CN104195218A

CN104195218A - 一种细胞色素p450酶的特异性探针底物组合物及其应用

Info

Publication number: CN104195218A
Application number: CN201410446334.1A
Authority: CN
Inventors: 张素行; 张飞鹏; 叶沛珍; 陈涛; 龙娜; 张科之; 黄晓勇
Original assignee: GUANGDONG ZHONGXI DAYI DRUG DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: GUANGDONG ZHONGXI DAYI DRUG DEVELOPMENT Co Ltd
Priority date: 2014-09-03
Filing date: 2014-09-03
Publication date: 2014-12-10

Abstract

本发明涉及一种细胞色素P450(CYP450)酶的特异性探针底物组合物及其在细胞色素P450酶亚型酶活检测中的应用，所述组合物由非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、双氯酚酸和睾酮中的至少两种组成，通过所述特异性探针底物组合物和液相色谱-质谱联用技术可以同时检测多离子通道的特性，同时间测定6种CYP450酶的抑制情况，极大地提高了实验通量效率，降低了实验成本。

Description

一种细胞色素P450酶的特异性探针底物组合物及其应用

技术领域

本发明涉及酶学和生物分析技术领域，具体涉及一种特异性探针底物组合物及其应用，尤其涉及一种细胞色素P450酶的特异性探针底物组合物及其在细胞色素P450酶亚型酶活检测中的应用。

背景技术

细胞色素P450(CYP450)酶分布于肝脏、小肠和肾脏，其中CYP1A2、2A6、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、2E1和3A4等亚型与外源性物质(如药物)代谢清除密切相关，参与90％的药物代谢。在新药研发过程中，可以通过这些CYP450酶的探针底物在体外代谢体系(如人肝微粒体等)生成特异性代谢产物的速率，判断药物是否会抑制特定的CYP酶亚型，进而推断该药物是否会引起体内药物间相互作用，降低药效或增加毒性。

近年来，对高通量药物筛选的需求日益增加，目前，用于研究CYP活性的方法主要中，“cocktail”探针药物法较为常见，但其仍有很多不足之处，如构成该cocktail的几种药物在共同孵育时可能存在着相互作用，而且对分析方法的灵敏度和特异性要求较高，这样就会提高分析成本。

随着组合化学和高通量筛选手段的采用，需要进行CYP450酶抑制作用筛选的化合物急剧增多，而目前由于分析方法(如高效液相、紫外或荧光)的灵敏度限制，每次分析仅能预测化合物对单个酶的抑制作用，耗时低效。

因此，寻找一种可靠的混合探针底物和高灵敏度的分析方法是目前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性探针底物组合物及其应用，特别是一种细胞色素P450酶的特异性探针底物组合物及其在细胞色素P450酶亚型酶活检测中的应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种细胞色素P450(CYP450)酶的特异性探针底物组合物由非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、双氯酚酸和睾酮中的至少两种组成。本发明的特异性探针底物组合物例如可以是：非那西丁与香豆素、安非他酮、右美沙芬、双氯酚酸或睾酮中任意一种或至少两种的组合，或者，香豆素与非那西丁、安非他酮、右美沙芬、双氯酚酸或睾酮中任意一种或至少两种的组合等等，优选为非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、双氯酚酸和睾酮的组合物。

其中，所述非那西丁的浓度为7.5-30μM，例如可以是：7.5μM、8.5μM、10.5μM、12.5μM、15μM、18μM、20μM、23μM、25μM、30μM，优选为15-25μM，更优选为15μM。

所述香豆素的浓度为1.25-5μM，例如可以是1.25μM、1.5μM、2.0μM、2.25μM、2.5μM、2.75μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM，优选为1.25-3.5μM，更优选为2.5μM。

所述安非他酮的浓度为2.5-10μM，例如可以是2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.75μM、5μM、5.25μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.25μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM，优选为3.5-8μM，更优选为5μM。

