CN107490640A - 一种能同时检测对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的方法 - Google Patents

一种能同时检测对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及一种能同时检测对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的方法。实验结果表明，该方法使得对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的定量下限最低可达0.46ng/mL，且各线性回归方程相关系数均为0.998；各测定物的日内准确度均在85％～111％之间，精密度均低于9％；各测定物的日间准确度均在94％～108％之间，精密度均低于9％。因此，本发明的方法快速、灵敏、准确，适用于大鼠血浆中对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的定量测定。

Description

一种能同时检测对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种能同时检测对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的方法。
背景技术
感冒灵颗粒(GML，含APAP 200mg)是20世纪70年代末上市的中西药复方制剂，具有解热镇痛的功效，用于因感冒引起的头痛、发热、鼻塞、流涕、咽痛等症状的治疗。感冒灵颗粒的主要药效成分的成分之一——对乙酰氨基酚(Acetaminophen，APAP)是临床常用的非处方解热镇痛药物，治疗剂量下安全性较高。
但是一些药物中APAP含量较高，过量的APAP会导致急性肝损伤发生，甚至造成个体死亡。研究表明，APAP的代谢产物是导致肝损伤发生的主要诱因。因此，建立系统性的APAP及其代谢产物的检测方法是研究APAP肝脏毒性机制及评价APAP肝毒性的有效手段。
N-乙酰-对-苯醌亚胺(N-Acetyl-p-benzoquinone imine，NAPQI)是对乙酰氨基酚的代谢产物中导致肝损伤的主要活性物质，但无法直接测定但是单一测定该物质不能有效的揭示APAP毒性及解毒机制。为了解决该问题，有文献报道了；液相色谱-串联质谱法同时测定对乙酰氨基酚及其中5个血浆代谢产物的方法。然而，一方面，上述方法仅仅可以检测对乙酰氨基酚的5种血浆代谢产物，定量检测的代谢产物不全面；另一方面，上述方法中对乙酰氨基酚及其5种血浆代谢产物的定量下限均在μg/ml水平，对更低浓度的5种血浆代谢产物无法实现定量检测。
因此，研究定量检测物质更为全面、且定量下限更低的对乙酰氨基酚及其血浆代谢产物的方法对于APAP肝损伤的临床和实验室研究具有重要意义，对于感冒灵颗粒的安全用药具有显著的临床指导意义。
发明内容
为此，本发明提供一种能同时检测对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的方法。
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明一种能同时检测对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的方法，所述8种血浆代谢产物为：4-硫酸-对乙酰氨基酚M1、葡萄醛酸化对乙酰氨基酚M2、3-羟基-对乙酰氨基酚M3、3-甲氧基-对乙酰氨基酚M3-3、对乙酰氨基酚谷胱甘肽二钠盐M4、3-半胱氨酰-对乙酰氨基酚M5、硫甲基3-嗪-对乙酰氨基酚M5-1、3-N-乙酰-半胱氨硫酰-对乙酰氨基酚M5-2；
各化合物的结构式具体如下：
4-硫酸-对乙酰氨基酚M1：(Acetaminophen-4-O-sulfate)；
葡萄醛酸化对乙酰氨基酚M2：(Acetaminophen-4-O-glucuronide)；
3-羟基-对乙酰氨基酚M3：(3-Hydroxyacetaminophen)；
3-甲氧基-对乙酰氨基酚M3-3：(3-Methoxyacetaminophen)；
对乙酰氨基酚谷胱甘肽二钠盐M4：(Acetaminophen-3-glutathione)；
3-半胱氨酰-对乙酰氨基酚M5：(Acetaminophen-3-mercapturate)；
硫甲基3-嗪-对乙酰氨基酚M5-1：(Acetaminophen-3-cysteine)；
3-N-乙酰-半胱氨硫酰-对乙酰氨基酚M5-2：(Acetaminophen-3-(S-N-acetyl-cystein).
该方法包括以下步骤：
(1)内标物对照品溶液的配置
配置含有浓度为90～110ng/mL的木蝴蝶苷OA和浓度为9～11μg/mL的非那西汀PNT的对照品溶液，-18～-22℃放置备用，即得内标物对照品溶液；
(2)供试品溶液的配置
取解冻后的大鼠血浆样品45～55μL，加入所述内标物对照品溶液9～11μL和蛋白沉淀剂135～165μL，搅拌、混合均匀，作为供试品溶液；
(3)检测条件
液相色谱分离条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含有体积浓度0.09～0.11％HCOOH的体积比为95：5的水-乙腈溶液为流动相A、以含有体积浓度0.1％HCOOH的乙腈为流动相B进行洗脱，流速0.2～0.4mL/min，柱温22～28℃，自动进样器温度：3～5℃，进样量为4～6μL；
质谱检测条件：采用ESI离子源，选择质谱多反应监测MRM工作方式进行二级质谱分析，以非那西汀PNT为内标物，在正离子检测方式下检测对乙酰氨基酚APAP、3-甲氧基-对乙酰氨基酚M3-3、3-羟基-对乙酰氨基酚M3、对乙酰氨基酚谷胱甘肽二钠盐M4和硫甲基3-嗪-对乙酰氨基酚M5-1；以木蝴蝶苷OA为内标物，在负离子检测方式下检测4-硫酸-对乙酰氨基酚M1、葡萄醛酸化对乙酰氨基酚M2、3-半胱氨酰-对乙酰氨基酚M5和3-N-乙酰-半胱氨硫酰-对乙酰氨基酚M5-2；
(4)测定
取供试品溶液的上清液135～165μL，进样4～6μL，测定，即得。
优选地，所述步骤(3)中，所述液相色谱分离条件中，所述流动相按照如下程序进行洗脱：
进一步优选地，以ID为50mm×2.0mm的SHESEIDO CAPCE PAK C18柱为色谱柱。
进一步优选地，所述质谱检测条件中，具体检测参数如下：
进一步优选地，所述蛋白沉淀剂选自甲醇、乙腈和乙酸乙酯中的至少一种。
进一步优选地，所述蛋白沉淀剂为甲醇。
