31℃。将内容物冷却至0℃并老化，然后过滤并用叔丁基甲基醚(32.7kg)冲洗，并在40℃下干燥，得到17.2kg的{6-[8-({4-[4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基]苯基}氨基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基]吡嗪-2-基}亚氨基二碳酸二叔丁酯。

LCMS-ESI⁺(m/z)：[M+H]⁺：644.3.¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ：9.43(s,1H),8.58(s,1H),8.53(s,1H),8.02(s,1H),7.84(m,2H),7.63(d,1H),7.61(d,1H),7.04(m,2H),4.71(m,4H),3.59(m,1H),3.27(m,4H),2.55(m,4H),1.46(s,18H)。

6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺琥珀酸盐(实施例2)：

向{6-[8-({4-[4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基]苯基}氨基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基]吡嗪-2-基}亚氨基二碳酸二叔丁酯(225g,0.35mol,1摩尔当量)在水(12份)中的浆液中加入硫酸(3.1份,6.99mol,20摩尔当量)的水(5份)溶液。将反应加热至约40℃，在此温度下搅拌约4小时，此时反应被认为是完全的。将反应混合物冷却至约22℃，加入丙酮(3份)，加入碳酸钠(4.1份，8.75摩尔，25.0摩尔当量)在水(15份)中的溶液。将得到的浆液过滤，将湿滤饼分批用水(4×1份)洗涤，然后用叔丁基甲基醚(4份)洗涤。将湿滤饼(实施例2游离碱)在约60℃干燥。向2-丙醇中的干燥实施例2的游离碱(2.3份)浆液中加入琥珀酸(基于分离的实施例2游离碱：0.43份，1.6摩尔当量)在2-丙醇(15份)中的溶液。将所得浆液加热至约40℃，在此温度下搅拌约2小时，然后冷却至约22℃，然后搅拌约16小时。将浆液在约22℃下过滤，将湿滤饼用2-丙醇(5份)洗涤，在约60℃下干燥以得到产物。

LCMS-ESI⁺(m/z)：[M+H]⁺：620.65.¹H NMR(400MHz d₆-DMSO)δ：12.2(宽单峰,1.5H),9.58(s,1H),8.63(s,1H),8.50(s,1H),8.15(s,1H),7.95(d,2H),7.90(s,1H),7.64(s,1H),7.00(d,2H),6.50(s,2H),4.52(dd,4H),3.45(m,1H),3.19(m,4H),2.40(m,10H)。

实施例3.(R)-(4-(4-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)苯基)吗啉-2-基)甲醇(3)的制备

(R)-(4-(4-((6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)苯基)吗啉-2-基)甲醇XVII：在装配有冷凝器的250mL圆底烧瓶中加入6,8-二溴咪唑并[1,2-a]吡嗪(2000mg，7.22mmol)，加入30mL异丙醇，然后加入N,N-二异丙基乙胺(2.52ml，14.44mmol)和(R)-(4-(4-氨基苯基)吗啉-2-基)甲醇(1504.12mg，7.22mmol)。将反应加热至回流(油浴95℃)过夜。将反应冷却，过滤收集沉淀，用异丙醇洗涤，然后用己烷洗涤，得到所需化合物XVII。

(R)-(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(2-(((叔丁氧基羰基)氧基)甲基)吗啉代)苯基)氨基甲酸叔丁酯XVIII：在250mL圆底烧瓶中加入(R)-(4-(4-((6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)苯基)吗啉-2-基)甲醇XVII(2.80g,6.9mmol)，并加入DCM，随后加入三乙胺(2.9mL,2.1g,20.8mmol)、DMAP(63g,0.52mmol)和二碳酸二叔丁酯(3.8g,17.3mmol)。将反应物搅拌过夜，然后用DCM和水稀释，分离，用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩。将粗物质通过色谱法纯化：ISCO 40g硅胶，25g硅胶装载器，用0-100％EtOAc/己烷洗脱，得到化合物XVIII。

(R)-(4-(2-(((叔丁氧基羰基)氧基)甲基)吗啉代)苯基)(6-(三丁基锡烷基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基甲酸叔丁酯XIX：根据实施例中间体1.01的类似方法使(R)-(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(2-(((叔丁氧基羰基)氧基)甲基)吗啉代)苯基)氨基甲酸叔丁酯XVIII反应，得到(R)-(4-(2-(((叔丁氧基羰基)氧基)甲基)吗啉代)苯基)(6-(三丁基锡烷基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基甲酸叔丁酯XIX。

(R)-(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(2-(((叔丁氧基羰基)氧基)甲基)吗啉代)苯基)氨基甲酸叔丁酯XX：根据实施例2中所述的化学A的类似方法，使(R)-(4-(2-(((叔丁氧基羰基)氧基)甲基)吗啉代)苯基)(6-(三丁基锡烷基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基甲酸叔丁酯XIX与2-双(叔丁氧基羰基)氨基-6-溴吡嗪XIV反应，得到所需的化合物(R)-(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(2-(((叔丁氧基羰基)氧基)甲基)吗啉代)苯基)氨基甲酸叔丁酯XX。

(R)-(4-(4-((6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)苯基)吗啉-2-基)甲醇(3)：将在DCM中的(R)-(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(2-(((叔丁氧基羰基)氧基)甲基)吗啉代)苯基)氨基甲酸叔丁酯XX(460mg,0.56mmol)添加至圆底烧瓶，并添加TFA(1.29ml,16.85mmol)。反应在搅拌～5小时之后部分完成。添加另外的10当量TFA并搅拌过夜，然后在减压下浓缩。添加10％MeOH/DCM(～100mL)和饱和碳酸氢钠水溶液，并搅拌15分钟，分离，用～100mL 10％MeOH/DCM萃取。将有机层合并，用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤，并在减压下浓缩并在真空下干燥。将所得固体用DCM研磨，经过滤收集固体并在真空下干燥，得到化合物3。LCMS-ESI⁺(m/z)：[M+H]⁺：419.2.¹H NMR(300MHz d₆-DMSO)δ：9.57(s,1H),8.59(s,1H),8.47(s,1H),8.13(d,J＝1.2Hz,1H),8.06–7.90(m,2H),7.87(s,1H),7.62(d,J＝1.1Hz,1H),7.05–6.93(m,2H),6.49(s,2H),4.78(t,J＝5.8Hz,1H),3.98–3.87(m,1H),3.71–3.36(m,7H),2.63(td,J＝11.7,3.4Hz,1H),2.37(dd,J＝12.1,10.5Hz,1H)。相应的(S)异构体或者化合物的外消旋混合物在第一步骤中分别使用(S)-(4-(4-氨基苯基)吗啉-2-基)甲醇或者(4-(4-氨基苯基)吗啉-2-基)甲醇的外消旋混合物类似地制备。

