CN105136961A - 一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法 - Google Patents
一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法，包括以下步骤：(1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物系列浓度的6α-羟基紫杉醇对照品，制备标准曲线样品；(2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；根据检测结果得到6α-羟基紫杉醇的标准曲线；(3)按照步骤(1)相同的方法制备待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤(2)相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的6α-羟基紫杉醇浓度。本发明检测方法分析时间短、灵敏度高、进样量小，符合方法学验证要求，适用于肝微粒体温孵样本中6α-羟基紫杉醇浓度的测定，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及药物的检测方法，具体涉及肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法。
背景技术
CYP450酶是参与药物代谢的主要酶系，包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4等与药物代谢密切相关的同工酶。研究表明，大部分药物-药物相互作用的发生与CYP450酶活性的诱导和抑制相关，其中主要由酶抑制引起。利用体外方法进行药物代谢研究，可有效缩短新药研发周期，直接观察酶对底物的选择性代谢和底物对酶的诱导和抑制，确定药物代谢途径，预测体内潜在的药物相互作用。目前，常用的体外方法为探针药物法，该方法通过建立肝微粒体温孵体系，从而建立了药物代谢研究模型。
6α-羟基紫杉醇是CYP2C8探针底物紫杉醇的代谢产物。因此，目前亟需一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的检测方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法，包括以下步骤：
(1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物和系列浓度的6α-羟基紫杉醇对照品，制备标准曲线样品；
(2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；
色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液；
梯度洗脱条件为：
运行时间为3分钟；
质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子源；
检测方式：正离子多反应监测；
根据检测结果得到6α-羟基紫杉醇的标准曲线；
(3)按照步骤(1)相同的方法，将底物紫杉醇与肝微粒体温孵体系共温孵，制备得到含有内标物的待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤(2)相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的6α-羟基紫杉醇浓度。
其中，温孵的时间为20min。
优选地，所述内标物为邻甲苯海拉明。
优选地，所述色谱条件中，流动相的流速为0.3mL/min。
优选地，所述色谱条件中，柱温为40℃。
优选地，所述色谱条件中，色谱柱为ACQUITYUPLC-BEHC18色谱柱，规格为1.7μm,2.1×50mm。
优选地，所述色谱条件中，进样量为1μL。
优选地，所述正离子多反应监测中，6α-羟基紫杉醇的母离子-子离子对为m/z870.41→m/z286.05，锥孔电压为9V，碰撞电压为16V；邻甲苯海拉明的母离子-子离子对为m/z270.10→m/z181.08，锥孔电压为15V，碰撞电压为12V。
优选地，所述质谱条件中，毛细管电压为3000V，离子源温度为150℃，去溶剂化温度为350℃，去溶剂化气体流速为650L/h。
优选地，所述质谱条件中，锥孔气体流速为150L/h，雾化气压力为6.0bar。
优选地，所述步骤(1)的标准曲线样品制备方法为：将6α-羟基紫杉醇加入肝微粒体温孵体系，所述肝微粒体温孵体系包含肝微粒体、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、MgCl2、PBS和NADP，再加入含内标的甲醇溶液，混匀，离心，取上清液，即得标准曲线样品。
其中，标准曲线样品的制备可以按照下述方法进行：分别将系列浓度的对照标准品6α-羟基紫杉醇加入肝微粒体温孵体系(包含肝微粒体、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、MgCl2、PBS和NADP)，再加入含内标的甲醇溶液，充分混匀3min，于4℃，13000rpm离心10min，取上清液即得。肝微粒可以采用人、大鼠、小鼠、犬、恒河猴、食蟹猴的肝微粒。
本发明专一地检测对肝微粒体中的6α-羟基紫杉醇浓度，色谱分析时间仅需3分钟，进样量仅需1μL，分析时间短、灵敏度高、进样量小。同时，本发明检测方法专属性强、基质效应小、线性和范围广、批内和批间准确度与精密度高、进样盘稳定性高、工作液稳定性高，符合方法学验证要求，适用于肝微粒体温孵样本中6α-羟基紫杉醇浓度的测定，具有广泛的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
所用肝微粒体为人肝微粒体。
图1为母离子和锥孔电压的优选结果。
图2的质谱条件为：离子对：m/z870.41→m/z105.07，锥孔电压9V，碰撞电压46V。