进一步优选地，所述内标物对照品溶液的配置中，具体配置过程如下：
精密称取非那西汀PNT和木蝴蝶苷OA，分别加入适量甲醇后，分别得浓度均为0.9～1.1mg/mL的非那西汀PNT和木蝴蝶苷OA储备液，-70～-90℃放置备用；
精确量取木蝴蝶苷OA储备液9～11μL，置于1～3mL离心管中，加入891～1089μL甲醇，得浓度为9～11μg/mL的木蝴蝶苷OA溶液；
分别取浓度为9～11μg/mL的木蝴蝶苷OA溶液和浓度为0.9～1.1mg/mL的非那西汀PNT储备液各9～11μL，加入至1～3mL离心管中，加入882～1078μL甲醇，得到含有浓度为90～110ng/mL的木蝴蝶苷和浓度为9～11μg/mL的非那西汀的对照品溶液，-18～-22℃放置备用，即得内标物对照品溶液。
进一步优选地，所述内标物对照品溶液的配置中，具体配置过程如下：
精密称取非那西汀PNT和木蝴蝶苷OA，分别加入适量甲醇后，分别得浓度为1mg/mL的非那西汀PNT和木蝴蝶苷OA储备液，-80℃放置备用；
精确量取木蝴蝶苷OA储备液10μL，置于2mL离心管中，加入990μL甲醇，得浓度均为10μg/mL的木蝴蝶苷OA溶液；
分别取浓度为10μg/mL的木蝴蝶苷OA溶液和浓度为1mg/mL的非那西汀PNT储备液各10μL，加入至2mL离心管中，加入980μL甲醇，得到含有浓度为100ng/mL的木蝴蝶苷和浓度为10μg/mL的非那西汀的对照品溶液，-20℃放置备用，即得内标物对照品溶液。
进一步优选地，该方法包括以下步骤：
(1)内标物对照品溶液的配置
配置含有浓度为100ng/mL的木蝴蝶苷和浓度为10μg/mL的非那西汀的对照品溶液，-20℃放置备用，即得内标物对照品溶液；
(2)供试品溶液的配置
取解冻后的大鼠血浆样品50μL，加入所述内标物对照品溶液10μL和甲醇150μL，搅拌、混合均匀，作为供试品溶液；
(3)检测条件
液相色谱分离条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含有体积浓度0.1％HCOOH的体积比为95：5的水-乙腈溶液为流动相A、以含有体积浓度0.1％HCOOH的乙腈为流动相B进行洗脱，流速0.3mL/min，柱温25℃，自动进样器温度：4℃，进样量为5μL；
质谱检测条件：采用ESI离子源，选择质谱多反应监测MRM工作方式进行二级质谱分析，以非那西汀PNT为内标物，在正离子检测方式下检测对乙酰氨基酚APAP、3-甲氧基-对乙酰氨基酚M3-3、3-羟基-对乙酰氨基酚M3、对乙酰氨基酚谷胱甘肽二钠盐M4、硫甲基3-嗪-对乙酰氨基酚M5-1；以木蝴蝶苷OA为内标物，在负离子检测方式下检测4-硫酸-对乙酰氨基酚M1、葡萄醛酸化对乙酰氨基酚M2、3-半胱氨酰-对乙酰氨基酚M5、3-N-乙酰-半胱氨硫酰-对乙酰氨基酚M5-2；
(4)测定
取供试品溶液的上清液150μL，进样5μL，测定，即得。
进一步优选地，所述供试品溶液的配置中，按照如下步骤进行搅拌、混合均匀：先在离心速度2000rpm下涡旋混合5min后，然后在4℃下以离心力14000g离心5min。
进一步优选地，在所述供试品溶液的配置中，还包括如下步骤：
取解冻后的大鼠血浆样品5μL，加入45μL水、所述内标物对照品溶液10μL和甲醇150μL，搅拌、混合均匀，即得稀释10倍后的供试品溶液；
取解冻后的大鼠血浆样品5μL，加入45μL水进行稀释，取稀释后的大鼠血浆样品5μL，再加入45μL水进行二次稀释，取二次稀释后的大鼠血浆样品50μL加入所述内标物对照品溶液10μL和甲醇150μL，搅拌、混合均匀，即得稀释100倍后的供试品溶液。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点：
本发明将血浆样品经甲醇沉淀蛋白后，采用LC-MS/MS法，以C18色谱柱为色谱柱，以含有体积浓度0.1％HCOOH的体积比为95：5的水-乙腈溶液为流动相A、以含有体积浓度0.1％HCOOH的乙腈为流动相B进行洗脱，流速为0.3mL/min，柱温25℃，采用电喷雾离子化(ESI)，通过正离子多反应监测(MRM)检测方式进行定量分析，以非那西汀PNT为内标物，在正离子检测方式下检测对乙酰氨基酚APAP、3-甲氧基-对乙酰氨基酚M3-3、3-羟基-对乙酰氨基酚M3、对乙酰氨基酚谷胱甘肽二钠盐M4、硫甲基3-嗪-对乙酰氨基酚M5-1；以木蝴蝶苷OA为内标物，在负离子检测方式下检测4-硫酸-对乙酰氨基酚M1、葡萄醛酸化对乙酰氨基酚M2、3-半胱氨酰-对乙酰氨基酚M5、3-N-乙酰-半胱氨硫酰-对乙酰氨基酚M5-2。
实验结果表明，该方法使得APAP的定量下限可达12.4ng/mL，M1的定量下限可达1.37ng/mL，M2的定量下限可达4.11ng/mL，M3的定量下限可达1.37ng/mL，M3-3的定量下限可达1.37ng/mL，M4的定量下限可达1.37ng/mL，M5的定量下限可达1.37ng/mL，M5-1的定量下限可达0.46ng/mL，M5-2的定量下限可达4.11ng/mL，且各线性回归方程相关系数均为0.998；各测定物的日内准确度均在85％～111％之间，精密度均低于9％；各测定物的日间准确度均在94％～108％之间，精密度均低于9％。因此，本发明的方法快速、灵敏、准确，适用于大鼠血浆中对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的定量测定。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：
图1(a)、1(b)、1(c)分别是空白样品、最低定量下限样品和供试样品中APAP的色谱图；图2(a)、2(b)、2(c)分别是空白样品、最低定量下限样品和供试样品中M1的色谱图；图3(a)、3(b)、3(c)分别是空白样品、最低定量下限样品和供试样品中M2的色谱图；图4(a)、4(b)、4(c)分别是空白样品、最低定量下限样品和供试样品中M3的色谱图；图5(a)、5(b)、5(c)分别是空白样品、最低定量下限样品和供试样品中M3-3的色谱图；图6(a)、6(b)、6(c)分别是空白样品、最低定量下限样品和供试样品中M4的色谱图；图7(a)、7(b)、7(c)分别是空白样品、最低定量下限样品和供试样品中M5的色谱图；图8(a)、8(b)、8(c)分别是空白样品、最低定量下限样品和供试样品中M5-1的色谱图；图9(a)、9(b)、9(c)分别是空白样品、最低定量下限样品和供试样品中M5-2的色谱图。
具体实施方式
本发明以下实施例和实验例中，大鼠血浆样品按照以下方法制备：取胰岛素抗凝大鼠全血，4℃下以10000g离心制备血浆。
