CN107474124B

CN107474124B - OsAPBP2蛋白在促进植物叶酸合成中的应用

Info

Publication number: CN107474124B
Application number: CN201710740638.2A
Authority: CN
Inventors: 张执金; 张海文; 权瑞党; 王娟; 赵辉; 黄荣峰
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-08-25
Filing date: 2017-08-25
Publication date: 2020-04-07
Anticipated expiration: 2037-08-25
Also published as: CN107474124A

Abstract

本发明公开了OsAPBP2蛋白在促进植物叶酸合成中的应用。本发明的OsAPBP2蛋白为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。通过实验证明：OsAPBP2蛋白可以识别并结合与水稻叶酸合成关键基因OsADCS启动子而调控水稻叶酸合成关键基因表达，进而调控水稻中叶酸含量，在植物叶酸合成中具有重要作用。

Description

OsAPBP2蛋白在促进植物叶酸合成中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及OsAPBP2蛋白在促进植物叶酸合成中的应用。

背景技术

叶酸(folic acid)也叫维生素B9，是动物和人必需的B族维生素。叶酸作为一碳供体参与嘌呤和胸腺嘧啶的合成，进一步影响DNA和RNA的合成；叶酸作为一碳的载体还与甘氨酸、丝氨酸和组氨酸等氨基酸代谢相关；另外叶酸还涉及血红蛋白及肾上腺素、胆碱和肌酸等甲基化合物的合成，在改善巨幼红细胞性贫血，胎儿神经管发育有重要作用。尽管叶酸在生物体内具有如此重要的作用，但人无法合成叶酸，需要从日常饮食中摄取。而水稻等人类主要食物中叶酸含量很低，因此利用生物技术的途径提高水稻等粮食中叶酸含量对提高人体叶酸摄取量，改善人体营养具有重要作用。

植物中叶酸合成路径比较清楚。叶酸的蝶啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸三个组成部分别在细胞质、质体和线粒体中合成，然后再组合成完整的叶酸分子。细胞质中植物以GTP起始原料，在GTP环化水解酶Ⅰ、二氢新喋呤醛缩酶、二氢新喋呤三磷酸焦磷酸酶及6-羟甲基二氢喋呤焦磷酸酶催化下形成喋呤。在质体中植物以分支酸和谷氨酰胺为起始底物，在氨基脱氧分支酸合酶催化合成4-氨基-4-脱氧分支酸，再由氨基脱氧分支酸裂解酶催化合成对氨基苯甲酸。上述合成蝶啶和对氨基苯甲酸被转移到线粒体中，在羟甲基二氢蝶啶焦磷酸酶，二氢蝶啶合成酶，二氢叶酸合成酶，二氢叶酸还原酶的催化下形成谷氨酰四氢叶酸，谷氨酰四氢叶酸可以在多聚谷氨酸合成酶的作用下形成不同长度谷氨酸尾巴的叶酸，也可以被修饰成5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸等不同形式的叶酸。

目前利用叶酸合成途径关键酶人们通过生物技术的途径已经可以提高植物中叶酸的含量，如番茄果和拟南芥中过表达GTP环化水解酶Ⅰ可以提高叶酸含量2-4倍。在水稻过表达拟南芥氨基脱氧分支酸合成酶可以提高叶酸含量约6倍。尽管在植物中人们通过过表达叶酸合成途径关键酶可以提高植物叶酸含量，但是单一表达叶酸合成途径某种酶经常导致该酶所在叶酸合成支路底物富集，而另外叶酸合成代谢支路底物不足，引起植物体内叶酸代谢紊乱。因此有必要探索通过其它途径提高植物叶酸含量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何提高植物叶酸含量。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了OsAPBP2蛋白质的新用途。

本发明提供了OsAPBP2蛋白质在调控植物叶酸含量中的应用。

本发明还提供了OsAPBP2蛋白质在调控与植物叶酸合成关键基因表达水平中的应用。

所述OsAPBP2蛋白质为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			MYC	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了与OsAPBP2蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与OsAPBP2蛋白质相关的生物材料在调控植物叶酸含量中的应用。

本发明还提供了与OsAPBP2蛋白质相关的生物材料在调控与植物叶酸合成关键基因表达水平中的应用。

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码OsAPBP2蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码OsAPBP2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码OsAPBP2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

