CN107421796A - 用于生物样品的组织加工的溶液 - Google Patents
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Abstract
本申请公开的制剂、系统和方法允许自动制备用于检查的试样(例如，生物试样)。所述公开的制剂、系统和方法提供了使用最少数量的流体进行快速、有效和高度均匀的试样加工。所述方法至少包括将试样固定至基底如显微镜载玻片的固定阶段、用于染色试样的染色阶段和用于漂洗试样的漂洗阶段。所述固定、染色和漂洗阶段中的一个或者多个包括一个或者多个搅动阶段，用于在试样中均匀地和一致地分配试剂。所述系统可作为独立的设备或者作为较大系统中的一个构件使用，用于制备和检查试样。
Description
本申请是中国申请号为201280039988.1、发明名称为“用于生物样品的组织加工的溶液”且申请日为2012年6月18日的专利申请(PCT申请号为PCT/US2012/042961)的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年6月17日提交的美国临时申请61/498,159、2011年7月6日提交的美国临时申请61/505,011和2011年7月21日提交的美国临时申请61/510,180的权益；将前面提交的每个申请的全部内容并入本申请作为参考。
技术领域
本公开涉及用于制备生物试样的制剂，并且更具体地，涉及固定、染色和漂洗制剂。
背景技术
多年来，实验室技术已经使用染料和染色剂如在Romanowsky染色中使用的那些来制备生物试样，以改善在检查期间试样的对比。这种检查通常使用显微镜(一种捕捉试样图像的自动设备)，或者在其它情况中，使用肉眼目视检查。制备用于检查的试样的数种不同的系统和方法是已知的。例如，美国专利6,096,271；7,318,913；5,419,279；和5,948,360，以及公布的美国专利申请2008/0102006和2006/0073074涉及在试样加工期间用于染色基底的机器和方法。这些公开提供了染色和制备用于检查的试样的许多细节。
发明内容
本公开涉及制备用于检查的试样的制剂、系统和方法。所述试样可包括，例如，来自生物样品的包含红细胞、白细胞和血小板的血液样品，例如，施用至基底如显微镜载玻片或者盖玻片的血液样品。可使用不同实施方案制备来自生物样品的试样，所述生物样品包括骨髓、尿、阴道组织、上皮组织、肿瘤、精液、唾液和其它体液。本公开的另外的方面包括使用本公开的制剂固定、染色、漂洗和搅动试样的系统和方法。通常，本申请公开的制剂、系统和方法使用最少的流体量提供快速、有效和高度均匀的试样制备和加工。所述方法包括一个或者多个固定、染色和漂洗阶段，在一个或者多个固定、染色和漂洗阶段后，例如，在每个固定、染色和漂洗阶段后，包括一个或者多个搅动阶段。所述系统可作为独立的设备或者作为较大系统中的构件用于制备和检查试样。
在第一方面，本公开的特征在于细胞学固定溶液，其包含天青B；表面活性剂；甲醇；和乙二醇。
例如，细胞学固定溶液可包含约0.5g/L至约5.0g/L天青B；约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20；约5mL/L至约50mL/L乙二醇、丙二醇或者聚丙二醇；约0.1g/L至约10g/L HEPES钠盐；和甲醇。
作为另一实例，细胞学固定溶液可包含约0.8g/L至约1.2g/L天青B；约0.8mL/L至约1.2mL/L聚山梨酯20；约9mL/L至约11mL/L乙二醇；约0.25g/L至约0.38g/L HEPES钠盐；和甲醇。
例如，细胞学固定溶液可包含约1g/L天青B；约1mL/L聚山梨酯20；约10mL/L乙二醇；约0.32g/L HEPES钠盐；和甲醇。
作为另一实例，细胞学固定溶液可包含约1g/L天青B；约0.5mL/L聚山梨酯20；约10mL/L丙二醇；约0.32g/L HEPES钠盐；和甲醇。
作为又一实例，细胞学固定溶液可包含约1g/L天青B；约1.5mL/L聚山梨酯20；约10mL/L聚丙二醇；约0.32g/L HEPES钠盐；和甲醇。
在第二方面，本公开的特征在于第一细胞学染色溶液，其包含曙红Y；缓冲剂；表面活性剂；氯化钠；乙二醇；和水。
例如，第一细胞学染色溶液可包含约0.5g/L至约5.0g/L曙红Y；约5mM至约250mMbis-tris或者磷酸盐缓冲剂；约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20；约1g/L至约20g/L氯化钠；约5mL/L至约50mL/L乙二醇；约0.2ppm至约50ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
作为另一实例，第一细胞学染色溶液可包含约0.6g/L至约0.9g/L曙红Y；约45mM至约55mM bis-tris缓冲剂；约0.8mL/L至约1.2mL/L聚山梨酯20；约3g/L至约5g/L氯化钠；约9mL/L至约11mL/L乙二醇；约10ppm至约20ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
例如，第一细胞学染色溶液可包含约0.75g/L曙红Y；约50mM bis-tris缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20；约4g/L氯化钠；约10mL/L乙二醇；约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
作为另一实例，第一细胞学染色溶液可包含约0.75g/L曙红Y；约50mM bis-tris缓冲剂；约0.5mL/L聚山梨酯20；约6g/L氯化钠；约20mL/L乙二醇；约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
作为又一实例，第一细胞学染色溶液可包含约0.75g/L曙红Y；约50mM磷酸盐缓冲剂；约2.0mL/L聚山梨酯20；约4g/L氯化钠；约50mL/L乙二醇；约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
在第三方面，本公开的特征在于第二细胞学染色溶液，其包含天青B；亚甲蓝；缓冲剂；表面活性剂、氯化钠和水。
例如，第二细胞学染色溶液可包含约0.25至约2.5g/L天青B；约0.25g/L至约2.5g/L亚甲蓝；约5mM至约250mM bis-tris或者HEPES缓冲剂；约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20、约1g/L至约20g/L氯化钠和约0.2ppm至约50ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
作为另一实例，第二细胞学染色溶液可包含约0.4至约0.6g/L天青B；约0.4g/L至约0.5g/L亚甲蓝；约45mM至约55mM bis-tris缓冲剂；约0.8mL/L至约1.2mL/L聚山梨酯20、约1.8g/L至约2.2g/L氯化钠和约10ppm至约20ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
例如，第二细胞学染色溶液可包含约0.5g/L天青B；约0.45g/L亚甲蓝；约50mMbis-tris缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20、约2g/L氯化钠和约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
作为另一实例，第二细胞学染色溶液可包含约0.5g/L天青B；约0.45g/L亚甲蓝；约50mM HEPES缓冲剂；约0.5mL/L聚山梨酯20、约2g/L氯化钠和约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