图3的质谱条件为：离子对：m/z870.41→m/z122.09，锥孔电压9V，碰撞电压32V。
图4的质谱条件为：离子对：m/z870.41→m/z286.05，锥孔电压9V，碰撞电压16V，也即本发明的质谱条件。
图5空白样本的色谱图。
图6LLOQ(定量下限)样本色谱图。
图7为待测样本色谱图。
图8为6α-羟基紫杉醇典型标准曲线。
具体实施方式
实施例1
所述试剂和仪器均来自市售的商品。
1、对照品及内标
6α-羟基紫杉醇(OH-TX)：分子量869.91，纯度95％，批号3-WXT-24-2(TCR)；
柠檬酸邻甲苯海拉明(IS,正离子内标)：纯度99％，批号048F0510V(sigma-aldrich)。
2、主要仪器
3、试验所用主要软件
UNIFI1.6.1：UPLC/MS/MS数据采集及浓度计算。
4、检测方法
(1)制备对照样品，加入内标物；
(2)将对照样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；检测条件如下：
色谱柱：ACQUITYUPLC-BEHC18,1.7μm,2.1×50mm(Waters公司)
流动相：A：0.1％甲酸水溶液
B：0.1％甲酸乙腈溶液
流速：0.3mL/min
柱温：40℃
进样盘温度：4℃
离子源：电喷雾离子化源(ESI)；
内标(IS)：10ng/mL邻甲苯海拉明甲醇溶液
梯度洗脱：
进样量：1μL
运行时间：3min
保留时间：tR(OH-TX)≈1.70min；tR(IS)≈1.57min
毛细管电压(Capillaryvoltage)：3.00kV
离子源温度(SourceTemperature)：150℃
去溶剂化温度(DesolvationTemperature)：350℃
去溶剂化气体流速(Desolvationgasflow)：650L/h
锥孔气体流速(Conegasflow)：150L/h
雾化气压力(Nebulizergaspressure)：6.0bar
检测方式：正离子多反应监测(MRM)
离子对：m/z870.41→m/z286.05(OH-TX)，m/z270.10→m/z181.08(IS)
锥孔电压(Conevoltage)：9V(OH-TX)和15V(IS)
碰撞电压(Collisionenergy)：16V(OH-TX)和12V(IS)
根据检测结果得到6α-羟基紫杉醇的标准曲线；
(3)按照步骤(1)相同的方法，将底物紫杉醇与肝微粒体温孵体系共温孵20min，制备得到含有内标物的待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤(2)相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的6α-羟基紫杉醇浓度。
在确定本发明的检测方法各项工艺参数中，发明人对本发明方法的色谱条件和质谱条件进行了筛选，结果如图1-4所示。
图1为母离子和锥孔电压的优选结果。
三种离子对的检测结果如下：
(1)图2的质谱条件为：
离子对：m/z870.41→m/z105.07，锥孔电压9V，碰撞电压46V。
结果显示强度为6456422。
(2)图3的质谱条件为：
离子对：m/z870.41→m/z122.09，锥孔电压9V，碰撞电压32V。
结果显示强度为4879034。
(3)图4的质谱条件为：
离子对：m/z870.41→m/z286.05，锥孔电压9V，碰撞电压16V，也即本发明的质谱条件。
结果显示强度为4317210。
综合考虑上述图谱和强度的结果，本发明的检测方法最佳。
5、方法学考察
分别考察了本发明检测方法的专属性、基质效应、线性和范围、批内和批间准确度与精密度、进样盘稳定性、工作液稳定性等。具体如下：
5.1专属性
分别取肝微粒，制备空白温孵体系样本，考察内源性物质对待测物和内标的影响。空白样本中内源性物质的干扰不应超过待测物定量下限(LLOQ)的20％和内标响应的5％。
空白样本、6α-羟基紫杉醇及内标邻甲苯海拉明的典型色谱图如图5-7所示。
结果显示，肝微粒温孵体系中内源性物质对6α-羟基紫杉醇及内标邻甲苯海拉明无影响。
5.2基质效应
制备空白肝微粒体温孵体系样本，分别加入低、中、高三个浓度的待测物对照品工作液和内标，同时制备不含基质样品，考察其基质效应，不应超过85％～115％。
结果如表1所示。
表16α-羟基紫杉醇基质效应考察
结果显示，6α-羟基紫杉醇基质效应为92.8％～100.0％％，基质效应小，证明本发明方法有效克服了基质效应。
5.3标准曲线
标准曲线：配制一定浓度梯度的待测物标准曲线样品，以待测物与内标峰面积的比值为纵坐标(y)，浓度为横坐标(x)，经加权最小二乘法(W＝1/x2)回归计算线性方程。
结果如表2和图8所示。
表26α-羟基紫杉醇标准曲线
结果显示，本发明检测方法在0.005～1μM范围内，线性关系良好。
5.4定量下限
平行配制5份定量下限样本(标准曲线最低浓度)，测定浓度的平均值偏差应在理论浓度±20％以内。
结果如表3所示。
表36α-羟基紫杉醇定量下限
结果显示，本发明检测方法的定量下限为0.005μM，灵敏度高。
5.5批内及批间准确度和精密度
准确度与精密度：配制低、中、高三个浓度的质控样本。每个浓度平行配制5份，连续测定3批，以当批标准曲线计算其浓度，批内和批间准确度偏差Dev％((测定浓度-理论浓度)/理论浓度×100)不超过±15％，精密度RSD％小于15％。
结果如表4所示。
表46α-羟基紫杉醇批内及批间准确度和精密度
结果显示，批内和批间准确度(Dev％)在-8.25％～8.00％之间，精密度(RSD％)在0.00％～6.85％之间。
5.6进样盘放置稳定性
进样盘稳定性：质控样本在进样盘内放置一定时间后重新进样检测。
结果如表5所示。
表56α-羟基紫杉醇4℃进样盘放置稳定性
结果显示，在4℃进样盘放置3天稳定。
5.7工作液稳定性
结果如表6所示。
表66α-羟基紫杉醇工作液稳定性
结果显示，工作液于2～8℃放置49天稳定。
实施例2本发明方法的应用
1、酶动力学试验
