CN106072657A - 益生菌组合物及其制备方法 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明公开了益生菌组合物及其制备方法。本发明所公开的益生菌组合物，所述益生菌组合物主要由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉1％‑3％、干酪乳杆菌菌粉0.5％‑1.5％、乳双歧杆菌菌粉1％‑3％、甘露低聚糖5％‑8％、圆苞车前子粉3％‑5％、低聚果糖40％‑60％、玉米低聚肽粉2％‑5％、菊粉3％‑5％、蓝莓粉5％‑8％和麦芽糊精10％‑25％。本发明所制备的益生菌组合物不仅能有效调节肠道菌群，同时也能增强人体的免疫力。
Description
技术领域
本发明涉及食品领域，尤其涉及益生菌组合物及其制备方法。
背景技术
益生菌(Probiotics)一字源自希腊语，原意味“对生命有益”的意思，益生菌多分布于人体肠道，广泛包含乳酸杆菌(Lactobacillus species)、乳酸球菌(Lactococcusspecies)、肠球菌(Entrococcus species)、双歧杆菌菌属(Bifidobacterium species)部分菌种及部分酵母菌(yeast)等多种菌类。
甘露低聚糖又称甘露寡聚糖，是从酵母培养细胞壁中提取的一类新型抗原活性物质，广泛存在于魔芋粉、瓜尔豆胶、田箐胶及多种微生物细胞壁内。它具有低热、稳定、安全无毒等良好的理化性质。
圆苞车前子，Psyllium是Ginuceae科的一种草药，原产于印度、伊朗，在地中海地区国家，如法国、西班牙等国亦有栽培。圆苞车前草茎粗短，叶长椭圆形，种子含珊瑚木苷(Aucubine)、酵素、脂肪、黏胶质(Mucilage)等成分。圆苞车前草的种子外壳经加工磨碎后，称为圆苞车前子壳粉，或洋车前子纤维(Psyllium Husk Powder)。
低聚果糖又称蔗果低聚糖，是由1～3个果糖基通过β(2—1)糖苷键与蔗糖中的果糖基结合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。
玉米低聚肽粉，拉丁文名称为Cornoligopeptidespowder，其是以玉米蛋白粉为原料，经调浆、蛋白酶酶解、分离、过滤、喷雾干燥等工艺生产而成的。
菊粉(Inulin)是一类天然果聚糖的混合物，来源于菊苣根(拉丁学名：Cichoriumintybus var.sativum，Asteraceae)。以菊苣根为原料，去除蛋白质和矿物质后，经喷雾干燥等步骤获得菊粉。果聚糖是果粮单元通过(2-1)链联接而成并以葡萄糖单元终止的碳水化合物，通常商品化菊粉中果聚糖的平均聚合度为2－60，其中含有少量的低聚果糖。
随着现今社会生活节奏加快，加之人们饮食营养失调、长期运动不足，各种益生菌制品不断推陈出新，最普遍常见的便是添加有益生菌的饮料制品或食品组成物。但目前的益生菌制品多为调节肠道菌群平衡，功效较单一。
发明内容
为了弥补以上领域的不足，本发明公开了一种益生菌组合物，该组合物不仅能有效调节肠道菌群，同时也能增强人体的免疫力。
本发明所提供的益生菌组合物，主要由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉1％-3％、干酪乳杆菌菌粉0.5％-1.5％、乳双歧杆菌菌粉1％-3％、甘露低聚糖5％-8％、圆苞车前子粉3％-5％、低聚果糖40％-60％、玉米低聚肽粉2％-5％、菊粉3％-5％、蓝莓粉5％-8％和麦芽糊精10％-25％。
优选地，所述益生菌组合物由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉2％-3％、干酪乳杆菌菌粉1％-1.5％、乳双歧杆菌菌粉2％-3％、甘露低聚糖7％-8％、圆苞车前子粉3％-5％、低聚果糖40％-60％、玉米低聚肽粉2％-5％、菊粉3％-5％、蓝莓粉5％-8％和麦芽糊精10％-23％。
所述益生菌组合物由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉2％、干酪乳杆菌菌粉1％、乳双歧杆菌菌粉2％、甘露低聚糖8％、圆苞车前子粉3％、低聚果糖50％、玉米低聚肽粉2％、菊粉5％、蓝莓粉5％、麦芽糊精22％。
所述益生菌组合物由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉3％、干酪乳杆菌菌粉1％、乳双歧杆菌菌粉3％、甘露低聚糖8％、圆苞车前子粉5％、低聚果糖60％、玉米低聚肽粉2％、菊粉3％、蓝莓粉5％、麦芽糊精10％。
所述益生菌组合物由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉1％、干酪乳杆菌菌粉0.5％、乳双歧杆菌菌粉1.5％、甘露低聚糖5％、圆苞车前子粉3％、低聚果糖50％、玉米低聚肽粉2％、菊粉3％、蓝莓粉5％、麦芽糊精10％。