上述应用中，所述调控植物叶酸含量为促进植物叶酸合成。

上述应用中，所述叶酸合成关键基因为OsGDPCHI基因和/或OsDHNA基因和/或OsADCS基因和/或OsADCL基因和/或OsDHFR1基因和/或OsDHFR2基因和/或OsFPGS1基因；所述表达水平为转录水平。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了OsAPBP2蛋白质或相关生物材料的新用途。

本发明提供了OsAPBP2蛋白质或相关生物材料在培育叶酸含量提高或叶酸合成能力提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了OsAPBP2蛋白质或相关生物材料在培育叶酸合成关键基因表达水平提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了OsAPBP2蛋白质或相关生物材料在水稻育种中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育叶酸含量提高或叶酸合成能力提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育叶酸含量提高或叶酸合成能力提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中OsAPBP2蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的叶酸含量高于所述受体植物。

为了解决上述技术问题，本发明最后还提供了一种培育叶酸合成关键基因表达水平提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育叶酸合成关键基因表达水平提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中OsAPBP2蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的叶酸合成相关基因表达水平高于所述受体植物。

上述方法中，所述叶酸合成关键基因为OsGDPCHI基因和/或OsDHNA基因和/或OsADCS基因和/或OsADCL基因和/或OsDHFR1基因和/或OsDHFR2基因和/或OsFPGS1基因；所述表达水平为转录水平。

上述方法中，所述提高受体植物中OsAPBP2蛋白质的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达OsAPBP2蛋白质；所述过表达的方法为将OsAPBP2蛋白质的编码基因导入受体植物。在本发明的具体实施例中，所述OsAPBP2蛋白质的编码基因通过重组载体pCAMBIA1307-OsAPBP2导入受体植物，所述pCAMBIA1307-OsAPBP2为将序列1所示的OsAPBP2基因插入pCAMBIA1307载体的Xba I与Sal I酶切位点间，且保持pCAMBIA1307载体的其他序列不变得到的载体。pCAMBIA1307-OsAPBP2表达N端带有MYC标签的OsAPBP2蛋白，OsAPBP2蛋白的氨基酸序列如序列2所示。

上述方法中，所述OsAPBP2蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述OsAPBP2基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物可为水稻；所述水稻品种具体可为中花11。

本发明提供的OsAPBP2蛋白是一类植物特有的ERF类转录因子，它具有调控多个叶酸合成关键基因如OsGDPCHI基因、OsDHNA基因、OsADCS基因、OsADCL基因、OsDHFR1基因、OsDHFR2基因和OsFPGS1基因表达水平的能力，在体内OsAPBP2蛋白可以识别并结合水稻叶酸合成关键基因OsADCS启动子。通过实验证明：OsAPBP2蛋白可通过调控水稻叶酸合成关键基因的表达进而提高水稻中叶酸含量。可见OsAPBP2蛋白在植物叶酸合成中具有重要作用。

附图说明

图1为OsAPBP2植物过表达载体的构建示意图。

图2为转OsAPBP2水稻的鉴定。

图3为转OsAPBP2水稻中叶酸含量的检测结果。

图4为转OsAPBP2水稻中叶酸合成关键基因表达水平的检测结果。

图5为OsAPBP2蛋白在体内与叶酸合成关键基因OsADCS启动子结合的分析。其中，Vector为转空载体水稻；OsAPBP2为转OsAPBP2水稻。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的pCAMBIA1307购自上海吉然生物科技有限公司，产品目录号为JR13080311。

下述实施例中的农杆菌LBA4404购自行知生物科技有限公司，产品目录号为AABV02-03。

下述实施例中的诱导培养基(NB培养基)购自上海科敏生物科技有限公司，货号为BS1309。

下述实施例中的继代培养基是将NB培养基与2，4-D混匀得到的培养基，其中，2，4-D在继代培养基中的浓度为2mg/L。

下述实施例中的100uM AS+AA液体培养基是将NB培养基、AS和2，4-D混匀得到的培养基，其中，2，4-D在100uM AS+AA液体培养基中的浓度为2mg/L，AS在100uM AS+AA液体培养基中的浓度为100uM/L。

