CN104849371A - 一种同时测定人肝微粒体中7种cyp450酶探针底物代谢产物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时测定人肝微粒体7种CYP450酶探针底物代谢产物的检测方法，属于生物检测技术领域。将CYP450酶的特异性探针底物与人肝微粒体温孵不同的反应时间后，生成相应的代谢产物，以扎托布洛芬为内标，蛋白沉淀法预处理后，采用高效液相色谱-串联质谱法可同时检测7种探针底物的代谢产物浓度。本发明方法特异性强、灵敏度高、操作简便，已成功运用于黄芩苷对人肝微粒体CYP450酶抑制作用的研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种时测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
在药物的生物转化过程中，CYP450酶参与大多数内源性和外源性化合物的体内代谢，是药物代谢的关键酶，其活性决定药物的代谢速率和清除率；而CYP450酶同时又可以被多种药物抑制或诱导，从而产生代谢性药物相互作用，影响药效，产生不良反应。FDA于2012年颁布的《药物相互作用研究指南》中明确指出，进行药物相互作用研究时，需首先考察药物对CYP450酶活性的影响。细胞色素P450(CYP450)是人体中重要的氧化酶，包括CYP1A2，2B6，2C8，2C9，2C19，2D6和3A4/5等，超过90％以上的药物经其代谢。CYP450酶的抑制或诱导是引起代谢性药物相互作用的主要原因，特别是由代谢酶抑制所致的药物相互作用约占全部相互作用的70％。因此，研究药物对代谢酶的抑制作用，对临床合理用药和避免潜在的药物相互作用具有重要的指导意义。
高效液相-串联质谱法(HPLC-MS/MS)是检测药物浓度最常用的方法，具有其灵敏度高、特异性强等特点，可以对多种微量化合物同时进行检测，通过检测CYP450酶探针药物代谢产物的浓度，从而来判断代谢酶代谢能力的变化，是目前研究药物代谢酶活性最常用的一种检测方法。通过建立该检测方法可以应用于研究药物对CYP450酶的抑制和诱导作用。
目前经过系统验证的HPLC-MS/MS方法只能同时检测5种代谢产物：(1)同时测定5种CYP450酶探针药代谢产物的检测方法。专利申请号-:CN201010559684，吉林大学；(2)A high-throughput inhibition screening of major human cytochrome P450 enzymes using an in vitro cocktail and liquid chromatography-tandem mass spectrometry.Biomed Chromatogr.2014，28(2):197-203。
经检索，检测7种代谢产物的方法也具有缺陷性：如7种代谢产物并不是同时进行检测，而是采用HPLC和HPLC-MS/MS分别进行检测(曹秀珍，张伟，姚志红，等。甲基原薯蓣皂苷对人肝微粒体中7种CYP450酶活性的影响。沈阳药科大学学报，2008)；检测方法学没有经过严格的系统性验证(如：专属性、标准曲线、准确度、精密度等)。(刘丽雅，韩永龙，余奇，等.消癌平注射液等4种抗肿瘤中药注射剂对人肝微粒体中CYP450酶7种亚型的体外抑制作用研究.中国临床药理学与治疗学，2014，15(9)：522-527；刘海燕，张乐多，向志雄，等.体外“鸡尾酒法”研究5-羟基雷公藤内酯醇对人肝微粒体CYP450酶亚型的抑制.中国临床药理学与治疗学，2013，18(11)：1211-1218)。
发明内容
本发明的目的提供一种能够准确、高效的检测人肝微粒体中7种CYP450 酶探针底物代谢产物的方法，从而应用于CYP450酶7种亚型活性的评价。
按照本发明提供的技术方案，一种测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的方法，步骤为：
(1)人肝微粒体的孵化：选取不同的代谢酶探针底物，分别与人肝微粒体和Tris-HCL缓冲液(50mmol/L，pH＝7.4)37℃预温孵5～10min后，再加入20μL NADPH(0.1mmol/L)启动反应，温孵不同的反应时间，反应总体积为200μL(有机溶剂体积<0.5％总体积)(见表1)。
表1 CYP450酶探针底物在人肝微粒体温孵体系中的反应条件和生成代谢产物
(2)人肝微粒体样品预处理：将温孵后200μL人肝微粒体样品，加入200μL含500ng/mL扎托布洛芬的冰乙腈终止反应。涡旋混匀5～10min，13000rpm离心10～15min，离心后取上清液。
(3)色谱：将步骤(2)预处理后的人肝微粒体样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱：ZORBXA Eclipse-plus C18柱；流动相：甲醇(A)：水，水中还含有质量浓度0.1％的甲酸；梯度洗脱：0→0.8min，5％A；0.8→5.0min，95％A；5.0→7.0min，5％A。流速：200～300μL/min；柱温：30～35℃；进样量：5～10μL；
