CN107445949B - 荧光化合物及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由下述[化学式1]表示的荧光化合物及其制造方法。[化学式1]
Figure DDA0001281468250000011
上述[化学式1]中，X、Y、R1、R2、R3及n分别表示与说明书中相同的含义。

Description

荧光化合物及其制造方法
技术领域
本发明涉及荧光化合物，更详细地涉及包含烷基羧基氨基氰尿酰氯取代基的花青类荧光化合物及其应用。
背景技术
对于生物物质自身而言，可见光及近红外线区域的荧光微弱或者没有，因此在生物领域中，为了在生物内/外观察细胞及细胞以下阶段的生物学现象，或者向生物体内投影而为了获得显影及疾病部位的光学图像，通过对生物物质应用荧光染料或已标记荧光染料的特定生物物质以及光学设备的多种方法来获得图像资料。
生物领域中使用的多种光学分析(optical analysis)设备选择具有根据内置的光源和滤波器适合观察荧光的激发波长(excitation wavelength)及荧光波长(emissionwavelength)的荧光染料作为基础材料或试剂。
主要使用的光学分析设备除了用于观察细胞的荧光显微镜(fluorescenc emicroscope)、共焦显微镜(confocal microscope)、流式细胞分析仪(flowc ytometer)、基因芯片(microarray)、定量聚合酶链反应装置(qualitative PCR system)、用于对核酸及蛋白质进行分离、分析的电泳(electrophoresis)装置、实时在体成像设备(in vivoimaging system)等研究目的的设备以外，还已知结合了免疫分析方法(immuno assay)或PCR分析及统计技术的基于核酸及蛋白质诊断试剂盒(或生物芯片)的体外诊断(in vitrodiagnosis)设备和用于医疗影像手术(image-guided surgery)的手术台及内窥镜设备等用于诊断及治疗的设备，目前正在持续开发具有新的应用领域以及更高水准的分辨率和数据处理能力的设备。
通常，使用于蛋白质或肽等生物分子的标记的荧光染料(fluorescent d ye)大部分包含邻氨基苯甲酸盐(anthranilate)、1-alkylthic isoindoles、吡咯啉酮(pyrrolinones)、bimanes、苯并噁唑(benzoxazole)、苯并咪唑(benzimid azole)、苯并呋咱(benzofurazan)、萘(naphthalenes)、香豆素(coumarins)、花青(cyanine)、芪(stilbenes)、咔唑(carbazoles)、菲啶(phenanthridine)、蒽(anthracenes)、氟硼荧(bodipy)、荧光素(fluoresceins)、曙红(eosins)、若丹明(rhodamines)、芘(pyrenes)、
Figure BDA0001281468230000021
(chrysenes)及吖啶(acridines)等结构。
从上述所例示的多个荧光发色团(chromophore)中筛选可利用于生物领域中的荧光染料结构时，通常筛选存在于大部分的生物分子存在的介质即水溶液及水溶性缓冲液内时显出强的荧光并且具有符合荧光设备的激发波长以及荧光波长的荧光染料结构。
在生物领域中主要应用的染料尽量在水溶液或亲水性条件下光漂白(photobleaching)及消光(quenching)现象少，摩尔消光系数(molar extinctioncoefficient)大以便能够吸收大量的光，并且需要存在于与生物分子自身的荧光范围相隔远距离的500nm以上的可见光线区域或近红外线区域，在多种pH条件下稳定，但是满足上述限制条件的可用于生物分子标记的染料的结构是有限的。
作为符合这样的要求条件的荧光色素原，具有花青、若丹明、荧光素、氟硼荧、香豆素、吖啶、芘衍生物等，可以单独使用染料或者可以导入与生物分子结构内的特定取代基结合的官能团，其中，苍耳烷(xanthane)系列的荧光素及若丹明以及聚甲炔(polymethine)系列的花青衍生物染料化合物已成为商品。
特别是，具有花青发色团的染料化合物除了容易合成多种吸收/激发波长的化合物的优点以外，通常光学及pH稳定性优异，具有窄的吸收及发光波长范围，并具有500至800nm的荧光区域，因此不会与生物分子的自身荧光区域重叠，所以容易分析，而且虽然根据溶剂及溶解度特性有所差异，但是因具有示出高的摩尔消光系数等多的优点，所以广泛利用于生物学应用中。
除此之外，具有花青发色团的染料化合物可有效利用于图像显示装置用光学滤波器或激光熔合用树脂组合物的用途。对特定的光具有强度大的吸收性的化合物广泛被用作液晶显示装置、等离子体显示板、电致发光显示器、阴极管显示装置、荧光显示管等图像显示装置用光学滤波器或DVD±R等光学记录介质的光学要素。对光学滤波器要求选择性吸收不必要的波长的光的功能，并且为了防止荧光灯等的外光的反射或眩光要求吸收480～500nm及540～560nm的波长光，为了提高图像品质要求选择性吸收近红外线的波长的功能。
如上所述，为了在工业上有效地应用，持续要求开发光学及pH稳定性优异、在特定波长范围具有窄的吸收/发光波长范围、且示出高的摩尔消光系数的新染料。
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于提供光学及pH稳定性优异、具有窄的吸收及发光波长的范围、且荧光强度在600至800nm的荧光区域进一步提高而能够用作显影剂组合物，特别是导入氰尿酰氯取代基而能够增加荧光的荧光化合物，上述化合物的制造方法或上述化合物的应用。
用于解决课题的方案
为了实现上述目的，本发明提供由下述[化学式1]表示的荧光化合物及其制造方法。
[化学式1]
Figure BDA0001281468230000031
上述[化学式1]中，
X及Y相同或不同，分别独立地选自H、-SO3 -及-SO3H中，
R1及R2相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure BDA0001281468230000032
中，
R3及R4相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、-(CH2)mCOOZ1及
Figure BDA0001281468230000041
中，
R3及R4不会同时是选自-(CH2)mCOOZ1及
Figure BDA0001281468230000042
中的一个，
Z1及Z2相同或不同，分别独立地被选自H、N-琥珀酰亚胺基、肼基、N-羟基琥珀酰亚胺基、N-羟基琥珀酰亚胺基氧基、磺基琥珀酰亚胺基氧基、4-磺基-2,3,4,5-四氟苯基、马来酰亚胺C0-10烷基胺基、乙烯基磺酰基、乙烯基磺酰基C0-6烷基胺基及氨基C0-6烷基中的取代基取代，
n为1至6中的一个整数，
m为1至7中的一个整数，
p为1至10中的一个整数，
q为0至6中的一个整数，
r为1至10中的一个整数，
p’为1至10中的一个整数，
q’为1至10中的一个整数，
r’为1至10中的一个整数。
根据本发明的一个实施例，R1及R2中至少一个可以为
Figure BDA0001281468230000043
R3及R4中至少一个可以为选自-(CH2)mCOOZ1及
Figure BDA0001281468230000051
中的一个。
另外，本发明提供包含由上述[化学式1]表示的荧光化合物作为有效成分的显影剂组合物。
另外，本发明提供将由上述[化学式1]表示的荧光化合物标记于标记对象物质的方法。
发明效果
本发明的荧光化合物在水溶性条件下具有高的稳定性，因此容易长时间保管，而且pH稳定性得到提高，特别是通过导入氰尿酰氯取代基，与现有结构相比，即使在低的浓度下荧光强度也得到了提高，因此能够更有效地利用于目标物质的标记及染色。另外，光学稳定性优异，因此即使在长时间的染色下也示出稳定的荧光，在体内给予时不会蓄积并且荧光强度优异，因此与现有的染料相比，即使少量使用，也容易实现染色以及体内成像化，故可经济利用。
附图说明
图1是对本发明的一个实施例的在导入烷基羧基氨基氰尿酰氯取代基下的光学性能进行评价的结果。
图2是对本发明的另一个实施例的在导入烷基羧基氨基氰尿酰氯取代基下的光学性能进行评价的结果。
图3是将本发明的另一个实施例的化合物标记于生物分子而确认光学性能提高的结果。
图4是示出化合物20和对照荧光染料的荧光光谱的图。
图5是示出化合物18和对照荧光染料的荧光光谱的图。
图6是示出对化合物20和对照荧光染料的相对量子效率进行测定的结果的图。
图7是示出对化合物18和对照荧光染料的相对量子效率进行测定的结果的图。
图8是示出化合物18和对照荧光染料的蛋白质反应物(Conjugates)间荧光强度比较结果的图。
图9是示出利用了FOBI的荧光强度分析结果的图。
图10是示出对化合物20和对照荧光染料的按染料反应量的标记率(D/P ratio)进行比较的结果的图。
图11是示出对化合物20和对照荧光染料的对蛋白质标记时按染料反应量的荧光强度进行比较的结果的图。
图12是示出在FOBI红色通道(Red channel)成像的结果的图。
图13是化合物20和对照荧光染料的按标记率的荧光强度的图。
具体实施方式
以下，进一步对本发明进行详细说明。
本发明提供由下述[化学式1]表示的荧光化合物。
[化学式1]
Figure BDA0001281468230000061
上述[化学式1]中，
X及Y相同或不同，分别独立地选自H、-SO3 -及-SO3H中，
R1及R2相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure BDA0001281468230000062
中，
R3及R4相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、-(CH2)mCOOZ1及
Figure BDA0001281468230000071
中，
R3及R4不会同时是选自-(CH2)mCOOZ1及
Figure BDA0001281468230000072
中的一个，
Z1及Z2相同或不同，分别独立地被选自H、N-琥珀酰亚胺基、肼基、N-羟基琥珀酰亚胺基、N-羟基琥珀酰亚胺基氧基、磺基琥珀酰亚胺基氧基、4-磺基-2,3,4,5-四氟苯基、马来酰亚胺C0-10烷基胺基、乙烯基磺酰基、乙烯基磺酰基C0-6烷基胺基及氨基C0-6烷基中的取代基取代，
n为1至6中的一个整数，
m为1至7中的一个整数，
p为1至10中的一个整数，
q为0至6中的一个整数，
r为1至10中的一个整数，
p’为1至10中的一个整数，
q’为1至10中的一个整数，
r’为1至10中的一个整数。
根据本发明的一个实施例，R1及R2中至少一个可以为
Figure BDA0001281468230000073
