CN102816830A - 检测药物对人肝细胞色素p450抑制作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测药物对人肝细胞色素P450抑制作用的方法,通过将探针药物、测试药物与含有所述细胞色素P450的人肝微粒体共同孵育后,检测探针药物的代谢产物,可有效地检测测试药物对细胞色素P450的抑制作用,为工业上药物的研发、筛选、和临床上用药指导提供一种便利的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种医药检测技术,尤其涉及一种检测药物对人细胞色素P450(或其亚型)抑制作用的方法。
背景技术
药物相互作用一般分为药动学相互作用和药效学相互作用。药动学相互作用可发生在吸收、分布、代谢、排泄4个阶段,其中代谢性相互作用发生率最高,约占药动学相互作用的40%,具有非常重要的临床意义。药物代谢的主要场所是肝脏,肝脏进行生物转化则依赖于微粒体中的多种酶系,其中最重要的是细胞色素P450混合功能氧化酶(简称CYP450)。
细胞色素P450是人体最重要的药物代谢酶,主要分布于肝脏,参与内源性物质(如类固醇激素、花生四烯酸等)和外源性物质(如药物、环境致癌物等)的生物转化,药物在人体内的许多代谢动力学特征,如药物半衰期、肝脏首过效应、药物相互作用、清除率和生物利用度等均和参与其代谢的细胞色素P450有关。细胞色素P450又被称为肝微粒体酶,其包括多种亚型,其中参与药物代谢的亚型主要有CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4等。
CYP450可受遗传、年龄、机体状态、营养、疾病、吸烟、饮酒等各种因素的影响,尤其药物能够明显影响药酶的活性。代谢性药物相互作用在药品不良反应中占有很大比例,但是,目前由于对用药者还不能普遍地开展相关基因遗传多态性检测,用基因芯片检定整个人类基因寻找药效相关的多态性点位的做法也不切实际,为减轻或避免代谢性药物相互作用的发生,最简便易行的方法是合理选用药物,目前,代谢性药物相互作用已成为申报新药的必备项目,因此,考察药物对人细胞色素P450的抑制作用,进行前瞻性的早期预防,可避免药物相互作用引起的毒副作用或疗效降低,对于药物筛选、临床指导用药等方面至关重要。
发明内容
本发明提供了一种检测药物对人肝细胞色素P450抑制作用的方法,通过将探针药物、测试药物与含有所述人细胞色素P450的微粒体共同孵育后,检测探针药物的代谢产物,可有效的检测药物对人细胞色素P450的抑制作用,为工业上药物的研发、筛选、和临床上用药指导提供一种便利的方法。
本发明所述检测药物对人肝细胞色素P450抑制作用的方法,步骤包括:
步骤1,选择人细胞色素P450的探针药物,将测试药物、探针药物与含所述人细胞色素P450的微粒体共同孵育;
步骤2,孵育结束后,检测探针药物在其特异性亚酶的作用下转化生成代谢产物的量,代谢产物生成量越大,则测试药物对所述人细胞色素P450抑制作用越小。
本发明所述的方法中,以未加测试药物组酶的活性为100%,然后检测加入测试药物后生成代谢产物的量,与未加测试药物组进行对比。
优选地,检测加入浓度梯度组所述测试药物后探针药物的代谢产物的量。
本发明上述的方法中,还可以包括步骤3,将加入浓度梯度组测试药物后测得的探针药物代谢产物生成速率与测试药物浓度之间按照非线性回归作图,和/或计算半数抑制浓度IC50;IC50值越小代表抑制作用越强。
本发明所述的人细胞色素P450可以是其任意亚型(特异性酶),人细胞色素P450亚型优选自CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4中的任意一种或其任意组合。
本发明所述含人细胞色素P450的微粒体优选为人肝微粒体。
本发明上述的方法中,所述亚型CYP1A2的探针药物为非那西丁、CYP2C9的探针药物为双氯芬酸、CYP2C19的探针药物为s-(+)美芬妥英、CYP2D6的探针药物为右美沙芬、CYP3A4的探针药物为咪达唑仑和睾酮中的任意一种或其混合物。