实施例1
本实施例能同时检测对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的方法，包括以下步骤：
(1)内标物对照品溶液的配置
精密称取非那西汀PNT和木蝴蝶苷OA，分别加入适量甲醇后，分别得浓度为1mg/mL的非那西汀PNT和木蝴蝶苷OA储备液，-80℃放置备用；
精确量取木蝴蝶苷OA储备液10μL，置于2mL离心管中，加入990μL甲醇，得浓度均为10μg/mL的木蝴蝶苷OA溶液；
分别取浓度为10μg/mL的木蝴蝶苷OA溶液和浓度为1mg/mL的非那西汀PNT储备液各10μL，加入至2mL离心管中，加入980μL甲醇，得到含有浓度为100ng/mL的木蝴蝶苷和浓度为10μg/mL的非那西汀的对照品溶液，-20℃放置备用，即得内标物对照品溶液；
(2)供试品溶液的配置
取解冻后的大鼠血浆样品50μL，加入所述内标物对照品溶液10μL和甲醇150μL，先在离心速度2000rpm下涡旋混合5min后，然后在4℃下以离心力14000g离心5min，作为供试品溶液；
取解冻后的大鼠血浆样品5μL，加入45μL水、所述内标物对照品溶液10μL和甲醇150μL，搅拌、混合均匀，即得稀释10倍后的供试品溶液；
取解冻后的大鼠血浆样品5μL，加入45μL水进行稀释，取稀释后的大鼠血浆样品5μL，再加入45μL水进行二次稀释，取二次稀释后的大鼠血浆样品50μL加入所述内标物对照品溶液10μL和甲醇150μL，搅拌、混合均匀，即得稀释100倍后的供试品溶液；
(3)检测条件
液相色谱分离条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以ID为50mm×2.0mm的SHESEIDO CAPCE PAK C18柱为色谱柱，以含有体积浓度0.1％HCOOH的体积比为95：5的水-乙腈溶液为流动相A、以含有体积浓度0.1％HCOOH的乙腈为流动相B进行洗脱，按照如下程序进行洗脱：
时间(min) 流速(mL/min) A：B的体积比 Curve
0 0.3 100:0 初始
3 0.3 40:60 6
4 0.3 40:60 6
6 0.3 100:0 1
流速0.3mL/min，柱温25℃，自动进样器温度：4℃，进样量为5μL；
质谱检测条件：采用ESI离子源，选择质谱多反应监测MRM工作方式进行二级质谱分析，以非那西汀PNT为内标物，在正离子检测方式下检测对乙酰氨基酚APAP、3-甲氧基-对乙酰氨基酚M3-3、3-羟基-对乙酰氨基酚M3、对乙酰氨基酚谷胱甘肽二钠盐M4、硫甲基3-嗪-对乙酰氨基酚M5-1；以木蝴蝶苷OA为内标物，在负离子检测方式下检测4-硫酸-对乙酰氨基酚M1、葡萄醛酸化对乙酰氨基酚M2、3-半胱氨酰-对乙酰氨基酚M5、3-N-乙酰-半胱氨硫酰-对乙酰氨基酚M5-2，具体检测参数如下：
(4)测定
取供试品溶液的上清液150μL，进样5μL，测定，即得。
实施例2
本实施例能同时检测对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的方法，包括以下步骤：
(1)内标物对照品溶液的配置
精密称取非那西汀PNT和木蝴蝶苷OA，分别加入适量甲醇后，分别得浓度均为0.9mg/mL的非那西汀PNT和木蝴蝶苷OA储备液，-90℃放置备用；
精确量取木蝴蝶苷OA储备液9μL，置于1mL离心管中，加入990μL甲醇，得浓度为9μg/mL的木蝴蝶苷OA溶液；
分别取浓度为9μg/mL的木蝴蝶苷OA溶液和浓度为0.9mg/mL的非那西汀PNT储备液各9μL，加入至1mL离心管中，加入980μL甲醇，得到含有浓度为90ng/mL的木蝴蝶苷和浓度为9μg/mL的非那西汀的对照品溶液，-18℃放置备用，即得内标物对照品溶液；
(2)供试品溶液的配置
取解冻后的大鼠血浆样品45μL，加入所述内标物对照品溶液9μL和甲醇135μL，先在离心速度2000rpm下涡旋混合5min后，然后在4℃下以离心力14000g离心5min，作为供试品溶液；
取解冻后的大鼠血浆样品5μL，加入45μL水、所述内标物对照品溶液10μL和甲醇150μL，搅拌、混合均匀，即得稀释10倍后的供试品溶液；
取解冻后的大鼠血浆样品5μL，加入45μL水进行稀释，取稀释后的大鼠血浆样品5μL，再加入45μL水进行二次稀释，取二次稀释后的大鼠血浆样品50μL加入所述内标物对照品溶液10μL和甲醇150μL，搅拌、混合均匀，即得稀释100倍后的供试品溶液；
(3)检测条件
液相色谱分离条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以ID为50mm×2.0mm的SHESEIDO CAPCE PAK C18柱为色谱柱，以含有体积浓度0.09％HCOOH的体积比为95：5的水-乙腈溶液为流动相A、以含有体积浓度0.1％HCOOH的乙腈为流动相B进行洗脱，按照如下程序进行洗脱：
时间(min) 流速(mL/min) A：B的体积比 Curve
0 0.3 100:0 初始
3 0.3 40:60 6
4 0.3 40:60 6
6 0.3 100:0 1
流速0.4mL/min，柱温22℃，自动进样器温度：5℃，进样量为4μL；
质谱检测条件：采用ESI离子源，选择质谱多反应监测MRM工作方式进行二级质谱分析，以非那西汀PNT为内标物，在正离子检测方式下检测对乙酰氨基酚APAP、3-甲氧基-对乙酰氨基酚M3-3、3-羟基-对乙酰氨基酚M3对乙酰氨基酚谷胱甘肽二钠盐M4、硫甲基3-嗪-对乙酰氨基酚M5-1；以木蝴蝶苷OA为内标物，在负离子检测方式下检测4-硫酸-对乙酰氨基酚M1、葡萄醛酸化对乙酰氨基酚M2、3-半胱氨酰-对乙酰氨基酚M5和3-N-乙酰-半胱氨硫酰-对乙酰氨基酚M5-2，具体检测参数如下：
(4)测定
取供试品溶液的上清液165μL，进样4μL，测定，即得。
实施例3
本实施例能同时检测对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的方法，包括以下步骤：
(1)内标物对照品溶液的配置
精密称取非那西汀PNT和木蝴蝶苷OA，分别加入适量甲醇后，分别得浓度均为1.1mg/mL的非那西汀PNT和木蝴蝶苷OA储备液，-70℃放置备用；
精确量取木蝴蝶苷OA储备液11μL，置于3mL离心管中，加入990μL甲醇，得浓度为11μg/mL的木蝴蝶苷OA溶液；
分别取浓度为11μg/mL的木蝴蝶苷OA溶液和浓度为1.1mg/mL的非那西汀PNT储备液各11μL，加入至3mL离心管中，加入980μL甲醇，得到含有浓度为110ng/mL的木蝴蝶苷和浓度为11μg/mL的非那西汀的对照品溶液，-22℃放置备用，即得内标物对照品溶液；