根据本发明的一个实施例，R3及R4中至少一个可以为-(CH2)mCOOZ1及
Figure BDA0001281468230000081
根据本发明的一个实施例，在由上述[化学式1]表示的化合物中，
R1及R2相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure BDA0001281468230000082
中，
R3及R4相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、-(CH2)mCOOZ1及
Figure BDA0001281468230000083
中，
R3及R4不会同时是选自-(CH2)mCOOZ1及
Figure BDA0001281468230000084
中的一个，
Z1及Z2相同或不同，分别独立地为H或N-琥珀酰亚胺基，
n为1至6中的一个整数，
m为1至6中的一个整数，
p为3至7中的一个整数，
q为0至4中的一个整数，
r为1至6中的一个整数，
p’为1至10中的一个整数，
q’为1至10中的一个整数，
r’为1至10中的一个整数。
根据本发明的另一个实施例，在由上述[化学式1]表示的化合物中，
R1及R2中至少一个为
Figure BDA0001281468230000091
R3及R4中至少一个可以为-(CH2)mCOOZ1及
Figure BDA0001281468230000092
本发明的由上述[化学式1]表示的化合物可以选自下述化合物1至化合物20中，但并不限定于此。
本发明的由上述[化学式1]表示的化合物为在分子内具有连续的双键的不饱和烃将两个的吲哚化合物连接的结构，可以根据碳原子数(A)标记为CyA。在下述化合物中，仅例示了Cy3、Cy5及Cy9系列的化合物，但并不限定于此，利用下述的制造方法容易合成Cy7、Cy11及Cy13系列的化合物。
另外，在下述化合物中，仅例示了在上述[化学式1]的定义中q为0或3的化合物，但并不限定于此，利用下述的制造方法容易合成q为1至6的化合物。
另外，在下述化合物中，仅例示了在上述[化学式1]的定义中r为1或5的化合物，但并不限定于此，利用下述的制造方法也容易合成r为2至10的化合物。
另外，在下述化合物中，仅例示了在上述[化学式1]的定义中p为4、6或9的化合物，但并不限定于此，利用下述的制造方法也容易合成p为1至10的化合物。
另外，在下述化合物中，仅例示了在上述[化学式1]的定义中q为3的化合物，但并不限定于此，利用下述的制造方法容易合成q为1至6的化合物。
另外，在下述化合物中，仅例示了在上述[化学式1]的定义中r为5的化合物，但并不限定于此，利用下述的制造方法也容易合成r为2至10的化合物。
另外，在下述化合物中，仅例示了在上述[化学式1]的定义中p为5的化合物，但并不限定于此，利用下述的制造方法也容易合成p为1至10的化合物。
化合物1：
Figure BDA0001281468230000101
化合物2：
Figure BDA0001281468230000102
化合物3：
Figure BDA0001281468230000103
化合物4：
Figure BDA0001281468230000111
化合物5：
Figure BDA0001281468230000112
化合物6：
Figure BDA0001281468230000113
化合物7：
Figure BDA0001281468230000114
化合物8：
Figure BDA0001281468230000115
化合物9：
Figure BDA0001281468230000121
化合物10：
Figure BDA0001281468230000122
化合物11：
Figure BDA0001281468230000123
化合物12：
Figure BDA0001281468230000131
化合物13：
Figure BDA0001281468230000132
化合物14：
Figure BDA0001281468230000133
化合物15：
Figure BDA0001281468230000134
化合物16：
Figure BDA0001281468230000141
化合物17：
Figure BDA0001281468230000142
化合物18：
Figure BDA0001281468230000143
化合物19：
Figure BDA0001281468230000151
化合物20：
Figure BDA0001281468230000152
本发明的由上述[化学式1]表示的荧光化合物与现有的花青系列染料化合物相比，即使在低的浓度处理下也能够示出强度得到提高的荧光。
本发明的由上述[化学式1]表示的荧光化合物吸收作为近红外线区域的500至700nm的窄的区域的波长，在600至800nm的波长示出强度得到提高的荧光。
本发明的由上述[化学式1]表示的荧光化合物可以标记于纤维、生物分子、纳米粒子或有机化合物之类的标记对象物质。
上述生物分子可以选自蛋白质、肽、碳水化合物、糖、脂肪、抗体、蛋白多糖、糖蛋白及siRNA中，但并不限定于此。
上述标记对象物质可以是未经过物理或化学改性的物质，但并不限定于此，也可以是经过物理或化学改性的物质。上述物理或化学改性可以是基于实验者要求的改性。另外，本发明的由上述[化学式1]表示的荧光化合物可以是为了容易标记而经过改性的化合物
根据本发明，为了标记于标记对象物质，由上述[化学式1]表示的化合物的定义R1或R2的-(CH2)mCOOH或
Figure BDA0001281468230000161
末端的-COOH的氢原子未被取代或者改性成可与存在于标记对象物质结构的官能团结合的取代基的情况也包含在上述[化学式1]的范围。可与上述取代基结合的取代基可以选自在肼基、N-羟基琥珀酰亚胺基、N-羟基琥珀酰亚胺基氧基、磺基琥珀酰亚胺基氧基、4-磺基-2,3,4,5-四氟苯基、马来酰亚胺C0-10烷基胺基、乙烯基磺酰基、乙烯基磺酰基C0-6烷基胺基及氨基C0-6烷基中，但并不限定于此。根据本发明，如果由上述[化学式1]表示的化合物被上述例示的取代基取代，则使其标记于纤维、生物分子、纳米粒子或有机化合物之类的标记对象物质会变得更容易。存在于上述标记对象物质的官能团可以是胺基、羟基或硫醇基，但并不限定于此。
标记由上述[化学式1]表示的荧光化合物的方法通过如下实现，作为溶剂，使用选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液及三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的缓冲液、选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇及乙腈中的有机溶剂、或水，在pH为5至12的条件下，使上述[化学式1]的化合物与上述生物分子、纳米粒子或有机化合物反应。上述反应在20至80℃的温度下进行30分钟至48小时即可。
在生物分子的情况下，大部分从包装单位开始已溶解在指定的缓冲液中，为了确保生物分子的稳定性，要求其它的缓冲液或pH的情况多，因此难以调节。本发明的化学式1的化合物因在多种缓冲液、反应温度、pH条件等下与蛋白质容易反应而显出荧光，所以适合用于生物分子标记。
提供制造本发明的由上述[化学式1]表示的荧光化合物的方法。
由下述[化学式1]表示的化合物可以利用下述[化学式2]的化合物而制造，
[化学式2]
Figure BDA0001281468230000162
[化学式1]
Figure BDA0001281468230000171
上述[化学式1]或[化学式2]中，
X及Y相同或不同，分别独立地选自H、-SO3 -及-SO3H中，
R1及R2相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure BDA0001281468230000172
中，
R3及R4相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、-(CH2)mCOOZ1及
Figure BDA0001281468230000173
中，
R3及R4不会同时是选自-(CH2)mCOOZ1及
Figure BDA0001281468230000174
中的一个，
R5及R6相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure BDA0001281468230000175
中，
R7及R8相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、-(CH2)mCOOH及
Figure BDA0001281468230000181
中，
n为1至6中的一个整数，
m为1至7中的一个整数，
p为1至10中的一个整数，
q为0至6中的一个整数，
r为1至10中的一个整数，
p’为1至10中的一个整数，
q’为1至10中的一个整数，
r’为1至10中的一个整数。
根据本发明的一个实施例，上述反应可以在水溶液中进行，为了提高反应性，可以进一步添加碳酸氢钠之类的碱而进行。
根据本发明，上述[化学式2]的化合物可以使下述[化学式3]的化合物与氰尿酰氯反应而制造。
[化学式3]
Figure BDA0001281468230000182
上述[化学式3]中，
X及Y相同或不同，分别独立地选自H、-SO3 -及-SO3H中，
R9及R10相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure BDA0001281468230000183
中，
R11及R12相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基及
Figure BDA0001281468230000191
中。
本发明的上述反应优选在低温的水或有机溶剂中进行，反应时可以添加碳酸氢钠之类的碱而进行。
根据本发明，上述[化学式3]的化合物分别可以使下述[化学式4]的化合物被胺C0-6烷基胺基取代而制造。
[化学式4]
Figure BDA0001281468230000192
上述[化学式4]中，
X及Y相同或不同，分别独立地选自H、-SO3 -及-SO3H中，
R13及R14相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure BDA0001281468230000193
中，
R15及R16相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基及
Figure BDA0001281468230000194
中。
在上述胺C0-6烷基胺基中，碳原子数为0的胺C0烷基胺基意味着肼基(-NHNH2)。用上述胺C0-6烷基胺基取代的方法可以利用通常的胺C0-6烷基胺基取代方法。