所述益生菌组合物由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉3％、干酪乳杆菌菌粉1.5％、乳双歧杆菌菌粉3％、甘露低聚糖7％、圆苞车前子粉4.5％、低聚果糖40％、玉米低聚肽粉5％、菊粉5％、蓝莓粉8％、麦芽糊精23％。
所述益生菌组合物由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉2.5％、干酪乳杆菌菌粉1.5％、乳双歧杆菌菌粉1％、甘露低聚糖5％、圆苞车前子粉5％、低聚果糖60％、玉米低聚肽粉5％、菊粉5％、蓝莓粉5％、麦芽糊精10％。
本发明还公开了一种制备所述益生菌组合物的方法。
本发明所公开的制备所述益生菌组合物的方法，包括以下步骤：
(1)按重量百分比将嗜酸乳杆菌菌粉、干酪乳杆菌菌粉和乳双歧杆菌菌粉混合均匀得到混合物A；
(2)按重量百分比将圆苞车前子粉和玉米低聚肽粉混合均匀得到混合物B；
(3)按重量百分比将所述混合物A与菊粉混合均匀得到混合物C，按重量百分比将所述混合物B与蓝莓粉混合均匀得到混合物D；
(4)按重量百分比将所述混合物C、所述混合物D与甘露低聚糖混合均匀得到混合物E；
(5)按重量百分比将所述混合物E与麦芽糊精混合均匀得到混合物F；
(6)按重量百分比将所述混合物F与低聚果糖混合均匀即得本发明的益生菌组合物。
所述益生菌组合物在调节肠道菌群和/或增强人体的免疫力中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明所制备的益生菌组合物中所选用的原料均为食品原料或国家允许用于保健食品的原料，用量上严格限制在一定范围，所以安全有效，无毒副作用。申请人在广泛研究以上采用的各原料对调节肠道菌群和增强人体免疫力的作用的基础上，尝试了大量的组合，但只在以上组合中观察到协同作用。本发明所制备的益生菌组合物不仅能有效调节肠道菌群，同时也能增强人体的免疫力。
具体实施方式
实施例1、制备益生菌组合物
该实施例中所用的原料嗜酸乳杆菌菌粉、干酪乳杆菌菌粉、乳双歧杆菌菌粉、甘露低聚糖、圆苞车前子粉、低聚果糖、玉米低聚肽粉、菊粉、蓝莓粉和麦芽糊精均可从商业途径购买得到。
制备益生菌组合物的方法，包括以下步骤：
(1)按重量百分比将嗜酸乳杆菌菌粉、干酪乳杆菌菌粉和乳双歧杆菌菌粉混合均匀得到混合物A；
(2)按重量百分比将圆苞车前子粉和玉米低聚肽粉混合均匀得到混合物B；
(3)按重量百分比将所述混合物A与菊粉混合均匀得到混合物C，按重量百分比将所述混合物B与蓝莓粉混合均匀得到混合物D；
(4)按重量百分比将所述混合物C、所述混合物D与甘露低聚糖混合均匀得到混合物E；
(5)按重量百分比将所述混合物E与麦芽糊精混合均匀得到混合物F；
(6)按重量百分比将所述混合物F与低聚果糖混合均匀即得本发明的益生菌组合物。
经长期实践，得到具有协同作用配比(以重量百分比为单位)的益生菌组合物，如表1所示。
表1实施例1制备得到的益生菌组合物
根据以上配比制备得到不同的益生菌组合物，对这些组合物进行如下功能试验。
一、益生菌组合物调节肠道菌群
(一)益生菌组合物调节肠道菌群动物实验
1材料和方法
1.1样品：本实施例所制备的益生菌组合物，人体口服推荐量为每日2次，每次1袋，成人体重按60kg计算，折合剂量为0.0667g/kg·bw。
1.2实验动物与实验环境条件：SPF级ICR种雄性小鼠40只，体重18g～22g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号为SCXK(湘)2011-0003，实验条件为屏障环境，实验期间环境温度22℃～23℃，湿度52％～58％，实验动物使用许可证号为SYXK(湘)2010-0010。
1.3剂量选择及样品处理：根据人体口服推荐量，设益生菌组合物低、中、高剂量分别为0.333g/kg·bw、0.667g/kg·bw、2.000g/kg·bw(分别相当于人体推荐剂量的5、10、30倍)。试验时，分别取益生菌组合物3.33g、6.67g、20.00g加蒸馏水定容至200ml，按0.2ml/10g·bw体积给小鼠灌胃，每天一次，连续14天。对照组灌胃予以等体积的蒸馏水。
1.4主要仪器与试剂
1.4.1主要仪器电子天平，CO2水套培养箱，厌氧培养箱。
1.4.2主要试剂伊红-美蓝培养基、TSC培养基、叠氮钠-结晶紫-七叶苷培养基、LBS培养基、改良BBL培养基、样品稀释液等。
1.5实验方法
实验前无菌采集小鼠粪便适量，置已称重的带玻璃珠的干燥灭菌小试管中，再称重，计算出小鼠粪便的重量，加入无菌稀释液，稀释10倍，振荡1分钟，再依次进行10倍系列稀释，选择合适的稀释度，分别接种在各培养基上，按要求进行培养。据粪便中双歧杆菌的基础水平将40只小鼠分入对照组和低、中、高剂量组，每组10只小鼠，按1.3中剂量设置灌胃14天，最后一次灌胃后24h，再次无菌采集小鼠粪便，同上检测肠道菌群。各肠道菌群的培养基和培养条件为：