(2)供试品溶液的配置
取解冻后的大鼠血浆样品55μL，加入所述内标物对照品溶液11μL和甲醇165μL，先在离心速度2000rpm下涡旋混合5min后，然后在4℃下以离心力14000g离心5min，作为供试品溶液；
取解冻后的大鼠血浆样品5μL，加入45μL水、所述内标物对照品溶液10μL和甲醇150μL，搅拌、混合均匀，即得稀释10倍后的供试品溶液；
取解冻后的大鼠血浆样品5μL，加入45μL水进行稀释，取稀释后的大鼠血浆样品5μL，再加入45μL水进行二次稀释，取二次稀释后的大鼠血浆样品50μL加入所述内标物对照品溶液10μL和甲醇150μL，搅拌、混合均匀，即得稀释100倍后的供试品溶液；
(3)检测条件
液相色谱分离条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以ID为50mm×2.0mm的SHESEIDO CAPCE PAK C18柱为色谱柱，以含有体积浓度0.09～0.11％HCOOH的体积比为95：5的水-乙腈溶液为流动相A、以含有体积浓度0.1％HCOOH的乙腈为流动相B进行洗脱，按照如下程序进行洗脱：
时间(min) 流速(mL/min) A：B的体积比 Curve
0 0.3 100:0 初始
3 0.3 40:60 6
4 0.3 40:60 6
6 0.3 100:0 1
流速0.2mL/min，柱温28℃，自动进样器温度：3℃，进样量为6μL；
质谱检测条件：采用ESI离子源，选择质谱多反应监测MRM工作方式进行二级质谱分析，以非那西汀PNT为内标物，在正离子检测方式下检测对乙酰氨基酚APAP、3-甲氧基-对乙酰氨基酚M3-3、3-羟基-对乙酰氨基酚M3对乙酰氨基酚谷胱甘肽二钠盐M4、硫甲基3-嗪-对乙酰氨基酚M5-1；以木蝴蝶苷OA为内标物，在负离子检测方式下检测4-硫酸-对乙酰氨基酚M1、葡萄醛酸化对乙酰氨基酚M2、3-半胱氨酰-对乙酰氨基酚M5和3-N-乙酰-半胱氨硫酰-对乙酰氨基酚M5-2，具体检测参数如下：
(4)测定
取供试品溶液的上清液135μL，进样6μL，测定，即得。
实验例1方法学考察
1、实验仪器与试剂
1.1实验仪器
液相-质谱联用分析系统(LC/MS/MS)由美国Waters公司生产的AcQuityTM UPLC系列液相仪以及AB Sciex公司生产的API5500Qtrap质谱仪组成，系统工作软件为Empower(UPLC)和Analyst 1.62(美国)；Sanyo-70℃超低温冰箱(日本)，Haier-80℃超低温冰箱(中国)；SorvallBiofugepico高速台式离心机(德国)；ThermoSorvallBiofugeStratos(德国)；Sorvall Legend RT低温台式离心机(德国)；Vibrax VXR小型摇床(德国)；IKA T18Basic高速分散机(德国)；超纯水仪(Simplicity，默克密理博公司)。
1.2试剂
甲醇(色谱纯)，对乙酰氨基酚、4-硫酸-对乙酰氨基酚、葡萄醛酸化对乙酰氨基酚、3-羟基-对乙酰氨基酚、3-甲氧基-对乙酰氨基酚、3-半胱氨酰-对乙酰氨基酚、硫甲基3-嗪-对乙酰氨基酚、3-N-乙酰-半胱氨硫酰-对乙酰氨基酚均购自Toronto Research ChemicalsInc.，非那西汀、木蝴蝶苷购自上海弘顺生物科技有限公司。
2、实验方法
2.1大鼠血浆样品前处理
将-80℃冷冻保存的大鼠血浆解冻，分别取50μL血浆样品+内标工作溶液10μL(OA100ng/mL、PNT 10μg/mL)+甲醇150μL；取5μL血浆样品+45μL水+内标工作溶液10μL+甲醇150μL；取5μL血浆样品+45μL水，稀释后取5μL+45μL水，再取稀释后样品50μL+内标工作溶液10μL+甲醇150μL，分别配置成不稀释、稀释10倍、稀释100倍的大鼠血浆样品，2000rpm涡旋混合5min后，4℃下14000g离心5min，取上清液150μL，于UPLC-MS/MS进样5μL，分别分析M3-3、M3、M5-1；APAP、M5、M5-2；M1、M2。
2.2仪器条件
2.2.1色谱条件
色谱柱：SHESEIDO CAPCE PAK C18柱(50mm×2.0mm ID)；柱温：25℃；流动相：A：H2O：CH3CN＝95：5(0.1％HCOOH)，B：CH3CN(0.1％HCOOH)；洗脱条件见表1；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；样品温度：4℃；分析时间：6min。
表1 APAP和其相关代谢产物的液相洗脱条件
时间(min) 流速(mL/min) B相(％) Curve
初始 0.3 0 初始
3 0.3 60 6
4 0.3 60 6
6 0.3 0 1
2.2.2质谱检测条件
采用ESI离子源，选择MRM工作方式进行二级质谱分析，在正离子检测方式下检测APAP、M3-3、M3、M5-1，内标物为非那西汀(PNT)；在负离子检测方式下检测M1、M2、M5、M5-2，内标物为木蝴蝶苷(OA)。
质谱检测工作参数见表2。
表2 APAP和其相关代谢产物的质谱检测工作条件
2.3对照品工作液的配制
2.3.1对照品储备液配制
精密称取对乙酰氨基酚、4-硫酸-对乙酰氨基酚(M1)、葡萄醛酸化对乙酰氨基酚(M2)、3-羟基-对乙酰氨基酚(M3)、3-甲氧基-对乙酰氨基酚(M3-3)、对乙酰氨基酚谷胱甘肽二钠盐(M4)、3-半胱氨酰-对乙酰氨基酚(M5)、硫甲基3-嗪-对乙酰氨基酚(M5-1)、3-N-乙酰-半胱氨硫酰-对乙酰氨基酚(M5-2)、非那西汀(PNT)、木蝴蝶苷(OA)，分别加入适量甲醇后，得浓度为1mg/mL的储备液，-80℃冰箱放置备用。
2.3.2对照品工作溶液配制
精确量取对乙酰氨基酚、4-硫酸-对乙酰氨基酚(M1)、葡萄醛酸化对乙酰氨基酚(M2)、3-羟基-对乙酰氨基酚(M3)、3-甲氧基-对乙酰氨基酚(M3-3)、对乙酰氨基酚谷胱甘肽二钠盐(M4)、3-半胱氨酰-对乙酰氨基酚(M5)、硫甲基3-嗪-对乙酰氨基酚(M5-1)、3-N-乙酰-半胱氨硫酰-对乙酰氨基酚(M5-2)、非那西汀(PNT)、木蝴蝶苷(OA)，分别加入适量甲醇后储备液各10μL，置于2mL离心管中，加入910μL甲醇，得终浓度均为10μg/mL的混合工作溶液，依次稀释分别得到浓度分别为3333、1111、370.3、123.6、41.1、13.7及4.57ng/mL的工作溶液，-20℃冰箱放置备用。
2.3.3 IS工作溶液配制
