CN107510705A - 一种水蛭粗提物的冻干保护剂及冻干保存工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水蛭粗提物的冻干保护剂及冻干保存工艺，属水蛭粗提物保护和存储技术领域。其特点是：水蛭粗提物的冻干保护剂由一定质量百分比的海藻糖、PEG2000和甘露醇组成；以水蛭粗提物为基础物质，在500ml水蛭粗提物溶液中，按照海藻糖、PEG2000和甘露醇各自的质量百分比依次、逐步将它们加入，通过本发明的八个步骤方法，大大提高水蛭粗提物冻干品生物活性的稳定性，冻干保护剂制作简单，冻干保护工艺操作方便，保护效果好，水蛭粗提物冻干粉的活性在4℃冰箱内保存一年后，活性损失率由原来的45%左右降低至15%以下。解决了现有水蛭粗提物经过冻干处理后其活性损失率高，活性保存不稳定的问题。

Description

一种水蛭粗提物的冻干保护剂及冻干保存工艺

技术领域

本发明涉及一种水蛭粗提物的冻干保护剂及冻干保存工艺，属水蛭粗提物保护和存储技术领域。

背景技术

现代临床医学利用水蛭粗提物的抗凝活性和抗血栓性来治疗冠心病、心梗和心绞痛等心脑血管疾病，均取得了不错的疗效。对水蛭粗提物提取纯化后通常采用冻干方式保存，研究表明，水蛭粗提物经过冻干处理后保存的活性物，其抗凝血酶和抗血栓及溶栓的作用比水蛭活体的更好。不过，目前水蛭粗提物通过冻干处理后其活性损失率高达45%左右；可见对水蛭粗提物冻干品如何保存其活性物是一个亟待解决的问题。因此，十分有必要研发一种可有效提高水蛭粗提物冻干品生物活性稳定性的冻干保护剂及冻干保存工艺，以利于中医中药学的发展，造福于民。

发明内容

本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提供一种水蛭粗提物的冻干保护剂及冻干保存工艺，大大提高水蛭粗提物冻干品生物活性稳定性，配方简单，冻干保护工艺操作方便，保护效果好，活性损失率可由原来的45%左右降低至15%以下。

本发明是通过如下的技术方案来实现上述目的的：

一种水蛭粗提物的冻干保护剂，其特征在于：它是由如下质量百分比的原料药组成的：

海藻糖 0.5～5.5%

PEG2000 0.5～6.5%

甘露醇 1～5%；

一种水蛭粗提物的冻干保护剂，其中各原料药的质量百分比为：

海藻糖 1～3%

PEG2000 2.5～5%

甘露醇 1.5～3.5%；

一种水蛭粗提物的冻干保护剂，其中各原料药的质量百分比为：

海藻糖 1.5～2.5%

PEG2000 3.5～4.5%

甘露醇 1.5～2.5%；

一种水蛭粗提物的冻干保护剂，其中各原料药的质量百分比为：

海藻糖 2%

PEG2000 4%

甘露醇 2%。

一种水蛭粗提物冻干保护剂的冻干保存工艺，其特征在于：它是通过如下的工艺步骤实现的：

1）、首先对冻干操作室进行消毒、灭菌处理，保证达到无菌标准；

2）、在无菌冻干操作室内，将-18℃冷冻的新鲜水蛭分别称重，匀浆；再分别用水蛭体重4倍的生理盐水稀释匀浆液，室温23±2℃下不断搅拌20min，搅拌后用1O% 的三氯乙酸溶液调整pH至2.5，65℃水浴15min，其间适当搅拌；水浴后4℃10000r/min离心1Omin，收集上清液，上清液用1mol/L的NaOH溶液调整pH 至7.0，而后4℃10000r/min离心10 min，收集上清液即为菲牛蛭粗提物；

3）、将提取的水蛭粗提物上清液分装到1000ml的烧杯中，每个1000ml的烧杯中加入500ml水蛭粗提物上清液；

4）、在分装有500ml水蛭粗提物上清液的烧杯中加入：0.5～5.5%海藻糖、0.5～4.5%PEG2000和1～5%甘露醇，并用玻璃棒搅拌20～40min，使其溶解；