作为又一实例，第二细胞学染色溶液可包含约0.5g/L天青B；约0.45g/L亚甲蓝；约50mM HEPES缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20、约1g/L氯化钠和约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
在第四方面，本公开的特征在于用于自动试样制备装置的漂洗溶液，其包含聚乙二醇；缓冲剂；表面活性剂；甲醇；和水。
例如，漂洗溶液可包含约0.2g/L至约10g/L聚乙二醇；约1mM至约250mM HEPES、MES，或者bis-tris缓冲剂；约0.1mL/L至约2.40mL/L聚山梨酯20；约0.04ppm至约50ppmProClin约9mL/L至约200mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
例如，漂洗溶液可包含约1g/L至约10g/L聚乙二醇；约5mM至约250mM HEPES、MES，或者bis-tris缓冲剂；约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20；约0.2ppm至约50ppm ProClin约10mL/L至约200mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
作为另一实例，漂洗溶液可包含约4.5g/L至约5.5g/L聚乙二醇；约45mM至约55mMHEPES缓冲剂；约0.8mL/L至约1.2mL/L聚山梨酯20；约10ppm至约20ppm ProClin约45mL/L至约55mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
例如，漂洗溶液包含约5g/L聚乙二醇；约50mM HEPES缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20；约15ppm ProClin约50mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
作为另一实例，漂洗溶液包含约10g/L聚乙二醇；约50mM MES缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20；约15ppm ProClin约50mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
作为又一实例，漂洗溶液包含约10g/L聚乙二醇；约50mM bis-tris缓冲剂；约0.5mL/L聚山梨酯20；约15ppm ProClin约50mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
例如，漂洗溶液可包含约0.2g/L至约2g/L聚乙二醇；约1mM至约50mM HEPES缓冲剂；约0.16mL/L至约0.24mL/L聚山梨酯20；约0.04ppm至约10ppm ProClin约9mL/L至约11mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
作为另一实例，漂洗溶液可包含约0.9g/L至约1.1g/L聚乙二醇；约9mM至约11mMHEPES缓冲剂；约0.16mL/L至约0.24mL/L聚山梨酯20；约2ppm至约10ppm ProClin约9mL/L至约11mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
在又一实例中，漂洗溶液包含约1g/L聚乙二醇；约10mM HEPES缓冲剂；约0.2mL/L聚山梨酯20；约3ppm ProClin约10mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
在第五方面，本公开的特征在于试样制备试剂盒，其包含细胞学固定溶液；第一细胞学染色溶液；第二细胞学染色溶液；和漂洗溶液。在一些实施方案中，所述试样制备试剂盒包含单独包装的细胞学固定溶液；单独包装的第一细胞学染色溶液；单独包装的第二细胞学染色溶液；和单独包装的漂洗溶液。
在第六方面，本公开的特征在于在用于检查的基底上制备试样的方法，其包括(a)相对于表面定位基底，使得试样面对表面，使得定位基底以在表面和至少一部分基底之间形成至少约100微米的间隔；(b)实施固定阶段，其包括(i)以足以使试样和表面接触的量，将固定溶液分配至基底和表面之间的间隔中；(ii)实施至少第一搅动阶段，其中所述第一搅动阶段包括改变基底和表面之间的距离，同时在第一搅动阶段的持续时间内使得固定溶液接触试样；和(iii)从间隔和试样除去固定溶液；(c)实施第一染色阶段；(d)实施第二染色阶段；和(e)实施第一漂洗阶段。
在第七方面，本公开的特征在于用于成像试样的系统，其包含自动试样分析机器和细胞学固定溶液；第一细胞学染色溶液；第二细胞学染色溶液；和/或漂洗溶液。在一些实施方案中，所述用于成像试样的系统包含自动试样分析机器和试样，所述试样用以下物质制备：细胞学固定溶液；第一细胞学染色溶液；第二细胞学染色溶液；和/或漂洗溶液。
本申请所述的细胞学固定溶液、第一细胞学染色溶液、第二细胞学染色溶液、漂洗溶液、方法、试剂盒和系统的实施方案可包含以下特征中的任何一种或者多种。
在一些实施方案中，所述细胞学固定溶液可包含约0.5至约5g/L天青B(例如，约1g/L天青B)。例如，细胞学固定溶液在水中的1:1000稀释液在约640至约650nm的峰值波长具有约0.1至约1的UV吸光度。
在一些实施方案中，所述细胞学固定溶液不含或者基本不含一种(或者多种)红色染色剂(例如，本领域已知的一种或者多种常规红色染色剂，例如，曙红Y和荧光素衍生物)。
细胞学固定溶液可包含以体积计或者以重量计约0.05％至约0.5％的表面活性剂(例如，以体积计或者以重量计约0.05％至约0.3％的表面活性剂、以体积计或者以重量计约0.05％至约0.1％的表面活性剂)。表面活性剂可选自非离子的、阳离子的、阴离子的和两性离子的表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂为非离子的，并可包含例如，聚山梨酯20。例如，细胞学固定溶液可包含约0.5mL/L至约2mL/L(例如，约0.5mL/L至约1.5mL/L、约1ml/L)的聚山梨酯20。
在一些实施方案中，所述细胞学固定溶液还可包含缓冲剂，例如bis-tris、磷酸盐、HEPES、MES和/或Tris缓冲剂。例如，细胞学固定溶液在水中的1:10稀释液可具有约6至约8(例如，约6.7至约7.3)的pH并包含约0.5mM至约10mM HEPES。
细胞学固定溶液可包含以体积计约0.5至约5％(例如，约1％)的乙二醇。
在一些实施方案中，所述细胞学固定溶液可包含约1g/L天青B；约1mL/L聚山梨酯20；约10mL/L乙二醇；约0.32g/L HEPES钠盐；和甲醇。
在一些实施方案中，第一细胞学染色溶液可包含抗微生物剂(例如，约0.2至约50ppm抗微生物剂)，其可包括例如，苯扎氯铵、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、(例如，ProClin)、叠氮化物、硫柳汞类、抗生素和它们的任何组合。例如，抗微生物剂可包含5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。在一些实施方案中，所述抗微生物剂为ProClin例如，第一细胞学染色溶液可包含约15ppm ProClin
第一细胞学染色溶液可包含约0.5至约1g/L(例如，约0.75g/L)曙红Y。例如，所述溶液在水中的1:500稀释液可在约510至约530nm的峰值波长具有约0.1至约1的UV吸光度。