其中,所述探针药物的代谢产物可以是一种或几种,并且优选为检测如下代谢产物:非那西丁的代谢产物包括对乙酰氨基酚、双氯芬酸的代谢产物包括4-羟基双氯芬酸、s-(+)美芬妥英的代谢产物包括4-羟基美芬妥英、右美沙芬的代谢产物包括去甲右美沙芬(右啡烷)、咪达唑仑的代谢产物包括1′-羟基咪达唑仑、和睾酮的代谢产物包括6β-羟基睾酮。
本发明上述方法中,所述孵育体系优选为:终体积为150μl的肝微粒体体外孵育体系包括微粒体、pH值为7.4的磷酸缓冲液、MgCl2、探针药物和测试药物。
其中,微粒体蛋白浓度优选为0.01~1mg/ml,更优选为0.02~0.8mg/ml,更优选为0.05~0.5mg/ml,如0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg//ml。
其中,所述孵育时间优选为1~60min,更优选为2~50min,如5min、10min、20min、30min、40min。
其中,所述探针药物浓度优选为0.5~100μmol/L,更优选为1~80μmol/L,如2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L、50μmol/L。
其中,所述孵育过程中,还加入再生系统,所述再生系统优选为包括G-6-P(浓度5mM)、NADP+(浓度1mM)和G-6-PDH(浓度1unit/ml)的NADPH再生系统。
其中,孵育体系中,溶剂可以包括有机溶剂、水,有机溶剂体积百分比优选控制在5%范围内,更优选控制在2%范围内,更优选控制在1%范围内。
其中,所述孵育结束包括:用含内标的溶液终止反应,离心分离,取上清。
所述内标优选为维拉帕米、美洛昔康中的一种或其组合,其在所述含内标的溶液中的浓度优选为5~50nM,如10nM、25nM、100nM、200nM。
所述含内标的溶液,溶剂优选为乙腈。
所述离心优选为涡旋震荡10~60s(如20s、30s、50s)后,12000×g离心5~30min,优选为10~20min,如12 min、15min、17min。
其中,所述在后续代谢产物检测前,上清液可以进行稀释,如1:1稀释。
本发明上述方法中,所述代谢产物量的测定,可以采用本领域任意已知的方法,如质谱、色谱(包括气相色谱、液相色谱、高效液相色谱)、色谱/质谱联用。
本发明上述方法中,所述测试药物可以是任意的代谢性药物,如大内环酯类药物、抗真菌药物、H1受体拮抗剂、H2受体拮抗剂、质子泵抑制剂、抗抑郁剂、安定药、HMG-CoA还原酶抑制剂等。
本发明提供的检测药物对人细胞色素P450抑制作用的检测方法,能够帮助人们掌握各种药物代谢的酶学基础、结构特征、代谢途径、与肝药酶的结合和催化能力、药酶的底物、诱导剂和抑制剂等,从而帮助筛选出合适的药物、或者判断药物是否适用,避免和降低代谢性药物相互作用的发生,因此,本发明所提供的方法具有显著的社会效益和经济效益。
附图说明
图1为三种孵育时间下,不同微粒体蛋白浓度代谢产物形成的量,其中,图1A为非那西丁作为CYP1A2的探针药物、图1B为双氯芬酸作为CYP2C9的探针药物、图1C为s-(+)美芬妥英作为CYP2C19的探针药物、图1D为右美沙芬作为CYP2D6,图1E为睾酮作为CYP3A4探针药物,图1F为咪达唑仑作为CYP3A4探针药物;
图2为三种微粒体蛋白浓度下,不同孵育时间代谢产物形成的量,其中,图2A为非那西丁作为CYP1A2的探针药物、图2B为双氯芬酸作为CYP2C9的探针药物、图2C为s-(+)美芬妥英作为CYP2C19的探针药物、图2D为右美沙芬作为CYP2D6,图2E为睾酮作为CYP3A4探针药物,图2F为咪达唑仑作为CYP3A4探针药物;
图3为探针药物酶动力学曲线,其中,图3A为非那西丁作为CYP1A2的探针药物、图3B为双氯芬酸作为CYP2C9的探针药物、图3C为s-(+)美芬妥英作为CYP2C19的探针药物、图3D为右美沙芬作为CYP2D6,图3E为睾酮作为CYP3A4探针药物,图3F为咪达唑仑作为CYP3A4探针药物。
图4为本发明检测药物对人肝细胞色素P450的抑制作用的方法流程图。
具体实施方式