实施例1、转OsAPBP2水稻的制备

一、OsAPBP2植物过表达载体的构建

(一)提取水稻中花11的基因组DNA。

(二)设计并合成如下引物(下划线所示序列为酶切识别位点)：

上游引物：5'-GCTCTAGAACCATGTGCGGCGGAGCAATCATC-3'；

下游引物：5'-ATGTCGACGTAGGCACCAGCTGCCATGA-3'。

(三)以步骤(一)的基因组DNA为模板，以步骤(二)中的上游引物和下游引物为引物进行PCR扩增，得到OsAPBP2基因。

(四)用Xba I与Sal I双酶切步骤(三)得到的PCR产物，得到基因片段；Xba I与SalI双酶切pCAMBIA1307，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为pCAMBIA1307-OsAPBP2，pCAMBIA1307-OsAPBP2结构示意图如图1所示。并对其进行测序验证。

测序结果表明：pCAMBIA1307-OsAPBP2为将序列1所示的OsAPBP2基因插入pCAMBIA1307载体的Xba I与Sal I酶切位点间，且保持pCAMBIA1307载体的其他序列不变得到的载体。pCAMBIA1307-OsAPBP2表达N端带有MYC标签的OsAPBP2蛋白，OsAPBP2蛋白的氨基酸序列如序列2所示。

二、重组菌的构建

将pCAMBIA1307-OsAPBP2通过电转化方法导入农杆菌LBA4404中，得到重组农杆菌，将其命名为LBA4404/pCAMBIA1307-OsAPBP2。

将pCAMBIA1307通过电转化方法导入农杆菌LBA4404中，得到重组农杆菌，将其命名为LBA4404/pCAMBIA1307。

三、过表达载体转化水稻

(一)将用体积百分含量75％的乙醇灭菌后的水稻中花11的种子种于诱导培养基上，28℃黑暗培养。两周后，将愈伤组织转入新的诱导培养基，28℃继代暗培养，共继代暗培养2代。

(二)将第三代继代愈伤组织中自然分散、颜色淡黄的胚性愈伤颗粒置于继代培养基上，28℃暗培养3天，得到的愈伤组织用于重组农杆菌的转化。

(三)将重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA1307-OsAPBP2悬浮于100uM AS+AA液体培养基中(OD₆₀₀为0.3)，然后将步骤(二)得到的愈伤组织置于菌悬浮液中浸泡10-20分钟，其间轻轻摇动，于28℃培养过夜，至OD₆₀₀＝0.8，6000rpm离心6min，收集菌体。将菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化缓冲液中，至终浓度0D₆₀₀＝0.3-0.6。

(四)倒掉菌液，小心取出愈伤组织用滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织转移到共培养培养基上，21℃-22℃暗培养3天。

(五)挑选共培养后的愈伤组织，滤纸滤干表面水汽后平铺于筛选培养基(含50mg/L潮霉素)上，28℃进行暗培养。2周时继代一次，共继代2次。

(六)将步骤(五)得到的生长旺盛，呈乳白色或微黄色的新鲜愈伤组织转至预分化培养基，28℃暗培养1周左右，然后28℃光照培养，两周左右继代一次，得到分化苗。

(七)将长势好的分化成苗移至生根培养基(瓶装)上。培养1-2周后移栽温室，得到T0代转基因植株以及T0转基因植株的种子。

将T0转基因植株的种子使用潮霉素选择平板萌发，确认潮霉素抗性具有3：1分离比的株系，然后将由其得到的T1转基因植株转至土壤培养直至成熟。将获得的转基因材料加代繁殖，得到T3代转基因水稻。

将上述步骤中的重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA1307-OsAPBP2替换为重组农杆菌LBA4404/pCAMBIA1307，按照上述方法，得到转空载体水稻(Vector)。

四、转基因水稻的鉴定

提取野生型水稻中花11以及T3代转基因水稻的RNA进行Q-PCR实验，检测OsAPBP2基因的相对表达量。上游引物：5'-GGGAAATGGCATGCCTAATCTC-3'；下游引物：5'-GGCACCAGCTGCCATGAGCA-3'。

结果如图2所示。图2中，WT为野生型水稻中花11；OX-4和OX-6为两株T3代转OsAPBP2过表达载体pCAMBIA1307-OsAPBP2的水稻。与野生型水稻中花11相比，OX-4和OX-6这两株T3代转基因水稻的OsAPBP2基因的相对表达量显著升高。T3代转基因水稻株系OX-4和OX-6为阳性转OsAPBP2水稻，将其用于下述功能分析实验。