在一些实施方案中，第一细胞学染色溶液不含或者基本不含一种(或者多种)其它红色染色剂(例如，本领域已知的一种或者多种其它常规红色染色剂，例如，其它荧光素衍生物)。
在一些实施方案中，第一细胞学染色溶液不含或者基本不含一种(或者多种)蓝色染色剂(例如，本领域已知的一种或者多种常规蓝色染色剂，例如，天青B、亚甲蓝和/或其它噻嗪染料)。
在一些实施方案中，第一细胞学染色溶液不含或者基本不含一种(或者多种)其它红色染色剂(例如，本领域已知的一种或者多种其它常规红色染色剂，例如，其它荧光素衍生物)，并且第一细胞学染色溶液不含或者基本不含一种(或者多种)蓝色染色剂(例如，本领域已知的一种或者多种常规蓝色染色剂，例如，天青B、亚甲蓝和/或其它噻嗪染料)。
第一细胞学染色溶液可包含以体积计约0.5至约5％(例如，约1％)乙二醇。
在一些实施方案中，第一细胞学染色溶液可具有约5至约8的pH和约5至约250mM的缓冲剂浓度。
缓冲剂可包含bis-tris、磷酸盐、HEPES、MES、Tris和它们的任何组合。例如，第一细胞学染色溶液可具有约5.8至约6.2的pH和约5mM至约250mM的bis-tris缓冲剂浓度。在一些实施方案中，第一细胞学染色溶液还可包含乙酸(例如，约2至约3mL/L乙酸)。
在一些实施方案中，第一细胞学染色溶液可包含以体积计或者以重量计约0.05至约0.5％(例如，约0.05％至约0.3％，约0.05％至约0.1％)的表面活性剂。表面活性剂可选自非离子的、阳离子的、阴离子的或者两性离子的表面活性剂。例如，表面活性剂可为非离子的，例如聚山梨酯20。在一些实施方案中，第一细胞学染色溶液可包含约0.5mL/L至约2mL/L(例如，约0.5mL/L至约1.5mL/L、约1ml/L)聚山梨酯20。
在一些实施方案中，第一细胞学染色溶液可包含约1至约20g/L氯化钠。
在一些实施方案中，第一细胞学染色溶液可包含约0.75g/L曙红Y；约50mM bis-tris缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20；约4g/L氯化钠；约10mL/L乙二醇；约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
在一些实施方案中，第二细胞学染色溶液可包含抗微生物剂(例如，约0.2至约50ppm抗微生物剂)，其可包括例如，苯扎氯铵、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、(例如，ProClin)、叠氮化物、硫柳汞类、抗生素和它们的任何组合。例如，抗微生物剂可包含5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。在一些实施方案中，第二细胞学染色溶液可包含ProClin(例如，约15ppm ProClin)。
在一些实施方案中，第二细胞学染色溶液可包含约0.25至约1g/L(例如，约0.5g/L)天青B。第二细胞学染色溶液可包含约0.25至约1g/L(例如，约0.45g/L)亚甲蓝。例如，第二细胞学染色溶液在水中的1:1000稀释液可在约640至约660nm的峰值波长具有约0.1至约1的UV吸光度。
在一些实施方案中，第二细胞学染色溶液不含或者基本不含一种(或者多种)其它蓝色染色剂(例如，本领域已知的一种或者多种其它常规蓝色染色剂，例如，天青B、亚甲蓝和/或其它噻嗪染料)。
在一些实施方案中，第二细胞学染色溶液不含或者基本不含一种(或者多种)红色染色剂(例如，本领域已知的一种或者多种常规红色染色剂，例如，荧光素衍生物)。
在一些实施方案中，第二细胞学染色溶液不含或者基本不含一种(或者多种)其它蓝色染色剂(例如，本领域已知的一种或者多种其它常规蓝色染色剂，例如，其它噻嗪染料)，并且第二细胞学染色溶液不含或者基本不含一种(或者多种)红色染色剂(例如，本领域已知的一种或者多种常规红色染色剂，例如，荧光素衍生物)。
在一些实施方案中，第二染色溶液可具有约5至约8的pH和约5mM至约250mM的缓冲剂浓度(例如，约6.8至约7.2的pH和约25mM至约100mM的bis-tris缓冲剂浓度)。缓冲剂可包括bis-tris缓冲剂、磷酸盐、HEPES、MES、Tris和它们的任何组合。在一些实施方案中，第二细胞学染色溶液还可包含乙酸。
在一些实施方案中，第二细胞学染色溶液可包含以体积计或者以重量计约0.05至约0.5％(例如，约0.05％至约0.3％，约0.05％至约0.1％)的表面活性剂，其可包含非离子的、阳离子的、阴离子的和两性离子的表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂为非离子的并可包括聚山梨酯20，并且第二细胞学染色溶液可包含约0.5mL/L至约2mL/L(例如，约0.5mL/L至约1.5mL/L、约1ml/L)聚山梨酯20。
在一些实施方案中，第二细胞学染色溶液可包含约1至约20g/L氯化钠。
在一些实施方案中，第二细胞学染色溶液可包含约0.5g/L天青B；约0.45g/L亚甲蓝；约50mM bis-tris缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20、约2g/L氯化钠和约15ppm ProClin乙酸；和水。溶液的pH可为约6.8至约7.2。
在一些实施方案中，所述漂洗溶液可包含抗微生物剂(例如，约0.2至约50ppm抗微生物剂或者约0.04至约10ppm抗微生物剂)，其可包括例如，苯扎氯铵、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、(例如，ProClin)、叠氮化物、硫柳汞类、抗生素和它们的任何组合。在一些实施方案中，所述抗微生物剂可包括5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。例如，漂洗溶液可包括ProClin(例如，约15ppm ProClin至约3ppm ProClin)。
漂洗溶液可包含约1至约10g/L(例如，约5g/L)聚乙二醇。
漂洗溶液可包含约0.2至约2g/L(例如，约1g/L)聚乙二醇。
漂洗溶液可具有5至8的pH和约5mM至约250mM的缓冲剂浓度(例如，约5至约8的pH和约50mM的HEPES缓冲剂浓度)。缓冲剂可包括bis-tris缓冲剂、磷酸盐、HEPES、MES、Tris和它们的任何组合。
漂洗溶液可具有5至8的pH和约1mM至约50mM的缓冲剂浓度(例如，约5至约8的pH和约10mM的HEPES缓冲剂浓度)。缓冲剂可包括bis-tris缓冲剂、磷酸盐、HEPES、MES、Tris和它们的任何组合。
在一些实施方案中，所述漂洗溶液包含以体积计或者以重量计约0.05至约0.5％(例如，约0.05％至约0.3％，约0.05％至约0.1％)表面活性剂。表面活性剂可选自非离子的、阳离子的、阴离子的和两性离子的表面活性剂。例如，表面活性剂可为非离子的并可包括聚山梨酯20(例如，约0.5mL/L至约2mL/L，约0.5mL/L至约1.5mL/L的聚山梨酯20)。
在一些实施方案中，所述漂洗溶液包含以体积计或者以重量计约0.01至约0.1％(例如，约0.01％至约0.06％，约0.01％至约0.02％)表面活性剂。表面活性剂可选自非离子的、阳离子的、阴离子的和两性离子的表面活性剂。例如，表面活性剂可为非离子的并可包括聚山梨酯20(例如，约0.1mL/L至约0.4mL/L，约0.1mL/L至约0.3mL/L聚山梨酯20)。
在一些实施方案中，所述漂洗溶液包含约45至约55mL/L(例如，约50mL/L)甲醇。
在一些实施方案中，所述漂洗溶液包含约9至约11mL/L(例如，约10mL/L)甲醇。
在一些实施方案中，所述漂洗溶液包含约5g/L聚乙二醇；约50mM HEPES缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20；约15ppm ProClin约50mL/L甲醇；和水。漂洗溶液的pH可为约6.6至约7.0。