例如，在导入肼基的情况下，可以通过以下方式制造，在休尼格碱(Hunig’s base)存在下的有机溶剂中添加DSC(N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯)使上述[化学式4]的化合物反应，之后使其与腈基甲酸叔丁酯反应，之后除去叔丁氧基羧基。
另一方面，在导入胺C0-6烷基胺基的情况下，能够将像O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N’,N’-四甲基四氟硼酸脲之类的一侧胺被保护基保护的胺烷基氨基前体使用于反应中，但是并不限定于此。
根据本发明，上述[化学式4]的化合物可以使下述[化学式5]的化合物在包含下述[化学式6]的化合物和乙酸酐的溶剂中回流而制造。
[化学式5]
Figure BDA0001281468230000201
[化学式6]
Figure BDA0001281468230000202
上述[化学式5]或[化学式6]中，
X及Y相同或不同，分别独立地选自H、-SO3 -及-SO3H中，
R13及R14相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure BDA0001281468230000203
中，
R15及R16相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基及
Figure BDA0001281468230000204
中。
上述反应为了提高反应性，可以在乙酸酐进一步添加三乙基胺之类的碱和有机溶剂而进行反应，或者也可以在乙酸酐进一步添加吡啶而进行反应。
本发明提供包含由上述[化学式1]表示的的荧光化合物的显影剂组合物。
本发明的由上述[化学式1]表示的的荧光化合物为花青发色团被烷基羧基氨基氰尿酰氯取代基取代的结构，与现有的花青染料相比，波长范围窄，在低的浓度下示出高的荧光强度，并且无细胞毒性。本发明的由上述[化学式1]表示的的荧光化合物有效地吸收500-700nm的窄的区域的波长，在600至800nm的窄的波长区域示出显著得到提高的荧光强度，因此不会与生物分子的自身荧光区域重叠，所以包含其作为有效成分的组合物可以有效应用于在体成像化用显影剂。
本发明提供包含使由上述[化学式1]表示的荧光化合物与标记对象物质结合的步骤的化合物标记方法。
根据本发明，上述标记对象物质可以选自纤维、生物分子、纳米粒子或有机化合物中，上述生物分子可以选自蛋白质、肽、碳水化合物、糖、脂肪、抗体、蛋白多糖、糖蛋白及siRNA中。
本发明的上述[化学式1]的化合物可以通过蛋白质与[化学式1]的化合物的反应而容易染色在蛋白质。
因此，上述标记通过如下实现，作为溶剂，使用选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液及三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的缓冲液、选自二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇及乙腈中的有机溶剂、或水，在pH为5至12的条件下，使上述[化学式1]的化合物与上述生物分子、纳米粒子或有机化合物反应。上述反应在20至80℃的温度下进行30分钟至48小时即可。
另一方面，在生物分子的情况下，大部分从包装单位开始已溶解在指定的缓冲液中，为了确保生物分子的稳定性，要求其它的缓冲液或pH的情况多，因此难以调节。本发明的化学式1的化合物因在多种缓冲液、反应温度、pH条件等下与蛋白质容易反应而显出荧光，所以适合用于生物分子标记。
以下，为了有助于本发明的理解，举优选的实施例来进一步对本发明进行详细说明。但是，下述的实施例只是为了更容易理解本发明而提供的，本发明的内容并不限定于此。
实施例
为了对合成的化合物进行分析，FT-NMR分光分析使用Bruker公司的Avance 300或500、LC/MS使用Agilent公司的LC/MSD(G-1956B)而进行了测定。
合成的染料的在吸收波长及最大波长的吸收值使用Agilent公司的Cary 8454UV-VIS而进行了测定，在发光波长及最大发光波长的发光值使用Perkin Elmer公司的LS-55而进行了测定。
在用于化合物的分离及提纯的柱色谱法(column chromatography)中，在正相(normal phase)的情况下，作为硅胶(silica gel)使用了Merck公司的kieselgel 60(230-400mesh)，在薄层色谱法(TLC)中，使用了涂布有silicagel60GF254(0.25mm,Merck)的玻璃板。TLC的化合物确认利用254nm及365nm的紫外线或者使用磷钼酸(phosphomolybdicacid)(PMA)20至30％乙醇溶液或KMnO4发色剂来实现。在反相(reverse phase)的情况下，在TLC中使用了涂布有silicagel 60RP-18F254S(0.25mm,Merck)的玻璃板，在柱色谱法的情况下，在Buchi公司的MPLC(medium pressure liquid chromatography)仪器的FractionCollector R-660连接反相柱Lichroprep RP-18(40至63m,Merck公司产品)而使用。
制造例1
Figure BDA0001281468230000221
1阶段
在对肼基苯磺酸(p-hydrazinobenzenesulfonic acid)(10g,53mmol,1eq,Aldrich)和3-甲基-2-丁酮(3-methyl-2-butanone)(17.18mL,160mmol,3.02eq,TCI)中加入乙酸30mL，之后加热回流4小时，使其反应。冷却至常温，过滤生成的固体粒子。用乙酸乙酯清洗3次，之后减压干燥(11.34g,89％)。
Rf＝0.68(RP-C18,乙腈/水的体积比为1:4v/v)
2阶段
将氢氧化钾(1.427g,25.4mmol,1.2eq)溶解于丙醇35mL中，将在1阶段中得到的化合物(5.073g,21.2mmol,1eq)溶解于甲醇35mL中而向上述混合液中添加，之后在常温搅拌24小时，之后过滤，得到目标的化合物(5.35g,90％)。
Rf＝0.68(RP-C18,乙腈/水的体积比为1:4v/v)
1H NMR(300MHz，D2O)：δ7.60(s，1H)，7.58(d，1H，J＝8.32Hz)，7.32(d，1H，J＝7.99Hz)，2.08(s，3H)，1.06(s，6H)
制造例2
Figure BDA0001281468230000231
将制造例1的化合物(2.774g，10mmol，1eq)和6-溴正己酸(6-bromo-n-hexanoicacid)(2.34g，12mmol，1.2eq，Aldrich)溶解于15mL的1，2-二氯苯(1，2-dichlorobenzene)中，加热回流12小时。冷却至常温后，除去溶剂，加入异丙醇(isopropyl alcohol)后，进行过滤、减压干燥，得到目标的化合物(2.653g，75％)。
Rf＝0.08(RP-C18，乙腈/水的体积比为1：4v/v)
1H NMR(400MHz，D2O)：δ8.00(s，1H)，7.90(d，1H，J＝8.86Hz)，7.77(d，1H，J＝8.43Hz)，4.37(t，2H，J＝7.46Hz)，2.25(t，2H，J＝7.01Hz)，1.85(m，2H)，1.57-1.26(m，13H)
LC/MS，计算值C17H23NO5S 353.43，测定值354.18
制造例3
Figure BDA0001281468230000232
将制造例1的化合物(1.66g，6mmol，1eq)和8-溴辛酸(8-bromooctanoic acid)(1.34g，6mmol，1eq，Aldrich)溶解于30mL的1，2-二氯苯(1，2-dichlorobenzene)中，加热回流12小时。冷却至常温后，除去溶剂，添加异丙醇(isopropyl alcohol)，进行过滤、减压干燥，得到目标的化合物(1.85g，81％)。
Rf＝0.20(RP-C18，乙腈/水的体积比为1∶3v/v)
实施例1.化合物1的制造
实施例1.1
Figure BDA0001281468230000241
在制造例1的化合物(20g，72.1mmol，1eq)中加入碘乙烷(ethyl iodide)(110mL，1.375mmol，19eq，TCI)后，加热回流24小时。冷却至常温后，除去残留的碘乙烷，用50mL的丙酮清洗3次，之后过滤，在40℃减压干燥，得到目标的化合物(18.37g，95％)。
Rf＝0.18(RP-C18，乙腈/水的体积比为1∶4v/v)
1H NMR(400MHz，D2O)：δ7.99(s，1H)，7.88(d，1H，J＝8.23Hz)，7.80(d.1H，J＝8.46Hz)，4.43(m，2H)，1.52-1.40(m，12H)
LC/MS，计算值C13H17NO3S 267.34，测定值268.16
实施例1.2
Figure BDA0001281468230000242
将实施例1.1的化合物(16g，59.8mmol，1eq)和N，N’-二苯基甲脒(N，N’-Diphenylformamidine)(13.2g，67.3mmol，1.125eq，TCI)加入到40mL的乙酸和40mL的乙酸酐的混合溶液中，加热回流4小时。反应终止后，冷却至常温后，除去溶剂，之后加入乙酸乙酯，生成固体。接着，进行过滤、减压干燥，得到目标的化合物(12.97g，57％)。
Rf＝0.25(RP-C18，乙腈/水的体积比为1∶4v/v)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ7.85(s.1H)，7.70(dd，1H，J＝1.35Hz，1.32Hz)，7.53-7.45(m，7H)，7.29(dd，1H，J＝1.92Hz，6.66Hz)，4.13(m，2H)，1.70(s.6H)，1.32(t，3H，J＝7.05Hz)
LC/MS，计算值C20H22N2O3S 370.47，测定值370.98
实施例1.3
Figure BDA0001281468230000251
将实施例1.2的化合物(1.01g，2.429mmol，1eq)和制造例2的化合物(0.86g，2.429mmol，1eq)加入到5mL的乙酸酐和5mL的吡啶(Pyridine)的混合溶液中后，在110℃反应4小时。反应终止后，冷却至常温，添加乙酸乙酯，使其结晶化，之后进行过滤、减压干燥。将15％乙腈水溶液作为展开液并通过RP-C18反相色谱法进行提纯，得到目标的化合物(0.37g，24％)。
Rf＝0.70(RP-C18，乙腈/水的体积比为3∶7v/v)