实施例2、转OsAPBP2水稻中的叶酸含量检测

一、选取T3代转OsAPBP2水稻和野生型水稻中花11的种子，研磨成粉，4℃保存备用。

二、用叶酸提取缓冲液将1mg/ml的叶酸溶液稀释为浓度分别为100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、1ng/ml的标准溶液。

叶酸提取缓冲液是将维生素C钠盐(sigma A7631)与5mM磷酸缓冲液混匀得到的溶液，其中维生素C钠盐在叶酸提取缓冲液中的质量分数为1％。5mM磷酸缓冲液的配方如下：NaH₂PO₄(sigma，17844)0.419g/L、Na₂HPO₄·2H₂O(sigma，71633)0.269g/L，pH为6.0-6.5。

三、分别取300μl步骤二得到的不同浓度叶酸溶液，沸水煮10min，冰上冷却10min，混匀。加入大鼠血清100μl，37℃处理4h，沸水煮10min，冰浴10min，4℃、13300rpm离心10min，取上清300ul用HPLC/MS/MS法测定波面积。以波面积为横坐标，叶酸浓度为纵坐标作图，绘制标准曲线，得到线性回归方程。

四、准确称取50mg种子粉末，溶于加入500微升叶酸提取缓冲液，轻弹混匀，放置于冰上，得到待测样品溶液。

五、将步骤四中的待测样品溶液沸水煮10min；冰上冷却10min；4℃、13300rpm离心10min，取上清300μl加入大鼠血清100μl，37℃处理4h；样品溶液再次沸水煮10min，冰浴10min，4℃、13300rpm离心10min。

六、取上清300ul用HPLC/MS/MS法测定波面积。

七、将步骤六得到波面积代入线性回归方程，计算出叶酸的浓度。

各植株中的叶酸含量检测结果如图3所示。图3中，OX-4和OX-6为两个独立的T3代转OsAPBP2过表达载体pCAMBIA1307-OsAPBP2的水稻。从图中可以看出：T3代转OsAPBP2水稻OX-4和OX-6中叶酸含量均高于野生型水稻品种中花11。说明OsAPBP2可以提高水稻中的叶酸含量，在水稻叶酸合成中具有重要作用。

实施例3、转OsAPBP2水稻中的叶酸合成关键基因表达水平的检测

一、选取3周龄T3代转OsAPBP2水稻和野生型水稻中花11的叶片，用水冲洗干净，并用吸水纸吸干多余的水分，然后分别用液氮迅速冷冻，于-80℃保存。

二、取大约0.1g叶片，液氮迅速研磨成粉末，加入1ml的TRIZOL(Invitrogen，货号为15596026)按说明书提取总RNA。

三、用反转录试剂盒(TaKaRa，货号：DRR014A)将步骤二中得到的RNA反转录成cDNA。

四、以步骤三中的cDNA为模板进行定量PCR，检测水稻叶酸合成关键基因OsGDPCHI、OsDHNA、OsADCS、OsADCL、OsDHFR1、OsDHFR2和OsFPGS1的表达水平，分析OsAPBP2蛋白对水稻叶酸合成关键基因的调控作用。引物序列如下：

OsGDPCHI上游引物：5'-TTATTCTGTTTCGCATTG-3'；

OsGDPCHI下游引物：5'-AACCAGTTGTATCTACTAC-3'；

OsDHNA上游引物：5'-TTGCTTACAGTGACTTAA-3'；

OsDHNA下游引物：5'-AGGGTATATCATAGGACAT-3'；

OsADCS上游引物：5'-CCTGGATTACATAAGAGA-3'；

OsADCS下游引物：5'-AGAAGAGCAACATATACT-3'；

OsADCL上游引物：5'-CTTCTAGCTGCTCTATCTG-3'；

OsADCL下游引物：5'-CGATCACCAAGACATCAA-3'；

OsDHFR1上游引物：5'-CAGTGAATGATGTTAGAG-3'；

OsDHFR1下游引物：5'-AGATGGAGACAATTAGTA-3'；

OsDHFR2上游引物：5'-GCCTTGTCATCCTGTCTT-3'；

OsDHFR2下游引物：5'-CATCTTATACCAATCATCCA-3'；

OsFPGS1上游引物：5'-AATGATACTTCTTCTTGGA-3'；

OsFPGS1下游引物：5'-CCTGAAATTGAAATTGTTG-3'。

结果如图4所示。从图中可以看出：T3代转OsAPBP2水稻中的OsGDPCHI、OsDHNA、OsADCS、OsADCL、OsDHFR1、OsDHFR2和OsFPGS1基因的相对表达量均高于野生型水稻品种中花11。表明过表达OsAPBP2可以显著提高OsADCS等水稻叶酸合成关键基因的表达，OsAPBP2在调控水稻叶酸合成关键基因表达水平中有重要作用。