所述右美沙芬的浓度为2.5-10μM，例如可以是2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.25μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.25μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM，优选为3.5-8μM，更优选为5μM。

所述双氯酚酸的浓度为2.5-10μM，例如可以是2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、5.25μM、6.5μM、7μM、7.5μM、8μM、8.25μM、8.5μM、9μM、9.5μM、10μM，优选为3.5-8μM，更优选为5μM。

所述睾酮的浓度为5-20μM，例如可以是5μM、6.5μM、8μM、10μM、12μM、15μM、16μM、17μM、18μM、20μM，优选为8-18μM，更优选为10μM。

第二方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的特异性探针底物组合物在检测细胞色素P450酶6种亚型酶活性的应用。

本发明的细胞色素P450酶可以是来源于肝、肾和胃肠道等含有P450酶的细胞和亚细胞器，如肝细胞、微粒体和S9等。

作为优选技术方案，本发明的应用包括利用如本发明第一方面所述的特异性探针底物组合物检测细胞色素P450酶6种亚型的抑制作用。

在进行检测时，可以结合液相色谱-质谱联用技术同时进行，或者采用高效液相色谱等检测手段，都可以实现对细胞色素P450酶6种亚型的抑制作用。

作为优选技术方案，本发明的检测方法包括以下步骤：

(1)将所述的特异性探针底物组合物同时与肝微粒体在体外进行孵化反应；

(2)采用液相色谱-质谱分析方法同时测定所述的特异性探针底物组合物及其生成的对应的6种代谢产物；

(3)选择6种细胞色素P450酶的特异性抑制剂加入到其所对应酶的单个探针底物及混合探针底物的反应体系中，测定生成的代谢物，计算相应IC50值。

优选地，所述孵化时间为5-20min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、12min、14min、15min、16min、18min、20min，优选为7-15min，更优选为10min。优选地，步骤(2)所述的代谢产物为对乙酰氨基酚、羟基香豆素、羟基安非他酮、右羟吗喃、4-羟基双氯酚酸和6β-羟基睾酮。

本发明的肝微粒体包括但不限于人源性的，还包括大鼠、小鼠、狗、猴、树鼩等灵长类动物，优选为人肝微粒体。

第三方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的特异性探针底物组合物制成药学上可接受的制剂。

作为优选技术方案，所述的制剂为溶液剂。

第四方面，本发明还提供了如本发明第一方面所述的特异性探针底物组合物在制备测定肝药酶活性药物的应用。

第五方面，本发明还提供了如本发明第三方面所述的制剂在制备测定肝药酶活性药物的应用。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明采用的6种混合CYP450酶探针底物，特异性强，任一探针底物均可被目标细胞色素P450高特异性地代谢成为相应的单羟化产物；相互间的干扰低，实现了在一个样品中多个反应互不干扰，可用于检测待测物对多个酶的抑制情况；

此外，本发明采用液相色谱-质谱联用技术进行定量分析，提高了实验通量效率，大大节约了检测的成本和时间，而且更接近肝组织代谢过程，更好地模拟了肝酶代谢环境。

附图说明

图1是本发明的特异性探针底物组合物与单独底物1A2对各CYP450酶的产物-时间曲线图。

图2是本发明的特异性探针底物组合物与单独底物2A6对各CYP450酶的产物-时间曲线图。

图3是本发明的特异性探针底物组合物与单独底物2B6对各CYP450酶的产物-时间曲线图。

图4是本发明的特异性探针底物组合物与单独底物3A4对各CYP450酶的产物-时间曲线图。

图5是本发明的特异性探针底物组合物与单独底物2D6对各CYP450酶的产物-时间曲线图。

图6是本发明的特异性探针底物组合物与单独底物2C9对各CYP450酶的产物-时间曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1筛选特异性强的CYP450酶探针底物

