CN107466852A - 一种粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法 - Google Patents

一种粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明一种粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法。本发明实现了粗茎紫金牛组织培养快速繁殖，为粗茎紫金牛组织培养技术开辟新道路。本发明的方法操作简单，易于实施，可一次性培育出大量的粗茎紫金牛种苗。本发明能够有效的缩短育苗时间，且本发明所用的培养基和试剂易配置，成本低，易大范围推广。

Description

一种粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法
技术领域：
本发明属于植物繁殖领域，具体涉及一种粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法。
背景技术：
粗茎紫金牛(Ardisia dasyrhizomatica C.Y.Wu et C.Chen)是紫金牛科紫金牛属常绿灌木，高约50厘米，茎粗壮，直立不分枝；叶片革质，聚生茎顶端，叶片大，紫红色；花紫红色、果鲜红色。该物种产于云南河口，分布在海拔约150米的林下，其标本仅见于昆明植物所标本馆，由中越考察队于1965年采集。因当地大面积开垦林地种植香蕉，其生境受到严重破坏，2013年在云南河口一带多次野外考察过程中，仅发现2处香蕉地边缘沟边有十多株，2016年11月再次考察时仅剩1处香蕉地边缘有5株。粗茎紫金牛生境受到严重破坏，野生数量稀少，具有重要的研究和保护意义。同时其株型低矮紧凑，叶片紫红色，花紫红色，具有很高的观赏价值和开发利用前景。
华南植物园于2013年开展了粗茎紫金牛迁地保育研究，几年的观察研究发现其在广州栽培能正常开花，但自然条件下难以结实，而扦插繁殖会使母株受损，且繁殖系数低。如何解决其繁殖技术问题，成为该物种保护和开发利用的关键。
发明内容：
本发明的目的是提供一种粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法，繁殖系数高，培育时间短，只需有简单的植物组织培养设备即可进行，实现粗茎紫金牛种苗的组织培养和快速繁殖。
本发明的粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法，包括以下步骤：
a、在生长季节剪取粗茎紫金牛幼嫩叶片作为外植体；
b、将外植体消毒，将消毒后的外植体的叶脉主脉两边的叶子各切掉一半，然后将余下的外植体切块，将切块接种于初代诱导培养基中培养获得丛生芽，所述的初代诱导培养基每升含有：0.5～1.5mg TDZ(噻苯隆)、0.2～0.5mg NAA(萘乙酸)、琼脂、蔗糖，余量为WPM培养基，每升初代诱导培养基是这样配制的：按上述组分及其含量，在少量WPM培养基加入TDZ、NAA、琼脂、蔗糖，然后再用WPM培养基定容至1L，调pH至5.2，混合均匀后，灭菌后即得初代诱导培养基；87～94天所述的切块叶脉开始膨大，继续接种90天在膨大的主脉、侧脉上开始有丛生芽冒出；
所述的初代诱导培养基中琼脂、蔗糖的量为常规量就可以，如琼脂6g/L，蔗糖20g/L，pH优选为5.2。
c、将萌发丛生芽的膨大的叶脉切割成带1～2个丛生芽的小块，接种于继代增殖培养基中培养获得继代培养苗，所述的继代增殖培养基每升含有：1.0～2.0mg 6-BA(6-苄基腺嘌呤)、0.1～0.5mg NAA、琼脂、蔗糖，余量为WPM培养基，每升继代增殖培养基是这样配制的：按上述组分及其含量，在少量WPM培养基加入6-BA、NAA、琼脂、蔗糖，然后再用WPM培养基定容至1L，调pH至5.2，混合均匀后，灭菌后即得继代增殖培养基；继代增殖培养周期为120d，增殖系数达2.1～4.0；
所述的继代增殖培养基中琼脂、蔗糖的量为常规量就可以，如琼脂6g/L，蔗糖20g/L，pH优选为5.2。
d、待继代培养苗长到3～4厘米时，将所述的继代培养苗从基部切开来，用含有NAA的溶液浸泡，然后扦插于由泥炭和珍珠岩组成的基质中，培养期间注意杀菌、保湿和遮阴，获得组培苗；30天左右开始生根，每株苗有根数3-5条，生根率可达92％，所述的基质由泥炭：珍珠岩按质量比2:1混合而成；