实施例1
选用非那西丁作为CYP1A2的探针药物。
建立体外孵育体系;将不同浓度的测试药物、探针药物与人肝微粒体共孵育。
孵育体系:终体积为150μl的肝微粒体体外孵育体系包括一定浓度的微粒体、pH为7.4的磷酸缓冲液(100mM)、MgCl2溶液(3mM)、各个亚型对应的不同的探针药物和不同浓度的测试药物。
37℃水浴中预孵化5 min,加入由G-6-P(5mM)、NADP+(1mM)和G-6-PDH(1unit/mL)组成的NADPH再生系统,启动反应,孵化特定的时间,整个孵育体系控制有机溶剂的体积浓度在1%以内。蛋白浓度与孵育时间见表1。
孵育反应终止后,用含内标维拉帕米的冰乙腈终止反应,涡旋震荡30s,12000×g离心12min,取上清液5μl进样,内标浓度见表1。
上清液按照1:1的比例稀释,采用色谱法分离探针药物代谢产物对乙酰氨基酚含量,色谱条件包括:色谱柱:Aglient XDB C18柱(50 mm×2.1mm,3.5μm);Zorbax SB-C8保护柱(2.1mm×12.5mm);流动相为乙腈(含体积百分比为0.1%的甲酸):水(含体积百分比为0.1%的甲酸),梯度洗脱,流速为0.35ml/min,进样量为5μl;柱温为35℃。梯度洗脱条件见表2-1。
实施例2
选用双氯芬酸作为CYP2C9的探针药物。
建立体外孵育体系;将不同浓度的测试药物、探针药物与人肝微粒体共孵育。
孵育体系:终体积为150μl的肝微粒体体外孵育体系包括一定浓度的微粒体、pH为7.4的磷酸缓冲液(100mM)、MgCl2溶液(3mM)、各个亚型对应的不同的探针药物和不同浓度的测试药物。
37℃水浴中预孵化5 min,加入由G-6-P(5mM)、NADP+(1mM)和G-6-PDH(1unit/mL)组成的NADPH再生系统,启动反应,孵化特定的时间,整个孵育体系控制有机溶剂的体积浓度在1%以内。蛋白浓度与孵育时间见表1。
孵育反应终止后,用含内标维拉帕米的冰乙腈终止反应,涡旋震荡30s,12000×g离心12min,取上清液5μl进样,内标浓度见表1。
采用色谱法分离探针药物代谢产物4-羟基双氯芬酸含量,色谱条件包括:色谱柱:Aglient XDB C18柱(50 mm×2.1mm,3.5μm);Zorbax SB-C8保护柱(2.1mm×12.5mm);流动相为乙腈(含体积百分比为0.1%的甲酸):水(含体积百分比为0.1%的甲酸),梯度洗脱,流速为0.35ml/min,进样量为5μl;柱温为35℃。梯度洗脱条件见表2-2。
实施例3
选用s-(+)美芬妥英作为CYP2C19的探针药物。
建立体外孵育体系;将不同浓度的测试药物、探针药物与人肝微粒体共孵育。
孵育体系:终体积为150μl的肝微粒体体外孵育体系包括一定浓度的微粒体、pH为7.4的磷酸缓冲液(100mM)、MgCl2溶液(3mM)、各个亚型对应的不同的探针药物和不同浓度的测试药物。
37℃水浴中预孵化5 min,加入由G-6-P(5mM)、NADP+(1mM)和G-6-PDH(1unit/mL)组成的NADPH再生系统,启动反应,孵化特定的时间,整个孵育体系控制有机溶剂的体积浓度在1%以内。蛋白浓度与孵育时间见表1。
孵育反应终止后,用含内标美洛昔康的冰乙腈终止反应,涡旋震荡30s,12000×g离心12min,取上清液5μl进样,内标浓度见表1。
采用色谱法分离探针药物代谢产物4-羟基美芬妥英含量,色谱条件包括:色谱柱:Aglient XDB C18柱(50 mm×2.1mm,3.5μm);Zorbax SB-C8保护柱(2.1mm×12.5mm);流动相为乙腈(含体积百分比为0.1%的甲酸):水(含体积百分比为0.1%的甲酸),梯度洗脱,流速为0.35 ml/min,进样量为5μl;柱温为35℃。梯度洗脱条件见表2-3。
实施例4
选用右美沙芬作为CYP2D6的探针药物。
建立体外孵育体系;将不同浓度的测试药物、探针药物与人肝微粒体共孵育。
孵育体系:终体积为150μl的肝微粒体体外孵育体系包括一定浓度的微粒体、pH为7.4的磷酸缓冲液(100mM)、MgCl2溶液(3mM)、各个亚型对应的不同的探针药物和不同浓度的测试药物。