1.6实验数据统计
用Excel、Spss软件进行统计分析。用Spss软件比较各实验组与对照组数据时，先对数据进行方差齐行检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异再用Dunnett法进行多个剂量组与一个对照组均数间的两两比较。若方差不齐则对原始数据进行适当的变量转换，满足方差齐性检验后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到方差齐的目的，改用秩和检验进行统计，发现总体比较有差异，则采用不要求方差齐性的Tamhane′sT2检验进行两两比较。对照组及各剂量组实验前后自身菌数比较采用配对t检验。
1.7结果判定
比较实验前后自身及组间双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌的变化情况，实验组实验前后自身比较差异有显著性，或实验后实验组与对照组组间比较差异有显著性、且实验组实验前后自身比较差异有显著性，符合以下一项，可以判断受试样品动物实验结果阳性。
1.7.1粪便中双歧杆菌和/或乳杆菌明显增加，产气荚膜梭菌减少或不增加，肠杆菌、肠球菌无明显变化。
1.7.2粪便中双歧杆菌和/或乳杆菌明显增加，产气荚膜梭菌减少或不增加，肠杆菌和/或肠球菌明显增加，但增加的幅度低于双歧杆菌/乳杆菌增加的幅度。
2.结果
2.1益生菌组合物对小鼠体重的影响
见表1-1。实验前后受试物组动物体重及实验期间体重增长与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。
表1-1益生菌组合物对小鼠体重的影响(g)
2.2益生菌组合物对小鼠肠杆菌数量的影响
见表1-2。实验前、实验后肠杆菌数各剂量组与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。对照组及各剂量组实验前后自身比较，肠杆菌数量均无显著性差异(P>0.05)。
表1-2益生菌组合物对小鼠肠杆菌数量的影响
2.3益生菌组合物对小鼠肠球菌数量的影响
见表1-3。实验前、实验后肠球菌数各剂量组与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。对照组及各剂量组实验前后自身比较，肠球菌数量均无显著性差异(P>0.05)。
表1-3益生菌组合物对小鼠肠球菌数量的影响
2.4益生菌组合物对小鼠肠道产气荚膜梭菌数量的影响
见表1-4。实验前、实验后产气荚膜梭菌数量各剂量组与对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。对照组及各剂量组实验前后自身比较，产气荚膜梭菌数量均无显著性差异(P>0.05)。
表1-4益生菌组合物对小鼠肠道产气荚膜梭菌数量的影响
2.5益生菌组合物对小鼠肠道乳杆菌数量的影响
见表1-5。实验前各组肠道乳杆菌数比较无显著性差异(P>0.05)，实验后高剂量组肠道乳杆菌数与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，中、高剂量组实验前后自身比较差异有显著性(P＜0.05)，对照组实验前后自身比较差异无显著性(P>0.05)。
表1-5益生菌组合物对小鼠肠道乳杆菌数量的影响
2.6益生菌组合物对小鼠肠道双歧杆菌数量的影响
见表1-6。实验前各组肠道双歧杆菌数比较无显著性差异(P>0.05)，实验后高剂量组肠道双歧杆菌数与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，高剂量组实验前后自身比较差异有显著性(P＜0.05)，对照组实验前后自身比较差异无显著性(P>0.05)。
表1-6益生菌组合物对小鼠肠道双歧杆菌数量的影响
3小结
在本实验室条件下，经口灌胃给予小鼠0.333g/kg·bw、0.667g/kg·bw、2.000g/kg·bw剂量的益生菌组合物14天，实验前后自身比较及实验后组间比较，小鼠肠道肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌均无显著性差异(P>0.05)。实验前后自身比较，0.667g/kg·bw、2.000g/kg·bw剂量组小鼠肠道乳杆菌数及2.000g/kg·bw剂量组肠道双歧杆菌数显著增加(P＜0.05)，实验后2.000g/kg·bw剂量组小鼠肠道乳杆菌数、双歧杆菌数与对照组比较显著增加(P＜0.05)。提示本发明的益生菌组合物对动物具有调节肠道菌群作用。