实施例4、OsAPBP2蛋白与水稻叶酸合成关键基因OsADCS启动子体内互作检测

一、选取3周龄T3代转OsAPBP2水稻和转空载体水稻(Vector)的叶片各2g，将其浸入40ml体积分数为1％的丙酮溶液中，在真空泵中抽真空1小时后，加入2ml浓度为2M甘氨酸(Glycine)溶液，使甘氨酸终浓度为125mM，继续抽真空5分钟；然后用预冷的10mM Tris-HCl(pH 8.0)洗材料3次，再在液氮中将洗好的材料充分研磨成粉末。

二、将研磨的粉末转移到50ml预冷的离心管中，加入20ml预冷的Extractionbuffer I(4M蔗糖、10mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mMβ-mercaptoethanol、10mM MgCl₂、0.1mMPMSF)，震荡混匀，冰上放置5分钟，Miracloth滤膜过滤后转移到新的50ml离心管中，然后4℃、13,400g离心10min，弃上清夜，收集沉淀；向沉淀中加入300μl现配的预冷的Nucleilysis buffer(50mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM EDTA、1％SDS、0.1mM PMSF)重悬沉淀；振荡器剧烈震荡30sec，3-4次，用超声波破碎样品(100W，20sec on/60sec off，6-10次)，4℃、16,000g离心10min，转移上清液到新的离心管中。

三、取200μl步骤二中的上清液，用ChIP dilution buffer(1％Triton X-100、0.1mM PMSF、16.7mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl)稀释10倍；然后与用ChIP dilutionbuffer平衡的magnetic antibody-beads(上海毕傲图生物科技有限公司，货号：B26301)混合，4℃摇床上轻摇2h或过夜。

四、依次用1ml的low salt wash buffer(20mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl、0.1％SDS、1％Triton X-100、2mM EDTA)、high salt wash buffer(20mM Tris-HCl(pH8.0)、500mM NaCl、0.1％SDS、1％TritonX-100、2mM EDTA)和LiCl wash buffer(0.25MLiCl、1％NP-40、1％sodium deoxicholate、1mM EDTA、10mM Tris-HCl(pH 8.0))在4℃摇床上各轻轻旋转5分钟洗涤beads三次，然后用超纯水洗涤两次，得到洗涤后的beads。

五、向步骤四中的洗涤后的beads中加入500μl Elution buffer(1％SDS和0.1MNaHCO₃)，煮沸10min，然后1,3000rpm离心5min，转移上清液到新离心管中。

六、向步骤五中得到的上清液中加入20μl NaCl水溶液(浓度为5mol/L)，65℃温浴4h后加入400μl的超纯水。然后加入等体积(500μl)酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，涡旋混匀，静置分层后，1,3000rpm离心10min；转移上清液至2.0ml离心管中。然后再加入1/10倍体积的3M NaAc溶液(pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，室温静置30min；1,3000rpm离心10min，弃上清液，收集沉淀。最后向沉淀中加入1ml体积分数为70％乙醇洗涤沉淀两次，室温晾干。

七、用ddwater溶解步骤六中沉淀，得到DNA样品，取0.5-1μl DNA样品，采用上游引物(5'-TGGTACTCCCTACGTCCTA-3')和下游引物(5'-TCTACTCCATCCGTTTCAA-3')进行PCR扩增，得到PCR产物，然后通过电泳检测PCR产物判断OsAPBP2蛋白是否与目标基因OsADCS的启动子结合。

PCR扩增体系：模板1μl、引物(0.5μmol)各1μl、dNTPs(10mmol)0.5μl、DNApolymerase(5U/μl)0.5μl、ddwater加水至20μl。