1H NMR(300MHz，D2O)：δ8.38(t，1H，J＝13.5Hz)，7.78(s.2H)，7.73(t，2H，J＝7.42Hz)，7.23(dd，2H，J＝5.25Hz，7.97Hz)，6.24(dd，2H，J＝4.79Hz，4.56Hz)，3.97(m，4H)，2.23(t，2H，J＝7.26Hz)，1.73-1.20(m，21H)
LC/MS，计算值C31H38N2O8S2630.77，测定值631.31
λabs(水)：549nm，λfl(水)：573nm
实施例1.4
Figure BDA0001281468230000261
将实施例1.3的化合物(963mg,1.53mmol,1eq)溶解于DMF(二甲基甲酰胺)80mL中，加热至40℃。加入休尼格碱2.7mL，将DSC(1.17g,4.58mmol,3eq,Aldrich)投入到反应液中。搅拌1小时，加入乙酸乙酯，得到红褐色的固体，用乙酸乙酯和醚(ether)清洗多次而过滤。将清洗后的固体溶解于DMF 70mL中，投入肼基甲酸叔丁酯(tert-butyl carbazate)(303mg,2.29mmol,1.5eq,TCI)后，加入休尼格碱2.7mL，搅拌12小时。反应终止后，加入乙酸乙酯，得到红褐色的固体，进行过滤、减压干燥后，将15％乙腈水溶液作为展开液并通过RP-C18反相色谱法进行提纯，得到目标的化合物(407mg,35.8％)。
Rf＝0.65(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例1.5
Figure BDA0001281468230000262
在实施例1.4的化合物(400mg,0.54mmol,1eq)中投入氯仿5mL、TFA12mL及水5mL。在常温搅拌12小时，之后对反应混合液进行减压蒸馏，得到红褐色的固体。将15％乙腈水溶液作为展开液并通过RP-C18反相色谱法进行提纯，得到目标的化合物(130mg,37.3％)。
Rf＝0.55(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例1.6
Figure BDA0001281468230000271
将氰尿酰氯(Cyanuric chloride)(17mg,0.093mmol,1eq,Aldrich)投入到水10mL中，冷却至0℃后，搅拌30分钟。保持温度，添加实施例1.5的化合物(60mg,0.093mmol,1eq)，搅拌10分钟。接着，在反应混合液中添加碳酸氢钠15mg，之后将温度保持在0℃，反应2小时。将15％乙腈水溶液作为展开液并通过RP-C18反相色谱法进行提纯，得到目标的化合物(34mg,46.1％)。
Rf＝0.6(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例1.7.化合物1的合成
Figure BDA0001281468230000272
将实施例1.6的化合物(50mg,0.063mmol,1eq)完全溶解于水3mL中，之后添加甘氨酸(14mg,0.189mmol,3eq)，搅拌10分钟，之后添加碳酸氢钠15mg，搅拌12小时。将15％乙腈水溶液作为展开液并通过RP-C18反相色谱法进行提纯，得到目标的化合物1(32mg,61％)。
Rf＝0.5(Silicagel,乙腈/水的体积比为9:1v/v)
MALDI-TOF M/S,计算值C36H43ClN8O9S2 831.36,测定值831.12
以下，对于实施例2至10，如果没有特别记载，则与实施例1相同或相似的方法来合成目标的化合物。
实施例2.化合物2的制造
实施例2.1
Figure BDA0001281468230000281
通过除了在制造例1的化合物中使用碘甲烷以外与实施例1.1相同的方法，合成目标的化合物(13.45g，82％)。
Rf＝0.13(RP-C18，乙腈/水的体积比为1∶4v/v)
实施例2.2
Figure BDA0001281468230000282
通过除了代替实施例1.1的化合物使用实施例2.1的化合物以外与实施例1.2相同的方法，合成目标的化合物(6.48g，52％)。
Rf＝0.33(RP-C18，乙腈/水的体积比为1∶4v/v)
实施例2.3
Figure BDA0001281468230000283
(0.94g，27％)
Rf＝0.80(RP-C18，乙腈/水的体积比为3∶7v/v)
1H NMR(300MHz，D2O)：δ7.95(m，1H)，7.84-7.62(m，4H)，7.46(d，2H，J＝7.89Hz)，6.51(d，2H，J＝8.22Hz)，4.41(t，2H，J＝8.07Hz)，3.56(s，3H)，1.90(m，2H)，1.70-1.24(m，18H)
MALDI-TOF M/S，计算值C30H36N2O8S2616.75，测定值617.53
λabs(水):546nm,λfl(水):570nm
实施例2.4
Figure BDA0001281468230000291
(820mg,51.9％)
Rf＝0.7(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例2.5
Figure BDA0001281468230000292
(450mg,65.2％)
Rf＝0.55(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例2.6
Figure BDA0001281468230000293
(183mg,33.0％)
Rf＝0.6(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例2.7.化合物2的合成
Figure BDA0001281468230000301
(41mg,39.1％)
Rf＝0.4(Silicagel,乙腈/水的体积比为9:1v/v)
MALDI-TOF M/S,计算值C35H41ClN8O9S2 817.33,测定值817.02
实施例3.化合物3的制造
实施例3.1
Figure BDA0001281468230000302
(19.81g,98％)
Rf＝0.45(RP-C18,乙腈/水的体积比为1:4v/v)
实施例3.2
Figure BDA0001281468230000303
(10.28g,85％)
Rf＝0.10(RP-C18,乙腈/水的体积比为1:4v/v)
实施例3.3
Figure BDA0001281468230000311
(3.06g，20.6％)
Rf＝0.49(RP-C18，乙腈/水的体积比为3∶7v/v)
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ8.34(t，1H，J＝13.2Hz)，7.78(s，2H)，7.65(d，2H，J＝8.04Hz)，7.39(m，2H)，6.56(dd，2H，J＝13.16Hz，13.44Hz)，4.10(m，4H)，1.88(t，2H，J＝6.88Hz)，1.77-1.38(m，21H)，0.96(t，3H，J＝7.24Hz)
LC/MS，计算值C32H40N2O8S2644.8，测定值643.29
λabs(水)：550nm，λfl(水)：574nm
实施例3.4
Figure BDA0001281468230000312
(625mg，39.8％)
Rf＝0.65(Silicagel，异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2∶4∶1∶3v/v/v/v)
实施例3.5
Figure BDA0001281468230000313
(373mg,70.4％)
Rf＝0.55(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例3.6
Figure BDA0001281468230000321
(300mg,70.0％)
Rf＝0.7(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例3.7.化合物3的合成
Figure BDA0001281468230000322
(61mg,38.8％)
Rf＝0.6(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
MALDI-TOF M/S,计算值C37H45ClN8O9S2 845.38,测定值845.48
实施例4.化合物4的制造
实施例4.1
Figure BDA0001281468230000323
使用实施例2.2的化合物和制造例3的化合物，并通过实施例1.3的方法，得到目标的化合物(0.85g,22％)。
Rf＝0.6(RP-C18,乙腈/水的体积比为1:3v/v)
实施例4.2
Figure BDA0001281468230000331
(655mg,37.1％)
Rf＝0.65(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例4.3
Figure BDA0001281468230000332
(470mg,86.0％)
Rf＝0.6(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例4.4
Figure BDA0001281468230000333
(242mg,45.9％)
Rf＝0.65(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例4.5
Figure BDA0001281468230000341
(52mg,33.1％)
Rf＝0.45(Silicagel,乙腈/水的体积比为9:1v/v)
MALDI-TOF M/S,计算值C37H45ClN8O9S2 845.38,测定值845.52
实施例5.化合物5的制造
实施例5.1
Figure BDA0001281468230000342
(0.31g,25％)
Rf＝0.6(RP-C18,乙腈/水的体积比为1:3v/v)
LC/MS,计算值C33H42N2O8S2 658.83,测定值656.9
实施例5.2
Figure BDA0001281468230000343
(603mg,38.7％)
Rf＝0.60(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例5.3
Figure BDA0001281468230000351
(396mg,75.8％)
Rf＝0.45(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例5.4
Figure BDA0001281468230000352
(155mg,33.4％)
Rf＝0.55(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例5.5
