CN107515261A - 一种高效液相色谱法测定辅酶i的方法 - Google Patents

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金永红
郎巧洁
李映峤
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Abstract

本发明属于涉及辅酶I检测领域，提出一种高效液相色谱法测定辅酶I的方法，具体为：通过高效液相色谱法进行梯度洗脱测定辅酶I的浓度，检测波长为254nm；梯度洗脱分为4个阶段，第一阶段洗脱时间为20min；流动相为乙腈；第二阶段洗脱时间为10min，流动相为乙腈和0.2mol/L的乙酸铵溶液；乙腈和乙酸铵的体积比为9:1；第三阶段洗脱时间为15min，流动相为乙腈和0.2mol/L的乙酸铵溶液；乙腈和乙酸铵的体积比为35:65；第四阶段洗脱时间为0.1min，流动相为0.2mol/L的乙酸铵溶液。该方法具有检测结果准确、检测速度快的优点。

Description

一种高效液相色谱法测定辅酶I的方法
技术领域
本发明涉及辅酶I检测领域，特别是一种高效液相色谱法测定辅酶I的方法。
背景技术
人体氧化还原反应中重要的辅酶，出现在细胞很多代谢反应中。作为生物催化反应必不可少的辅酶，参与上千种生理反应，如细胞三羧酸循环(TCA)、脂肪β氧化等，在糖、脂肪、氨基酸等营养物质的代谢利用过程中具有重要意义。同时亦是辅酶I消耗酶(如NAD+依赖型ADP核糖基转移酶)的唯一底物。这类酶将辅酶I(NAD+)作为底物分解成ADP核糖和烟酰胺(Nam)，在不同细胞中发挥不同生理功能，如参与DNA修复、细胞氧化压力调节等生理功能。
辅酶I现有的国家法定含量检测标准为紫外分光光度法。其缺陷在于，灵敏度较差，专属性不强，重现性不好且不够准确。
发明内容
本发明旨在提供一种检测结果准确、检测速度快的高效液相色谱法测定辅酶I的方法。
其具体方案为：一种高效液相色谱法测定辅酶I的方法，通过高效液相色谱法进行梯度洗脱测定辅酶I的浓度，检测波长为254nm；
梯度洗脱分为4个阶段，第一阶段洗脱时间为20min；流动相为乙腈；
第二阶段洗脱时间为10min，流动相为乙腈和0.2mol/L的乙酸铵溶液；乙腈和乙酸铵的体积比为9:1；
第三阶段洗脱时间为15min，流动相为乙腈和0.2mol/L的乙酸铵溶液；乙腈和乙酸铵的体积比为35:65；
第四阶段洗脱时间为0.1min，流动相为0.2mol/L的乙酸铵溶液。
在上述的高效液相色谱法测定辅酶I的方法中，梯度洗脱过程中，流动相的流速为1ml/min。
在上述的高效液相色谱法测定辅酶I的方法中，检测过程中，柱温为25℃。
在上述的高效液相色谱法测定辅酶I的方法中，进样量为20μl。
在上述的高效液相色谱法测定辅酶I的方法中，所述的方法具体为：
步骤1：对照品溶液配制：取辅酶I对照品10mg,精密称定，加水稀释成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀即得；
步骤2：供试品溶液配制：取辅酶I样品10mg,精密称定，加水稀释成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀即得；
步骤3：测定：待系统稳定后，依次进样1针空白溶液、3针对照品溶液、2针供试品溶液，记录色谱图，并分析得到供试品浓度。
本发明的有益效果在于：
与现有的紫外分光光度法相比，高效液相色谱法测定辅酶I含量，结果更为准确，灵敏度高，重现性好，专属性更强。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
为了更加清楚的对本发明进行说明，列举如下实施例来说明本发明的优越性。
实施例1
高效液相色谱法测定辅酶I的方法包括以下步骤：
1)对照品溶液配制：取辅酶I对照品10mg,精密称定，加水稀释成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀即得。
2)供试品溶液配制：取辅酶I样品10mg,精密称定，加水稀释成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀即得。
3)测定：待系统稳定后，依次进样1针空白溶液、3针对照品溶液、2针供试品溶液，记录色谱图。
色谱条件：
流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.2mol/L乙酸铵溶液
检测波长：254nm
流速：1ml/min
进样量：20μl
柱温：25℃
梯度洗脱时间表如下表1：
表1：梯度洗脱时间表
时间(min) 梯度
0 100％B+0％A
20 90％B+10％A
30 35％B+65％A
45 100％B+0％A
45.1 结束
与现有的紫外分光光度法相比，高效液相色谱法测定辅酶I含量，结果更为准确，灵敏度高，重现性好，专属性更强。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种高效液相色谱法测定辅酶I的方法，其特征在于，通过高效液相色谱法进行梯度洗脱测定辅酶I的浓度，检测波长为254nm；
梯度洗脱分为4个阶段，第一阶段洗脱时间为20min；流动相为乙腈；
第二阶段洗脱时间为10min，流动相为乙腈和0.2mol/L的乙酸铵溶液；乙腈和乙酸铵的体积比为9:1；
第三阶段洗脱时间为15min，流动相为乙腈和0.2mol/L的乙酸铵溶液；乙腈和乙酸铵的体积比为35:65；
第四阶段洗脱时间为0.1min，流动相为0.2mol/L的乙酸铵溶液。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定辅酶I的方法，其特征在于，梯度洗脱过程中，流动相的流速为1ml/min。
3.根据权利要求2所述的高效液相色谱法测定辅酶I的方法，其特征在于，检测过程中，柱温为25℃。
4.根据权利要求3所述的高效液相色谱法测定辅酶I的方法，其特征在于，进样量为20μl。
5.根据权利要求1所述的高效液相色谱法测定辅酶I的方法，其特征在于，所述的方法具体为：
步骤1：对照品溶液配制：取辅酶I对照品10mg,精密称定，加水稀释成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀即得；
步骤2：供试品溶液配制：取辅酶I样品10mg,精密称定，加水稀释成每1ml含0.1mg的溶液，摇匀即得；
步骤3：测定：待系统稳定后，依次进样1针空白溶液、3针对照品溶液、2针供试品溶液，记录色谱图，并分析得到供试品浓度。
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