(1)分别测定CYP450酶和其常用的探针底物间的酶动力学参数，结果如表1所示，作为挑选探针底物的参考和依据。

表1

CYP450酶抑制反应通常需要满足孵育期间反应速度恒定的要求。从表1可以看出，咪达唑仑因为代谢过快，线性范围与其他底物不一致，所以改用睾酮作为3A4的底物；S-美芬妥因则代谢过慢，信号又较低，因而被排除；6-羟基氯唑沙宗只有负离子，也被排除；阿莫地喹对其他酶有较强的抑制作用，无法和其它底物一起孵育。因而本发明采用非那西丁、香豆素、安非他酮、右美杀芬、双氯酚酸和睾酮作为细胞色素R450的特异性探针底物。

其中，非那西丁，安非他酮和睾酮的Km值较高，考虑到尽可能降低对其他底物反应的影响，需适当降低这三个底物的浓度，非那西丁，睾酮降低4倍，安非他酮对其他酶有一定的抑制作用，需降低20倍以上。

(2)经过对探针底物浓度的调整，得到最终的各探针底物的最终实验条件如表2所示，最终确定各探针底物的浓度为：非那西丁的浓度为15μM，香豆素的浓度为2.5μM，安非他酮的浓度为5μM，右美沙芬的浓度为5μM，双氯酚酸的浓度为5μM，睾酮的浓度为10μM。

表2

CYP	底物	代谢产物	HLM浓度(mg/mL)	时间(min)	底物浓度(μM)
						1A2	非那西丁	对乙酰氨基酚	0.1	10	15
2A6	香豆素	羟基香豆素	0.1	10	2.5
						2B6	安非他酮	羟基安非他酮	0.1	10	5
2D6	右美沙芬	右羟吗喃	0.1	10	5
						2C9	双氯酚酸	4-羟基双氯酚酸	0.1	10	5
3A4	睾酮	6β-羟基睾酮	0.1	10	10

实施例2特异性探针底物组合物检测CYP450酶6种亚型的抑制作用

(1)将特异性探针底物组合物同时与人肝微粒体在体外进行孵化反应：

a.仪器与试药

8道或12道移液器，96孔深孔板，1000×的各底物贮存液，商品化人肝微粒体，NAPDH辅酶，待测试药物。

b.微粒体体外孵化反应体系

将待测试药物与6种底物、NAPDH辅酶和人肝微粒体混合，于37℃孵育10分钟后，用乙腈终止反应，取上清，送样检测。

(2)采用液相色谱-质谱同时分析测定所述的特异性探针底物组合物及其生成的对应的6种代谢产物：

a.采用超高效液相色谱质谱联用技术分析样品

仪器：CTC HTS-XT进样器；岛津公司LC20AD液相；AB公司API4000质谱。

b.6种代谢产物及内标的色谱质谱行为

液相色谱条件：菲罗门公司Synergi，C18,80A，4μm，30×2mm色谱柱；色谱柱温度25℃；流动相：A为含有0.1％甲酸的去离子水，B为含有0.1％甲酸的乙腈；梯度洗脱程序：0～0.3min，5％B；0.3～3min，5％B～40％B；3～4min，40％B～90％B；4～4.5min，90％B；4.5～5min，90％B～5％B；流速0.4mL/min，进样量：10μL。

质谱条件：电喷雾正离子电离(ESI+)；锥孔电压：5500V；毛细管温度500度。

对所有探针底物和代谢产物以及内标进行母离子和子离子扫描，选择丰度最大的产物离子进行多级反应监测，各代谢产物的多级反应监测参数见表3。

表3

化合物

母离子

子离子

去簇电压

碰撞能量(eV)

			(eV)
					甲苯磺丁脲(内标)	271.3	155	70	26
对乙酰氨基酚	151.9	110.1	64	21
					4-羟基双氯酚酸	312	231	32	29
去甲右美沙芬	258.1	157	103	60
					6β-羟基睾酮	305.2	269.3	80	19
羟基安非他酮	256.1	238	61	18
					7-羟基香豆素	162.9	119.1	70	24