e、将组培苗移栽到移栽基质中进行移栽培养。
所述的步骤b的将外植体消毒是在无菌操作台上，用洗洁精漂洗10min，流水冲洗30min，然后在超净工作台上用体积分数75％的酒精浸泡30s，用质量分数为0.1％的HgCl2溶液消毒5min，用无菌水漂洗5～6次，用无菌滤纸吸干表面水份后，得到消毒处理的外植体。所述的切块其大小为1.5cm×2.0cm。所述的步骤b的在初代诱导培养基中培养和步骤c的在继代增殖培养基中培养，其培养条件都为：光照强度1500Lx，培养温度23℃～27℃，光照时间12h/d。所述的步骤d的含有NAA的溶液，其浓度为0.33mg/L。所述的步骤d的杀菌、保湿和遮阴是用质量分数50％多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液喷施一次，每隔一个星期再使用质量分数50％多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液喷施一次，培养期间保持相对湿度90％以上并注意遮荫。30天左右开始生根，每株苗有根数3-5条，生根率可达92％；洗洁精为市售的洗洁精均可。
本发明以粗茎紫金牛幼嫩叶片为外植体，经过芽的诱导、继代增殖、生根培养和移栽等各阶段，选择适合粗茎紫金牛丛生芽诱导、繁殖、生根、移栽等各培养阶段的培养基配方和培养条件，实现粗茎紫金牛种苗的组织培养和快速繁殖，可在较短时间内繁育出大量优质种苗，为满足该物种的迁地保育与引种回归研究及资源开发利用提供优质种苗，实现粗茎紫金牛的资源保护和可持续利用。
优选地，所述的步骤e的移栽培养是待继代培养苗生长60天后，根粗壮完好，获得组培苗，组培苗移栽至由珍珠岩、河沙和泥炭土混合而成的移栽基质中，第一周内注意遮荫，第一周以后放在荫棚内进行常规管理。
优选地，所述的移栽基质由珍珠岩：河沙：泥炭土按质量比2:1:7混合而成。
优选地，所述的步骤b中初代诱导培养基每升含有：0.5mg TDZ、0.2mg NAA、6g琼脂、20g蔗糖，余量为WPM培养基，pH5.2。
优选地，所述的步骤c中继代增殖培养基每升含有：2.0mg 6-BA、0.2mg NAA、6g琼脂、20g蔗糖，余量为WPM培养基，pH5.2。
本发明中的WPM培养基配方属于本领域的公知常识。WPM培养基母液配方：大量元素：k2SO4 990mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4 170mg/L，NH4NO3 400mg/L；微量元素：MnSO4·4H2O 22.5mg/L，ZnSO4·7H2O 8.6mg/L，H3BO3 6.2mg/L，CuSO4·5H2O 0.25mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L；钙盐：Ca(NO3)2·4H2O 556mg/L；铁盐：FeSO4·7H2O 27.8mg/L，Na2EDTA 37.3mg/L；肌醇：100mg/L；有机物：甘氨酸2.0mg/L，VB1 1.0mg/L，VB5 0.5mg/L，VB6 0.5mg/L，PH 5.2。
与现有的技术相比，本发明的具有以下优点：
本发明实现了粗茎紫金牛组织培养快速繁殖，为粗茎紫金牛种苗组织培养技术开辟新道路。本发明的方法简单实惠，切实可行，应用价值高，可一次性培育出大量的粗茎紫金牛种苗。本发明能够有效的缩短育苗时间，且本发明所用的培养基和试剂易配置，成本低，易大范围推广。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
对比例1：
a、外植体的消毒和丛生芽的诱导培养：在生长季节剪取粗茎紫金牛幼嫩叶片为外植体，用洗洁精漂洗10min，流水冲洗30min，然后在超净工作台上用体积分数75％酒精浸泡30s，质量分数0.1％的HgCl2溶液消毒5min，然后用无菌水漂洗5～6次，用无菌滤纸吸干表面水份后，得到消毒处理的外植体，消毒成功率90％。
将消毒后的外植体叶脉主脉两边的叶子各切掉一半，然后将余下的外植体切成1.5cm×2.0cm切块，将切块接种于初代诱导培养基中，使叶脉的主脉和侧脉上获得丛生芽，培养条件为：光照强度1500Lx，培养温度23℃，光照时间12h/d，初代诱导培养基中每升含有：0.5mg TDZ、0.1mg NAA、6g琼脂、20g蔗糖，余量为WPM培养基，pH 5.2；94天切块叶脉开始膨大，继续接种90天在膨大的主脉、侧脉上开始有小的丛生芽冒出。