5）、将溶解后的水蛭粗提物溶解液分装到经过预先灭菌处理好的10ml西林瓶中，每个西林瓶中灌入5ml水蛭粗提物溶解液；

6）、将每个装有5ml水蛭粗提物溶解液的西林瓶放入冷冻干燥机的干燥箱中进行预冻，预冻温度设置为-45℃，预冻时间设置为6h；

7）、将经过预冻后的水蛭粗提物溶解液进行第一步冷凝干燥和第二步解析干燥；第一步冷凝干燥时：将冷冻干燥箱的前箱隔板温度设置为-30℃，后箱冷阱温度设置为-75℃，时间设置为22h，压力设置为20Pa；第二步解析干燥时：将冷冻干燥箱的前箱隔板温度设置为25℃，后箱冷阱温度设置为-75℃，时间设置为19h，压力设置为10Pa；

8）、冷凝干燥和解析干燥结束后，测试压力小于3Pa，对每个西林瓶进行压盖，制成保护剂成品。

海藻糖：又称漏芦糖、蕈糖等。是一种安全、可靠的天然糖类。海藻糖是由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成的非还原性糖，有3种异构体即海藻糖（α，α）、异海藻糖（β，β）和新海藻糖（α，β），并对多种生物活性物质具有非特异性保护作用。海藻糖在自然界中许多可食用动植物及微生物体内都广泛存在，如人们日常生活中食用的蘑菇类、海藻类、豆类、虾、面包、啤酒及酵母发酵食品中都有含量较高的海藻糖。海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。

在医学上已经成功地应用海藻糖替代血浆蛋白作为血液制品、疫苗、淋巴细胞、细胞组织等生物活性物质的稳定剂。不仅可以常温条件下干燥存放，更重要的是可以防止因血源污染而引起乙肝、艾滋病等致命疾病的传播，世界卫生组织对此十分重视。海藻糖可应用于研究用生物试剂的保存，我国中科院微生物研究所应用海藻糖干燥制备、用于人血清胆固醇测定的三种诊断工具酶，在室温下长期保存后，活性保持率都在90%以上，现已成功的进入于临床应用。这是其它种类的保护剂都不可能达到的效果，利用海藻糖作为诊断工具酶等生物试剂的稳定剂和保护剂，可置于常温条件下干燥并保存，不仅简化了生物试剂的制备过程，也给我国幅员广大的农村地区患者的疾病诊治带来便利。

PEG2000：中文名为聚乙二醇；它的任何分解产物都是挥发性的，不会生成硬壳或粘泥状的沉淀物。聚乙二醇为环氧乙烷水解产物的聚合物，聚乙二醇系列产品无毒、无刺激性，味微苦，具有良好的水溶性，并与许多有机物组份有良好的相溶性。它们具有优良的润滑性、保湿性、分散性、粘接剂、抗静电剂及柔软剂等，在化妆品、制药、化纤、橡胶、塑料、造纸、油漆、电镀、农药、金属加工及食品加工等行业中均有着极为广泛的应用。

甘露醇：甘露醇是山梨糖醇的同分异构体，两种醇类物质的二号碳原子上羟基朝向不同，分子式是C6H14O6，分子量为182.17。易溶于水，为白色透明的固体，有类似蔗糖的甜味。甘露醇在医药上是良好的利尿剂，降低颅内压、眼内压及治疗肾药、脱水药、食糖代用品、也用作药片的赋形剂及固体、液体的稀释剂。甘露醇注射液(Injectio Mannitou)作为高渗降压药，是临床抢救特别是脑部疾患抢救常用的一种药，具有降低颅内压药物所要求的降压快疗效准确的特点。甘露醇无吸湿性，干燥快，化学稳定性好，而且具有爽口、造粒性好等特点，用于抗癌药、抗菌药、抗组织胺药以及维生素等大部分片剂。甘露醇因溶解时吸热，有甜味，对口腔有舒服感，故更广泛用于醒酒药、口中清凉剂等咀嚼片的制造，其颗粒型专作直接压片的赋形剂。也可用作糖尿病患者食品、健美食品等低热值、低糖的甜味剂。

本发明与现有技术相比的有益效果在于：

该水蛭粗提物的冻干保护剂及冻干保存工艺，采用由海藻糖、PEG2000和甘露醇组成的保护剂，利用海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下都能在细胞表面形成独特保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活的特性；甘露醇无吸湿性，干燥快，化学稳定性好，且具有爽口、造粒性好的特点，聚乙二醇PEG2000优良的润滑性、保湿性、分散性、粘接性、抗静电性及柔软性；三氯乙酸与蛋白质形成不溶性盐的特性，盐浸提取水蛭粗提物，通过本发明8个工艺步骤大大提高水蛭粗提物冻干保存的活性及稳定性，配方简单，冻干保护工艺操作方便，保护效果好，可将水蛭粗提物冻干保存的活性损失率由原来的45%左右降低至15%以下。很好地解决了现有水蛭粗提物经过冻干处理后其活性损失率高，活性保存不稳定的问题。