比较使用本发明的特异性探针底物混合物(6in1底物)和单独底物时各CYP酶的产物-时间的关系，如图1所示。其中图1中的斜率为反应速度。

从图1-图6可以看出，6个CYP450酶在使用6in1底物和每个单个底物时，15分钟内的产物量和时间呈线性关系，从表4可以看出，6in1底物的反应速度为单独底物的80％-100％。证明混合底物互相之间的干扰在可控范围内。

表4

选用非特异性CYP450酶抑制剂1-氨基苯并三唑(1-ABT)，使用6in1底物或单一底物考察药物对CYP450酶的抑制作用是否有差异，IC50值的测定结果如表5所示。

表5

1-ABT对1A2，2D6和2B6的IC₅₀值在用6in1底物和单一底物时差异较大，分析原因时发现，因为1-ABT对2B6酶的抑制作用不明显，在最大浓度1mM时，1-ABT对2B6的抑制率为35.2％±4.3(6in1)和43.2％±0.69(单一底物)。对于1A2和2D6，使用6in1底物比使用单一底物获得的IC₅₀值略低，说明6in1底物不会造成假阴性的偏差。

使用6in1底物和单一底物计算的酶活力比较结果如表6所示。使用t-test比较6in1底物和单一底物获得结果的差异，p值都大于0.05，显示两组数据总体无显著差异。

表6

使用选择性更强的标准抑制剂分别用6in1底物和单一底物计算IC₅₀值，结果如表7所示。

表7

由表7可以看出，标准抑制剂与混合探针底物反应后所得的IC50值和与单个探针底物反应后所得的IC50值具有很好的一致性。

从实施例1-2可以得出，本发明采用混合探针底物方法和液相色谱-质谱联用技术可以高效快速地同时预测化合物对CYP450酶6种亚型的抑制作用，在药物研发过程中可以代替传统一次试验采用单个探针底物预测一种CYP450酶亚型的做法，而且，特异性探针底物组合物特异性强，在合适的反应条件下，可以将其相互间的干扰降低到对实验影响不大的水平，从而实现在一个样品中多个反应互不干扰，可用于检测待测物对多个酶的抑制情况，满足了药物研发早期的高通量要求，具有重要的意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种细胞色素P450(CYP450)酶的特异性探针底物组合物，其特征在于，所述组合物由非那西丁、香豆素、安非他酮、右美沙芬、双氯酚酸和睾酮中的至少两种组成；其中，非那西丁的浓度为7.5-30μM，香豆素的浓度为1.25-5μM，安非他酮的浓度为2.5-10μM，右美沙芬的浓度为2.5-10μM，双氯酚酸的浓度为2.5-10μM，睾酮的浓度为5-20μM。

2.根据权利要求1所述的特异性探针底物组合物在检测细胞色素P450酶6种亚型酶活性中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的应用包括采用权利要求1所述的特异性探针底物组合物检测细胞色素P450酶6种亚型的抑制作用；

优选地，采用权利要求1所述的特异性探针底物结合液相色谱-质谱联用技术或高效液相色谱技术检测细胞色素P450酶6种亚型的抑制作用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤：

(3)选择6种细胞色素P450酶的特异性抑制剂加入到其所对应酶的单个探针底物及混合探针底物的反应体系中，测定生成的代谢物，计算相应IC50值；

优选地，所述孵化时间为5-20min，优选为10min。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述的代谢产物为对乙酰氨基酚、7-羟基香豆素、羟基安非他酮、去甲右美沙芬、4-羟基双氯酚酸和6β-羟基睾酮。

6.根据权利要求1所述的特异性探针底物组合物制成药学上可接受的制剂。

7.根据权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述的制剂为溶液剂。

8.根据权利要求1所述的特异性探针底物组合物在制备测定肝药酶活性药物的应用。

9.根据权利要求6所述的制剂在制备测定肝药酶活性药物的应用。