(二)益生菌组合物调节肠道菌群人体试食试验
1材料和方法
1.1样品
本实施例所制备的益生菌组合物；安慰剂作为对照。人口服每日2次，每次2克。
1.2受试对象：
1.2.1纳入标准：经体检合格符合下列条件的自愿受试者。
1.2.1.1一个月内未患过胃肠疾病者。
1.2.1.2一个月内未服用过抗生素者。
1.2.2受试者排除标准：年龄在65岁以上者，妊娠或哺乳期妇女，过敏体质及对本品过敏者；合并有心血管、脑血管、肝、肾和造血系统等严重疾病及内分泌疾病，精神病患者；停服受试样品或中途加服其它药物，无法判断功效或资料不全者；短期内服用与受试功能有关的物品，影响到对结果的判断者。
1.3试验方法
采用组间对照设计和自身对照设计。将符合纳入标准并保证配合试验的自愿受试者，按菌群状况随机分为试食组和对照组，并尽可能考虑影响结果的主要因素如年龄、性别、饮食因素等，进行均衡性检验。受试者按推荐剂量服用样品或安慰剂，连续14天。试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。
2观察指标
各项观察指标于试食试验开始及结束时各测定一次。
2.1安全性指标
2.1.1一般体格检查：试验前详细询问受试者健康情况，了解受试者的精神、睡眠、饮食、大小便等情况，并测量体重、血压、心率，对所有受试者进行常规体格检查及必要的实验室检查。
2.1.2血常规：红细胞计数、白细胞计数、血红蛋白含量测定等。
2.1.3尿常规：PH值、包细胞、尿糖等。
2.1.4粪便常规。
2.1.5血生化检查(仅在试验开始前检查一次)：血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、血糖(GLU)测定。
2.1.6心电图、腹部B超、胸透等检查(仅在试验开始前检查一次)。
2.1.7不良反应观察
2.2功效指标
于试食受试物前和连续服用受试物14天后，分别采集受试者粪便，进行10倍系列稀释，选合适稀释度，分别接种在各培养基上，按下列要求进行培养，然后对培养物进行菌落计算。
3.结果判定
符合以下任一项，且试食组试食前后自身比较及试食后试食组与对照组比较，差异均有显著性，可以判定该受试样品具有调节肠道菌群功能的作用。
3.1粪便中双歧杆菌和/或乳杆菌明显增加，产气荚膜梭菌减少或不增加，肠杆菌和/或肠球菌、拟杆菌明显增加，但增加的幅度低于双歧杆菌/乳杆菌增加的幅度。
4.统计学处理
资料结果用均数±标准差表示，自身配对资料采用配对t检验，试食组合对照组之间在方差齐性的前提下，均数比较采用成组t检验，否则进行变量转化后满足方差齐性后采用t检验，如果方差仍然不齐，采用秩和检验。
5.结果
双盲法观察结束揭晓：服食1号者为安慰剂，服食2号者为益生菌组合物。
5.1一般情况：初始试验人群试食组52例，对照组52例，试食前后，受试者精神、睡眠、饮食、大小便状况未见异常。对照组：男/女为19/33，年龄为49.31±8.70岁；试食组：男/女为18/34，年龄为48.67±8.72岁。
5.2安全性观察
5.2.1体重、血压、心率、尿常规、大便常规、血常规指标
见表2-1。食用受试物14天后，试食组和对照组体重、血压、心率均未见明显异常改变，尿常规、大便常规、血常规指标均在正常范围内，提示样品对机体健康无明显损害。
表2-1试食前后体重、血压、心率、尿、大便、血常规变化情况
5.2.2血生化指标
见表2-2。食用受试物前试食组和对照组血生化指标均在正常范围内。
表2-2试食前生化指标
5.2.3腹部B超、心电图、X线胸部透视检测，均在正常范围。
5.2.4试食期间未见明显不良反应。
5.3功效指标：
试食试验前后肠道菌群数量变化见表2-3。试食前，对照组和试食组肠道菌群数量比较，P值均大于0.05，提示两组之间具有可比性。试食后试食组乳杆菌和双歧杆菌数量与试食前及对照组试验后比较增加，差异皆有显著性(P＜0.05)；试食后产气荚膜梭菌、肠杆菌、肠球菌和拟杆菌数量无明显变化(P＞0.05)。
表2-3试食前后肠道菌群数量变化(cfu/g粪便，log x±s)
注：与试食前比较*P＜0.05，与对照组比较*P＜0.05
5.4脱失率
经过14天试验后，试验组有0例受试者因间断服用受试品无法判断效果被筛除；对照组有0例受试者因间断服用受试品无法判断效果被筛除。最后有效试验人群试食组52例，对照组52例。见表2-4。
表2-4试验脱失率
6小结
将受试者按菌群状况随机分为试食组和对照组，分别服用益生菌组合物或安慰剂，14天后结果表明：试食组乳杆菌和双歧杆菌数量与试食前比较增加，差异有显著性(P＜0.05)；试食后试食组乳杆菌和双歧杆菌数量显著高于对照组(P＜0.05)；试食后产气荚膜梭菌不增加，肠杆菌、肠球菌和拟杆菌数量无明显变化。试食后，体重、血压、心率、尿、大便、血常规等各项检测指标均未见明显异常改变，试食期间未观察到明显不良反应。根据评价标准，提示本实施例制备的益生菌组合物具有调节人体肠道菌群的作用。