精确量取木蝴蝶苷(OA)储备液10μL，置于2mL离心管中，加入990μL甲醇，得终浓度均为10μg/mL的溶液，再取10μg/mL的木蝴蝶苷溶液及非那西汀储备液各10μL，置于2mL离心管中，加入980μL甲醇，得到木蝴蝶苷及非那西汀浓度分别为100ng/mL和10μg/mL的IS工作溶液，-20℃冰箱放置备用。
2.3.4 APAP和其相关代谢产物定量分析标准曲线的制作
向与检测样品相同的空白生物基质中加入一定量的APAP和其相关代谢产物，配成血药浓度分别为1000、333.3、111.1、37.03、12.36、4.11、1.37及0.457ng/mL的血浆样品，取各浓度血样50μL，加入内标工作溶液10μL(OA 100ng/mL、PNT 10μg/mL)，2000rpm涡旋混合60s；再加入150μL的CH3OH，2000rpm涡旋混合5min后；4℃下14000g，离心5min后吸取上清液150μL，于LC/MS/MS进样5μL进行分析。
以被测化合物与IS的峰面积之比对被测化合物在生物样品中的浓度进行线性回归，并以浓度的倒数(1/X)为加权系数(Weighting factor)，求得测定效应与浓度的回归方程。
2.3.5 QC样品配制
取与检测样品相同的空白生物基质45μL，置于1.5mL离心管中，分别依次加入系列浓度QC工作溶液(QC-L、QC-M和QC-H)5μL，2000rpm涡旋混合60s后，分别得低、中、高浓度QC样品，其中待测化合物标示浓度见表3。之后样品处理步骤同“2.1大鼠血浆样品前处理”。每个浓度平行制备共5个样品。
表3 QC样品中待测化合物标示浓度
*表中阴影部分为负离子模式检测；空白背景部分为正离子模式检测。
2.3.6血浆样品回收率
取50μL含三种不同QC浓度APAP和其相关代谢产物的大鼠血样(浓度见表3)，混匀。按“2.1大鼠血浆样品前处理”处理血样，再取上清液5μL进行UPLC/MS/MS分析。同时，取200μL空白血浆，分别加入40μL水，加入600μL甲醇，2000rpm涡旋混合60s后，4℃下14000g离心5min，取上清液合并备用。取195μL上清液，置于1.5mL离心管中，分别依次加入三种不同QC浓度的APAP和其相关代谢产物的工作液各5μL，2000rpm涡旋混合60s后，以此为对照，取5μL进行LC/MS/MS分析。
血样提取回收率由从血样中提取出的APAP和其相关代谢产物色谱峰面积与空白血样提取后加入相应浓度的溶液中的APAP和其相关代谢产物色谱峰面积之商计算而得。
2.3.7血浆样品基质效应
取50μL含低、中、高三种不同QC浓度的APAP和其相关代谢产物的纯水样品，加入内标工作溶液10μL(OA 100ng/mL、PNT 10μg/mL)，2000rpm涡旋混合60s，加入CH3OH 150μL，2000rpm涡旋混合5min后。再取5μL上清液进行LC/MS/MS分析。另取200μL空白血浆，分别加入40μL水，加入600μL甲醇，2000rpm涡旋混合5min后，4℃下14000g离心5min，取上清液合并备用。取195μL上清液，置于1.5mL离心管中，分别依次加入三种不同浓度APAP和其相关代谢产物的工作液各5μL，加入内标工作溶液10μL，2000rpm涡旋混合60s后，以此为对照，取5μL进行LC/MS/MS分析。
血样基质效应由从血样中提取出的APAP和其相关代谢产物和内标物(木蝴蝶苷、非那西丁)色谱峰面积与空白纯水样品提取后加入相应浓度的溶液中的APAP和其相关代谢产物和内标物(木蝴蝶苷、非那西丁)色谱峰面积之商计算而得。
2.3.8 APAP和其相关代谢产物在血样中稀释可靠性的考查
配制含有一定浓度的APAP和其相关代谢产物的大鼠血浆样品(浓度见表3)，每个浓度各3个样品，按“2.1大鼠血浆样品前处理”稀释该样品。加入内标工作溶液10μL(OA100ng/mL、PNT 10μg/mL)，2000rpm涡旋混合60s，加入CH3OH 150μL，2000rpm涡旋混合5min后，4℃下14000g离心5min，取上清液后用LC/MS/MS分析。通过分析其精密性与准确性考查APAP和其相关代谢产物的稀释可靠性。
2.3.9分析方法准确度和精密度的日内与日间差
配制含有一定浓度的APAP和其相关代谢产物的大鼠血浆样品，每个浓度各3个样品，按“2.1大鼠血浆样品前处理”稀释该样品。加入内标工作溶液10μL(OA 100ng/mL、PNT10μg/mL)，2000rpm涡旋混合60s，加入CH3OH 150μL，2000rpm涡旋混合5min后，4℃下14000g离心5min，取上清液后用LC/MS/MS分析。通过分析其精密性与准确性考查APAP和其相关代谢产物的稀释可靠性。
2.3.10化合物APAP和其相关代谢产物的稳定性
用SD大鼠空白血浆分别配制三个不同QC浓度的APAP和其相关代谢产物的血浆溶液。分装成50μL/份。血浆样品前处理过程与“2.1大鼠血浆样品前处理”相同。
2.3.11 APAP和其相关代谢产物在血浆冻融中稳定性的考查
取三个不同QC浓度的APAP和其相关代谢产物的血浆溶液样品各21份，分成7组(每组3份)。4组样品分别进行“-80℃冰箱冷冻和23℃解冻”的0、1、2及3次循环处理。随后样品加入内标工作溶液10μL(OA 100ng/mL、PNT 10μg/mL)，2000rpm涡旋60s，用150μL的CH3OH提取处理后，用UPLC/MS/MS分析。通过与0次循环的样品比较色谱峰面积考查APAP和其相关代谢产物的稳定性。
2.3.12 APAP和其相关代谢产物在大鼠血浆中短期稳定性的考查
取三个不同QC浓度的APAP和其相关代谢产物的血浆溶液样品各9份，分别分成3组(每组3份)。待各样品解冻后，于23℃室温条件下放置0和24h后(其中M3室温下放置时间为2h)，用150μL的CH3OH提取处理后用LC/MS/MS分析。通过与放置0h的样品比较色谱峰面积考查APAP和其相关代谢产物的稳定性。
2.3.13 APAP和其相关代谢产物在的制备后稳定性考查
取三个不同浓度的大鼠血浆溶液样品各6份，分别分成2组(每组3份)。其中一组样品加入内标工作溶液10μL(OA 100ng/mL、PNT 10μg/mL)，2000rpm涡旋60s，加入150μL的CH3OH，2000rpm涡旋混合5min后，4℃下14000g离心5min，取上清液4℃下(进样器温度)放置3小时。另取一组样品，同上处理，后将两组样品上清液进样5μL，后用LC/MS/MS分析。通过与放置0h的样品比较色谱峰面积考查APAP和其相关代谢产物的稳定性。
2.3.14 APAP和其相关代谢产物在血样中长期稳定性的考查