实施例4.6-(6-氨基吡嗪-2-基)-5-甲基-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(4)的制备

(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)-5-甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XXI：根据如实施例2中所述的化学B的方法，将(6-溴-5-甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯X与XV反应，得到所需的化合物XXI。

6-(6-氨基吡嗪-2-基)-5-甲基-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(4)：通过实施例2中所述的类似方法，将(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)-5-甲基咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XXI脱保护，得到所需的化合物4。LCMS-ESI⁺(m/z)：[M+H]⁺：458.32.¹H NMR(300MHz,d₆-DMSO)δ：9.28(s,1H),8.28(s,1H),8.04(s,1H),7.89(d,2H),7.83(s,1H),7.7(s,1H),6.91(d,2H),6.46(s,2H),4.6-4.4(dt,4H),3.43(m,1H),3.1(t,4H),2.49(s,3H),2.4(t,4H)。

实施例5.2-(5-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-2-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯氧基)乙醇(5)的制备

2-(2-(2-氟-5-硝基苯氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃XXII：将2-氟-5-硝基苯酚(4g,25mmol)、2-(2-溴乙氧基)四氢-2H-吡喃(4.4mL,28mmol)和碳酸钾(4.2g 30mmol)在DMF(50mL)中的混合物在50℃搅拌16小时。将反应混合物冷却至室温，用EtOAc和H₂O稀释。将含水层分离并用EtOAc萃取。将合并的有机萃取液用H₂O(5次，以除去DMF)和盐水洗涤，并经硫酸钠干燥。将所得残留物通过柱色谱法ISCO Rf(40g柱)用100％己烷–1:1己烷:EtOAc的梯度洗脱纯化，得到2-(2-(2-氟-5-硝基苯氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃XXII。

1-(4-硝基-2-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪XXIII：将2-(2-(2-氟-5-硝基苯氧基)乙氧基)四氢-2H-吡喃XXII(1550mg,5.43mmol)、1-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪(772mg,5.43mmol)和碳酸钾(1126.41mg,8.15mmol)在NMP(6mL)中的混合物在100℃搅拌8小时。将含水层分离并用EtOAc萃取。将合并的有机萃取液用H₂O(5次，以除去NMP)和盐水洗涤并经硫酸钠干燥。将所得残留物通过柱色谱法ISCORf(24g柱)用100％DCM–60:35:5DCM:Et₂O:MeOH的梯度洗脱纯化，得到1-(4-硝基-2-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪XXIII。

4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯胺XXIV：在500-mL Parr氢化瓶中，向1-(4-硝基-2-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)-4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪XXIII(2100mg,5.1mmol)在乙醇(50mL)中的悬浮液添加10％Pd/C(50％湿的,390mg干重)。将瓶抽空，用氢气填充至50psi的压力并在Parr氢化设备上在室温振摇2小时。将反应混合物过滤，并用乙醇洗涤。将滤液真空浓缩，得到4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯胺XXIV。

6-溴-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺XXV：向4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯胺XXIV(619mg,2.17mmol)和6,8-二溴咪唑并[1,2-a]吡嗪(601mg,2.2mmol)在IPA(15mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(0.95ml,5.43mmol)。将混合物在110℃搅拌16小时。然后，添加DCM(10mL)和饱和NaHCO₃水溶液(15mL)。将水层分离并用DCM(2×10mL)萃取。将合并的有机萃取液用盐水(10mL)洗涤并经硫酸钠干燥。将所得残留物通过柱色谱法ISCO Rf(24g柱)，用100％DCM–60:35:5DCM:Et₂O:MeOH的梯度洗脱纯化，得到6-溴-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺XXV。

(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XXVI：根据中间体实施例1.01中所述的类似方法(III转化成IV)，将6-溴-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺XXV(1.2g,2.4mmol)反应，得到(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XXVI。

(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XXVII：根据如实施例2中所述的化学B的方法，将(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XXVI与XV反应，得到所需的化合物(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XXVII。

2-(5-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-2-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯氧基)乙醇(5)：通过实施例2中所述的类似方法，将化合物(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XXVII(313mg,0.35mmol)脱保护，得到2-(5-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-2-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯氧基)乙醇(5)。LCMS-ESI⁺(m/z)：[M+H]⁺：504.3.¹H NMR(300MHz,d₆-DMSO)δ：9.52(s,1H),8.61(s,1H),8.51(s,1H),8.14(d,J＝1.1Hz,1H),7.89(s,1H),7.81(d,J＝2.3Hz,1H),7.74–7.60(m,2H),6.90(d,J＝8.6Hz,1H),6.47(s,2H),5.74(s,1H),4.86–4.76(m,1H),4.50(dt,J＝25.6,6.3Hz,4H),4.04(t,J＝5.1Hz,2H),3.73(q,J＝5.1Hz,2H),3.51–3.42(m,1H),3.02(s,4H),2.40(s,4H)。

实施例6. 2-((4-(4-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)甲基)丙-1,3-二醇(6)的制备

氧杂环丁烷-3-甲醛XXVIII：在配有搅拌棒的圆底烧瓶中，将氧杂环丁烷-3-基甲醇(2.00g,22.7mmol)溶解在DCM(50mL)中，并一次性添加戴斯-马丁高碘烷(10.67g,28.38mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。将固体通过硅藻土过滤，并用DCM(3mL x 5)洗涤。将滤液移除并真空浓缩，将所得粗的氧杂环丁烷-3-甲醛XXVIII直接用于后续步骤中。