PCR反应程序：1、95℃5min；2、95℃20sec；3、56℃20sec；4、72℃20sec，重复2～4步骤45个循环；5、72℃10min。

结果如图5所示(input是指上样量，washing是指非特异结合蛋白核酸复合物洗脱，eluate是指特异结合蛋白核酸复合物洗脱)。从图中可以看出：OsAPBP2-MYC复合蛋白(N端带有MYC标签的OsAPBP2蛋白)可以特异结合OsADCS的启动子，而转空载体水稻(Vector)的MYC标签蛋白不能特异结合OsADCS的启动子。表明OsAPBP2可以与水稻叶酸合成关键基因OsADCS启动子结合。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>OsAPBP2蛋白在促进植物叶酸合成中的应用

<160>2

<210>1

<211>1191bp

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atgtgcggcg gagcaatcat ctccgggttc atcccgccgt cggccgctgc ggcggcggcg 60

gctgcggtgg ccaagaagca gcagggcagg agggtcacgg ccgacgtgct gtggccgggg 120

atgctgcgga aggggaaggc ggcggcggcg gaggaggact ttgaggccga cttccgcgag 180

ttcgagcgtg gcatgagcga cgacgaggcg gaggggggcg gcggcgagga ggaggaggac 240

gacgacgacg tggtcgtggt ggtccccccg ccggcggcgg cgaggttcgt cgtccgtgcc 300

gcggccaagg cggcgccccc aactgcagat gggatgttga ctacaaagct tgtccaacat 360

gatggaccta ctgctagatc agcaaagcac aagaggaaga atcagtacag ggggatccgc 420

cagcgtccct ggggcaaatg ggcagctgaa atccgagacc ccagcaaggg tgtccgtgtt 480

tggcttggaa catataacac tgctgaggag gcagctaggg catatgacgc tgaagcccgc 540

aagatccgtg gcaagaaagc caaggtcaac tttcctgatg aaccagctgt tgctcagaag 600

ctctccctga agcaaaacgc tgccaagcaa gagaaactag ctccacctct gaagacctgt 660

ggcgatgatg ctttctttca gctaaacagt tcagacaatg atttgtttgc aatgcttgca 720

aaggtgcctg caaagccggc agagcctgtt gatctcatgc ctccagtcaa acctcttgct 780

tccactgaga cattcgagat gaacatgctc tctgatacga gcagcaactc atttggctct 840

tcagactttg gttgggagga tgacaccctg accccagact acacttcagt cttcgttcct 900

aatgctgcca tgccagcata tggtgaacct gcttacctga caggtggagc gccaaagaga 960

atgaggaaca actatggtat cgccgtgccc cagggaaatg gcatgcctaa tctcgcacaa 1020

aacatgccca ccttcgatcc cgagatgaag tatttgccat taccttatgt tgagagcagc 1080

tcagatgaat caatggacaa ccttctgcaa aatgatgcta cacaagacgg ggcaagcaac 1140

gagggcatct ggagccttga tgagctgctc atggcagctg gtgcctactg a 1191

<210>2

<211>396

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

Met Cys Gly Gly Ala Ile Ile Ser Gly Phe Ile Pro Pro Ser Ala Ala

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Lys Lys Gln Gln Gly Arg Arg Val

20 25 30

Thr Ala Asp Val Leu Trp Pro Gly Met Leu Arg Lys Gly Lys Ala Ala

35 40 45

Ala Ala Glu Glu Asp Phe Glu Ala Asp Phe Arg Glu Phe Glu Arg Gly

50 55 60

Met Ser Asp Asp Glu Ala Glu Gly Gly Gly Gly Glu Glu Glu Glu Asp

65 70 75 80

Asp Asp Asp Val Val Val Val Val Pro Pro Pro Ala Ala Ala Arg Phe

85 90 95

Val Val Arg Ala Ala Ala Lys Ala Ala Pro Pro Thr Ala Asp Gly Met

100 105 110

Leu Thr Thr Lys Leu Val Gln His Asp Gly Pro Thr Ala Arg Ser Ala

115 120 125

Lys His Lys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg Gly Ile Arg Gln Arg Pro Trp

130 135 140

Gly Lys Trp Ala Ala Glu Ile Arg Asp Pro Ser Lys Gly Val Arg Val

145 150 155 160

Trp Leu Gly Thr Tyr Asn Thr Ala Glu Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Asp