取三个不同QC浓度的大鼠血浆溶液样品各3份，-80℃放置1个月，新配制的三个不同浓度的大鼠血浆溶液样品各3份，用150μL的CH3OH提取后，用UPLC/MS/MS分析。通过与新鲜样品比较色谱峰面积考查APAP和其相关代谢产物的稳定性。
3、结果与讨论
3.1色谱条件优化
研究发现，选用2.0×50mm，1.7μm的C18色谱柱可以在相对较短时间内保证APAP及其代谢产物的有效分离。进一步比较甲醇-水、乙腈-水体系作为流动相对APAP及其代谢产物的分离效果的影响。实验结果表明，待测化合物在乙腈-水流动相中的选择性优于甲醇-水体系且由于待测化合物极性差异较大，实验采用梯度洗脱方式可以获得理想的色谱分离效果，单个运行过程时间仅需6min。
3.2质谱条件优化
采用流动注射方式，在正离子和负离子模式下对每种化合物进行一级质谱扫描获得其分子离子峰；在确定各类化合物的准分子离子峰后分别对其进行二级质谱分析，获得其碎片离子信息，确定定量离子和辅助定性离子。通过优化碎裂电压(Fragmentor，V)、碰撞电压(Collision Energy，eV)等参数，使APAP及其代谢产物、CAF、CLP的准分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大；对毛细管电压、雾化压力、干燥气温度、干燥气流量等进行优化，使每种待测化合物的离子化效率达到最佳。
3.3线性范围与检出限
测定APAP和其相关代谢产物大鼠血药浓度的标准曲线由6-9个浓度(每个浓度点含5个重复样)的数据转化而成。得到测定效应与血药浓度的线性回归方程见表4，Y为分析化合物与IS的峰面积之比，X为分析化合物的血药浓度。标准曲线线性良好r≥0.99(n＝5)。测定不同血浆样品中APAP和其相关代谢产物浓度的线性回归方程，APAP和其相关代谢产物的线性回归方程及定量范围如表4所示。
表4 APAP和其相关代谢产物的线性回归方程及定量范围
由表4可知，APAP和其相关代谢产物的线性回归方程相关系数均为0.998，表明相关性良好。
3.4血样前处理过程的回收率
通过从血浆中提取APAP和其相关代谢产物所得的峰面积除以空白血样提取后加入等量的APAP和其相关代谢产物所得的峰面积来计算血浆APAP和其相关代谢产物的回收率，具体实验结果如表5所示。
表5 APAP和其相关代谢产物的回收率(％)
由表5可知，APAP和其相关代谢产物的回收率均在83.5％-107％之间，满足分析的要求。
3.5血浆样品的基质效应
通过从血浆中提取APAP和其相关代谢产物及内标物(OA、PNT)所得的峰面积除以空白纯水样品提取后加入等量的APAP和其相关代谢产物及内标物(OA、PNT)所得的峰面积来计算血浆APAP和其相关代谢产物的基质效应，具体实验结果如表6所示。
表6 APAP和其相关代谢产物及内标物(OA、PNT)的基质效应(％)
由表6可知，APAP和其相关代谢产物及内标物(OA、PNT)的基质效应均在50.1％-96.5％之间，满足分析的要求。
3.6精密性及准确性考察
分析不同血浆样品中APAP和其相关代谢产物浓度的日内准确度和精密度，具体实验结果分别如表7和表8所示。
表7 APAP和其相关代谢产物日内的准确度、精密度
表8 APAP和其相关代谢产物日间的准确度、精密度
由表7和表8可知，APAP和其相关代谢产物及内标物(OA、PNT)的日内和日间准确度在85.2％-111％，精密度在0.08％-11.9％之间，满足分析的要求。
3.7 APAP和其相关代谢产物的稀释可靠性
APAP和其相关代谢产物的稀释可靠性的实验结果如表9所示。
表9 APAP和其相关代谢产物稀释可靠性
由表9可知，APAP和其部分相关代谢产物在整个实验过程中均稀释稳定。
3.8 APAP和其相关代谢产物的稳定性
在整个分析实验过程中，各种浓度的分析物溶液以及采集分装后不同含分析物的生物样品均储存于-80℃冰箱中。在样品分析实验过程中，最高温度为25℃，其它实验步骤温度为4-25℃。
在以上温度条件下开展APAP和其相关代谢产物的稳定性研究，发现M3室温条件下于血浆中放置2h稳定，其它化合物在室温条件下于血浆中可以放置24h稳定，结果见表10；血浆中分析物经过三次冻融循环后稳定，结果见表11；分析物在-80℃条件下于血浆中放置2个月稳定，结果见表12；血浆中分析物及IS在样品前处理后于液相进样瓶中4℃放置24h，均未降解，结果见表13。在我们使用的实验条件下，APAP和其相关代谢产物是稳定的。
由表10～表13可知，APAP和其相关代谢产物在血浆样品中室温条件放置24h、冻融循环、-80℃放置2个月以及在制备后的血浆样品中4℃放置24h，均稳定，满足分析的要求。
表10 APAP和其相关代谢产物室温条件放置24h稳定性
*M3在室温下放置2小时。
表11 APAP和其相关代谢产物室冻融循环后稳定性
表12 APAP和其相关代谢产物-80℃放置2个月稳定性
表13大鼠血浆样品处理后APAP和其相关代谢产物4℃放置24h稳定性
APAP和其相关代谢产物及IS的色谱保留时间tR见表14，代表性色谱图见图1(a)-图9(c)。
表14 APAP和其相关代谢产物的色谱保留时间
由图1(a)-图9(c)可知，APAP、M1、M2、M3、M3-3、M4、M5、M5-1、M5-2的保留时间分别为1.36、1.70、1.12、1.18、1.49、1.281.14、1.81和1.50min，空白血浆中均无干扰，特异性良好，满足分析的要求。
实验例2药动学研究
1、实验方法
1.1在大鼠上进行的药动学研究
根据药效评价试验提供的数据，本试验设计感冒灵化药组合(118.8mg/kg)及感冒灵全方(628mg/kg)两个组，在大鼠上进行药动学试验。每组动物数为4个，皆为雄性。购入的大鼠在动物中心大鼠房适应五天后，开始动物试验。
给药前后，在异氟烷麻醉状态下眼窝静脉窦采血约0.5mL，收集于事先加入肝素的试管中。采血时间点安排为：0min、5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h和24h。采血后全血样品于4℃下10000rpm离心2min，血浆样品分装于1.5mL EP管中，每个样品分2份装，50μL+X。血浆样品于-80℃保存直至分析。按实验例1中“2.1大鼠血浆样品前处理”中描述的方法分析各动物不同时间点的血样中APAP和其相关代谢产物的浓度。
1.2药动学参数的计算