37℃水浴中预孵化5 min,加入由G-6-P(5mM)、NADP+(1mM)和G-6-PDH(1unit/mL)组成的NADPH再生系统,启动反应,孵化特定的时间,整个孵育体系控制有机溶剂的体积浓度在1%以内。蛋白浓度与孵育时间见表1。
孵育反应终止后,用含内标维拉帕米的冰乙腈终止反应,涡旋震荡30s,12000×g离心12min,取上清液5μl进样,内标浓度见表1。
采用色谱法分离探针药物代谢产物右啡烷含量,色谱条件包括:色谱柱:Aglient XDB C18柱(50 mm×2.1mm,3.5μm);Zorbax SB-C8保护柱(2.1mm× 12.5mm);流动相为乙腈(含体积百分比为0.1%的甲酸):水(含体积百分比为0.1%的甲酸),梯度洗脱,流速为0.35 ml/min,进样量为5μl;柱温为35℃。梯度洗脱条件见表2-4。
实施例5
选用咪达唑仑作为CYP3A4的探针药物。
建立体外孵育体系;将不同浓度的测试药物、探针药物与人肝微粒体共孵育。
孵育体系:终体积为150μl的肝微粒体体外孵育体系包括一定浓度的微粒体、pH为7.4的磷酸缓冲液(100mM)、MgCl2溶液(3mM)、各个亚型对应的不同的探针药物和不同浓度的测试药物。
37℃水浴中预孵化5 min,加入由G-6-P(5mM)、NADP+(1mM)和G-6-PDH(1unit/mL)组成的NADPH再生系统,启动反应,孵化特定的时间,整个孵育体系控制有机溶剂的体积浓度在1%以内。蛋白浓度与孵育时间见表1。
孵育反应终止后,用含内标维拉帕米的冰乙腈终止反应,涡旋震荡30s,12000×g离心12min,取上清液5μl进样,内标浓度见表1。
采用色谱法分离探针药物代谢产物1′-羟基咪达唑仑含量,色谱条件包括:色谱柱:Aglient XDB C18柱(50 mm×2.1mm,3.5μm);Zorbax SB-C8保护柱(2.1mm×12.5mm);流动相为乙腈(含含体积百分比为0.1%的甲酸):水(含体积百分比为0.1%的甲酸),梯度洗脱,流速为0.35 ml/min,进样量为5μl;柱温为35℃。梯度洗脱条件见表2-5。
实施例6
选用睾酮作为CYP3A4的探针药物。
建立体外孵育体系;将不同浓度的测试药物、探针药物与人肝微粒体共孵育。
孵育体系:终体积为150μl的肝微粒体体外孵育体系包括一定浓度的微粒体、pH为7.4的磷酸缓冲液(100mM)、MgCl2溶液(3mM)、各个亚型对应的不同的探针药物和不同浓度的测试药物。
37℃水浴中预孵化5 min,加入由G-6-P(5mM)、NADP+(1mM)和G-6-PDH(1unit/mL)组成的NADPH再生系统,启动反应,孵化特定的时间,整个孵育体系控制有机溶剂的体积浓度在1%以内。蛋白浓度与孵育时间见表1。
孵育反应终止后,用含内标维拉帕米的冰乙腈终止反应,涡旋震荡30s,12000×g离心12min,取上清液5μl进样,内标浓度见表1。
上清液按照1:1比例稀释,采用色谱法分离探针药物代谢产物6β-羟基睾酮含量,色谱条件包括:色谱柱:Aglient XDB C18柱(50 mm×2.1mm,3.5μm);Zorbax SB-C8保护柱(2.1mm×12.5mm);流动相为乙腈(含体积百分比为0.1%的甲酸):水(含体积百分比为0.1%的甲酸),梯度洗脱,流速为0.35 ml/min,进样量为5μl;柱温为35℃。梯度洗脱条件见表2-6。
将上述实施例中得到的代谢产物,用质谱进行测试,质谱条件包括:电喷雾电离源(ESI源),气流速(N2)为8 L/min,雾化气(N2)压力为40psi,驻留时间为200ms;毛细管电压3500V,干燥气温度为350℃;碰撞气为高纯氮气,压力为0.1MPa;质谱的半峰宽均为0.7amu。采用多反应监测(MRM)模式对药物浓度离子进行测定。各个代谢产物的离子对以及传输电压和碰撞能量见表3。
表1,细胞色素P450的5种亚型探针药物的体外孵育条件
表2-1,对乙酰氨基酚(CYP1A2)LC梯度洗脱条件
时间(min) | 乙腈(+0.1% 甲酸) | 水(+0.1%甲酸) | 流速(ml/min) |