Figure BDA0001281468230000353
(23mg,21.9％)
Rf＝0.45(Silicagel,乙腈/水的体积比为9:1v/v)
MALDI-TOF M/S,计算值C38H47ClN8O9S2 859.41,测定值859.57
实施例6.化合物6的制造
实施例6.1
Figure BDA0001281468230000361
(2.09g,31％)
Rf＝0.52(RP-C18,乙腈/水的体积比为1:3v/v)
LC/MS,计算值C34H44N2O8S2 672.85,测定值671.04
实施例6.2
Figure BDA0001281468230000362
(510mg,40.1％)
Rf＝0.55(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例6.3
Figure BDA0001281468230000363
(126mg,73.0％)
Rf＝0.45(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例6.4
Figure BDA0001281468230000371
(88mg,36.2％)
Rf＝0.50(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例6.5
Figure BDA0001281468230000372
(36mg,41.5％)
Rf＝0.45(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例7.化合物7的制造
实施例7.1
Figure BDA0001281468230000373
将实施例1.1的化合物(2.2g,8.23mmol,1eq)和丙二醛二苯胺盐酸盐(Malonaldehyde Dianilide Hydrochloride)(2.55g,9.88mmol,1.2eq,TCI)加入到10m的乙酸和10mL的乙酸酐的混合溶液中，加热回流4小时。冷却至常温，除去反应液后，利用乙酸乙酯，生成固体，进行过滤、减压干燥，得到目标的化合物(3.47g,96％)。
Rf＝0.20(RP-C18,乙腈/水的体积比为1:4v/v)
实施例7.2
Figure BDA0001281468230000381
将实施例7.1的化合物(6.40g，14.6mmol，1eq)和制造例2的化合物(5.12g，14.6mmol，1eq)加入到80mL的吡啶中后，在60℃反应4小时。冷却至常温，加入乙酸乙酯，生成蓝色的固体，之后进行过滤、减压干燥。将25％乙腈水溶液作为展开液并通过RP-C18反相色谱法进行提纯，得到目标的化合物(2.09g，22％)。
Rf＝0.58(RP-C18，乙腈/水的体积比为3∶7v/v)
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.34(t，2H，J＝13.2Hz)，7.80(s，2H)，7.63(d，2H，J＝8.16Hz)，7.30(dd，2H，J＝2.80Hz，2.76Hz)，6.58(t，1H，J＝12.2Hz)，6.30(dd，2H，J＝8.64Hz，8.56Hz)，4.13-4.06(m，4H)，1.98(t，2H，J＝6.84Hz)，1.72-1.18(m，21H)
LC/MS，计算值C33H39N2O8S2655.22，测定值655.24
λabs(水)：647nm，λfl(水)：678nm
实施例7.3
Figure BDA0001281468230000382
(200mg，28.4％)
Rf＝0.7(Silicagel，异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2∶4∶1∶3v/v/v/v)
实施例7.4
Figure BDA0001281468230000391
(150mg,86％)
Rf＝0.56(Silicagel,乙腈/水的体积比为＝12:1v/v)
实施例7.5
Figure BDA0001281468230000392
(15mg,61.5％)
Rf＝0.59(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例7.6
Figure BDA0001281468230000393
(10mg,63.7％)
Rf＝0.1(Silicagel,乙腈/水的体积比为＝12:1v/v)
实施例8.化合物8的制造
实施例8.1
Figure BDA0001281468230000401
(0.52g,6.75％)
Rf＝0.55(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例8.2
Figure BDA0001281468230000402
(250mg,30.5％)
Rf＝0.65(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例8.3
Figure BDA0001281468230000403
(150mg,68.6％)
Rf＝0.65(Silicagel,乙腈/水的体积比为＝8:1v/v)
实施例8.4
Figure BDA0001281468230000411
(200mg,59.2％)
Rf＝0.55(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例8.5
Figure BDA0001281468230000412
(25mg,20.6％)
Rf＝0.475(Silicagel,乙腈/水的体积比为＝12:1v/v)
实施例9.化合物9的制造
实施例9.1
Figure BDA0001281468230000413
添加2-甲基乙酰乙酸乙酯(Ethyl 2-Methyl Acetoacetate)(29.2mL,0.203mol,1eq)、21％乙氧基钠溶液(21％Sodium Ethoxide Solution)(64mL,0.816mol,4eq)、6-溴己酸乙酯(Ethyl 6-Bromohexanoate)(34mL,0.192mol,1eq)、乙醇(Ethanol)(200mL)后，在120℃回流12小时。然后，利用1M盐酸，使溶剂的pH中和成中性，之后利用氯仿和蒸馏水进行萃取。对萃取的溶剂进行减压干燥，之后利用正相色谱法进行提纯，得到目标的化合物(36.8g,63.4％)。
Rf＝0.34(Silicagel,己酸/乙酸乙酯＝10:1v/v)
实施例9.2
Figure BDA0001281468230000421
在实施例9.1的化合物(13.7g,0.0486mol,1eq)中添加氢氧化钠(6.2g,0.170mol,3.5eq)、甲醇(Methanol)(47.2mL)、蒸馏水(15.6mL)后，在50℃回流12小时。然后，对溶剂进行减压干燥，之后利用1M盐酸，将pH调节成1，之后利用乙酸乙酯进行萃取，之后进行减压干燥，得到目标的化合物(8.17g,90.7％)。
Rf＝0.05(Silicagel,己酸/乙酸乙酯＝10:1v/v)
实施例9.3
Figure BDA0001281468230000422
在实施例9.2的化合物(8.165g,0.0438mol,1eq)中添加对肼基苯磺酸半水合物(p-Hydrazinobenzensulfonic Acid Hemihydrate)(8.25g,0.0438mol,1eq)、乙酸后，在120℃回流5小时。反应终止后，进行减压干燥，之后利用正相色谱法进行提纯(12.6g,84.8％)。
Rf＝0.51(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例9.4
Figure BDA0001281468230000431
在实施例9.3的化合物(12.57g,0.037mol,1eq)中添加乙酸钠(4.16g,0.061mol,1.65eq)、1,3-丙磺酸内酯(1,3-Propane Sultone)(21.3mL,0.243mol,6.57eq)、乙腈(24.8mL)后，在110℃回流5小时。反应终止后，进行减压干燥，之后利用反相色谱法进行提纯(12g,70.6％)。
Rf＝0.3(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例9.5
Figure BDA0001281468230000432
在制造例1的化合物(50g,0.18mol,1eq)中添加乙酸钠(Sodium Acetate)(17.87g,0.216mol,1.2eq)、1,3-丙磺酸内酯(1,3-Propane Sultone)(70.5mL,0.8mol,4.5eq)、乙腈(42mL)。然后，在110℃回流12小时，之后利用乙酸乙酯使其结晶化，进行过滤、减压干燥(61g,94％)。
Rf＝0.3(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例9.6
Figure BDA0001281468230000433
在实施例9.5的化合物(60g,0.166mol,1eq)中添加丙二醛二苯胺盐酸盐(Malonaldehyde Dianilide Hydrochloride)(42.9g,0.166mol,1eq)、三乙基胺(Triethylamine)(2.3mL,0.016mol,0.1eq)、乙酸(551mL)后，在140℃回流。反应终止后，利用乙酸乙酯使其结晶化，进行过滤及减压干燥后，利用正相色谱法提纯化合物(7.5g,8.5％)。
Rf＝0.55(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
实施例9.7
Figure BDA0001281468230000441
将实施例9.4的化合物(6.5g,0.014mol,1eq)和实施例9.6的化合物(7.5g,0.014mol,1eq)添加到三乙基胺(16.6mL,0.12mol,8.5eq)、乙酸酐(7.3mL)、DMF(75mL)的混合溶液中，在常温反应1小时。反应终止后，利用乙酸乙酯使其结晶化，之后进行过滤及减压干燥，利用正相色谱法提纯化合物(250mg,2％)。
Rf＝0.4(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
LC/MS,计算值C36H44N2Na2O14S4 902.98,测定值901
实施例9.8
Figure BDA0001281468230000442