1-(4-硝基苯基)-4-(氧杂环丁烷-3-基甲基)哌嗪XXIX：向配有搅拌棒的圆底烧瓶中添加氧杂环丁烷-3-甲醛XXVIII(0.977g,11.35mmol)、在DCM(100mL)中的1-(4-硝基苯基)哌嗪(1.18g,5.68mmol)和在DCM(2mL)中的HOAc(1.70g,28.38mmol)。在5分钟之后，添加NaBH(OAc)₃(24.06g,113.05mmol)。将所得混合物在室温搅拌2小时。将大部分挥发物真空除去。添加DCM(200mL)，然后添加饱和NaHCO₃水溶液(20mL)，并将所得混合物搅拌20分钟。将有机相分离，用饱和NaHCO₃水溶液(20mL x 3)、盐水(20mL x 1)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并真空除去溶剂。将残留物通过硅胶柱(MeOH：DCM＝0：100至5：95至25：75)，得到所需的化合物XXIX。

4-(4-(氧杂环丁烷-3-基甲基)哌嗪-1-基)苯胺XXX：向配有搅拌棒的圆底烧瓶中添加1-(4-硝基苯基)-4-(氧杂环丁烷-3-基甲基)哌嗪XXIX(3.20g,11.54mmol)、乙醇(60mL)和水(60mL)。添加铁(4.51g,80.77mmol)和氯化铵(4.32g,80.77mmol)后，将反应混合物在80℃加热1小时，然后通过硅藻土过滤并用DCM(5mL x 5)洗涤。将所得滤液用DCM(20mL x 3)萃取。将合并的有机萃取液用水(20mL x 2)、盐水(20mL x 1)洗涤，经Na₂SO₄干燥，并真空浓缩。得到所需的4-(4-(氧杂环丁烷-3-基甲基)哌嗪-1-基)苯胺XXX。

6-溴-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基甲基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺XXXI：向配有搅拌棒的密封管中添加4-(4-(氧杂环丁烷-3-基甲基)哌嗪-1-基)苯胺XXX(1.19g,4.81mmol)、6,8-二溴咪唑并[1,2-a]吡嗪(1.33g,4.81mmol)、异丙醇(24.1mL)和二异丙基乙胺(1.37g,10.58mmol)，并将反应混合物在100℃加热过夜。真空除去大部分溶剂并将DCM(200mL)添加至混合物。将溶液用H₂O(20mL x 2)、盐水(20mL x 1)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并真空除去溶剂。将所得残留物通过硅胶柱(MeOH：DCM＝5：95)，得到作为所需的化合物XXXI的浅红色固体，0.692g。

(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(1-(氧杂环丁烷-3-基甲基)哌啶-4-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XXXII：向配有搅拌棒的圆底烧瓶中添加6-溴-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基甲基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺XXXI(560mg,1.27mmol)、DCM(11mL)、二碳酸二叔丁酯(414.4mg,1.90mmol)和三乙胺(640.5mg,6.33mmol)。将反应混合物在50℃加热过夜。添加DCM(200mL)，将所得溶液用水(20mL x 2)、盐水(20mL x 1)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并真空除去溶剂。进行柱色谱法处理，得到为黄色固体的所需化合物XXXII。

(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基甲基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XXXIII：向配有搅拌棒的圆底烧瓶中添加(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基甲基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XXXII(150mg,0.276mmol)、在DME(2.3mL)中的N,N-双(叔丁氧羰基)6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡嗪-2-胺XV(255.8mg,0.607mmol)、Pd(PPh₃)₄(16.0mg,0.14mmol)、Na₂CO₃水溶液(1.0N,0.91mL,0.91mmol)，和DME(2mL)。将混合物在75℃加热2小时，然后添加DCM(200mL)，将所得混合物用水(30mL x 3)、盐水(30mL x1)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并真空除去溶剂。通过硅胶柱(MeOH：DCM＝5：95)纯化，得到所需的化合物XXXIII。

2-((4-(4-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)甲基)丙-1,3-二醇(6)：向(6-(6-(双(叔丁氧基羰基)氨基)吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基甲基)哌嗪-1-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XXXIII(250mg,0.33mmol)在DCM(30mL)中的溶液添加TFA(940.3mg,8.25mmol)。将所得混合物在室温搅拌过夜。再次添加TFA(752.2mg,6.60mmol)，并在室温搅拌过夜。真空除去大部分溶剂，添加DCM(200mL)和饱和NaHCO₃水溶液(30mL)，并将所得混合物搅拌30分钟。将有机相分离，用饱和NaHCO₃水溶液(20mL x 4)、盐水(20mL x 1)洗涤。用DCM(30mL x 2)萃取水相。将合并的有机相用盐水(20mL x 1)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤，并真空除去溶剂。将粗物质在ISCO柱上纯化(MeOH：DCM＝0:100至5:95至7.5：92.5至25：75)，以洗脱所需的化合物。得到两种化合物，第一种是氧杂环丁烷化合物；另一种是所需的化合物6。LCMS-ESI⁺(m/z)：[M+H]⁺：476。¹H NMR(300MHz,d₆-DMSO)δ：9.51(s,1H),8.60(s,1H),8.49(s,1H),8.14(d,J＝1.5Hz,1H),7.95(d,J＝9Hz,2H),7.90(s,1H),7.64(s,1H),6.99(d,J＝9Hz,2H),6.48(s,2H),4.51(宽单峰,2H),3.43(d,J＝6Hz,4H),3.12(宽多重峰,4H),2.54(宽多重峰,4H),2.34(d,J＝7.2Hz,2H),1.83(m,1H)。

实施例7. 2-(5-((6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-2-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯氧基)乙醇(7)的制备

叔丁氧基羰基(6-(8-((叔丁氧基羰基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)氨基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)-3-氯吡嗪-2-基)氨基甲酸叔丁酯XXXIV：向配有回流冷凝器的烧瓶中添加(6-溴咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)氨基甲酸叔丁酯XXVI(如实施例5所述制备)(352mg,0.52mmol)、2-(双-boc-氨基)-3-氯-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)吡嗪(通过与实施例2中用于制备化合物XV使用的方法类似的方法制备)(500mg,1.1mmol)、在碳酸钠(1.6mL,1M的H₂O溶液)中的Pd(PPh₃)₄(30mg,0.03mmol)和DME(4.8mL)。将混合物加热至回流并保持1小时。将反应混合物冷却至室温，用DCM和H₂O稀释。将水层分离并用DCM萃取。将合并的有机萃取液用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩。将所得残留物通过柱色谱法ISCO Rf(4g柱)，用100％DCM–100％60/35/5DCM/Et₂O/MeOH的梯度洗脱纯化，合并适当的级分，并浓缩，得到所需的化合物叔丁氧基羰基(6-(8-((叔丁氧基羰基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)氨基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)-3-氯吡嗪-2-基)氨基甲酸叔丁酯XXXIV。