二、益生菌组合物增强免疫力功能试验
1材料和方法
1.1样品：本实施例制备的益生菌组合物，人体口服推荐量为每日2次，每次1袋，成人体重按60kg计算，折合剂量为0.0667g/kg·bw。
1.2实验动物与分组：ICR种雌性小鼠200只，体重18g～22g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号为SCXK(湘)2011-0003。每40只小鼠为一大组，共五大组。免疫Ⅰ组，进行碳廓清实验；免疫Ⅱ组，进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；免疫Ⅲ组，进行迟发型变态反应实验；免疫Ⅳ组，进行脏体比值测定、半数溶血值(HC50)的测定和抗体生成细胞数的测定；免疫Ⅴ组，进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验、NK细胞的活性测定。每大组40只小鼠按体重随机分为4小组，即对照组和低、中、高剂量组，每组10只小鼠。
1.3实验条件：为屏障环境，实验期间环境温度22℃～23℃，湿度52％～58％，实验动物使用许可证号为SYXK(湘)2010-0010。
1.4剂量选择及样品处理：据人体口服推荐量，设本实施例益生菌组合物低、中、高剂量分别为0.333g/kg·bw、0.667g/kg·bw、2.000g/kg·bw(分别相当于人体推荐剂量的5、10、30倍)。试验时，分别取样品3.33g、6.67g、20.00g加蒸馏水定容至200ml，按0.2ml/10g·bw体积给小鼠灌胃，对照组灌胃予以等体积的蒸馏水。每天一次，连续灌胃至少30天。
1.5主要仪器与试剂：动物台秤、分析天平、洁净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、722分光光度计、恒温水浴箱、酶标仪、显微镜等。
无菌手术器械、游标卡尺、微量注射器、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板，96孔U型细胞培养板、玻璃器皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色素习惯、载玻片等。
SRBC、生理盐水、Hank’s液、RPMⅠ1640培养液、小牛血清、青链霉素、ConA、1％冰醋酸，1mol/L的HCL溶液，酸性异丙醇、MTT、PBS缓冲液(Ph7.2-7.4)、补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、琼脂糖、都氏试剂、YAC-1细胞、乳酸钠、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶Ⅰ、0.2mol/L的Tris-HCL缓冲液、2.5％Triton、印度墨汁、0.1％的碳酸钠、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液等。
1.6实验方法：
1.6.1脏器/体重比值测定：称重后处死小鼠，去除脾脏和胸腺，在电子分析天平上称重，计算脏/体比值。
1.6.2迟发型变态反应(DTH)(足跖增厚法)
小鼠腹腔注射2％(v/v)SRBC(0.2ml/每鼠)致敏后4天，测量左后足跖部厚度，然后再测量部位皮下注射20％(v/v)SRBC(0.2ml/每鼠)，于注射后24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。以攻击前后足跖厚度差值(足跖肿胀度)来表示DTH的程度。
1.6.3ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用Hank’s液洗2次，每次离心10分钟(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL完全培养液中，计数活细胞，用RPMI1640培养液调整细胞浓度为3×106个/ml。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，在其中一孔加75μLConA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％二氧化碳培养箱，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养技术后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。
1.6.4抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)