APAP和其相关代谢产物的药动学参数用InnaPhaseKinetica 2000TM软件(美国)用非房室模型分析处理。Cmax为实测的最大血药浓度，血药浓度-时间曲线下面积AUC由梯形法计算得到，Tpeak为给药后APAP和其相关代谢产物血药浓度达峰时间。实验数据用“均数±标准差”(Mean±SD,n≥3)或“均数”(Mean,n＝3或n＝4)表示。
2、实验结果
大鼠口服给予化药组118.8mg/kg后，APAP于0.35h达峰，平均峰浓度为238nmol/mL，血中平均AUC为575nmol·h/mL，半衰期T1/2为2.37h；大鼠给予感冒灵全方(628mg/kg，相当于生药g/kg，含化药组合剂量为118.8mg/kg)后，APAP达峰时间为0.33h，与化药组相近，峰浓度为214nmol/mL，是化药组合的89.9％，两组没有统计学差异；血中AUC为562nmol·h/mL，是化药组合的97.7％，两组没有统计学差异；半衰期T1/2为2.13h。将APAP及其代谢产物(M1、M2、M3、M3-3、M5、M5-1和M5-2)的血中AUC相加，以此计算给药全方后APAP的大鼠口服生物利用度是给药化药组合后APAP的口服生物利用度的94.0％。
大鼠口服给予化药组合组118.8mg/kg后，M1、M2、M3和M3-3平均达峰时间分别为0.56、1、0.56、0.38h，其平均峰浓度分别为126、95.6、0.74、0.04nmol/mL；M1、M2、M3、M3-3血中平均AUC分别为714、221、1.42和0.15nmol·h/mL，平均半衰期分别为4.07、3.77、0.89、7.46h；大鼠给予感冒灵全方(628mg/kg，相当于生药g/kg，含化药组合剂量为118.8mg/kg)后，M1、M2和M3-3平均达峰时间分别延长到0.69、1.25、0.52h，只有M3的平均达峰时间缩短到0.38h，M1、M2、M3和M3-3的平均峰浓度均有所降低，分别为115(-0.87％)、84.5(-11.6％)、0.59(-20.2％)、0.03(-25％)nmol/mL；对应的平均AUC分别为636(-10.9％)、225(+1.80％)、1.56(+9.86％)和0.13(-13.3％)nmol·h/mL；M1、M2、M3和M3-3的平均T1/2分别为3.10、3.19、1.94和6.66h。
3、实验结论
本发明建立了一种能同时检测对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的方法，该方法灵敏、可靠，将该方法应用于感冒灵全方组和化药组合给药的大鼠后，可以成功地对APAP及其8个代谢产物大鼠进行体内药动学特征研究，为其它含APAP成分药物的代谢研究奠定了基础。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种能同时检测对乙酰氨基酚及其8种血浆代谢产物的方法，所述8种血浆代谢产物为：4-硫酸-对乙酰氨基酚M1、葡萄醛酸化对乙酰氨基酚M2、3-羟基-对乙酰氨基酚M3、3-甲氧基-对乙酰氨基酚M3-3、对乙酰氨基酚谷胱甘肽二钠盐M4、3-半胱氨酰-对乙酰氨基酚M5、硫甲基3-嗪-对乙酰氨基酚M5-1、3-N-乙酰-半胱氨硫酰-对乙酰氨基酚M5-2；
该方法包括以下步骤：
(1)内标物对照品溶液的配置
配置含有浓度为90～110ng/mL的木蝴蝶苷OA和浓度为9～11μg/mL的非那西汀PNT的对照品溶液，-18～-22℃放置备用，即得内标物对照品溶液；
(2)供试品溶液的配置
取解冻后的大鼠血浆样品45～55μL，加入所述内标物对照品溶液9～11μL和蛋白沉淀剂135～165μL，搅拌、混合均匀，作为供试品溶液；
(3)检测条件
液相色谱分离条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含有体积浓度0.09～0.11％HCOOH的体积比为95：5的水-乙腈溶液为流动相A、以含有体积浓度0.1％HCOOH的乙腈为流动相B进行洗脱，流速0.2～0.4mL/min，柱温22～28℃，自动进样器温度：3～5℃，进样量为4～6μL；
质谱检测条件：采用ESI离子源，选择质谱多反应监测MRM工作方式进行二级质谱分析，以非那西汀PNT为内标物，在正离子检测方式下检测对乙酰氨基酚APAP、3-甲氧基-对乙酰氨基酚M3-3、3-羟基-对乙酰氨基酚M3、对乙酰氨基酚谷胱甘肽二钠盐M4和硫甲基3-嗪-对乙酰氨基酚M5-1；以木蝴蝶苷OA为内标物，在负离子检测方式下检测4-硫酸-对乙酰氨基酚M1、葡萄醛酸化对乙酰氨基酚M2、3-半胱氨酰-对乙酰氨基酚M5和3-N-乙酰-半胱氨硫酰-对乙酰氨基酚M5-2；
(4)测定
取供试品溶液的上清液135～165μL，进样4～6μL，测定，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述液相色谱分离条件中，所述流动相按照如下程序进行洗脱：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，以ID为50mm×2.0mm的SHESEIDO CAPCEPAK C18柱为色谱柱。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述质谱检测条件中，具体检测参数如下：
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白沉淀剂选自甲醇、乙腈和乙酸乙酯中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白沉淀剂为甲醇。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述内标物对照品溶液的配置中，具体配置过程如下：
精密称取非那西汀PNT和木蝴蝶苷OA，分别加入适量甲醇后，分别得浓度均为0.9～1.1mg/mL的非那西汀PNT和木蝴蝶苷OA储备液，-70～-90℃放置备用；
精确量取木蝴蝶苷OA储备液9～11μL，置于1～3mL离心管中，加入891～1089μL甲醇，得浓度为9～11μg/mL的木蝴蝶苷OA溶液；
分别取浓度为9～11μg/mL的木蝴蝶苷OA溶液和浓度为0.9～1.1mg/mL的非那西汀PNT储备液各9～11μL，加入至1～3mL离心管中，加入882～1078μL甲醇，得到含有浓度为90～110ng/mL的木蝴蝶苷和浓度为9～11μg/mL的非那西汀的对照品溶液，-18～-22℃放置备用，即得内标物对照品溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述内标物对照品溶液的配置中，具体配置过程如下：