0 | 25 | 75 | 0.35 |
1 | 25 | 75 | 0.35 |
1.1 | 90 | 10 | 0.35 |
1.6 | 90 | 10 | 0.35 |
1.7 | 25 | 75 | 0.35 |
5 | 25 | 75 | 0.35 |
表2-2,4-羟基双芬酸(CYP2C9)LC梯度洗脱条件
时间(min) | 乙腈(+0.1% 甲酸) | 水(+0.1%甲酸) | 流速(ml/min) |
0.01 | 15 | 85 | 0.4 |
0.1 | 95 | 5 | 0.4 |
0.9 | 95 | 5 | 0.4 |
1 | 15 | 85 | 0.4 |
4 | 15 | 85 | 0.4 |
表2-3,4-羟基美芬妥英(CYP2C19)LC梯度洗脱条件
时间(min) | 乙腈(+0.1% 甲酸) | 水(+0.1%甲酸) | 流速(ml/min) |
0.01 | 10 | 90 | 0.4 |
0.1 | 90 | 10 | 0.4 |
0.9 | 90 | 10 | 0.4 |
1 | 10 | 90 | 0.4 |
4 | 10 | 90 | 0.4 |
表2-4,右啡烷(CYP2D6)LC梯度洗脱条件
时间(min) | 乙腈(+0.1% 甲酸) | 水(+0.1%甲酸) | 流速(ml/min) |
0.01 | 5 | 95 | 0.4 |
0.1 | 95 | 5 | 0.4 |
0.7 | 95 | 5 | 0.4 |
0.8 | 5 | 95 | 0.4 |
3.5 | 5 | 95 | 0.4 |
表2-5,1′-羟基咪达唑仑(CYP3A4)LC梯度洗脱条件
时间(min) | 乙腈(+0.1% 甲酸) | 水(+0.1%甲酸) | 流速(ml/min) |
0 | 10 | 90 | 0.3 |
0.5 | 10 | 90 | 0.3 |
1 | 90 | 10 | 0.3 |
1.9 | 90 | 10 | 0.3 |
2.0 | 10 | 90 | 0.3 |
3.0 | 10 | 90 | 0.3 |
表2-5,6β-羟基睾酮(CYP3A4)LC梯度洗脱条件
时间(min) | 乙腈(+0.1% 甲酸) | 水(+0.1%甲酸) | 流速(ml/min) |
0 | 20 | 80 | 0.4 |
0.5 | 20 | 80 | 0.4 |
0.6 | 90 | 10 | 0.4 |
1.5 | 90 | 10 | 0.4 |
1.6 | 20 | 80 | 0.4 |
5 | 20 | 80 | 0.4 |
表3 代谢产物及内标的MRM参数和保留时间
代谢产物 | 电压 | 碰撞能量 | 离子模式 | 离子对 | 保留时间 | 内标保留时间 |
对乙酰氨基酚 | 92V | 13 eV | + | 152.0>110.1 | 0.58 min | 4.02 min |
4-羟基双氯芬酸 | 80V | 5 eV | ﹣ | 310>265.9 | 2.99 min | 3.09 min |
4-羟基美芬妥英 | 116V | 13 eV | + | 233.2>189.9 | 2.75 min | 2.85 min |
右啡烷 | 140V | 40 eV | + | 258.2>157 | 2.8 min | 2.94 min |
6β-羟基睾酮 | 104V | 9 eV | + | 305>269 | 3.09 min | 3.3 min |
1′-羟基咪达唑仑 | 140V | 17 eV | + | 342>324 | 1.08 min | 1.16 min |
维拉帕米 | 140V | 29 eV | + | 455.3>165 | ||
美洛昔康 | 80V | 5 eV | ﹣ | 350>286 |
最后,将加入浓度梯度组测试药物后测得的探针药物代谢产物生成速率与测试药物浓度之间按照非线性回归作图,并计算测试药物的半数抑制浓度IC50值。一般认为,IC50值≤50μM才有意义,在此情况下,不建议联合使用。