165 170 175

Ala Glu Ala Arg Lys Ile Arg Gly Lys Lys Ala Lys Val Asn Phe Pro

180 185 190

Asp Glu Pro Ala Val Ala Gln Lys Leu Ser Leu Lys Gln Asn Ala Ala

195 200 205

Lys Gln Glu Lys Leu Ala Pro Pro Leu Lys Thr Cys Gly Asp Asp Ala

210 215 220

Phe Phe Gln Leu Asn Ser Ser Asp Asn Asp Leu Phe Ala Met Leu Ala

225 230 235 240

Lys Val Pro Ala Lys Pro Ala Glu Pro Val Asp Leu Met Pro Pro Val

245 250 255

Lys Pro Leu Ala Ser Thr Glu Thr Phe Glu Met Asn Met Leu Ser Asp

260 265 270

Thr Ser Ser Asn Ser Phe Gly Ser Ser Asp Phe Gly Trp Glu Asp Asp

275 280 285

Thr Leu Thr Pro Asp Tyr Thr Ser Val Phe Val Pro Asn Ala Ala Met

290 295 300

Pro Ala Tyr Gly Glu Pro Ala Tyr Leu Thr Gly Gly Ala Pro Lys Arg

305 310 315 320

Met Arg Asn Asn Tyr Gly Ile Ala Val Pro Gln Gly Asn Gly Met Pro

325 330 335

Asn Leu Ala Gln Asn Met Pro Thr Phe Asp Pro Glu Met Lys Tyr Leu

340 345 350

Pro Leu Pro Tyr Val Glu Ser Ser Ser Asp Glu Ser Met Asp Asn Leu

355 360 365

Leu Gln Asn Asp Ala Thr Gln Asp Gly Ala Ser Asn Glu Gly Ile Trp

　　370 375 380

Ser Leu Asp Glu Leu Leu Met Ala Ala Gly Ala Tyr

385 390 395

Claims

1.OsAPBP2蛋白质在调控植物叶酸含量中的应用；所述OsAPBP2蛋白质的氨基酸序列如序列2所示；所述植物为水稻。

2.OsAPBP2蛋白质在调控与植物叶酸合成关键基因表达水平中的应用；所述OsAPBP2蛋白质的氨基酸序列如序列2所示；所述植物为水稻。

3.与权利要求1中所述的OsAPBP2蛋白质相关的生物材料在调控植物叶酸含量中的应用；所述生物材料为下述A1）至A8）中的任一种：

A1）编码OsAPBP2蛋白质的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；

A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；

A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物；

所述植物为水稻。

4.与权利要求1中所述的OsAPBP2蛋白质相关的生物材料在调控与植物叶酸合成关键基因表达水平中的应用；

所述生物材料为下述A1）至A8）中的任一种：

A1）编码OsAPBP2蛋白质的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；

A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；

A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物；

所述植物为水稻。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：A1）所述核酸分子为编码序列是序列1所示的DNA分子。

6.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于：

所述调控植物叶酸含量为促进植物叶酸合成。

7.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于：所述叶酸合成关键基因为OsGDPCHI基因和/或OsDHNA基因和/或OsADCS基因和/或OsADCL基因和/或OsDHFR1基因和/或OsDHFR2基因和/或OsFPGS1基因。

8.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于：所述表达水平为转录水平。

9.权利要求1中所述的OsAPBP2蛋白质或权利要求3或4中所述的相关生物材料在培育叶酸含量提高或叶酸合成能力提高的转基因植物中的应用；所述植物为水稻。

10.权利要求1中所述的OsAPBP2蛋白质或权利要求3或4中所述的相关生物材料在培育叶酸合成关键基因表达水平提高的转基因植物中的应用；所述植物为水稻。

11.权利要求1中所述的OsAPBP2蛋白质或权利要求3或4中所述的相关生物材料在水稻育种中的应用。

12.一种培育叶酸含量提高或叶酸合成能力提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述的OsAPBP2蛋白质的含量，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的叶酸含量高于所述受体植物；所述植物为水稻。

13.一种培育叶酸合成关键基因表达水平提高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述的OsAPBP2蛋白质的含量，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的叶酸合成相关基因表达水平高于所述受体植物；所述植物为水稻。

14.根据权利要求12或13所述的方法，其特征在于：

所述提高受体植物中权利要求1中所述的OsAPBP2蛋白质的含量的方法为在受体植物中过表达权利要求1中所述的OsAPBP2蛋白质。

15.根据权利要求12或13所述的方法，其特征在于：所述过表达的方法为将权利要求1中所述的OsAPBP2蛋白质的编码基因导入受体植物。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于：

所述OsAPBP2蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。