取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，将压积SRBC用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2ml。4天后将小鼠处死，取脾，轻轻磨碎，用Hanks液制成细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤、离心2次，最后将细胞悬浮在8ml Hanks液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/mL。将表层培养基加热溶解后与等量的PH7.4、2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加入用SA液配制的10％SRBC50μL(v/v)、20μL脾细胞悬液(5×106个/mL)，迅速混匀后倾倒于已刷薄层琼脂糖的玻片上，待琼脂糖凝固后将玻片水平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5h，然后用SA液稀释的补体(1:8)加入到玻片凹槽内，继续温育1.5h后计数溶血空斑数。
1.6.5半数溶血值(HC50)的测定
取羊血，用生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)SRBC0.2ml进行免疫。4天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000rpm离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释为200倍，取1mL置试管内，依次加入10％(v/v，用SA缓冲液配制)SRBC 0.5mL，补体1mL(用SA缓冲液按1:8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37℃恒温水浴中保温30min后，冰浴终止反应。2000rpm离心10min，取上清1mL，加都氏试剂3mL。同时取10％(v/v，用SA缓冲液配制)SRBC 0.25mL，加都氏试剂至4mL于另一试管中，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下式计算：
半数溶血值(HC50)＝样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数
1.6.6小鼠碳廓清实验
小鼠尾静脉注射以生理盐水稀释4倍的印度墨汁，每10g体重注射0.1mL，墨汁注入后立即计时，于注入墨汁后第2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，加入到2ml 0.1％Na2CO3溶液中，摇匀。以0.1％Na2CO3溶液作空白对照，用722型分光光度计在60nm波长处比色测光密度值(OD)。将小鼠处死，取肝、脾，称重，计算吞噬指数a。
1.6.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
小鼠腹腔注射20％(v/v，用生理盐水配制)的鸡红细胞(2000rpmr，10min)悬液1mL，间隔30min，颈椎脱臼处死，仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min。取腹腔巨噬细胞洗液1mL，滴于载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，置37℃孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗以除去未贴片细胞。晾干，以甲醇：丙酮(1:1)固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色，用蒸馏水漂洗晾干。油镜下每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：
吞噬率％＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100
吞噬指数＝被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数
1.6.8NK细胞活性的测定(乳酸脱氢酶测定法)