b、继代增殖培养：将萌发出丛生芽的主脉、侧脉切成只带1～2个芽的小块，接种于继代增殖培养基上，促使丛生芽的形成，培养条件为：光照强度1500Lx，培养温度23℃，光照时间12h/d，继代增殖培养基每升含有：1.0mg 6-BA、0.1mg NAA、6g琼脂、20g蔗糖，余量为WPM培养基，pH 5.2，继代增殖培养周期为120d，增殖系数为2.1。
c、组培苗生根：待继代培养苗长到3～4厘米时，将继代培养苗从基部切开来，接种于生根培养基中，培养条件为：培养温度25℃，光照度2000Lx，光照12h/d，生根培养基每升含有：0.5mg NAA、6g琼脂、20g蔗糖，余量为WPM培养基，pH 5.2，培养60天左右能生根，每株苗有根数2-3条，生根率为40％，由此得到组培苗。
d、组培苗移栽：组培苗在培养瓶中叶片长到4-5片时，把瓶苗放置于荫棚里2-3天，然后打开瓶塞又继续放3-4天后，用镊子把试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入质量比为2：1的泥炭土和珍珠岩的基质中，注意浇水、遮荫、保温和保湿，成活率可达83％。
实施例1：
a、外植体的消毒和丛生芽的诱导培养：在生长季节剪取粗茎紫金牛幼嫩叶片为外植体，用洗洁精漂洗10min，流水冲洗30min，然后在超净工作台上用体积分数75％酒精浸泡30s，用质量分数为0.1％的HgCl2溶液消毒5min，然后用无菌水漂洗5～6次，用无菌滤纸吸干表面水份后，得到消毒处理的外植体，消毒成功率90％。
将消毒后的外植体叶脉主脉两边的叶子各切掉一半，然后切成1.5cm×2.0cm的切块，将切块接种于初代诱导培养基上，使叶脉的主脉和侧脉上获得丛生芽，培养条件为：光照强度1500Lx，培养温度23℃，光照时间12h/d，初代诱导培养基每升含有：0.5mg TDZ、0.2mg NAA、6g琼脂、20g蔗糖，余量为WPM培养基，pH 5.2；90天切块叶脉开始膨大，继续接种90天在膨大的主脉、侧脉上开始有小的丛生芽冒出。
b、继代增殖培养：将萌发出丛生芽的主脉、侧脉切成只带1～2个芽的小块，接种于继代增殖培养基中，促使丛生芽的形成，培养条件为：光照强度1500Lx，培养温度23℃，光照时间12h/d，继代增殖培养基每升含有：1.0mg 6-BA、0.1mg NAA、6g琼脂、20g蔗糖，余量为WPM培养基，pH 5.2，继代增殖培养周期为120d，增殖系数为3.4。
c、组培苗生根：待继代培养苗长到3～4厘米时，将继代培养苗从基部切开来，用浓度为0.33mg/L的NAA溶液浸泡1min，然后扦插于装有质量比为2:1的泥炭和珍珠岩混合基质的32孔林木穴盘中，用质量分数50％多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液喷施一次，每隔一个星期再使用质量分数50％多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液喷施一次，培养期间保持相对湿度90％以上并注意遮荫，30天左右开始生根，每株苗有根数3-5条，生根率可达92％，由此获得组培苗。
d、组培苗移栽：组培苗在林木穴盘中两个月后，根粗壮完好，可以移栽至质量比为2:1:7的珍珠岩、河沙和泥炭土混合而成的移栽基质中，第一周内注意遮荫，以后可以放在荫棚内进行常规管理，成活率可达96％。
实施例2：
a、外植体的消毒和丛生芽的诱导培养：在生长季节剪取粗茎紫金牛幼嫩叶片为外植体，用洗洁精漂洗10min，流水冲洗30min，然后在超净工作台上用体积分数75％酒精浸泡30s，质量分数为0.1％的HgCl2溶液消毒5min，然后用无菌水漂洗5～6次，用无菌滤纸吸干表面水份后，得到消毒处理的外植体，消毒成功率90％。
将消毒后的外植体叶脉主脉两边的叶子各切掉一半，然后切成1.5cm×2.0cm的切块，将切块接种于初代诱导培养基上，使叶脉的主脉和侧脉上获得丛生芽，培养条件为：光照强度1500Lx，培养温度25℃，光照时间12h/d，初代诱导培养基每升含有：1.0mg TDZ、0.2mg NAA、6g琼脂、20g蔗糖，余量为WPM培养基，pH 5.2，87天左右切块叶脉开始膨大，继续接种90天左右在膨大的主脉、侧脉上开始有小的丛生芽冒出。