在一些实施方案中，所述漂洗溶液包含约1g/L聚乙二醇；约10mM HEPES缓冲剂；约0.2mL/L聚山梨酯20；约3ppm ProClin约10mL/L甲醇；和水。漂洗溶液的pH可为约6.6至约7.0。
在一些实施方案中，所述细胞学固定溶液不含染料专利蓝VF(例如，不含或者含量少于在WO 2007/117798中披露的制剂中存在的专利蓝VF的量)。
在一些实施方案中，第一细胞学染色溶液不含染料专利蓝VF(例如，不含或者含量少于在WO 2007/117798中披露的制剂中存在的专利蓝VF的量)。
在一些实施方案中，第二细胞学染色溶液不含染料专利蓝VF(例如，不含或者含量少于在WO 2007/117798中披露的制剂中存在的专利蓝VF的量)。
在一些实施方案中，所述漂洗溶液不含染料专利蓝VF(例如，不含或者含量少于在WO 2007/117798中披露的制剂中存在的专利蓝VF的量)。
在一些实施方案中，所述细胞学固定溶液不含蛋白水解酶(例如，不含或者含量少于在WO 2007/117798中披露的制剂中存在的蛋白水解酶的量)。
在一些实施方案中，第一细胞学染色溶液不含蛋白水解酶(例如，不含或者含量少于在WO 2007/117798中披露的制剂中存在的蛋白水解酶的量)。
在一些实施方案中，第二细胞学染色溶液不含蛋白水解酶(例如，不含或者含量少于在WO 2007/117798中披露的制剂中存在的蛋白水解酶的量)。
在一些实施方案中，所述漂洗溶液不含蛋白水解酶(例如，不含或者含量少于在WO2007/117798中披露的制剂中存在的蛋白水解酶的量)。
在一些实施方案中，实施第一染色阶段包括(i)以足以使试样和表面接触的量将第一细胞学染色溶液分配至基底和表面之间的间隔中；(ii)实施至少第二搅动阶段，其中所述第二搅动阶段包括改变基底和表面之间的距离，同时在第二搅动阶段的持续时间内使得第一染色溶液接触试样；和(iii)从间隔和试样除去第一染色溶液。
在一些实施方案中，实施第二染色阶段包括(i)以足以使试样和表面接触的量将第二细胞学染色溶液分配至基底和表面之间的间隔中；(ii)实施至少第三搅动阶段，其中所述第三搅动阶段包括改变基底和表面之间的距离，同时在第三搅动阶段的持续时间内使得第二染色溶液接触试样；和(iii)从间隔和试样除去第二染色溶液。
在一些实施方案中，实施第一漂洗阶段包括(i)以足以使试样和表面接触的量将漂洗溶液分配至基底和表面之间的间隔中；(ii)实施至少第四搅动阶段，其中所述第四搅动阶段包括改变基底和表面之间的距离，同时在第四搅动阶段的持续时间内使得漂洗溶液接触试样；和(iii)从间隔和试样除去漂洗溶液。
在一些实施方案中，所述自动试样分析机器具有基底臂，其包括基底夹持器；第一致动器，其与基底臂连接并设置成移动在打开位置和试样加工位置之间的基底臂；第二致动器，其安排和设置成搅动由基底臂上的基底夹持器夹持的基底；平台，其在基底臂处于试样加工位置时具有位置与基底相对的顶表面；和两个或者更多个偏置，其设置在平台的顶表面上，使得当在基底加工位置使得基底接触所有偏置时，平台的基底和顶表面基本平行并形成至少约50微米的间隔。
适当时，自动试样检查系统的实施方案可包含本申请所披露特征中的任何一个或者多个，包括本申请所披露的试样制备装置的特征中的任何一个或者多个。
在本申请所述的方法、试剂盒和系统的实施方案中，(A)、(B)、(C)和(D)中的一个、两个、三个，或者四个(例如，四个)可适用。
(A)细胞学固定溶液包含天青B；表面活性剂；甲醇；和乙二醇。
例如，细胞学固定溶液可包含约0.5g/L至约5.0g/L天青B；约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20；约5mL/L至约50mL/L乙二醇、丙二醇，或者聚丙二醇；约0.1g/L至约10g/LHEPES钠盐；和甲醇。
作为另一实例，细胞学固定溶液可包含约0.8g/L至约1.2g/L天青B；约0.8mL/L至约1.2mL/L聚山梨酯20；约9mL/L至约11mL/L乙二醇；约0.25g/L至约0.38g/L HEPES钠盐；和甲醇。
例如，细胞学固定溶液可包含约1g/L天青B；约1mL/L聚山梨酯20；约10mL/L乙二醇；约0.32g/L HEPES钠盐；和甲醇。
作为另一实例，细胞学固定溶液可包含约1g/L天青B；约0.5mL/L聚山梨酯20；约10mL/L丙二醇；约0.32g/L HEPES钠盐；和甲醇。
作为又一实例，细胞学固定溶液可包含约1g/L天青B；约1.5mL/L聚山梨酯20；约10mL/L聚丙二醇；约0.32g/L HEPES钠盐；和甲醇。
实施方案可包含上面和/或在具体实施方式中和/或在权利要求中所述的特征中的任何一个或者多个。
(B)第一细胞学染色溶液包含曙红Y；缓冲剂；表面活性剂；氯化钠；乙二醇；和水。
例如，第一细胞学染色溶液可包含约0.5g/L至约5.0g/L曙红Y；约5mM至约250mMbis-tris或者磷酸盐缓冲剂；约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20；约1g/L至约20g/L氯化钠；约5mL/L至约50mL/L乙二醇；约0.2ppm至约50ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
作为另一实例，第一细胞学染色溶液可包含约0.6g/L至约0.9g/L曙红Y；约45mM至约55mM bis-tris缓冲剂；约0.8mL/L至约1.2mL/L聚山梨酯20；约3g/L至约5g/L氯化钠；约9mL/L至约11mL/L乙二醇；约10ppm至约20ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
例如，第一细胞学染色溶液可包含约0.75g/L曙红Y；约50mM bis-tris缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20；约4g/L氯化钠；约10mL/L乙二醇；约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
作为另一实例，第一细胞学染色溶液可包含约0.75g/L曙红Y；约50mM bis-tris缓冲剂；约0.5mL/L聚山梨酯20；约6g/L氯化钠；约20mL/L乙二醇；约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
作为又一实例，第一细胞学染色溶液可包含约0.75g/L曙红Y；约50mM磷酸盐缓冲剂；约2.0mL/L聚山梨酯20；约4g/L氯化钠；约50mL/L乙二醇；约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
实施方案可包含上面和/或在具体实施方式中和/或在权利要求中所述的特征中的任何一个或者多个。
(C)第二细胞学染色溶液包含天青B；亚甲蓝；缓冲剂；表面活性剂、氯化钠和水。
例如，第二细胞学染色溶液可包含约0.25至约2.5g/L天青B；约0.25g/L至约2.5g/L亚甲蓝；约5mM至约250mM bis-tris或者HEPES缓冲剂；约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20、约1g/L至约20g/L氯化钠和约0.2ppm至约50ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
作为另一实例，第二细胞学染色溶液可包含约0.4至约0.6g/L天青B；约0.4g/L至约0.5g/L亚甲蓝；约45mM至约55mM bis-tris缓冲剂；约0.8mL/L至约1.2mL/L聚山梨酯20、约1.8g/L至约2.2g/L氯化钠和约10ppm至约20ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