受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank’s液洗2次，每次离心10min(1000转/min)，弃上清将细胞浆弹起，加入0.5ml灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5ml2倍Hank’s液及8ml Hank’s液，1000rpm离心10min，用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数，用台酚兰染色计数活细胞数(活细胞数应在95％以上)，调整细胞浓度为2×107个/mL此为效应细胞，取传代后24h生长良好的YAC-1细胞用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL此为靶细胞；取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5％Triton各100μL；上述各项均设三个平行孔，于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μL，根据室温反应3-10min，每孔加入1mol/L的HCL30μL，在酶标仪490nm处测定光密度(OD)。
NK细胞活性＝【(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)】×100％
1.7实验数据统计：用Excel、Spss软件进行数据转化和统计分析。用Spss软件分析时，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异再用Dunnett法进行多个剂量组与一个对照组均数间的两两比较。若方差不齐则对原始数据进行适当的变量转换，满足方差齐性检验后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到方差齐，则改用秩和检验进行统计，发现总体比较有差异，则采用不要求方差齐性的Tamhane’s检验进行两两比较。
2结果
2.1受试物对小鼠体重的影响
见表3-1～表3-5。各剂量组实验初期、实验中期、实验末小鼠体重及实验期间小鼠体重增长与对照组比较，差异均无显著性(P＞0.05)。
表3-1免疫Ⅰ组小鼠体重(g)
表3-2免疫Ⅱ组小鼠体重(g)
表3-3免疫Ⅲ组小鼠体重(g)
表3-4免疫Ⅳ组小鼠体重(g)
表3-5免疫Ⅴ组小鼠体重(g)
2.2受试物对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响
见表3-6。受试物各剂量对小鼠脾脏/体重比值和胸腺/体重比值无显著影响(P＞0.05)。
表3-6受试物对小鼠免疫器官脏器/体重比值的影响
2.3受试物对小鼠细胞免疫功能的影响
2.3.1受试物对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响
见表3-7。中、高剂量组小鼠迟发型变态反应能力与对照组比较显著提高(P＜0.05)。
表3-7受试物对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响
2.3.2受试物对小鼠ConA诱导的淋巴细胞转化能力的影响
见表3-8。高剂量组小鼠淋巴细胞转化能力与对照组比较显著提高(P＜0.05)。
表3-8受试物对小鼠淋巴细胞转化能力的影响
2.4受试物对体液免疫的影响
2.4.1受试物对小鼠抗体生成细胞数的影响
见表3-9。中、高剂量组小鼠抗体生成细胞数与对照组比较显著提高(P＜0.05)。
表3-9受试物对小鼠抗体生成细胞数的影响
2.4.2受试物对小鼠半数溶血值(HC50)的影响
见表3-10。高剂量组小鼠半数溶血值(HC50)与对照组比较显著提高(P＜0.05)。
表3-10受试物对小鼠半数溶血值(HC50)的影响
2.5受试物对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响
2.5.1受试物对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清的影响
见表3-11。各剂量对单核-巨噬细胞碳廓清能力未见明显影响(P＞0.05)。
表3-11受试物对小鼠单核-巨噬细胞碳廓清的影响
2.5.2受试物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力的影响
见表3-12-1、3-12-2。受试物各剂量对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力无显著影响(P＞0.05)。
表3-12-1受试物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率的影响
表3-12-2受试物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数的影响
2.6受试物对小鼠NK细胞活性的影响
见表3-13。中、高剂量组小鼠NK细胞活性与对照组比较显著提高(P＜0.05)。