叔丁氧基羰基(6-(8-((叔丁氧基羰基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)氨基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)-3-甲基吡嗪-2-基)氨基甲酸叔丁酯XXXV：向微波小瓶中添加叔丁氧基羰基(6-(8-((叔丁氧基羰基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)氨基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)-3-氯吡嗪-2-基)氨基甲酸叔丁酯XXXIV(258mg,0.28mmol)、甲基硼酸(503mg,8.4mmol)、在碳酸钠(0.8mL,1M的H₂O溶液)中的Pd(PPh₃)₄(32mg,0.03mmol)和DME(2.5mL)。将混合物在150℃加热20分钟。将反应混合物冷却至室温，用DCM和H₂O稀释。将水层分离并用DCM萃取。将合并的有机萃取液用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩。将所得残留物通过柱色谱法ISCO Rf(4g柱)，用100％DCM–100％75/18/7DCM/Et₂O/MeOH的梯度洗脱纯化，得到所需的化合物叔丁氧基羰基(6-(8-((叔丁氧基羰基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)氨基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)-3-甲基吡嗪-2-基)氨基甲酸叔丁酯XXXV。

2-(5-((6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-2-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯氧基)乙醇(7)：向叔丁氧基羰基(6-(8-((叔丁氧基羰基)(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)-3-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基)乙氧基)苯基)氨基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-6-基)-3-甲基吡嗪-2-基)氨基甲酸叔丁酯XXXV(165mg,0.18mmol)在DCM(2.2mL)中的溶液添加TFA(1.1mL,0.11mmol)。将混合物在室温搅拌16小时。将反应混合物用9:1DCM:MeOH和H₂O稀释。将水层分离并用9:1DCM:MeOH萃取。将合并的有机萃取液用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并在减压下浓缩。将所得残留物通过柱色谱法，用100％75/18/7DCM/Et₂O/MeOH-100％70/20/10DCM/Et₂O/MeOH的梯度洗脱纯化，得到所需的化合物2-(5-((6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-2-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯氧基)乙醇(7,56mg,59％)。LCMS-ESI⁺(m/z)：[M+H]⁺：518.2.¹H NMR(300MHz,d₆-DMSO)δ：9.49(s,1H),8.56(s,1H),8.44(s,1H),8.13(d,J＝1.1Hz,1H),7.85–7.66(m,2H),7.62(d,J＝1.1Hz,1H),6.90(d,J＝8.6Hz,1H),6.25(s,2H),4.87–4.77(m,1H),4.50(dt,J＝25.2,6.3Hz,4H),4.04(t,J＝5.1Hz,2H),3.74(q,J＝5.2Hz,2H),3.51–3.39(m,1H),3.10-2.95(m,4H),2.45-2.35(m,4H),2.34(s,3H)。或者，化合物XXXIV可直接用于该步骤并类似地进行脱保护，提供5-氯吡嗪取代的类似物。

单甲磺酸盐和琥珀酸盐形式

本申请实施例2化合物的单甲磺酸盐(MSA)和琥珀酸盐形式的X-射线粉末衍射(XRPD)分析在衍射仪(PANanalytical XPERT-PRO,PANalytical B.V.,Almelo,Netherlands)上使用铜辐射(Cu Kα,)进行。将粉末样品沉积在配有零背景板的铝保持器的中心，由此制备样品用于分析。发生器在45kV伏特和40mA安培操作。使用的狭缝为Soller 0.02rad.,防散射1.0°，和发散。样品旋转速度为2秒。扫描从2至40°2-θ实施。数据分析通过X’Pert Highscore版本2.2c(PANalytical B.V.,Almelo,Netherlands)和X’Pert data viewer版本1.2d(PANalytical B.V.,Almelo,Netherlands)实施。单MSA形式I&II的XRPD图案使用以下的仪器设定得到：45KV,40mA,Cu Kα, 扫描范围2.-40°,步长0.0167°,计数时间：15.875秒。琥珀酸盐形式I&II的XRPD图案使用以下的仪器设定得到：45KV,40mA,Cu Kα, 扫描范围2.-40°,步长0.0084°,计数时间：95.250秒。

实施例2化合物的单甲磺酸盐(MSA)和琥珀酸盐形式的¹H NMR图谱在具有7620AS样品变换器的Varian 400-MR 400MHz仪器上收集。默认的质子参数如下：谱宽：14至-2ppm(6397.4Hz)；弛豫延迟：1秒；采集时间：2.5559秒；扫描或者重复的数目：8；温度：25℃。样品在二甲基亚砜-d₆中制备，除非另作说明。离线分析使用MNova软件进行。

实施例8-6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺单甲磺酸盐形式I

甲磺酸(MSA)盐形式I通过以下方法制备：在室温将6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺(实施例2)与1摩尔当量的甲磺酸(MSA)一起溶解在11体积的丙酮/H₂O(36:64体积％)中。然后历时1小时向溶液添加19体积的丙酮，并将反应器内容物在室温搅拌过夜。

6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺单甲磺酸盐形式I的XRPD分析如上所述进行，并提供US2015/0175616A1(Blomgren等人)的图1中所示的衍射图，具有下表中的峰。

在一种实施方案中，6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺单甲磺酸盐形式I可通过XRPD峰19.7(19.6606)、17.3(17.2746)、17.9(17.8971)、21.6(21.6306)和25.8(25.7805)表征。在又一实施方案中，6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺单甲磺酸盐形式I可通过XRPD峰19.7(19.6606)、17.3(17.2746)、17.9(17.8971)和21.6(21.6306)表征。在另一实施方案中，6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺单甲磺酸盐形式I可通过XRPD峰6.0、6.2、8.6和9.6表征。

如上所述进行的6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺单MSA盐形式I的NMR分析提供：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.57(s,1H),9.60(s,1H),8.62(s,1H),8.47(s,1H),8.17(d,J＝1.2Hz,1H),8.03–7.96(m,2H),7.90(s,1H),7.69(d,J＝1.2Hz,1H),7.09(d,J＝9.0Hz,2H),4.78(p,J＝8.0Hz,4H),4.49(m,1H),4.00–2.8(m,10H),2.32(s,3H)。