b、继代增殖培养：将萌发出丛生芽的主脉、侧脉切成只带1～2个芽的小块，接种于继代增殖培养基中，能促使丛生芽的形成，培养条件为：光照强度1500Lx，培养温度25℃，光照时间12h/d，继代增殖培养基每升含有：2.0mg 6-BA、0.2mg NAA、6g琼脂、20g蔗糖，余量为WPM培养基，pH 5.2，继代增殖培养周期为120d，增殖系数为4.0。
c、组培苗生根：待继代培养苗长到3～4厘米时，将继代培养苗从基部切开来，用浓度为0.33mg/L的NAA溶液浸泡1min，然后扦插于装有质量比为2:1的泥炭和珍珠岩混合基质的32孔林木穴盘中，用质量分数50％多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液喷施一次，每隔一个星期再使用质量分数50％多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液喷施一次，培养期间保持相对湿度90％以上并注意遮荫，30天左右开始生根，每株苗有根数3-5条，生根率可达92％，由此获得组培苗。
d、组培苗移栽：组培苗在穴盘中两个月后，根粗壮完好，可以移栽至质量比为2:1:7的珍珠岩、河沙和泥炭土混合而成的移栽基质中，第一周内注意遮荫，以后可以放在荫棚内进行常规管理，成活率可达96％。
实施例3：
a、外植体的消毒和丛生芽的诱导培养：在生长季节剪取粗茎紫金牛幼嫩叶片为外植体，用洗洁精漂洗10min，流水冲洗30min，然后在超净工作台上用体积分数75％酒精浸泡30s，质量分数为0.1％的HgCl2溶液消毒5min，然后用无菌水漂洗5～6次，用无菌滤纸吸干表面水份后，得到消毒处理的外植体，消毒成功率90％。
将消毒后的外植体叶脉主脉两边的叶子各切掉一半，然后切成1.5cm×2.0cm切块，将切块接种于初代诱导培养基上，使叶脉的主脉和侧脉上获得丛生芽，培养条件为：光照强度1500Lx，培养温度27℃，光照时间12h/d，初代诱导培养基每升含有：1.5mg TDZ、0.5mg NAA、6g琼脂、20g蔗糖，余量为WPM培养基，pH 5.2，87天切块叶脉开始膨大，继续接种90天左右在膨大的主脉、侧脉上开始有小的丛生芽冒出。
b、继代增殖培养：将萌发出丛生芽的主脉、侧脉切成只带1～2个芽的小块，接种于继代增殖培养基中，促使丛生芽的形成，培养条件为：光照强度1500Lx，培养温度27℃，光照时间12h/d，继代增殖培养基每升含有：2.0mg 6-BA、0.5mg NAA、6g琼脂、20g蔗糖，余量为WPM培养基，pH 5.2，继代增殖培养周期为120d，增殖系数为3.8。
c、组培苗生根：待继代培养苗长到3～4厘米时，将继代培养苗从基部切开来，用浓度为0.33mg/L的NAA溶液浸泡1min，然后扦插于装有质量比为2:1的泥炭和珍珠岩混合基质的32孔林木穴盘中，用质量分数50％多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液喷施一次，每隔一个星期再使用质量分数50％多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液喷施一次，培养期间保持相对湿度90％以上并注意遮荫，30天左右开始生根，每株苗有根数3-5条，生根率可达92％，由此获得组培苗。
d、组培苗移栽：组培苗在穴盘中两个月后，根粗壮完好，可以移栽至质量比为2:1:7的珍珠岩、河沙和泥炭土混合而成的移栽基质中，第一周内注意遮荫，以后可以放在荫棚内进行常规管理，成活率可达96％。
通过实施例1～3和对比例1比较可以得出结果，粗茎紫金牛外植体最适的初代诱导培养基中每升含有0.5mg TDZ和0.2mg NAA，继代增殖培养基每升含有2.0mg 6-BA和0.2mg NAA，最适合的生根方式为瓶外生根，即继代培养苗长到3～4厘米时，将继代培养苗从基部切开来，用浓度为0.33mg/L的NAA溶液浸泡1min，然后扦插于装有质量比为2:1的泥炭和珍珠岩基质的32孔林木穴盘中，用质量分数50％多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液喷施一次，每隔一个星期再使用质量分数50％多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液喷施一次，培养期间保持相对湿度90％以上并注意遮荫，30天左右开始生根，生根率高达92％，而且瓶外继代培养苗生根具有生根时间短，质量好，每根苗生根条数多，适应性强，移栽成活率高的特点。