将实施例9.7的化合物(100mg,0.1165mmol,1eq)和O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N’,N’-四甲基四氟硼酸脲(TSTU；N,N,N’,N’-Tetramethyl-O-(N-succinimidyl)uroniumtetrafluoroborate)(77mL,0.2563mmol,2.2eq)、三乙基胺(125mL,0.897mmol,7.7eq)添加到DMF 10mL中后，在常温反应40分钟。反应后，对生成的固体粒子进行过滤，利用乙酸乙酯清洗3次，之后进行减压干燥。将经干燥的化合物和1,3-丙二胺(1,3-Diaminopropane)(9.72mL.1165mmol,1eq)溶解于DMF 10mL中后，在常温反应30分钟。反应后，对生成的固体粒子进行过滤。利用乙酸乙酯清洗3次，之后进行减压干燥。然后，在10％乙腈存在的条件下通过反相色谱法进行提纯，得到目标的化合物(91mg,86％)。
Rf＝0.34(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
LC/MS,计算值C39H54N4NaO13S4 937.11,测定值934.8
实施例9.9
Figure BDA0001281468230000451
将氰尿酰氯(55mg,0.2996mmol,3eq)加入到蒸馏水5mL和冰10g中后，在0℃搅拌0.5小时。添加实施例9.8的化合物(91mg,0.0999mmol,1eq)和碳酸氢钠5mg，在0℃的温度反应3小时。反应终止后，进行冻结干燥，之后在20％乙腈展开液存在的条件下进行RP-C18反相色谱分析，得到目标的化合物(14mg,13％)。
Rf＝0.49(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
LC/MS,计算值C42H52Cl2N7O13S4 1062.07,测定值1061.4
实施例9.10
Figure BDA0001281468230000461
将实施例9.9的化合物(7mg,0.0066mmol,1eq)、甘氨酸(1.5mg,0.0198mmol,3eq)、碳酸氢钠(1mg,0.0132mmol,2eq)溶解于蒸馏水500μL中后，在常温反应12小时。反应终止后，进行冻结干燥，之后在10％乙腈展开液存在的条件下进行反相色谱分析，得到化合物9(1mg,14％)。
Rf＝0.31(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
LC/MS,计算值C44H54ClN8Na3O15S4 1167.63,测定值1167.2
实施例10.化合物10的制造
Figure BDA0001281468230000462
将实施例9.9的化合物(15mg,0.014mmol,1eq)和6-氨基己酸(6-Aminohexanoicacid)(9.27mg,0.0707mmol,5eq)、碳酸氢钠(4.7mg,0.056mmol,4eq)溶解于蒸馏数2mL中，之后在常温反应12小时。反应终止后，进行冻结干燥，在10％乙腈展开液存在的条件下进行反相色谱分析，得到化合物10(1.8mg,11％)。
Rf＝0.48(Silicagel,异丁醇/正丙醇/乙酸乙酯/水的体积比为2:4:1:3v/v/v/v)
MALDI-TOF M/S,计算值C48H65ClN8O15S4 1157.79,测定值1157.4
实施例11.化合物11的制造
Figure BDA0001281468230000471
通过与上述实施例相似的方法，得到化合物11。
MALDI-TOF M/S,计算值C45H67ClN8O9S2 999.68,测定值998.4
实施例12.化合物12的制造
Figure BDA0001281468230000472
通过与上述实施例相似的方法，得到化合物12。
MALDI-TOF M/S,计算值C41H53ClN8O9S2 901.49,测定值900.3
实施例13.化合物13的制造
Figure BDA0001281468230000473
通过与上述实施例相似的方法，得到化合物13。
MALDI-TOF M/S,计算值C43H51ClN8O9S2 923.50,测定值922.3
实施例14.化合物14的制造
Figure BDA0001281468230000481
通过与上述实施例相似的方法，得到化合物14。
MALDI-TOF M/S,计算值C43H54ClN8O15S4 1086.65,测定值1085.2
实施例15.化合物15的制造
Figure BDA0001281468230000482
通过与上述实施例相似的方法，得到化合物15。
MALDI-TOF M/S,计算值C51H63ClN14O15S3 1279.23,测定值1277.3
实施例16.化合物16的制造
Figure BDA0001281468230000483
通过与上述实施例相似的方法，得到化合物16。
MALDI-TOF M/S,计算值C39H47ClN8O9S2 871.42,测定值870.2
实施例17.化合物17的制造
实施例17.1
Figure BDA0001281468230000491
通过与上述实施例相似的方法，得到目标的化合物。
LC/MS,计算值C34H44N2O14S4 832.98,测定值831.1
实施例17.2
Figure BDA0001281468230000492
通过与上述实施例相似的方法，得到化合物17。
LC/MS,计算值C38H47N3O16S4 930.05,测定值929.8
实施例18.化合物18的制造
实施例18.1
Figure BDA0001281468230000501
通过与上述实施例相似的方法，得到目标的化合物。
LC/MS,计算值C46H63ClN8O15S4 1130.3,测定值1131.5
实施例18.2
Figure BDA0001281468230000502
通过与上述实施例相似的方法，得到化合物18。
LC/MS,计算值C50H66ClN9O17S4 1228.82,测定值1226.3
实施例19.化合物19的制造
实施例19.1
Figure BDA0001281468230000511
通过与上述实施例相似的方法，得到目标的化合物。
LC/MS,计算值C36H46N2O14S4 859.02,测定值858.3
实施例19.2
Figure BDA0001281468230000512
通过与上述实施例相似的方法，得到化合物19。
LC/MS,计算值C40H49N3O16S4 956.09,测定值954.3
实施例20.化合物20的制造
实施例20.1
Figure BDA0001281468230000521
通过与上述实施例相似的方法，得到目标的化合物。
LC/MS,计算值C48H65ClN8O15S4 1157.79,测定值1156.0
实施例20.2
Figure BDA0001281468230000522
通过与上述实施例相似的方法，得到化合物20。
LC/MS,计算值C52H68ClN9O17S4 1253.33,测定值1253.3
比较例1.
Figure BDA0001281468230000523
将实施例7.5的化合物(50mg,0.061mmol,1eq)完全溶解于水3mL中后，添加实施例7.4的化合物(82mg,0.122mmol,2eq)，搅拌10分钟，之后添加碳酸氢钠15mg，搅拌12小时。反应终止后，在15％乙腈水溶液作为展开液并通过RP-C18反相色谱法进行提纯，得到目标的化合物(37mg,42％)。
Rf＝0.6(Silicagel,乙腈/水的体积比为9:1v/v)
试验例1.
本发明的[化学式1]的化合物通过在花青结构的羧基烷基残基导入烷基羧基氨基氰尿酰氯取代基，与现有的花青结构的化合物相比，荧光强度得到大幅提高。
根据本发明的[化学式1]，合成导入有在氰尿酰氯结合有氨基烷基羧酸的取代基的化合物，对它们的光学性能进行比较。将甘氨酸(Glycine)作为氨基烷基羧酸利用于合成中而合成本发明的化合物1(实施例1.7)，对其和未导入烷基羧基氨基氰尿酰氯取代基的化合物(实施例1.3)的光学性能进行比较。
在相同的浓度下分别测定实施例1.7和实施例1.3的化合物的吸收波长及强度，示于下述图1a中。对于吸收波长强度而言，实施例1.3的化合物示出稍微高的倾向。为了比较准确的荧光波长强度，以具有相同的吸收强度的方式对实施例1.7和实施例1.3的化合物的浓度进行调整，之后测定荧光波长及强度，示于下述图1b中。
如图1b所示，确认到本发明的导入有烷基羧基氨基氰尿酰氯取代基的花青类化合物(实施例1.7)与未导入烷基羧基氨基氰尿酰氯取代基的花青类化合物(实施例1.3)相比，荧光波长的强度以2倍左右显著增加。
试验例2.
为了确认对本发明的[化学式1]的化合物以可标记于生物分子的方式进行了改性时的光学性能变化，在化合物9.7和化合物10导入N-琥珀酰亚胺基(N-succinimidyl)，通过上述实施例所示的方法，分别合成化合物19和化合物20，在相同的消光波长强度下对荧光特性进行比较。
在相同消光波长及强度下的荧光特性比较
在常温将5μL的化合物19和5μL的化合物20以10mg/mL的浓度分别添加到PBS 5mL中，制造试料。接着，在各试料2mL中分别添加PBS1mL，之后测定按消光波长的强度。根据上述得到的数据，对试料的浓度进行调节，使得化合物19和化合物20的消光强度(Abs at650nm)相同，之后稀释多次，利用Perkin Elmer公司制微孔板检测仪(Plate reader)测定荧光值，测定3次，将其平均示于下述表1及2中。表1是化合物19的按浓度的荧光强度结果，表2是化合物20的按浓度的荧光强度结果。
确认到本发明的[化学式1]的化合物20与化合物19相比，荧光强度得到显著提升。如图2所示，随着浓度的增加，荧光强度的差异更明显，在7M浓度确认到增加了约40％左右。通过上述的结果，证明了本发明的[化学式1]的化合物即使在用于生物分子标记的改性下也维持显著提高的荧光性。
[表1]
浓度(nM) 平均荧光强度(at 665nm) 标准
6280 308345.7 6239.5
3140 240494.7 5760.9
1570 160778.3 2481.3
785 91308.7 1273.9
393 48611.7 1555.6
196 24679.7 11.5
98 12523.0 205.9
49 6483.7 129.6
25 3336.7 49.6
12 1673.0 34.8
6 810.7 48.2
3 412.0 11.2
[表2]
浓度(nM) 平均荧光强度(at 665nm) 标准
6280 418428.3 10381.1
3140 321865.0 7104.5
1570 209850.3 6726.9
785 118049.0 4875.9
393 59756.7 2979.6
196 29396.3 1713.1
98 13859.7 1097.1
49 6693.3 443.8
25 2994.3 278.8
12 1454.7 137.8
6 721.3 78.8
3 313.3 64.1
试验例3.