(4)质谱：电喷雾离子化正离子(ESI+)；喷雾电压：4000V；离子传输毛细管温度：350℃；雾化气压力：30psi；干燥气流速：10L/min；扫描方式：选择性反应监测(SRM)；监测离子对和碰撞能量：对乙酰氨基酚(152/110，16eV)、1-羟基安非他酮(256/238，10eV)、4-羟基双氯芬酸(312/230，30eV)、6-羟基紫杉醇(870/286，34eV)、4-羟基美芬妥英(235/150，19eV)、右啡烷(258/157，37eV)、1-羟基咪达唑仑(342/203，24eV)、内标：扎托布洛芬(299/225，17eV)。
(5)计算：采用内标法，以7种探针底物代谢产物和扎托布洛芬(内标)的峰面积比值分别代入各自的标准曲线方程，计算温孵后人肝微粒体样品中代谢产物的浓度。
本发明的有益效果：
(1)预处理方法简便：采用一步蛋白沉淀法，适用于常规检测。
(2)专属性强，采用ZORBXA Eclipse-plus C18色谱柱进行分离，甲醇:水 (0.1％甲酸)的混合液作为流动相，梯度洗脱，7种代谢产物均具有良好的分离度，可在7min内完成测定。
(3)本方法采用梯度洗脱法，将需要多次分析的7种不同性质的化合物在一次色谱条件中成功的分离，并采用ESI+源，SRM扫描方式结合内标法，将7种探针底物的代谢产物同时定量分析，大大节省了检测时间。
(4)检测快速：7min完成样品的一次测定，时间短，因此适合大批量的生物样品的检测。
(5)样品用量小：仅需200μL人肝微粒体样品，即可测定出准确代谢物浓度。
(6)本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为评价药物对CYP450酶的抑制和诱导作用提供了依据。本方法的日内、日间精密度RSD均小于15％。
附图说明
图1为空白人肝微粒体温孵后的质谱图。
图2为7种探针底物代谢产物和内标扎托布洛芬的质谱图。
图3黄芩苷对人肝微粒体CYP1A2和2C19的抑制曲线图。
图中A:对乙酰氨基酚，保留时间为3.35min；B:4-羟基美芬妥英，保留时间为3.64min；C:1-羟基安非他酮，保留时间为3.48min；D:右啡烷，保留时间为3.40min；E:扎托布洛芬，保留时间为4.84min；F:4-羟基双氯芬酸，保留时间为4.35min；G:1-羟基咪达唑仑，保留时间为3.95min；H:6-羟基紫杉醇，保留时间为4.44min。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明，然而本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：考察黄芩苷对人肝微粒体CYP450酶7种亚型的抑制作用。
(1)色谱：将步骤(2)预处理后的人肝微粒体样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱：ZORBXA Eclipse-plus C18柱；流动相：甲醇(A)：水，水中还含有质量浓度0.1％的甲酸；梯度洗脱：0→0.8min，5％A；0.8→5.0min，95％A；5.0→7.0min，5％A。流速：200～300μL/min；柱温：30～35℃；进样量：5～10μL；
(2)质谱：电喷雾离子化正离子(ESI+)；喷雾电压：4000V；离子传输毛细管温度：350℃；雾化气压力：30psi；干燥气流速：10L/min；扫描方式：选择性反应监测(SRM)；监测离子对和碰撞能量：对乙酰氨基酚(152/110，16eV)、1-羟基安非他酮(256/238，10eV)、4-羟基双氯芬酸(312/230，30eV)、6-羟基紫杉醇(870/286，34eV)、4-羟基美芬妥英(235/150，19eV)、右啡烷(258/157，37eV)、1-羟基咪达唑仑(342/203，24eV)、内标：扎托布洛芬(299/225，17eV)。
(3)专属性：人肝微粒体和Tris-HCL缓冲液(50mmol/L，pH＝7.4)，37℃水浴预温孵5～10min后，加入20μL NADPH(0.1mmol/L)启动反应，反应总体积为200μL(有机溶剂体积<0.5％总体积)，温孵30min后，加入200μL冰乙腈 终止反应。涡旋混匀5～10min，13000rpm离心10～15min，离心后取上清液5～10μL进HPLC-MS/MS分析，7种代谢产物加入EP管中，氮气挥干，加入人肝微粒体和Tris-HCL缓冲液(50mmol/L，pH＝7.4)，加入20μL NADPH(0.1mmol/L)，总体积为200μL(有机溶剂体积<0.5％总体积)，加入200μL含扎托布洛芬的冰乙腈终止反应。涡旋混匀5min，13000rpm离心10～15min，离心后取上清液5～10μL进HPLC-MS/MS分析。
在本实验所采用的LC-MS/MS条件下，无杂峰对检测的7种代谢产物造成干扰，7min内完成测定。各代谢产物和内标互不干扰，分离度好，峰形良好，基线平稳。
(4)标准曲线配制：将含有不同浓度的7种代谢产物的混合标准溶液，氮气下挥干后，加入人肝微粒体和Tris-HCL缓冲液(50mmol/L，pH＝7.4)，加入20μL NADPH(0.1mmol/L)，反应总体积为200μL，旋涡混匀，配制成7种代谢产物的标准曲线范围均为10-1000ng/mL。再加入200μL含500ng/mL扎托布洛芬的冰乙腈，涡旋混匀5～10min，13000rpm离心10～15min，离心后取上清液5～10μL进HPLC-MS/MS分析。各代谢产物在10-1000ng/mL的线性范围内线性关系良好(R2>0.99)，最低定量限均可达10ng/mL。