图1~图3给出了本发明未加入测试药物情况下探针药物的代谢产物测定结果,从图1中可以看出,本发明在肝微粒蛋白浓度较小的情况下,能够准确地测得探针药物的代谢产物,并且线性关系良好,灵敏度高;从图2中可以看出,本发明在几分钟的孵育时间后,即可测得探针药物的代谢产物,并且线性关系良好;从图3可以看出,在较低的探针药物浓度下,即可进行测定,灵敏度较高。
综上所述,本发明提供的检测方法,线性关系良好、准确度高、重现性好而且灵敏、可靠,可用于各种药物对人肝细胞色素P450的CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4等亚型体外抑制作用的快速评价。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述,但其只是作为范例,本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言,任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此,在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改,都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (10)
1.一种检测药物对人肝细胞色素P450抑制作用的方法,其特征在于,步骤包括:
步骤1,选择人细胞色素P450的探针药物,将测试药物、探针药物与含所述人细胞色素P450的微粒体共同孵育;
步骤2,孵育结束后,检测探针药物在其特异性亚酶作用下转化生成代谢产物的量,代谢产物生成量越大,则测试药物对所述人细胞色素P450抑制作用越小。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述含人细胞色素P450的微粒体为人肝微粒体。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述人细胞色素P450亚型选自CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4中的任意一种或其任意组合。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述亚型CYP1A2的探针药物为非那西丁、CYP2C9的探针药物为双氯芬酸、CYP2C19的探针药物为s-(+)美芬妥英、CYP2D6的探针药物为右美沙芬、CYP3A4的探针药物为咪达唑仑和睾酮中的任意一种或其混合物。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述非那西丁的代谢产物包括对乙酰氨基酚、所述双氯酚酸的代谢产物包括4-羟基双氯芬酸、所述s-(+)美芬妥英的代谢产物包括4-羟基美芬妥英、所述右美沙芬的代谢产物包括去甲右美沙芬、所述咪达唑仑的代谢产物包括1′-羟基咪达唑仑、所述和睾酮的代谢产物包括6β-羟基睾酮。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述孵育时间为1~60min。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,微粒体蛋白浓度为0.01~1mg/ml。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述探针药物浓度为0.5~100μmol/L。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,以未加测试药物组酶的活性为100%,然后检测加入测试药物后探针药物产生代谢产物的量,与未加测试药物组进行对比。
10.根据权利要求1或9所述的方法,其特征在于,还包括步骤3,将加入浓度梯度组测试药物测得的探针药物代谢产物生成速率与测试药物浓度之间按照非线性回归作图,和/或计算半数抑制浓度IC50。
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