例如，第二细胞学染色溶液可包含约0.5g/L天青B；约0.45g/L亚甲蓝；约50mMbis-tris缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20、约2g/L氯化钠和约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
作为另一实例，第二细胞学染色溶液可包含约0.5g/L天青B；约0.45g/L亚甲蓝；约50mM HEPES缓冲剂；约0.5mL/L聚山梨酯20、约2g/L氯化钠和约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
作为又一实例，第二细胞学染色溶液可包含约0.5g/L天青B；约0.45g/L亚甲蓝；约50mM HEPES缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20、约1g/L氯化钠和约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
溶液的pH可为约6.8至约7.2。
实施方案可包含上面和/或在具体实施方式中和/或在权利要求中所述的特征中的任何一个或者多个。
(D)用于自动试样制备装置的漂洗溶液包含聚乙二醇；缓冲剂；表面活性剂；甲醇；和水。
例如，漂洗溶液可包含约0.2g/L至约10g/L聚乙二醇；约1mM至约250mM HEPES、MES，或者bis-tris缓冲剂；约0.1mL/L至约2.40mL/L聚山梨酯20；约0.04ppm至约50ppmProClin约9mL/L至约200mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
作为另一实例，漂洗溶液可包含约1g/L至约10g/L聚乙二醇；约5mM至约250mMHEPES、MES，或者bis-tris缓冲剂；约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20；约0.2ppm至约50ppmProClin约10mL/L至约200mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
作为又一实例，漂洗溶液可包含约4.5g/L至约5.5g/L聚乙二醇；约45mM至约55mMHEPES缓冲剂；约0.8mL/L至约1.2mL/L聚山梨酯20；约10ppm至约20ppm ProClin约45mL/L至约55mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
例如，漂洗溶液包含约5g/L聚乙二醇；约50mM HEPES缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20；约15ppm ProClin约50mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
作为另一实例，漂洗溶液包含约10g/L聚乙二醇；约50mM MES缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20；约15ppm ProClin约50mL/L甲醇；和，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
作为又一实例，漂洗溶液包含约10g/L聚乙二醇；约50mM bis-tris缓冲剂；约0.5mL/L聚山梨酯20；约15ppm ProClin约50mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
例如，漂洗溶液可包含约0.2g/L至约2g/L聚乙二醇；约1mM至约50mM HEPES缓冲剂；约0.16mL/L至约0.24mL/L聚山梨酯20；约0.04ppm至约10ppm ProClin约9mL/L至约11mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
作为另一实例，漂洗溶液可包含约0.9g/L至约1.1g/L聚乙二醇；约9mM至约11mMHEPES缓冲剂；约0.16mL/L至约0.24mL/L聚山梨酯20；约2ppm至约10ppm ProClin约9mL/L至约11mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
在又一实例中，漂洗溶液包含约1g/L聚乙二醇；约10mM HEPES缓冲剂；约0.2mL/L聚山梨酯20；约3ppm ProClin约10mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
当用于本申请时，当溶液“不含”一种或者多种物质时，这意味着，所述溶液含有少于5％(例如，少于4％，少于3％，少于2％，少于1％，0％(w/w或者w/v或者v/v))的指出的一种或者多种物质，如通过HPLC、UV光谱、电泳和/或酶测定检测测定。
除非另外定义，本申请使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在实践或者测试本发明中可使用与本申请所述相似或者相等的方法和材料，但是下面描述适合的方法和材料。本申请提及的所有公开、专利申请、专利和其它文献的全部内容并入本申请作为参考。在冲突的情况中，将遵循本发明说明书(包括定义)。另外，材料、方法和实施例仅为说明性的并且不意图限制本发明。
根据以下详细描述和权利要求，本发明的其它特征和优点将显而易见。
本申请还涉及以下各项：
项1.细胞学固定溶液，其包含：
天青B；
表面活性剂；
甲醇；和
乙二醇。
项2.项1的细胞学固定溶液，其中所述溶液包含约0.5至约5g/L天青B。
项3.项1的细胞学固定溶液，其中所述溶液包含以体积计约0.05％至约0.5％的所述表面活性剂。
项4.项1的细胞学固定溶液，其中所述溶液包含以体积计约0.05％至约0.3％的所述表面活性剂。
项5.项1的细胞学固定溶液，其中所述表面活性剂选自非离子的、阳离子的、阴离子的和两性离子的表面活性剂。
项6.项7的细胞学固定溶液，其中所述非离子的表面活性剂为聚山梨酯20。
项7.项6的细胞学固定溶液，其中所述溶液包含约0.5mL/L至约2mL/L聚山梨酯20。
项8.项1的细胞学固定溶液，其还包含缓冲剂。
项9.项8的细胞学固定溶液，其中所述缓冲剂选自bis-tris、磷酸盐、HEPES、MES、Tris和它们的任何组合。
项10.项9的细胞学固定溶液，其中所述溶液在水中的1:10稀释液具有6至8的pH，并包含约0.5mM至约10mM HEPES。
项11.项9的细胞学固定溶液，其中所述溶液在水中的1:10稀释液具有6.7至7.3的pH，并包含约0.5mM至约10mM HEPES。
项12.项1的细胞学固定溶液，其中所述溶液包含以体积计约0.5至约5％乙二醇。
项13.项1的细胞学固定溶液，其中所述固定溶液在水中的1:1000稀释液在约640至约650nm的峰值波长具有约0.1至约1的UV吸光度。
项14.项1的细胞学固定溶液，其中所述表面活性剂为非离子的。
项15.细胞学固定溶液，其包含
约0.5g/L至约5.0g/L天青B；
约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20；
约5mL/L至约50mL/L乙二醇；
约0.10g/L至约10g/L HEPES钠盐；和
甲醇。
项16.细胞学染色溶液，其包含
曙红Y；
缓冲剂；
表面活性剂；
氯化钠；
乙二醇；和
水。
项17.项16的细胞学染色溶液，其还包含抗微生物剂。
项18.项17的细胞学染色溶液，其中所述溶液包含约0.2至约50ppm的所述抗微生物剂。
项19.项17的细胞学染色溶液，其中所述抗微生物剂选自苯扎氯铵、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、叠氮化物、硫柳汞类、抗生素和它们的任何组合。