实施例9-6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺单甲磺酸盐形式II

6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺单MSA盐形式II通过以下方法制备：在真空烘箱中在～40℃在氮气吹洗下干燥6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺单MSA盐形式I(实施例8)。

6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺单甲磺酸盐形式II的XRPD分析如上所述进行并提供US2015/0175616A1(Blomgren等人)的图5中示出的衍射图谱，具有下表中的峰。

在一种实施方案中，6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺单甲磺酸盐形式II可通过XRPD峰17.3(17.2698)、25.1(25.1384)、20.4(20.4423)、19.6(19.5732)和18.5(18.5264)表征。在另一实施方案中，6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺单甲磺酸盐形式II可通过XRPD峰17.3(17.2698)、25.1(25.1384)、20.4(20.4423)和19.6(19.5732)表征。在另一实施方案中，6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺单甲磺酸盐形式II可通过XRPD峰6.1、6.9、11.0和13.6表征。

如上所述进行的6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺单MSA盐形式II的NMR分析提供：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.61(s,1H),8.63(s,1H),8.47(s,1H),8.19(d,J＝1.2Hz,1H),8.02–7.95(m,2H),7.91(s,1H),7.72(d,J＝1.2Hz,1H),7.13–7.06(m,2H),4.85–4.72(m,4H),4.53–4.45(m,1H),4.30–2.75(m,10H),2.34(s,3H)。

实施例10-6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺琥珀酸盐形式I

6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺琥珀酸盐形式I通过以下方法制备：首先将1.6摩尔当量的琥珀酸溶解在THF中，然后将所述酸性溶液添加至6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺。然后将物质在室温用磁性搅拌棒搅拌过夜。

6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺琥珀酸盐形式I的XRPD分析如上所述进行并提供下表中的峰。

在一种实施方案中，6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺琥珀酸盐形式I可通过XRPD峰16.5、24.5、17.7、28.4和21.8表征。在另一实施方案中，6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺琥珀酸盐形式I可通过XRPD峰16.5、24.5、8.0和8.3表征。

如上所述进行的6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺琥珀酸盐形式I的NMR分析提供：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.12(s,2H),9.48(s,1H),8.59(s,1H),8.48(s,1H),8.12(d,J＝1.1Hz,1H),7.97–7.86(m,3H),7.62(d,J＝1.1Hz,1H),7.01–6.94(m,2H),6.45(s,2H),4.55(t,J＝6.5Hz,2H),4.46(t,J＝6.1Hz,2H),3.49–3.38(m,1H),3.13(t,J＝4.9Hz,4H),2.40(s,10H)。

用于制备6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺琥珀酸盐形式I的方法还使用IPA、丙酮和2-MeTHF作为溶剂重复实施。

实施例11-6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺琥珀酸盐形式II

向6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺游离碱添加10.0份2-丙醇，然后快速搅拌，形成浆液。将琥珀酸(0.43份,1.6摩尔当量)在2-丙醇(15份)中的单独的溶液在环境温度制备并添加至所述浆液。然后将所得浆液在环境温度搅拌约1天。将琥珀酸(0.09份,0.3摩尔当量)在2-丙醇(3份)中的另一溶液添加至所述浆液，并将所得浆液在环境温度搅拌约两天。将琥珀酸(0.27份,1.0摩尔当量)在2-丙醇(8份)中的另外的溶液在环境温度制备并添加至所述浆液，并将所得浆液搅拌约2天。然后将内容物温度调节至40℃并将浆液搅拌约两个小时。然后使内容物返回至环境温度并搅拌约16小时。然后将所得浆液过滤，用2-丙醇(7.0份)洗涤，并在60℃干燥。

6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺琥珀酸盐形式II的XRPD分析如上所述进行并提供具有下表中的峰。

在一种实施方案中，6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺琥珀酸盐形式II可通过XRPD峰25.0(24.9821)、16.3(16.3186)、22.0(21.952)、7.9(7.8958)，和7.6(7.5828)表征。在又一实施方案中，6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺琥珀酸盐形式II可通过XRPD峰25.0(24.9821)、16.3(16.3186)、7.9(7.8958)，和7.6(7.5828)表征。

如上所述进行的6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺琥珀酸盐形式II的NMR分析提供：

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.13(s,2H),9.48(s,1H),8.58(s,1H),8.47z(s,1H),8.12(d,J＝1.1Hz,1H),7.97–7.86(m,3H),7.62(d,J＝1.1Hz,1H),7.02–6.94(m,2H),6.45(s,2H),4.55(t,J＝6.5Hz,2H),4.46(t,J＝6.0Hz,2H),3.44(p,J＝6.3Hz,1H),3.17–3.10(m,4H),2.40(s,10H),1.02(d,J＝6.1Hz,2H)。

生物实施例

实施例12:高通量Syk生物化学测试

Syk活性利用KinEASE(Cisbio)，时间分辨荧光共振能量转移(TR-FRET)免疫分析进行测试。在该测试中，Syk催化XL665-标记的肽底物的磷酸化。铕缀合的磷酸化酪氨酸特异性抗体结合所得到的磷酸化的肽。磷酸化肽的形成通过TR-FRET，利用铕作为供体，XL665作为受体，于2-步终点测试进行定量。简言之，利用Echo 550声学液体分配器(acousticliquid dispenser)将连续稀释于DMSO中的测试化合物递送至Corning白色、小体积、非-结合384孔板。利用Multi-Flo(Bio-Tek Instruments)将Syk酶和底物分配于测试板。该标准的5μL反应混合物含有在反应缓冲液(50mM Hepes,pH 7.0,0.02％NaN₃,0.1％BSA,0.1mM正钒酸盐,5mM MgCl₂,1mM DTT,0.025％NP-40)中的20μM ATP、1μM生物素化的肽、0.015nM的Syk。在室温培养30分钟后，添加5μL终止液和检测溶液(1:200铕穴状化合物标记的抗-磷酸化的肽抗体溶液和125nM链霉亲和素-XL665示踪剂，于50mM Hepes pH 7.0检测缓冲液(含足够的EDTA))。然后将板在室温再培养120分钟，利用Envision 2103多标记读数器(PerkinElmer)读数，分别在340nm/615nm/665nm的激发/发射/FRET发射。在615nm和665nm发射波长的荧光强度表示为比例(665nm/615nm)。抑制百分比如下计算：％抑制＝100x(比例_样品–比例_0％抑制)/(比例_100％抑制–比例_0％抑制)，其中0.1％DMSO(0％抑制)为阴性对照，1μM K252a(100％抑制)用作阳性对照。实施例1-7化合物的活性在下表中提供，证实所述化合物为IC₅₀低于50nM的Syk抑制剂。