精密称取非那西汀PNT和木蝴蝶苷OA，分别加入适量甲醇后，分别得浓度为1mg/mL的非那西汀PNT和木蝴蝶苷OA储备液，-80℃放置备用；
精确量取木蝴蝶苷OA储备液10μL，置于2mL离心管中，加入990μL甲醇，得浓度均为10μg/mL的木蝴蝶苷OA溶液；
分别取浓度为10μg/mL的木蝴蝶苷OA溶液和浓度为1mg/mL的非那西汀PNT储备液各10μL，加入至2mL离心管中，加入980μL甲醇，得到含有浓度为100ng/mL的木蝴蝶苷和浓度为10μg/mL的非那西汀的对照品溶液，-20℃放置备用，即得内标物对照品溶液。
9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)内标物对照品溶液的配置
配置含有浓度为100ng/mL的木蝴蝶苷和浓度为10μg/mL的非那西汀的对照品溶液，-20℃放置备用，即得内标物对照品溶液；
(2)供试品溶液的配置
取解冻后的大鼠血浆样品50μL，加入所述内标物对照品溶液10μL和甲醇150μL，搅拌、混合均匀，作为供试品溶液；
(3)检测条件
液相色谱分离条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含有体积浓度0.1％HCOOH的体积比为95：5的水-乙腈溶液为流动相A、以含有体积浓度0.1％HCOOH的乙腈为流动相B进行洗脱，流速0.3mL/min，柱温25℃，自动进样器温度：4℃，进样量为5μL；
质谱检测条件：采用ESI离子源，选择质谱多反应监测MRM工作方式进行二级质谱分析，以非那西汀PNT为内标物，在正离子检测方式下检测对乙酰氨基酚APAP、3-甲氧基-对乙酰氨基酚M3-3、3-羟基-对乙酰氨基酚M3、对乙酰氨基酚谷胱甘肽二钠盐M4、硫甲基3-嗪-对乙酰氨基酚M5-1；以木蝴蝶苷OA为内标物，在负离子检测方式下检测4-硫酸-对乙酰氨基酚M1、葡萄醛酸化对乙酰氨基酚M2、3-半胱氨酰-对乙酰氨基酚M5、3-N-乙酰-半胱氨硫酰-对乙酰氨基酚M5-2；
(4)测定
取供试品溶液的上清液150μL，进样5μL，测定，即得。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，
所述供试品溶液的配置中，按照如下步骤进行搅拌、混合均匀：先在离心速度2000rpm下涡旋混合5min后，然后在4℃下以离心力14000g离心5min；
在所述供试品溶液的配置中，还包括如下步骤：
取解冻后的大鼠血浆样品5μL，加入45μL水、所述内标物对照品溶液10μL和甲醇150μL，搅拌、混合均匀，即得稀释10倍后的供试品溶液；
取解冻后的大鼠血浆样品5μL，加入45μL水进行稀释，取稀释后的大鼠血浆样品5μL，再加入45μL水进行二次稀释，取二次稀释后的大鼠血浆样品50μL加入所述内标物对照品溶液10μL和甲醇150μL，搅拌、混合均匀，即得稀释100倍后的供试品溶液。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104195218A (zh) * 2014-09-03 2014-12-10 广东中西达一新药开发有限公司 一种细胞色素p450酶的特异性探针底物组合物及其应用
CN104849371A (zh) * 2015-05-22 2015-08-19 无锡市人民医院 一种同时测定人肝微粒体中7种cyp450酶探针底物代谢产物的检测方法
WO2015157407A1 (en) * 2014-04-08 2015-10-15 Metabolon, Inc. Small molecule biochemical profiling of individual subjects for disease diagnosis and health assessment

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015157407A1 (en) * 2014-04-08 2015-10-15 Metabolon, Inc. Small molecule biochemical profiling of individual subjects for disease diagnosis and health assessment
CN104195218A (zh) * 2014-09-03 2014-12-10 广东中西达一新药开发有限公司 一种细胞色素p450酶的特异性探针底物组合物及其应用
CN104849371A (zh) * 2015-05-22 2015-08-19 无锡市人民医院 一种同时测定人肝微粒体中7种cyp450酶探针底物代谢产物的检测方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JI HYE AN等: "Quantitative analysis of acetaminophen and its six metabolites in rat plasma using liquid chromatography/tandem mass spectrometry", 《BIOMED. CHROMATOGR.》 *
JOHN M. WILSON等: "ANALYSIS OF ACETAMINOPHEN METABOLITES IN URINE BY HIGHPERFORM LIQUID CHROMATOGRAPHY WITH UV AND AMPEROMETRIC DETECTION", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY》 *
SARAH F. COOK等: "Simultaneous quantification of acetaminophen and five acetaminophen metabolites in human plasma and urine by high-performance liquid chromatography–electrospray ionization-tandem mass spectrometry: Method validation and application to a neonatal", 《JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B》 *
李嫣等: "分化实验"内标法测定对乙酰氨基酚"的重新设计", 《实验室科学》 *

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