表3-13受试物对小鼠NK细胞活性的影响
3结论
在本实验室条件下，经口灌胃给予小鼠0.333g/kg·bw、0.667g/kg·bw、2.000g/kg·bw剂量的受试物30天，2.000g/kg·bw剂量能增加ConA诱导的淋巴细胞转化能力、血清半数溶血值，与对照组比较差异有显著性(P＜0.05)；0.667g/kg·bw、2.000g/kg·bw剂量能增加小鼠迟发型变态反应能力、抗体生成细胞数、NK细胞活性，与对照组比较差异有显著性(P＜0.05)；对小鼠体重增长、脾脏/体重比值、胸腺/体重比值、小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力及巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力无明显影响(P＞0.05)。提示本实施例制备的益生菌组合物具有增强免疫力的功能。
Claims (9)
1.一种益生菌组合物，其特征在于：所述益生菌组合物主要由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉1％-3％、干酪乳杆菌菌粉0.5％-1.5％、乳双歧杆菌菌粉1％-3％、甘露低聚糖5％-8％、圆苞车前子粉3％-5％、低聚果糖40％-60％、玉米低聚肽粉2％-5％、菊粉3％-5％、蓝莓粉5％-8％和麦芽糊精10％-25％。
2.根据权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于：所述益生菌组合物由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉2％-3％、干酪乳杆菌菌粉1％-1.5％、乳双歧杆菌菌粉2％-3％、甘露低聚糖7％-8％、圆苞车前子粉3％-5％、低聚果糖40％-60％、玉米低聚肽粉2％-5％、菊粉3％-5％、蓝莓粉5％-8％和麦芽糊精10％-23％。
3.根据权利要求1或2所述的益生菌组合物，其特征在于：所述益生菌组合物由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉2％、干酪乳杆菌菌粉1％、乳双歧杆菌菌粉2％、甘露低聚糖8％、圆苞车前子粉3％、低聚果糖50％、玉米低聚肽粉2％、菊粉5％、蓝莓粉5％、麦芽糊精22％。
4.根据权利要求1或2所述的益生菌组合物，其特征在于：所述益生菌组合物由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉3％、干酪乳杆菌菌粉1％、乳双歧杆菌菌粉3％、甘露低聚糖8％、圆苞车前子粉5％、低聚果糖60％、玉米低聚肽粉2％、菊粉3％、蓝莓粉5％、麦芽糊精10％。
5.根据权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于：所述益生菌组合物由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉1％、干酪乳杆菌菌粉0.5％、乳双歧杆菌菌粉1.5％、甘露低聚糖5％、圆苞车前子粉3％、低聚果糖50％、玉米低聚肽粉2％、菊粉3％、蓝莓粉5％、麦芽糊精10％。
6.根据权利要求1或2所述的益生菌组合物，其特征在于：所述益生菌组合物由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉3％、干酪乳杆菌菌粉1.5％、乳双歧杆菌菌粉3％、甘露低聚糖7％、圆苞车前子粉4.5％、低聚果糖40％、玉米低聚肽粉5％、菊粉5％、蓝莓粉8％、麦芽糊精23％。
7.根据权利要求1所述的益生菌组合物，其特征在于：所述益生菌组合物由下述重量百分比的物质制备而成：嗜酸乳杆菌菌粉2.5％、干酪乳杆菌菌粉1.5％、乳双歧杆菌菌粉1％、甘露低聚糖5％、圆苞车前子粉5％、低聚果糖60％、玉米低聚肽粉5％、菊粉5％、蓝莓粉5％、麦芽糊精10％。
8.一种制备权利要求1-7中任一所述的益生菌组合物的方法，包括以下步骤：
(1)按重量百分比将嗜酸乳杆菌菌粉、干酪乳杆菌菌粉和乳双歧杆菌菌粉混合均匀得到混合物A；
(2)按重量百分比将圆苞车前子粉和玉米低聚肽粉混合均匀得到混合物B；
(3)按重量百分比将所述混合物A与菊粉混合均匀得到混合物C，按重量百分比将所述混合物B与蓝莓粉混合均匀得到混合物D；
(4)按重量百分比将所述混合物C、所述混合物D与甘露低聚糖混合均匀得到混合物E；
(5)按重量百分比将所述混合物E与麦芽糊精混合均匀得到混合物F；
(6)按重量百分比将所述混合物F与低聚果糖混合均匀即得本发明的益生菌组合物。
9.权利要求1-7中任一所述的益生菌组合物在调节肠道菌群和/或增强人体的免疫力中的应用。
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