将本发明的[化学式1]的化合物在体外标记于生物分子而对荧光特性进行评价。
将从老鼠的免疫细胞中提取的单克隆性抗体免疫球蛋白G以2mg/mL浓度溶解于酸度9.0的0.1M磷酸盐-碳酸盐缓冲溶液中，之后向各管分配100μL，从而准备6个试样。将化合物19和化合物20分别溶解于二甲基甲酰胺中，以10mg/mL的浓度准备，将化合物19和化合物20分别以2.0、2.5及3.0L添加在上述6个试样管中，在常温搅拌60分钟，进行标记。
利用葡萄聚糖柱(dextran column)对完成标记反应的各抗体溶液进行提纯，调节成相同的抗体浓度后，测定各标记抗体溶液的荧光光谱，对按荧光染料添加量的荧光强度变化进行比较，将其示于图3中。
参照图3，可确认到将化合物20标记于免疫球蛋白G时与化合物19相比，荧光强度平均增加了32％左右。
即，本发明的[化学式1]的化合物即使标记于生物分子，与现有结构相比，也可显著提高荧光强度。
试验例4.化合物的光学特性评价
(1)荧光强度比较-650波长染料
对化合物20和对照荧光染料(Alexa Fluor 647NHS ester)的荧光强度进行比较。在2种的荧光染料中加入DMF，制造原液(Stock solution)，浓度相同，均为10mg/mL。然后，利用pH 7.4 10mM磷酸盐缓冲盐水(Phosphate buffered saline)(以下称为1X PBS)稀释成19.5nM的浓度，在Excitation 650nm设定条件下，测定荧光。测定利用了PerkinElmer公司的LS 55荧光分光计(Fluorescence spectrometer)。图4是示出化合物20和对照荧光染料的荧光光谱的图，根据本分析，确认到化合物20的荧光强度相对强。
(2)荧光强度比较-552波长染料
对化合物18和对照荧光染料(Alexa Fluor 555NHS ester)的荧光强度进行比较。在2种的荧光染料中加入DMF，制造原液(Stock solution)，浓度相同，均为10mg/mL。然后，利用pH 7.4 10mM磷酸盐缓冲盐水(Phosphate buffered saline)(以下称为1X PBS)稀释成19.5nM的浓度，在Excitation 552nm设定条件下，测定荧光。测定利用了PerkinElmer公司的LS 55荧光分光计(Fluorescence spectrometer)。图5是示出化合物18和对照荧光染料的荧光光谱的图，根据分析，确认到化合物18的荧光强度相对强。
(3)650化合物的相对量子效率(Relative quantum yield)测定
基于Rhodamine 6G(TCI)，对化合物20和对照荧光染料(Alexa Fluor647NHSester)的相对量子效率进行测定。在2个荧光染料和Rhodamine 6G中加入DMF，制造10mg/mL原液(Stock solution)。然后，利用pH 7.4 1X PBS稀释成10μM的浓度，之后测定消光及荧光。从10μM浓度开始进行1/2稀释(dilution)直至1/512x浓度为止，对每个染料测定10次的消光/荧光。将测定值代入到下述式1而对相对量子效率进行分析，得到了下述表3及图6的结果。化合物20的相对量子效率比对照荧光染料更高。
[式1]
Figure BDA0001281468230000561
Q＝Quantum Yield
I＝Fluorophore
OD＝Absorbance
SubscriptR＝Rodamine 6G
[表3]
化合物20 Alexa 647NHS酯
相对量子效率(％) 11.70 7.79
(4)552化合物的相对量子效率(Relative quantum yield)测定
基于Rhodamine 6G(TCI)，测定化合物18和对照荧光染料(Alexa Fluor 555NHSester)的相对量子效率进行测定。在2个荧光染料和Rhodamine 6G中加入DMF，制造10mg/mL原液(Stock solution)。然后，利用pH 7.41X PBS稀释成10μM的浓度，之后测定消光及荧光。从10μM浓度开始进行1/2稀释(dilution)直至1/512x浓度为止，对每个染料测定10次的消光/荧光。将测定值代入到下述式1而对相对量子效率进行分析。下述的表4及图7是示出各染料的相对量子效率的图。与Rhodamine 6G相比，化合物18的相对量子效率相对更高。
[表4]
化合物18 Alexa 555NHS酯
相对量子效率(％) 13.33 5.64
试验例5：标记(labeling)在蛋白质后性能比较
(1)552波长染料的蛋白质反应物(Conjugates)间荧光强度比较
将化合物18和对照荧光染料(Alexa Fluor 555NHS ester)标记于抗体(PierceTMGt anti-Ms IgG H+L Secondary Ab，10mg/mL，Thermo)，对相应反应物的荧光强度进行比较。化合物18和对照荧光染料均溶解于DMF中而制成10mg/mL的原液(Stocksolution)来使用。在抗体0.5mg中分别加入试样1、2、3，上述试样1及2分别使用了相对于上述抗体为25mol％的比率的染料，而且为了确认采用了与对照荧光染料相同的重量比率时的结果，上述试样3使用了0.083mg的化合物18。实验条件如表5所示，结果示于图8中。
[表5]
Figure BDA0001281468230000571
将抗体最终反应浓度设定为2mg/mL，反应缓冲液是以最终pH成为8.3-8.5左右的方式将10mM磷酸盐缓冲盐水(Phosphate buffered saline)(以下称为1X PBS)与pH 9.41M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(Sodium carbonate-Bicarbonate buffer)(以下称为1M CBC)混合而制造的。在常温/暗室/搅拌环境下使1～3试样反应1小时，通过填充有Sephadex G-25树脂(GEHealthcare)的柱管进行提纯，分离反应物。树脂事先用1X PBS进行缓冲平衡(Buffer equilibrium(buffer change))而使用。在280/552nm波长，通过各反应物的消光度分析(Cary 8454UV-Vis spectrophotometer,Agilent)，优先确认染料/蛋白质比(D/Pratio)，之后测定反应物(Conjugates)的荧光(LS 55 Fluorescence spectrometer,PerkinElmer)，对荧光强度进行比较。荧光测定在10μL的各反应物混合3mL的1X PBS而稀释后，在Excitation 552nm设定下进行。如图8所示，可知化合物18的Ab conjugates荧光强度更强，并且不受染料使用量的影响。
图9是利用了FOBI(Fluorescence In Vivo Imaging System,neoscience)的荧光强度分析结果，在这里也可以确认到相同的结果。第一行是将未稀释的原反应物(Originalconjugate)试样向每个孔(well)中注入100μL后应用光源绿色通道(Light source Greenchannel)进行分析的结果，第二行是将用1X PBS经过1/2稀释(Dilution)的试样向每个孔(well)中注入100μL后应用光源绿色通道(Light source Green channel)进行分析的结果。
(2)650波长染料的按反应量的标记率
将化合物20和对照荧光染料(Alexa Fluor 647NHS ester)按重量比率标记于抗体(PierceTM Gt anti-Rb IgG H+L Secondary Ab,10mg/mL,Thermo)0.5mg，将按染料反应量的标记率(D/P ratio)的比较结果示于图10中。作为参考，化合物20的分子量为1254.7g/mole，对照荧光染料的分子量为956.1g/mole。除了将染料反应量设计成0.01,0.03,0.05,0.10,0.14mg以外与实施例5-(1)的标记方法相同地进行。对于经过标记及提纯而分离的各反应物，在280/650nm波长进行消光度分析，通过普遍公知的数学式计算标记率。化合物20和对照荧光染料的摩尔消光系数为239000/cmM(In PBS)，蛋白质摩尔消光系数为203000/cmM，校正系数(Correction factor,CF280)为0.03。将其结果示于表6中，可知化合物20和对照荧光染料的反应量越增加，标记率均持续增加。在没有应用摩尔比的情况下，当使0.10mg(换算时约25molar)以上的染料反应时，化合物20的标记率开始比对照荧光染料的标记率高。另外，如上所述，化合物20的分子量为1254.7g/mole，与对照荧光染料的分子量956.1g/mole相比大30％以上，因此虽然将化合物20和对照荧光染料以相同重量使用，但本发明的化合物20与对照荧光染料相比投入相对少的摩尔数。因此，示出以少的摩尔数投入的化合物20的标记率与对照荧光染料同等或其以上的效果，所以判断其效果为超出同等程度的水准。
[表6]
Figure BDA0001281468230000581
(3)650波长染料的按反应量的荧光强度
利用从试验例5-(2)萃取的反应物(Conjugates)，对化合物20和对照荧光染料的标记于蛋白质时按染料反应量的荧光强度进行比较，并示于图11中，将其成像结果示于图12中。在96孔板(96well black plate)的第一行注入[IgG-化合物20]反应物，在第二行将[IgG-对照荧光染料]的反应物以1/10稀释而按染料反应量顺序注入，在第四行作为空白(blank)对照加入1XPBS。在每个孔(well)中注入100μL的所有分析试料，蛋白质浓度以可无视误差的程度相同。然后，在FOBI Red channel进行成像，为了比较更准确的数值，进行多功能盘式分析仪(Multilabel plate reader)(Enspire 2300,PerkinElmer)分析。在Ex.650/Em.665nm、Number of flashes 200且合适的设定下进行测定。在染料反应量0.03、0.05、0.10mg区间观察到较强的荧光，直至染料0.10mg(10mg/mL)反应为止，化合物20反应物的荧光强度比对照荧光染料更强。最大荧光强度是在抗体0.5mg与0.1mg的化合物20反应的条件下确认的，在仅反应0.03mg的化合物20的条件下也测定到能够发出与最大值相似的程度的荧光，因此化合物20的性能与对照荧光染料相比优异，可预测用更少的量标记于生物分子(biomolecule)时也会显出更高的荧光。另外，在按染料反应量的荧光强度维持倾向方面来说，在对照荧光染料反应物的情况下，0.05mg以后强度减少，相对于此，化合物20直到0.10mg也持续增加，因此能证明其优异性。