项20.项17的细胞学染色溶液，其中所述抗微生物剂包括5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。
项21.项20的细胞学染色溶液，其中所述抗微生物剂为ProClin
项22.项16的细胞学染色溶液，其还包含乙酸。
项23.项16的细胞学染色溶液，其中所述溶液包含以体积计约0.5至约5％乙二醇。
项24.项16的细胞学染色溶液，其中所述溶液具有约5至约8的pH和约5至约250mM的缓冲剂浓度。
项25.项16的细胞学染色溶液，其中所述缓冲剂包括bis-tris、磷酸盐、HEPES、MES、Tris和它们的任何组合。
项26.项25的细胞学染色溶液，其中所述溶液具有5.8至6.2的pH和约5mM至约250mM的bis-tris缓冲剂浓度。
项27.项16的细胞学染色溶液，其中所述溶液包含约0.05至约0.5％的所述表面活性剂。
项28.项27的细胞学染色溶液，其中所述溶液包含以体积计约0.05％至约0.3％的所述表面活性剂。
项29.项16的细胞学染色溶液，其中所述表面活性剂选自非离子的、阳离子的、阴离子的或者两性离子的表面活性剂。
项30.项29的细胞学染色溶液，其中所述非离子的表面活性剂为聚山梨酯20。
项31.项30的细胞学染色溶液，其中所述溶液包含约0.5mL/L至约2mL/L的聚山梨酯20。
项32.项16的细胞学染色溶液，其中所述溶液包含约1至约20g/L氯化钠。
项33.项16的细胞学染色溶液，其中所述溶液在水中的1:500稀释液在约510至约530nm的峰值波长具有约0.1至约1的UV吸光度。
项34.项16的细胞学染色溶液，其中所述表面活性剂为非离子的。
项35.细胞学染色溶液，其包含
约0.5g/L至约5.0g/L曙红Y；
约5mM至约250mM bis-tris缓冲剂；
约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20；
约1g/L至约20g/L氯化钠；
约5mL/L至约50mL/L乙二醇；
约0.2ppm至约50ppm ProClin
乙酸；和
水，
其中所述溶液具有5.8至6.2的pH。
项36.细胞学染色溶液，其包含
天青B；
亚甲蓝；
缓冲剂；
表面活性剂，
氯化钠和
水。
项37.项36的细胞学染色溶液，其还包含抗微生物剂。
项38.项37的细胞学染色溶液，其中所述溶液包含约0.2至约50ppm的所述抗微生物剂。
项39.项37的细胞学染色溶液，其中所述抗微生物剂选自苯扎氯铵、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、叠氮化物、硫柳汞类、抗生素和它们的任何组合。
项40.项37的细胞学染色溶液，其中所述抗微生物剂包括5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。
项41.项40的细胞学染色溶液，其中所述抗微生物剂为ProClin
项42.项36的细胞学染色溶液，其还包含乙酸。
项43.项36的细胞学染色溶液，其中所述溶液包含约0.25至约1g/L天青B。
项44.项36的细胞学染色溶液，其中所述溶液包含约0.25至约1g/L亚甲蓝。
项45.项36的细胞学染色溶液，其中所述溶液具有5至8的pH和约5mM至约250mM的缓冲剂浓度。
项46.项36的细胞学染色溶液，其中所述缓冲剂包括bis-tris缓冲剂、磷酸盐、HEPES、MES、Tris和它们的任何组合。
项47.项46的细胞学染色溶液，其中所述溶液具有6.8至7.2的pH和约25mM至约100mM的bis-tris缓冲剂浓度。
项48.项36的细胞学染色溶液，其中所述溶液包含以体积计约0.05至约0.5％的所述表面活性剂。
项49.项48的细胞学染色溶液，其中所述溶液包含以体积计约0.05％至约0.3％的所述表面活性剂。
项50.项36的细胞学染色溶液，其中所述表面活性剂选自非离子的、阳离子的、阴离子的和两性离子的表面活性剂。
项51.项50的细胞学染色溶液，其中所述非离子的表面活性剂为聚山梨酯20。
项52.项51的细胞学染色溶液，其中所述溶液包含约0.5mL/L至约2mL/L聚山梨酯20。
项53.项36的细胞学染色溶液，其中所述溶液包含约1至约20g/L氯化钠。
项54.项36的细胞学染色溶液，其中所述溶液在水中的1:1000稀释液在约640至约660nm的峰值波长具有约0.1至约1的UV吸光度。
项55.项36的细胞学染色溶液，其中所述表面活性剂为非离子的。
项56.细胞学染色溶液，其包含
约0.25g/L至约2.5g/L天青B；
约0.25g/L至约2.5g/L亚甲蓝；
约5mM至约250mM bis-tris缓冲剂；
约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20；
约1.0g/L至约20g/L氯化钠和
约0.2ppm至约50ppm ProClin
乙酸；和
水,
其中所述溶液的pH为6.8至7.2。
项57.用于自动试样制备装置的漂洗溶液，其包含
聚乙二醇；
缓冲剂；
表面活性剂；
甲醇；和
水。
项58.项57的漂洗溶液，其还包含抗微生物剂。
项59.项58的漂洗溶液，其中所述溶液包含约0.2至约50ppm的所述抗微生物剂。
项60.项58的漂洗溶液，其中所述抗微生物剂选自苯扎氯铵、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、叠氮化物、硫柳汞类、抗生素和它们的任何组合。
项61.项58的漂洗溶液，其中所述抗微生物剂包括5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。
项62.项61的漂洗溶液，其中所述抗微生物剂为ProClin
项63.项57的漂洗溶液，其中所述溶液包含约0.2至约2g/L聚乙二醇。
项64.项57的漂洗溶液，其中所述溶液具有5至8的pH和约1mM至约50mM的缓冲剂浓度。
项65.项57的漂洗溶液，其中所述缓冲剂包括bis-tris缓冲剂、磷酸盐、HEPES、MES、Tris和它们的任何组合。
项66.项57的漂洗溶液，其中所述溶液包含以体积计约0.01至约0.1％的所述表面活性剂。
项67.项66的漂洗溶液，其中所述溶液包含以体积计约0.0501％至约0.306％的所述表面活性剂。
项68.项57的漂洗溶液，其中所述表面活性剂选自非离子的、阳离子的、阴离子的和两性离子的表面活性剂。
项69.项68的漂洗溶液，其中所述非离子的表面活性剂为聚山梨酯20。
项70.项69的漂洗溶液，其中所述溶液包含约0.1mL/L至约0.4mL/L聚山梨酯20。
项71.项57的漂洗溶液，其中所述溶液包含约9至约11mL/L甲醇。
项72.项57的漂洗溶液，其中所述表面活性剂为非离子的。
项73.用于自动试样制备装置的漂洗溶液，其包含：
约0.2g/L至约10g/L聚乙二醇；
约1mM至约250mM HEPES缓冲剂；
约0.10mL/L至约2.40mL/L聚山梨酯20；
约0.04ppm至约50ppm ProClin
约9mL/L至约200mL/L甲醇；和
水，
其中所述漂洗溶液的pH为6.6至7.0。
项74.试样制备试剂盒，其包含：
项15的细胞学固定溶液；
项35的细胞学染色溶液；
项56的细胞学染色溶液；和
项73的漂洗溶液。
项75.制备试样的方法，其包括：
用项15的细胞学固定溶液处理所述试样；
用项35的细胞学染色溶液处理所述试样；
用项56的细胞学染色溶液处理所述试样；和
用项73的漂洗溶液处理所述试样。
附图说明
图1为固定溶液的实施方案的HPLC色谱图。
图2为固定溶液的实施方案的UV-Vis吸收光谱。
图3为第一染色溶液的实施方案的HPLC色谱图。
图4为第一染色溶液的实施方案的UV-Vis吸收光谱。
图5为第二染色溶液的实施方案的HPLC色谱图。