(5)准确度和精密度：按照人肝微粒体标准曲线方法配制含代谢产物浓度为20、250、800ng/mL的低、中、高的质控样品，按“人肝微粒体样品预处理”方法进行处理。连续3天，每天每个浓度5个平行样，计算日内、日间精密度和相对标准偏差(RSD)，实测浓度与理论浓度的比值即为准确度。结果显示，日内日间精密度RSD均小于15％，准确度符合要求。
(6)黄芩苷(浓度为0.5，1，2.5，5，10，25，50，100μmol/L)、探针底物(浓度见表1)、人肝微粒体和Tris-HCL缓冲液(50mmol/L，pH＝7.4)，37℃水浴预温孵5～10min后，加入20μL NADPH(0.1mmol/L)启动反应，反应总体积为200μL(有机溶剂体积<0.5％总体积)，继续温孵不同的反应时间后，加入200μL含500ng/mL扎托布洛芬的冰乙腈终止反应。处理后的人肝微粒体样品，涡旋混匀5～10min，13000rpm离心10～15min，离心后取上清液5～10μL进HPLC-MS/MS分析，观察黄芩苷对7种代谢产物生成的抑制作用(IC50)。每个样品平行操作3管。
结果表明，黄芩苷对人肝微粒体CYP1A2和2C19有较弱的抑制作用，对其他亚型无抑制作用，IC50分别为39.72和40.91μmol/L，结果见表2和图3。
按照通用的CYP450酶抑制剂强度分级规则：IC50<1μmol/L为强抑制剂，1μmol/L<IC50<10μmol/L为中等强度抑制剂，10μmol/L<IC50<50μmol/L为弱抑制剂。因此，黄芩苷为CYP1A2和2C19的弱抑制剂。
表2 黄芩苷对人肝微粒体CYP450酶7种亚型的IC50
| CYP450酶亚型 | CYP1A2 | CYP2B6 | CYP2C8 | CYP2C9 | CYP2C19 | CYP2D6 | CYP3A4/5 |
| IC50(μmol/L) | 39.72 | >100 | >100 | >100 | 40.91 | >100 | >100 |
Claims (6)
1.一种同时测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的检测方法，其特征是步骤为：
（1）人肝微粒体的孵化：选取不同的代谢酶探针底物，分别与人肝微粒体和Tris-HCL缓冲液37℃预温孵5~10min后，再加入20μL 0.1mmol/L的NADPH启动反应，温孵不同的反应时间，反应总体积为200μL；其中有机溶剂体积小于 0.5%总体积；
（2）人肝微粒体样品预处理：在温孵后人肝微粒体样品，加入内标，即扎托布洛芬的冰乙腈终止反应；涡旋混匀离心取上清液；
（3）色谱：将步骤（2）预处理后的人肝微粒体样品进行液相色谱分离；
（4）质谱：对步骤（3）所得到的人肝微粒体样品继续进行质谱分离，记录；
（5）计算：采用内标法，以不同的探针底物代谢产物和内标扎托布洛芬的峰面积比值分别代入各自的标准曲线方程，计算温孵后人肝微粒体样品中代谢产物的浓度。
2.如权利要求1所述同时测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的检测方法，其特征是步骤（2）具体步骤如下：温孵后的200μL人肝微粒体样品，加入200μL 含500ng/mL内标扎托布洛芬的冰乙腈终止反应；涡旋混匀5~10min，13000rpm离心10~15min，离心后取上清液。
3.如权利要求1所述同时测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的检测方法，其特征是步骤（3）中色谱条件为：
色谱条件中色谱柱：ZORBXA Eclipse-plus C18柱；流动相：甲醇（A）：水，水中还含有质量浓度0.1%的甲酸；梯度洗脱 0→0.8 min，5% A；0.8→5.0 min，95% A；5.0→7.0 min，5% A；流速：200~300μL/min；柱温：30~35℃；进样量：5~10μL。
4.如权利要求1所述同时测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的检测方法，其特征是步骤（4）中质谱条件为：
电喷雾离子化正离子ESI+；喷雾电压4000V；离子传输毛细管温度：350℃；雾化气压力：30psi；干燥气流速：10L/min；扫描方式：选择性反应监测SRM；
监测离子对和碰撞能量：对乙酰氨基酚152/110，16eV、1-羟基安非他酮256/238，10eV、4-羟基双氯芬酸312/230，30eV、6-羟基紫杉醇870/286，34eV、4-羟基美芬妥英235/150，19eV、右啡烷258/157，37eV、1-羟基咪达唑仑342/203，24eV、内标：扎托布洛芬299/225，17eV。
5.如权利要求1所述同时测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的检测方法，其特征是步骤（3）中色谱柱长度为100mm，内径为2.1mm，填料粒径为3.5μm。
6.如权利要求1所述同时测定人肝微粒体中7种CYP450酶探针底物代谢产物的检测方法，其特征是：所述7种代谢酶为CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4/5。
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