实施例13：384孔HTBS全血CD63嗜碱性粒细胞测试

Syk活性与在人全血嗜碱性粒细胞细胞测试(25％血)中通过CD63的表达测得的嗜碱性粒细胞的降低的活化相关地评价。嗜碱性粒细胞活化在人全血中测量，使用Flow CAST试剂盒(Buhlmann Laboratories AG,Baselstrasse,Switzerland)，遵循由制造商提供的方案并进行微小改动。将在肝素中的新鲜人全血收集并在同一天递送(AllCells,Emeryville,CA)。将全血样品用DMSO(最终1％)或者在DMSO中的连续稀释的化合物在37℃孵育60分钟。将嗜碱性粒细胞使用抗-FceRI mAb活化并用抗-CD63-FITC和抗-CCR3-PE在37℃染色20分钟(每孔：将50μL全血与113μL刺激缓冲液、8.5μL抗-FceRI mAb、8.5μL Ab染色剂CCR3-PE/CD63-FITC混合)。将细胞以1000x g离心18分钟并除去150μL/孔的上清液。红血细胞溶解，并将细胞通过2轮细胞溶解固定：将细胞团粒用150μL/孔的1X溶胞缓冲液再悬浮，在室温孵育10分钟，并通过以1200rpm离心5分钟收集细胞团粒。将细胞用150μL/孔的洗涤缓冲液洗涤两次，并再悬浮在最终体积为75μL/孔的洗涤缓冲液中，用于立即进行流式细胞术分析，或者在4℃孵育过夜然后流式细胞术分析。脱粒化(嗜碱性粒细胞活化)通过在CCR3阳性细胞上的CD63表面表达检测。对门控的(gated)嗜碱性粒细胞群中的CD63阳性细胞百分比进行确定并归一化至DMSO(阴性对照)和对照化合物(阳性对照)。实施例1-7化合物的活性在下表中提供，证实所述化合物在降低嗜碱性粒细胞的活化中有效，EC₅₀低于200nM。

实施例14：动力学溶解度

评价了化合物在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中的动力学溶解度。将待测试的化合物以10mM浓度溶解在二甲基亚砜中。将3μl储备液样品用297μl pH7.4的磷酸盐缓冲液(DulBecco磷酸盐缓冲盐水(Sigma-Aldrich D8662)，总体摩尔浓度为0.149M，pH 7.43)稀释。然后将样品在振摇下在37℃孵育24小时，离心并取等分试样并相对于0.1mM的已知标准浓度测试。实施例1-7化合物的动力学溶解度在下表中提供，证实所述化合物在pH 7.4的动力学溶解度大于90μM。

实施例15：人肝细胞稳定性测试

评价了化合物的人血细胞稳定性，作为预测的肝细胞清除率(以L/hr/kg计)。将待测试的化合物稀释至200μM(4μl 10mM DMSO储备液稀释至196μl ACN:H₂O(50:50)中)。普萘洛尔用作阳性对照，以及仅不含肝细胞的缓冲液用作0％对照。将4μl的这些物质用891μlKHB缓冲液(InVitroGRO目录编号Z99074)进一步稀释，以提供2X量配溶液。在24孔板的每孔中，将250μl 2X量配溶液添加至每孔，每孔具有250μl肝细胞(每孔1x 106活细胞/ml)或者用于对照样品的KHB，在孵育期间实现1μM的最终化合物浓度。最终溶剂浓度为0.01％DMSO和0.25％ACN。将培养板置于振荡器上并在37℃,5％CO₂孵育。在0、1、3和6小时收集样品。母体化合物的损失使用LC-MS方法针对标准曲线测定。实施例1-7化合物的活性在下表中提供，显示约0.12L/hr/kg或者更少的肝细胞清除率。

实施例16：与已知Syk抑制剂的比较

使用实施例8-11的测试比较本申请所述化合物与本领域已知化合物。实施例1-7化合物与前述化合物进行比较的数据在下表中提供。从这些结果明显看出，本申请所述化合物作为Syk抑制剂是理想的，相对于已知化合物具有改善的Syk和CD63活性，改善的动力学溶解度(至少约9倍地更易溶)和肝细胞清除率(至少约2倍的更少清除率)。因此，改善的Syk和CD63抑制活性与改善的动力学溶解度和清除率的组合提供了这样的化合物：其预期以改善的药代动力学性质有效地治疗本申请所述疾病。

实施例17-细胞凋亡测定

制备Entospletinib(式I)作为二甲基亚砜(DMSO)中的10mM储备液。在使用前，将entospletinib从在-20℃下在0.75mL聚丙烯管中冷冻的10mM DMSO储备液中解冻。

试剂

将来自3名具有活动性慢性移植物抗宿主病(cGVHD)的受试者和3名具有非活动性cGVHD的受试者的冷冻可存活(Viably-frozen)的外周血单核细胞(PBMC)在110μl RPMI-1640培养基中以每孔1x 106个B细胞接种在96孔板中，所述培养基补充有10％FBS、10mMHEPES、Pen/Strep和2倍连续稀释浓度范围为1.0-0.0078μM的GS-9973。对于未处理的PBMC，将单独的DMSO(用于产生entospletinib储备液的稀释剂)以当量体积用于培养物中作为1.0μM的entospletinib治疗组。然后将细胞在37℃和5％CO₂下孵育48小时，收集，并通过如下所述的流式细胞术分析评估凋亡B细胞的频率。