图6为第二染色溶液的实施方案的UV-Vis吸收光谱。
图7为制备用于检查的试样的装置的实施方案的透视图，所述装置在打开位置具有样品夹持器20A和20B。
图8为图7的装置的一部分的另一透视图(基底臂和样品夹持器未示出)。
图9A为图7的装置的又一透视图，样品夹持器20A处于打开位置并且样品夹持器20B处于关闭(试样加工)位置。
图9B为图7的装置的索引机构(indexing mechanism)的透视图。
图10为图7的装置的透视图，其示出在装置和流体贮存器之间通过多个流体管道的连接。
图11为包含自动基底移动器的试样检查系统和本申请所述的试样制备装置的实施方案的透视图。
图12A为图7的装置的一部分的展开透视图，其详细示出试样夹持器20B、平台60B和模块80B。
图12B为图7的装置的球接机构的透视图。
图12C为图12B的球接机构的横截面图。
图13A为流程图，其示出将基底臂从打开位置移动至关闭(试样加工)位置的一系列步骤。
图13B为本申请所述的试样制备装置的实施方案的示意图。
图14A为流程图，其示出将基底臂从打开位置移动至试样加工位置的一系列可选步骤。
图14B为制备用于检查的试样的装置的示意图，所述装置包括两个致动器。
图15为流程图，其示出将固定剂施用至试样的一系列步骤。
图16为流程图，其示出将染色剂施用至试样的一系列步骤。
图17A为流程图，其示出从基底除去过量流体的一系列步骤。
图17B为流程图，其示出从基底除去过量流体的一系列可选步骤。
图18为流程图，其示出漂洗试样的一系列步骤。
图19为流程图，其示出搅动试样的一系列步骤。
图20为流程图，其示出干燥试样的一系列步骤。
图21为在较大试样检查系统中使用的试样制备装置的透视图。
图22为流程图，其示出加工安装在基底上的试样的一系列步骤。
图23为图，其示出在图22的流程图中作为时间的函数的消耗的流体的体积。
图24A和24B为图7的装置的透视图，其示出通过自动基底移动器将基底置于基底臂上。
图25为含有固定溶液、第一染色溶液、第二染色溶液和漂洗溶液的试剂盒的实施方案。
在各个图中相同的参考符号表示相同的元件。
具体实施方式
本申请披露了用于自动试样加工的制剂、方法和系统。本申请所述的自动试样加工方法和系统提供优于手动和其它自动加工方法的优点，包括增强的加工速度，使用最小试剂体积，同时得到高度均匀染色，其显著降低与当通过手动或者通过其它系统加工试样时施用染色剂、固定剂和其它试剂有关的差异性。固定剂、染色剂和漂洗溶液可提供与试样增强的对比，并可容易地从自动试样加工系统分配。而且，固定剂、染色剂和漂洗溶液可提供优于常规固定剂、染色剂和漂洗溶液的改善的细胞识别和细胞分类。
常规的固定、染色和漂洗溶液通常提供差的染色结果，例如生物样品的浅色染色或者非特异性染色(例如，细胞质的非特异性染色)；或者需要大体积的加工流体。本申请公开的制剂允许使用低体积加工流体得到生物样品的高对比度和选择性染色，例如，当使用自动试样加工系统时。
而且，常规自动加工方法通常具有相对高的加工通量，而同时消耗大体积的加工流体，或者具有相对低的加工通量，而消耗降低体积的流体。然而，对于许多应用，希望高通量操作和低流体消耗。通过维持高通量，可有效地加工和检查试样。通过保持低的流体消耗，加工废物量连同需要的加工试剂体积得到降低，从而保持低的操作成本。本申请公开的制剂、系统和方法允许使用低体积的加工流体(例如，少于约1mL流体/试样、少于约1.5mL流体/试样、少于约2mL流体/试样)进行试样的快速自动加工(例如，通过单一机器超过100个试样/小时)，同时得到高度均匀和可重复的结果。
用于试样制备系统的制剂
本申请提供固定溶液、一种或者多种染色溶液和漂洗溶液，其可用于自动试样制备系统。每种溶液可具有特定配方。例如，固定溶液可包含细胞学染料、表面活性剂、有机溶剂、将非特异性结合最小化的试剂和缓冲剂。第一染色水溶液可包含细胞学染料、缓冲剂、表面活性剂、盐、将非特异性结合最小化的试剂和抗微生物剂。第二染色水溶液可包含一种或者多种细胞学染料、缓冲剂、表面活性剂、盐和抗微生物剂。漂洗溶液可包含缓冲剂、表面活性剂、抗微生物剂、有机溶剂和水溶性聚合物。可将所述制剂组分针对纯度分析和/或通过HPLC纯化。制剂也可包含调节pH的酸。下面更详细地描述每种制剂。
固定溶液
可包含在固定溶液中的固定剂包括用于防止生物样品腐烂的化学品。这种固定剂可阻止在试样中发生的生物化学反应和提高试样的机械强度和稳定性。在固定溶液中可包含各种固定剂，例如，甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、甲醛、戊二醛、EDTA、表面活性剂、金属盐、金属离子、脲和氨基化合物。在一些实施方案中，所述固定溶液包含有机溶剂或者固定剂，所述固定剂可沉淀、交联，或者以其它方式保存用于成像用途的细胞内的组分(例如，蛋白质)。例如，固定剂可包含有机溶剂，例如一种或者多种醇(包括甲醇、乙醇和异丙醇)，或者其它有机溶剂如丙酮和乙醚。在一些实施方案中，所述固定溶液包含有机溶剂如甲醇。有机溶剂可具有少于约0.1％水(例如，少于约0.05％水，少于约0.01％水)的ACS等级。有机溶剂在溶液中的存在量可为：在其它组分已经添加至固定溶液后的余量。有机溶剂可用作试样的干燥剂并可替代试样中的水。
在一些实施方案中，所述固定溶液包含细胞学染料。染料可提高试样的染色并可包括例如，天青B、亚甲蓝、曙红、噻嗪染色剂和荧光素衍生物。染料可为至少约80％纯(例如，至少约85％纯、至少约90％纯、至少约95％纯，或者至少约99％纯)。天青B的代表性HPLC色谱图例如在图1中示出。在固定溶液中染料的浓度可为约0.5g/L(例如，约0.75g/L、约1g/L、约2g/L、约3g/L，或者约4g/L)至约5g/L(例如，约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L，或者约0.75g/L)。例如，固定溶液可包含约1g/L天青B。在一些实施方案中，所述固定溶液可包含约0.8g/L天青B。
固定溶液可包含表面活性剂。不希望被任何理论束缚，据信，表面活性剂降低溶剂的表面张力，并提供溶液在图13B中所示的间隔92处的样品基底上的良好铺展性。在一些实施方案中，所述表面活性剂为非离子的，并可将从溶液沉淀的可能性最小化，所述沉淀可来自于与制剂中的组分如离子电荷染料的离子相互作用。具有极少沉淀或者没有沉淀的溶液可更容易从分配喷嘴排出，并可减少分配喷嘴阻塞的可能性或者液体流随时间推移变小的可能性。在一些实施方案中，所述表面活性剂可降低固定溶液中的组分与试样的非特异性结合的可能性，其可将成像伪影(imaging artifacts)最小化。
固定溶液可包含约0.05％(例如，约0.075％、约0.1％、约0.2％、约0.3％，或者约0.4％)至约0.5％(例如，至约0.4％、至约0.3％、至约0.2％、至约0.1％，或者至约0.075％)的液体表面活性剂(以体积计)或者固体表面活性剂(以重量计)。在一些实施方案中，所述固定溶液可包含约0.5至约2mL/L表面活性剂(例如，非离子的表面活性剂)。例如，固定溶液可包含约1mL/L聚山梨酯20(例如，吐温20)。
表面活性剂可为非离子的、阳离子的、阴离子的或者两性离子的。也可使用表面活性剂混合物。表面活性剂的示例性类别包括醇醚硫酸盐(alcohol ether sulfates)、醇硫酸盐(alcohol sulfates)、烷醇酰胺(alkanolamides)、烷基磺酸盐(alkyl sulfonates)、胺氧化物(amine oxides)、两性表面活性剂、阴离子表面活性剂、甜菜碱衍生物、阳离子表面活性剂、二磺酸盐、十二烷基苯、磺酸、乙氧基化醇、乙氧基化烷基酚、乙氧基化脂肪酸、甘油酯助水溶物、月桂基硫酸盐(lauryl sulfates)、单甘油酯和二甘油酯、非离子的表面活性剂、磷酸酯、季铵表面活性剂(quaternary surfactants)和脱水山梨糖醇衍生物。