Claims (10)

1.一种粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、剪取粗茎紫金牛幼嫩叶片作为外植体；
b、将外植体消毒，将消毒后的外植体的叶脉主脉两边的叶子各切掉一半，然后将余下的外植体切块，将切块接种于初代诱导培养基中培养获得丛生芽，所述的初代诱导培养基每升含有：0.5～1.5mg TDZ、0.2～0.5mg NAA、琼脂、蔗糖，余量为WPM培养基；
c、将萌发丛生芽的膨大的叶脉切割成带1～2个丛生芽的小块，接种于继代增殖培养基中培养获得继代培养苗，所述的继代增殖培养基每升含有：1.0～2.0mg 6-BA、0.1～0.5mgNAA、琼脂、蔗糖，余量为WPM培养基；
d、待继代培养苗长到3～4厘米时，将所述的继代培养苗从基部切开来，用含有NAA的溶液浸泡，然后扦插于由泥炭和珍珠岩组成的基质中，培养期间注意杀菌、保湿和遮阴，获得组培苗；
e、将组培苗移栽到移栽基质中进行移栽培养。
2.根据权利要求1所述的粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤b的将外植体消毒是在无菌操作台上，用洗洁精漂洗10min，流水冲洗30min，然后在超净工作台上用体积分数75％的酒精浸泡30s，用质量分数为0.1％的HgCl2溶液消毒5min，用无菌水漂洗5～6次，用无菌滤纸吸干表面水份后，得到消毒处理的外植体。
3.根据权利要求1所述的粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法，其特征在于，所述的切块，其大小为1.5cm×2.0cm。
4.根据权利要求1所述的粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤b的在初代诱导培养基中培养和步骤c的在继代增殖培养基中培养，其培养条件都为：光照强度1500Lx，培养温度23℃～27℃，光照时间12h/d。
5.根据权利要求1所述的粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤d的含有NAA的溶液，其浓度为0.33mg/L。
6.根据权利要求1所述的粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤d的杀菌、保湿和遮阴是用质量分数50％多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液喷施一次，每隔一个星期再使用质量分数50％多菌灵可湿性粉剂500倍稀释液喷施一次，培养期间保持相对湿度90％以上并注意遮荫。
7.根据权利要求1所述的粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤e的移栽培养是待继代培养苗生长60天后，根粗壮完好，获得组培苗，组培苗移栽至由珍珠岩、河沙和泥炭土混合而成的移栽基质中，第一周内注意遮荫，第一周以后放在荫棚内进行管理。
8.根据权利要求1所述的粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法，其特征在于，所述的移栽基质由珍珠岩：河沙：泥炭土按质量比2:1:7混合而成。
9.根据权利要求1所述的粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤b中初代诱导培养基每升含有：0.5mg TDZ、0.2mg NAA、6g琼脂、20g蔗糖，余量为WPM培养基，pH5.2。
10.根据权利要求1所述的粗茎紫金牛组织培养和快速繁殖方法，其特征在于，所述的步骤c中继代增殖培养基每升含有：2.0mg 6-BA、0.2mg NAA、6g琼脂、20g蔗糖，余量为WPM培养基，pH5.2。
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