具体实施方式

一种水蛭粗提物的冻干保护剂，其特征在于：它是由如下质量百分比的原料药组成：

海藻糖 0.5～5.5%

PEG2000 0.5～6.5%

甘露醇 1～5%。

一种水蛭粗提物的冻干保护剂，其中各原料药的质量百分比为：

海藻糖 1～3%

PEG2000 2.5～5%

甘露醇 1.5～3.5%。

一种水蛭粗提物的冻干保护剂，其中各原料药的质量百分比为：

海藻糖 1.5～2.5%

PEG2000 3.5～4.5%

甘露醇 1.5～2.5%。

一种水蛭粗提物的冻干保护剂，其中各原料药的质量百分比为：

海藻糖 2%

PEG2000 4%

甘露醇 2%。

所述的水蛭粗提物中的水蛭为菲牛蛭。

实施例1：以水蛭粗提物为基础物质，加入其质量3%的海藻糖、5%的PEG2000和3%的甘露醇，并用玻璃棒搅拌20～40min，直至溶解。水蛭粗提物通过冻干处理后其活性损失率为15%。

实施例2：以水蛭粗提物为基础物质，加入其质量2.5%海藻糖、4.5%PEG2000和2.5%甘露醇，并用玻璃棒搅拌20～40min，直至溶解。水蛭粗提物通过冻干处理后其活性损失率为10%。

实施例3：以水蛭粗提物为基础物质，加入其质量2%的海藻糖、4%的PEG2000和2%的甘露醇，并用玻璃棒搅拌20～40min，直至溶解。水蛭粗提物通过冻干处理后其活性损失率为7%。

海藻糖：研究发现海藻糖在高温下能保持酶的正常活性，甚至起热激活作用，还能用于提高干燥保存的酶的活性。

PEG2000：研究发现PEG2000具有良好的水溶性，并与许多有机物组份有良好的相溶性,是一种聚合物保护剂，防止蛋白降解变性,在化妆品、制药、化纤等行业中均有着极为广泛的应用。

甘露醇：甘露醇无吸湿性，干燥快，化学稳定性好。研究发现甘露醇作为冷冻干燥填充剂，在慢速冻结过程中会结晶，从而为菲牛蛭素活性组分提供结构支撑，并且不会与活性组分发生反应。

一种水蛭粗提物冻干保护剂配方的冻干保存工艺，它是通过如下的工艺步骤实现的：

1）、对冻干操作室进行消毒、灭菌处理，保证达到无菌标准；

2）、在无菌冻干操作室内，将-18℃冷冻的新鲜水蛭分别称重，匀浆；再分别用水蛭体重4倍的生理盐水稀释匀浆液，室温23±2℃下不断搅拌20min，搅拌后用1O% 的三氯乙酸溶液调整pH至2.5，65℃水浴15min，其间适当搅拌；水浴后4℃10000r/min离心1Omin，收集上清液，上清液用1mol/L的NaOH溶液调整pH 至7.0，而后4℃10000r/min离心10 min，收集的上清液即为菲牛蛭粗提物溶液；

3）、将提取的水蛭粗提物上清液分装到1000ml的烧杯中，每个1000ml的烧杯中加入500ml水蛭粗提物上清液；

4）、在分装有500ml水蛭粗提物上清液的烧杯中加入：0.5～5.5%的海藻糖、0.5～4.5%的PEG2000和1～5%的甘露醇，并用玻璃棒搅拌20～40min，使其溶解；

5）、将溶解后的水蛭粗提物溶解液分装到经过预先灭菌处理好的10ml西林瓶中，每个西林瓶加入5ml水蛭粗提物溶解液；

6）、将每个装有5ml水蛭粗提物溶解液的西林瓶放入冷冻干燥机的干燥箱中进行预冻，预冻温度设置为-45℃，预冻时间设置为6h；

7）、将经过预冻后的水蛭粗提物溶解液进行第一步冷凝干燥和第二步解析干燥；第一步冷凝干燥时：将冷冻干燥箱的前箱隔板温度设置为-30℃，后箱冷阱温度设置为-75℃，时间设置为22h，压力设置为20Pa；第二步解析干燥时：将冷冻干燥箱的前箱隔板温度设置为25℃，后箱冷阱温度设置为-75℃，时间设置为19h，压力设置为10Pa；