流式细胞术分析-将培养的PBMC在FACS洗涤缓冲液(含有2％FBS的PBS)中洗涤，然后以推荐浓度再悬浮于含有Fc嵌段(人类TruStain FcX^TM Fc受体阻滞溶液，来自BioLegend，San Diego，CA)的FACS洗涤液中。在冰上孵育15分钟后，将细胞用太平洋蓝^TM缀合的抗人CD19抗体(BioLegend,Inc.)再染色30分钟，然后在冷PBS中洗涤，然后根据制造商的说明书用膜联蛋白V结合缓冲液(膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒-APC，eBioscience,Inc.)进行第二次洗涤。然后将细胞再悬浮于含有APC缀合的膜联蛋白V的膜联蛋白V结合缓冲液中，并在室温下避光孵育15分钟。最后，用冷的膜联蛋白V结合缓冲液洗涤细胞，再悬浮于含有7-AAD(BD Biosciences)的冷的膜联蛋白V结合缓冲液中，保持在冰上，并在FACSCanto^TM流式细胞仪上立即分析。使用FlowJo软件(版本X)分析流式细胞术数据文件以鉴定B细胞，并基于膜联蛋白V和7-AAD染色法确定凋亡细胞的频率。

对于每组患者样品，通过以下比例来确定由每种浓度的entospletinib诱导的B细胞凋亡：％膜联蛋白V+/7-AAD-B细胞(用entospletinib处理的)/％膜联蛋白V+/7-AAD-B细胞(未经处理的)。然后使用双尾、非配对的Student氏t检验(GraphPad Prism软件，版本5)进行比较活动性和非活动性cGVHD组之间的凋亡B细胞比例的统计分析。使用GraphPadPrism软件(GraphPad Software，La Jolla，CA)进行图形显示和曲线拟合分析以确定活动性cGVHD B细胞中的entospletinib凋亡诱导活性的EC₅₀。

结果

将来自3名具有活动性cGVHD的受试者和3名没有cGVHD的HSCT受试者的冷冻可存活的PBMC解冻，并用1.0-0.0078μM浓度范围内的ENTO的2倍连续稀释液孵育48小时。通过流式细胞术测定和定量B细胞凋亡。对于每个受试者样品，数据(表1)在图1中示出，表明entospletinib引起由具有cGVHD的受试者获得的B细胞的凋亡。在具有cGVHD的一个受试者中，B细胞具有低水平的基线细胞凋亡，且entospletinib引起B细胞凋亡的剂量依赖性增加。虽然其他两个cGVHD受试者的样本在体外具有较高的B细胞凋亡基线水平，但是使用entospletinib治疗也可引起B细胞凋亡的增加。来自3个供体的平均结果以相对于媒介物对照的B细胞凋亡的平均倍数增加图示于图2中。数据表明，相对于不具有cGVHD的受试者，使用≥125nM ENTO治疗引起cGVHD样品中B细胞凋亡的统计学显著的剂量依赖性增加。

图1描述了具有cGVHD(空心圆圈)和没有cGVHD(实心圆圈)的受试者的PBMC用ETNO(7.8nM–1.0μM)如所示处理48小时的值。凋亡B细胞被定义为CD19+膜联蛋白V+7AAD-细胞。

图2描述了没有cGVHD(n＝3,实心正方形)和具有cGVHD(n＝3,实心圆圈)的受试者的人PBMC用ETNO(7.8nM-1μM)如所示处理48小时的细胞凋亡。凋亡B细胞被定义为CD19+膜联蛋白V+7AAD-细胞，并相对于单独用媒介物处理的样品绘制细胞凋亡的倍数诱导。统计数据是具有cGVHD的受试者和没有cGVHD的受试者之间的倍数变化的差异。

表1-cGVHD和非活动性cGVHD受试者用Entospletinib处理48小时的凋亡B细胞的频率

在说明书通篇，参考了各种专利、专利申请和其他类型的出版物(例如，期刊文章)。出于所有目的，将本发明所引用的全部专利、专利申请和出版物的公开内容全文引入本发明作为参考。

Claims

1.在人类中治疗移植物抗宿主病的方法，所述方法包括向有需要的人给药药学上有效量的化合物，所述化合物选自式(I)和式(II)化合物、或其药学上可接受的盐或共晶：

其中，在式(II)中：

R¹选自：其中＊表示R¹所连接的式I的所示苯环的碳原子；

R²为H或2-羟基乙氧基；

R³为H或甲基；和

R⁴为H或甲基。

2.抑制GVHD症状发作的方法，所述方法包括向移植同种异体造血干细胞的人类受体给药药学上有效量的化合物，所述化合物选自式(I)和式(II)化合物、或其药学上可接受的盐或共晶：

其中，在式(II)中：

R¹选自：其中＊表示R¹所连接的式I的所示苯环的碳原子；

R²为H或2-羟基乙氧基；

R³为H或甲基；和

R⁴为H或甲基。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述化合物为：

或其药学上可接受的盐或共晶。

4.根据权利要求1或2的方法，其中所述化合物为6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺、或其药学上可接受的盐或共晶。

5.根据权利要求1或2的方法，其中所述化合物为6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺、或其药学上可接受的盐或共晶。

6.根据权利要求1或2的方法，其中所述化合物为(R)-(4-(4-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)苯基)吗啉-2-基)甲醇、或其药学上可接受的盐或共晶。

7.根据权利要求1或2的方法，其中所述化合物为6-(6-氨基吡嗪-2-基)-5-甲基-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺、或其药学上可接受的盐或共晶。

8.根据权利要求1或2的方法，其中所述化合物为2-(5-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-2-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯氧基)乙醇、或其药学上可接受的盐或共晶。

9.根据权利要求1或2的方法，其中所述化合物为2-((4-(4-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)甲基)丙-1,3-二醇、或其药学上可接受的盐或共晶。

10.根据权利要求1或2的方法，其中所述化合物为2-(5-((6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-2-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯氧基)乙醇、或其药学上可接受的盐或共晶。

11.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一项的方法，其中所述GVHD为急性移植物抗宿主病。

12.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一项的方法，其中所述GVHD为慢性移植物抗宿主病。

13.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中任一项的方法，进一步包括向有需要的人给药药学上有效量的一种或多种用于治疗移植物抗宿主病的其它药剂。