测定酶动力参数时，探针底物的浓度通常选择1/3Km～3Km之间，代谢速率应与反应时间成线性，且被代谢的底物应小于10％。在能生成可定量的代谢物的情况下应采用尽可能低的蛋白浓度以降低非特异性结合。结合文献报道的Km及预试验结果，选取肝微粒体蛋白浓度为0.2mg/mL，探针底物紫杉醇浓度分别为1、1.5、2、5、8、10、20和40μM。
温孵体系介质为0.1M磷酸缓冲液(PBS)，包含探针底物、肝微粒体(终浓度0.2mg/mL)和NADP再生系统(终浓度为10mMG-6-P，1U/mLG-6-PDH，10mMMgCl2，0.5mMNADP)，终体积200μL，有机溶剂含量不超过1％。先分别将不同浓度的探针底物与肝微粒体、G-6-P、G-6-PDH、MgCl2、PBS混匀后37℃预温孵5min，然后加入NADP(37℃预温孵)启动反应，反应20min后加入含内标的甲醇溶液(冰浴)200μL终止反应，充分混匀3min，于4℃，13000rpm离心10min，取上清液以本发明的方法测定紫杉醇的代谢物6α-羟基紫杉醇生成量，分别计算各底物浓度酶反应速率，通过非线性回归酶动力学模型计算酶动力学参数Km、Vmax。
2、抑制效应试验
温孵体系介质为0.1MPBS，包含探针底物、抑制剂、肝微粒体(终浓度0.2mg/mL)和NADP再生系统(终浓度为10mMG-6-P，1U/mLG-6-PDH，10mMMgCl2，0.5mMNADP)，终体积200μL，有机溶剂含量不超过1％。选取的底物紫杉醇浓度分别为1、1.5、2、5、8、10、20和40μM，特异性抑制剂槲皮素浓度0.5、1、5和10μM。先将不同浓度探针底物和不同浓度抑制剂与肝微粒体、G-6-P、G-6-PDH、MgCl2、PBS混匀后37℃预温孵5min，然后加入NADP(37℃预温孵)启动反应，20min后加入含内标的甲醇溶液(冰浴)200μL终止反应，充分混匀3min，于4℃，13000rpm离心10min，取上清液以本发明方法测定6α-羟基紫杉醇的生成量。计算各浓度水平酶反应速率，通过非线性回归酶动力学抑制模型拟合，判断抑制类型并计算抑制常数Ki。
综上所述，本发明检测方法专属性强、基质效应小、线性和范围广、批内和批间准确度与精密度高、进样盘稳定性高、工作液稳定性高、，符合方法学验证要求，适用于肝微粒体温孵样本中6α-羟基紫杉醇浓度的测定，具有广泛的应用前景。
Claims (10)
1.一种肝微粒体中6α-羟基紫杉醇浓度的UPLC/MS/MS检测方法，包括以下步骤：
(1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物和系列浓度的6α-羟基紫杉醇对照品，制备标准曲线样品；
(2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；
色谱条件如下：
色谱柱：C18色谱柱；
流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液；
梯度洗脱条件为：
运行时间为3分钟；
质谱条件如下：
离子源：电喷雾离子源；
检测方式：正离子多反应监测，监测的离子对为：6α-羟基紫杉醇的母离子-子离子对和内标物的母离子-子离子对；
根据检测结果得到6α-羟基紫杉醇的标准曲线；
(3)按照步骤(1)相同的方法，将底物紫杉醇与肝微粒体温孵体系共温孵，制备得到含有内标物的待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤(2)相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的6α-羟基紫杉醇浓度。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述内标物为邻甲苯海拉明。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件中，流动相的流速为0.3mL/min。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件中，柱温为40℃。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件中，色谱柱为ACQUITYUPLC-BEHC18色谱柱，规格为1.7μm,2.1×50mm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述色谱条件中，进样量为1μL。
7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述正离子多反应监测中，6α-羟基紫杉醇的母离子-子离子对为m/z870.41→m/z286.05，锥孔电压为9V，碰撞电压为16V；邻甲苯海拉明的母离子-子离子对为m/z270.10→m/z181.08，锥孔电压为15V，碰撞电压为12V。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于：所述质谱条件中，毛细管电压为3000V，离子源温度为150℃，去溶剂化温度为350℃，去溶剂化气体流速为650L/h。
9.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于：所述质谱条件中，锥孔气体流速为150L/h，雾化气压力为6.0bar。
10.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)的标准曲线样品制备方法为：将6α-羟基紫杉醇加入肝微粒体温孵体系，所述肝微粒体温孵体系包含肝微粒体、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、MgCl2、PBS和NADP，再加入含内标的甲醇溶液，混匀，离心，取上清液，即得标准曲线样品。
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| GR01 | Patent grant |