8）、冷凝干燥和解析干燥结束后，测试压力小于3Pa，对每个西林瓶进行压盖，制成冻干保护剂成品。

以上所述发明实施例，是本发明申请人通过大量正交试验筛选研制出水蛭粗提物的冻干保护剂，及水蛭粗提物的冻干保护剂的冻干保存工艺，使得水蛭粗提物冻干粉的活性在4℃冰箱内保存一年后，活性损失率低于15%；保证了治疗冠心病、心梗和心绞痛等心脑血管疾病所需水蛭粗提物冻干粉原料的质量，从而为充分利用水蛭粗提物冻干粉制备药剂提供了更优质、广阔的原料市场，为中医中药治疗心脑血管疾病增添动力，更好地为民解除病痛，更好地为民造福。

上述说明不对本发明的实质内容作任何形式上的限制，所属技术领域的普通技术人员在阅读了本说明书后依据本发明的技术实质对以上具体实施方式所作的任何简单修改或变形，以及可能利用上述揭示的技术内容加以变更或修饰为等同变化的等效实施例，均仍属于本发明技术方案的范围内，而不背离本发明的实质和范围。

Claims (6)

1.一种水蛭粗提物的冻干保护剂，其特征在于：它是由如下质量百分比的原料药组成：

海藻糖 0.5～5.5%

PEG2000 0.5～6.5%

甘露醇 1～5%。

2.根据权利要求1所述的一种水蛭粗提物的冻干保护剂，其特征在于：其中各原料药的质量百分比为：

海藻糖 1～3%

PEG2000 2.5～5%

甘露醇 1.5～3.5%。

3.根据权利要求1所述的一种水蛭粗提物的冻干保护剂，其特征在于：其中各原料药的质量百分比为：

海藻糖 1.5～2.5%

PEG2000 3.5～4.5%

甘露醇 1.5～2.5%。

4.根据权利要求1所述的一种水蛭粗提物的冻干保护剂，其特征在于：其中各原料药的质量百分比为：

海藻糖 2%

PEG2000 4%

甘露醇 2% 。

5.根据权利要求1所述的一种水蛭粗提物的冻干保护剂，其特征在于：所述的水蛭粗提物中的水蛭为菲牛蛭。

6.一种水蛭粗提物冻干保护剂的冻干保存工艺，其特征在于，它是通过如下的工艺步骤实现的：

1）、首先对冻干操作室进行消毒、灭菌处理，保证达到无菌标准；

2）、在无菌冻干操作室内，将-18℃冷冻的新鲜水蛭分别称重，匀浆；再分别用水蛭体重4倍的生理盐水稀释匀浆液，室温23±2℃下不断搅拌20min，搅拌后用1O% 的三氯乙酸溶液调整pH至2.5，65℃水浴15min，其间适当搅拌；水浴后4℃10000r/min离心1Omin，收集上清液，上清液用1mol/L的NaOH溶液调整pH 至7.0，而后4℃10000r/min离心10 min，收集上清液即为菲牛蛭粗提物；

3）、将提取的水蛭粗提物上清液分装到1000ml的烧杯中，每个1000ml的烧杯中加入500ml水蛭粗提物上清液；

4）、在分装有500ml水蛭粗提物上清液的烧杯中加入：0.5～5.5%海藻糖、0.5～4.5%PEG2000和1～5%甘露醇，并用玻璃棒搅拌20～40min，使其溶解；

5）、将溶解后的水蛭粗提物溶解液分装到经过预先灭菌处理好的10ml西林瓶中，每个西林瓶中灌入5ml水蛭粗提物溶解液；

6）、将每个装有5ml水蛭粗提物溶解液的西林瓶放入冷冻干燥机的干燥箱中进行预冻，预冻温度设置为-45℃，预冻时间设置为6h；

7）、将经过预冻后的水蛭粗提物溶解液进行第一步冷凝干燥和第二步解析干燥；第一步冷凝干燥时：将冷冻干燥箱的前箱隔板温度设置为-30℃，后箱冷阱温度设置为-75℃，时间设置为22h，压力设置为20Pa；第二步解析干燥时：将冷冻干燥箱的前箱隔板温度设置为25℃，后箱冷阱温度设置为-75℃，时间设置为19h，压力设置为10Pa；

8）、冷凝干燥和解析干燥结束后，测试压力小于3Pa，对每个西林瓶进行压盖，制成保护剂成品。