14.根据权利要求13的方法，其中所述一种或多种用于治疗移植物抗宿主病的其它药剂选自：泼尼松，甲基泼尼松，口服不可吸收的皮质类固醇，例如布地奈德或二丙酸倍氯米松，免疫调节剂，例如环孢菌素，他克莫司，西罗莫司，霉酚酸酯，噻氯咪索，依木巯，抗胸腺细胞球蛋白，抗-TNF剂，硫唑嘌呤，肌苷5'-单磷酸脱氢酶抑制剂，azodiacarbonide，双吲哚基马来酰亚胺VIII，布喹那，苯丁酸氮芥，CTLA4-Ig，皮质类固醇，环磷酰胺，脱氧精胍菌素，地塞米松，糖皮质激素，来氟米特，巯嘌呤，6-巯基嘌呤，甲氨蝶呤，甲基泼尼松龙，咪唑立宾，咪唑立宾单磷酸盐，莫罗单抗CD3，霉酚酸酯，OKT3，rho(D)免疫球蛋白，维生素D类似物(MC1288)，达珠单抗，英夫利昔单抗，利妥昔单抗，托珠单抗，阿仑珠单抗，甲氨蝶呤，抗胸腺细胞球蛋白，地尼白介素2，Campath-1H，角质化细胞生长因子，阿巴他塞，remestemcel-L，辛二酰苯胺异羟肟酸，喷司他丁，沙利度胺，甲磺酸伊马替尼，环磷酰胺，氟达拉滨，OKT3，美法仑，噻替哌和淋巴细胞免疫球蛋白，抗胸腺细胞和球蛋白。

15.式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶在制备用于治疗人类中的移植物抗宿主病(GVHD)的药物中的用途：

其中，在式(II)中：

R¹选自：其中＊表示R¹所连接的式I的所示苯环的碳原子；

R²为H或2-羟基乙氧基；

R³为H或甲基；和

R⁴为H或甲基。

16.根据权利要求15的用途，其中所述化合物为：

或其药学上可接受的盐或共晶。

17.根据权利要求15的用途，其中所述化合物为6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺、或其药学上可接受的盐或共晶。

18.根据权利要求15的用途，其中所述化合物为6-(6-氨基吡嗪-2-基)-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺、或其药学上可接受的盐或共晶。

19.根据权利要求15的用途，其中所述化合物为(R)-(4-(4-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)苯基)吗啉-2-基)甲醇、或其药学上可接受的盐或共晶。

20.根据权利要求15的用途，其中所述化合物为6-(6-氨基吡嗪-2-基)-5-甲基-N-(4-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-胺、或其药学上可接受的盐或共晶。

21.根据权利要求15的用途，其中所述化合物为2-(5-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-2-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯氧基)乙醇、或其药学上可接受的盐或共晶。

22.根据权利要求15的用途，其中所述化合物为2-((4-(4-((6-(6-氨基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)甲基)丙-1,3-二醇、或其药学上可接受的盐或共晶。

23.根据权利要求15的用途，其中所述化合物为2-(5-((6-(6-氨基-5-甲基吡嗪-2-基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-8-基)氨基)-2-(4-(氧杂环丁烷-3-基)哌嗪-1-基)苯氧基)乙醇、或其药学上可接受的盐或共晶。

24.根据权利要求15、16、17、18、19、20、21、22或23中任一项的用途，其中所述GVHD为急性移植物抗宿主病。

25.根据权利要求15、16、17、18、19、20、21、22或23中任一项的用途，其中所述GVHD为慢性移植物抗宿主病。

26.试剂盒，其包括如权利要求1所定义的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的一种或多种单位剂型，以及包装说明书，其包含用于治疗GVHD的剂型的指示。

27.根据权利要求26的试剂盒，其包括如权利要求1所定义的式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶的一种或多种单位剂型，以及至少一种用于治疗GVHD的另一种药剂的单位剂型。

28.根据权利要求26或27的试剂盒，其中所述化合物为式(I)化合物或其药学上可接受的盐或共晶。

29.根据权利要求26或27的试剂盒，其中所述化合物为式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶。

30.根据权利要求27、28或29中任一项的试剂盒，其中所述至少一种用于治疗移植物抗宿主病的另一种药剂选自：泼尼松，甲基泼尼松，口服不可吸收的皮质类固醇，例如布地奈德或二丙酸倍氯米松，免疫调节剂，例如环孢菌素，他克莫司，西罗莫司，霉酚酸酯，噻氯咪索，依木巯，抗胸腺细胞球蛋白，抗-TNF剂，硫唑嘌呤，肌苷5'-单磷酸脱氢酶抑制剂，azodiacarbonide，双吲哚基马来酰亚胺VIII，布喹那，苯丁酸氮芥，CTLA4-Ig，皮质类固醇，环磷酰胺，脱氧精胍菌素，地塞米松，糖皮质激素，来氟米特，巯嘌呤，6-巯基嘌呤，甲氨蝶呤，甲基泼尼松龙，咪唑立宾，咪唑立宾单磷酸盐，莫罗单抗CD3，霉酚酸酯，OKT3，rho(D)免疫球蛋白，维生素D类似物(MC1288)，达珠单抗，英夫利昔单抗，利妥昔单抗，托珠单抗，阿仑珠单抗，甲氨蝶呤，抗胸腺细胞球蛋白，地尼白介素2，Campath-1H，角质化细胞生长因子，阿巴他塞，remestemcel-L，辛二酰苯胺异羟肟酸，喷司他丁，沙利度胺，甲磺酸伊马替尼，环磷酰胺，氟达拉滨，OKT3，美法仑，噻替哌和淋巴细胞免疫球蛋白，抗胸腺细胞和球蛋白。

31.根据权利要求27、28、29或30中任一项的试剂盒，其中所述化合物为式(I)化合物或其药学上可接受的盐或共晶。

32.根据权利要求27、28、29或30中任一项的试剂盒，其中所述化合物为式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶。

33.根据权利要求1、2、11、12、13或14中任一项的方法，其中所述化合物为式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶，其中R²、R³和R⁴各自为H。

34.根据权利要求1、2、11、12、13或14中任一项的方法，其中所述化合物为式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶，其中R²为H，R³为甲基和R⁴为H。

35.根据权利要求1、2、11、12、13或14中任一项的方法，其中所述化合物为式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶，其中R²为H，R³为H和R⁴为甲基。

36.根据权利要求1、2、11、12、13或14中任一项的方法，其中所述化合物为式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶，其中R²为2-羟基乙氧基，R³为甲基，且R⁴为H。

37.根据权利要求1、2、11、12、13或14中任一项的方法，其中所述化合物为式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶，其中R²为2-羟基乙氧基，R³为甲基，且R⁴为H。

38.根据权利要求1、2、11、12、13或14中任一项的方法，其中所述化合物为式(II)化合物或其药学上可接受的盐或共晶，其中R²为2-羟基乙氧基，R³为H，且R⁴为甲基。