(4)650波长染料的按标记率的荧光强度
基于试验例5-(2)及5-(3)的结果，将化合物20和对照荧光染料的按标记率的荧光强度示于图13中。先前结果中，尽管化合物20的分子量大，但以相同的重量比率与蛋白质反应时，示出了与对照荧光染料相似的水准的标记率，可知即使在反应量少的情况下，即在低标记率下，与对照荧光染料相比，也能到达更强的荧光强度。通过图13可知，标记于蛋白质的化合物20和对照荧光染料的自消光(Auto-quenching)在本发明的化合物20中更晚出现。在对照荧光染料的情况下，从6左右的比较低的标记率状态开始，消光进行。

Claims (12)

1.一种荧光化合物，由下述[化学式1]表示，
[化学式1]
Figure FDA0002447848630000011
上述[化学式1]中，
X及Y相同或不同，分别独立地选自H、-SO3 -及-SO3H中，
R1及R2相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure FDA0002447848630000015
中，
R3及R4相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、-(CH2)mCOOZ1及
Figure FDA0002447848630000013
中，
R3及R4不会同时是选自-(CH2)mCOOZ1及
Figure FDA0002447848630000014
中的一个，
Z1及Z2相同或不同，分别独立地被选自H、N-琥珀酰亚胺基、肼基、N-羟基琥珀酰亚胺基、N-羟基琥珀酰亚胺基氧基、磺基琥珀酰亚胺基氧基、4-磺基-2,3,4,5-四氟苯基、马来酰亚胺C0-10烷基胺基、乙烯基磺酰基、乙烯基磺酰基C0-6烷基胺基及氨基C0-6烷基中的取代基取代，
n为1至6中的一个整数，
m为1至7中的一个整数，
p为1至10中的一个整数，
q为0至6中的一个整数，
r为1至10中的一个整数，
p’为1至10中的一个整数，
q’为1至10中的一个整数，
r’为1至10中的一个整数；
其中，R1及R2中至少一个为
Figure FDA0002447848630000021
或
R3及R4中至少一个为
Figure FDA0002447848630000022
2.根据权利要求1所述的荧光化合物，其中，
R1及R2相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure FDA0002447848630000031
中，
R3及R4相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、-(CH2)mCOOZ1及
Figure FDA0002447848630000032
中，
R3及R4不会同时是选自-(CH2)mCOOZ1及
Figure FDA0002447848630000033
中的一个，
Z1及Z2相同或不同，分别独立地为H或N-琥珀酰亚胺基，
n为1至6中的一个整数，
m为1至6中的一个整数，
p为3至7中的一个整数，
q为0至4中的一个整数，
r为1至6中的一个整数，
p’为3至7中的一个整数，
q’为1至6中的一个整数，
r’为1至7中的一个整数。
3.根据权利要求1所述的荧光化合物，其特征在于，R1及R2中至少一个为
Figure FDA0002447848630000041
R3及R4中至少一个为-(CH2)mCOOZ1及
Figure FDA0002447848630000042
4.根据权利要求1所述的荧光化合物，其特征在于，
由上述[化学式1]表示的化合物选自下述化合物中，
化合物1：
Figure FDA0002447848630000043
化合物2：
Figure FDA0002447848630000044
化合物3：
Figure FDA0002447848630000051
化合物4：
Figure FDA0002447848630000052
化合物5：
Figure FDA0002447848630000053
化合物6：
Figure FDA0002447848630000054
化合物7：
Figure FDA0002447848630000061
化合物8：
Figure FDA0002447848630000062
化合物11：
Figure FDA0002447848630000063
化合物12：
Figure FDA0002447848630000064
化合物13：
Figure FDA0002447848630000071
化合物16：
Figure FDA0002447848630000072
化合物18：
Figure FDA0002447848630000073
化合物20：
Figure FDA0002447848630000081
5.一种荧光化合物的制造方法，其利用下述[化学式2]的化合物制造由下述[化学式1]表示的化合物，
[化学式2]
Figure FDA0002447848630000082
[化学式1]
Figure FDA0002447848630000083
上述[化学式1]或[化学式2]中，
X及Y相同或不同，分别独立地选自H、-SO3 -及-SO3H中，
R1及R2相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure FDA0002447848630000084
中，
R3及R4相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、-(CH2)mCOOZ1及
Figure FDA0002447848630000091
中，
R3及R4不会同时是选自-(CH2)mCOOZ1及
Figure FDA0002447848630000092
中的一个，
R5及R6相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure FDA0002447848630000093
中，
R7及R8相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、-(CH2)mCOOH及
Figure FDA0002447848630000094
中，
n为1至6中的一个整数，
m为1至7中的一个整数，
p为1至10中的一个整数，
q为0至6中的一个整数，
r为1至10中的一个整数，
p’为1至10中的一个整数，
q’为1至10中的一个整数，
r’为1至10中的一个整数；
Z1及Z2相同或不同，分别独立地被选自H、N-琥珀酰亚胺基、肼基、N-羟基琥珀酰亚胺基、N-羟基琥珀酰亚胺基氧基、磺基琥珀酰亚胺基氧基、4-磺基-2,3,4,5-四氟苯基、马来酰亚胺C0-10烷基胺基、乙烯基磺酰基、乙烯基磺酰基C0-6烷基胺基及氨基C0-6烷基中的取代基取代，
其中，R1及R2中至少一个为
Figure FDA0002447848630000101
或
R3及R4中至少一个为
Figure FDA0002447848630000102
6.根据权利要求5所述的荧光化合物的制造方法，其特征在于，
上述[化学式2]的化合物是使下述[化学式3]的化合物与氰尿酰氯反应而制造的，
[化学式3]
Figure FDA0002447848630000103
上述[化学式3]中，
X及Y相同或不同，分别独立地选自H、-SO3 -及-SO3H中，
R9及R10相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure FDA0002447848630000111
中，
R11及R12相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基及
Figure FDA0002447848630000112
中。
7.根据权利要求6所述的荧光化合物的制造方法，其特征在于，
上述[化学式3]的化合物分别是使下述[化学式4]的化合物被胺C0-6烷基胺基取代而制造的，
[化学式4]
Figure FDA0002447848630000113
上述[化学式4]中，
X及Y相同或不同，分别独立地选自H、-SO3 -及-SO3H中，
R13及R14相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure FDA0002447848630000114
中，
R15及R16相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基及
Figure FDA0002447848630000121
中。
8.根据权利要求7所述的荧光化合物的制造方法，其特征在于，
上述[化学式4]的化合物是使下述[化学式5]的化合物在包含下述[化学式6]的化合物和乙酸酐的溶剂中回流而制造的，
[化学式5]
Figure FDA0002447848630000122
[化学式6]
Figure FDA0002447848630000123
上述[化学式5]或[化学式6]中，
X及Y相同或不同，分别独立地选自H、-SO3 -及-SO3H中，
R13及R14相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基、C8-18烷基、-(CH2)mSO3 -、-(CH2)mSO3H及
Figure FDA0002447848630000124
中，
R15及R16相同或不同，分别独立地选自C1-7烷基及
Figure FDA0002447848630000131
中。
9.一种显影剂组合物，其包含权利要求1至权利要求4中任一项所述的荧光化合物作为有效成分。
10.权利要求1至权利要求4中任一项所述的荧光化合物在制备用于与标记对象物质结合的显影剂中的用途，其特征在于，
所述标记对象物质为选自纤维、生物分子、纳米粒子及有机化合物中的1种以上，
所述标记对象物质包含选自胺基、羟基及硫醇基中的至少1个官能团，
在所述官能团结合有所述权利要求1的荧光化合物。
11.根据权利要求10所述的用途，其中，
所述生物分子选自蛋白质、肽、碳水化合物、脂肪、抗体、蛋白多糖、糖蛋白及siRNA中。
12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述碳水化合物为糖。
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