示例性非离子的表面活性剂包括，例如，BigCHAP(N,N-二[3-(D-葡糖酰氨基)丙基]胆酰胺)、二(聚乙二醇二[咪唑甲酰羰基])(Bis(polyethylene glycol bis[imidazoylcarbonyl]))、30(聚氧乙烯4月桂基醚)35(聚氧乙烯23月桂基醚)、52(聚氧乙烯2鲸蜡基醚)、56(聚氧乙烯10鲸蜡基醚)、58(聚氧乙烯20鲸蜡基醚)、72(聚氧乙烯2硬脂基醚)、76(聚氧乙烯10硬脂基醚)、78(聚氧乙烯20硬脂基醚)、92(聚氧乙烯2油基醚)、97(聚氧乙烯10油基醚)、98(聚氧乙烯20油基醚)、700(聚氧乙烯100硬脂基醚)、EL(蓖麻油/氧化乙烯聚醚)、十乙二醇单十二烷基醚、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺(MECA-8)、癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(MECA-10)、正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、异十三烷基-聚(乙二醇醚)n、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、正癸基α-D吡喃葡糖苷、癸基β-D-吡喃麦芽糖苷、正-十二烷酰基-N-甲基葡糖酰胺、正十二烷基α-D-麦芽糖苷、正十二烷基β-D-麦芽糖苷、七乙二醇单癸基醚、七乙二醇单十四烷基醚、正十六烷基β-D-麦芽糖苷、六乙二醇单十二烷基醚、六乙二醇单十六烷基醚、六乙二醇单十八烷基醚、六乙二醇单十四烷基醚、Igepal CA-630(辛基苯基-聚乙二醇)、CA-210(聚氧乙烯(2)异辛基苯基醚)、CA-520(聚氧乙烯(5)异辛基苯基醚)、CO-630(聚氧乙烯(9)壬基苯基醚)、CO-720(聚氧乙烯(12)壬基苯基醚)、CO-890(聚氧乙烯(40)壬基苯基醚)、CO-990(聚氧乙烯(100)壬基苯基醚)、DM-970(聚氧乙烯(150)二壬基苯基醚)、甲基-6-O-(N-庚基氨基甲酰基)-α-D-吡喃葡糖苷、九乙二醇单十二烷基醚、N-壬酰基-N-甲基葡糖胺、八乙二醇单癸基醚、八乙二醇单十二烷基醚、八乙二醇单十六烷基醚、八乙二醇单十八烷基醚、八乙二醇单十四烷基醚、辛基-β-D-吡喃葡糖苷、五乙二醇单癸基醚、五乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十六烷基醚、五乙二醇单己基醚、五乙二醇单十八烷基醚、五乙二醇单辛基醚、聚乙二醇二缩水甘油基醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20异十六烷基醚、聚氧乙烯20油基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯二(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、皂苷、20(脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、40(脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、60(脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、65(脱水山梨糖醇三硬脂酸酯)、80(脱水山梨糖醇单油酸酯)、85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、任何形式的Tergitol(包括类型15-S-5、15-S-7、15-S-9、15-S-12、15-S-30、NP-4、NP-7、NP-9、NP-10、NP-40、NPX(Imbentin-N/63)、TMN-3(聚乙二醇三甲基壬基醚)、TMN-6(聚乙二醇三甲基壬基醚)、TMN-10(聚乙二醇三甲基壬基醚)、MIN FOAM lx和MIN FOAM 2x)、十四烷基-β-D-麦芽糖苷、四乙二醇单癸基醚、四乙二醇单十二烷基醚、四乙二醇单十四烷基醚、三乙二醇单癸基醚、三乙二醇单十二烷基醚、三乙二醇单十六烷基醚、三乙二醇单辛基醚、三乙二醇单十四烷基醚、CF-21、CF-32、DF-12、DF-16、GR-5M、N-101(聚氧乙烯支链壬基苯基醚)、QS-15、QS-44、RW-75(聚乙二醇260单(十六烷基/十八烷基)醚和1-十八醇)、X-100(聚乙二醇四-辛基苯基醚)、X-102、X-15、X-151、X-200、X-207、X-114、X-165、X-305、X-405(聚氧乙烯(40)异辛基苯基醚)、还原的X-405(聚氧乙烯(40)异辛基环己基醚)、X-45(聚乙二醇4-叔-辛基苯基醚)、X-705-70、任何形式的(包括20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯，或者聚山梨酯20)、21(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、40(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、60(聚乙二醇脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、61(聚乙二醇脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、65(聚氧乙烯脱水山梨糖醇三硬脂酸酯)、80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、81(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)和85(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇三油酸酯))、Tyloxapol(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚与甲醛和环氧乙烷的聚合物)和正十一烷基β-D-吡喃葡糖苷。
示例性阴离子表面活性剂包括鹅去氧胆酸、胆酸、去氢胆酸、去氧胆酸、洋地黄皂甙、洋地黄毒甙配基、N,N-二甲基十二烷基胺N-氧化物、多库酯钠、鹅脱氧胆酰甘氨酸钠、甘胆酸、甘氨脱氧胆酸、葡糖石胆酸3-硫酸酯二钠盐、葡糖石胆酸乙酯、N-月桂酰基肌氨酸、十二烷基硫酸锂、Lugol(碘碘化钾)、Niaproof(硫酸2-乙基己基酯钠盐)、Niaproof 4(硫酸7-乙基-2-甲基-4-十一烷基酯钠盐)、任选取代的烷基磺酸盐(包括1-丁烷磺酸盐、戊烷磺酸盐、己烷磺酸盐、1-辛烷磺酸盐、1-癸烷磺酸盐、1-十二烷磺酸盐、1-庚烷磺酸盐、1-庚烷磺酸盐、1-壬烷磺酸盐、1-丙烷磺酸盐和2-溴乙烷磺酸盐，尤其是钠盐)、胆酸钠、去氧胆酸钠、任选取代的十二烷基硫酸钠、辛基硫酸钠、牛磺胆酸钠、牛磺酸鹅去氧胆酸钠、牛磺酸猪去氧胆酸钠、牛磺石胆酸3-硫酸酯二钠盐、牛磺熊脱氧胆酸钠盐、十二烷基硫酸盐、熊去氧胆酸。阴离子表面活性剂可以以酸或者盐形式，或者酸和盐形式提供。
示例性阳离子表面活性剂包括烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、苄基二甲基十六烷基氯化铵、苄基二甲基十四烷基氯化铵、苄基十二烷基二甲基溴化铵、苄基三甲基四氯碘酸铵、二甲基二(十八烷基)溴化铵、十二烷基乙基二甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、乙基十六烷基二甲基溴化铵、Girard试剂T、十六烷基三甲基溴化铵、N,N',N'-聚氧乙烯(10)-N-牛油-1,3-二氨基丙烷、通佐溴铵和三甲基(十四烷基)溴化铵。
示例性两性离子的表面活性剂包括CHAPS(3-{(3-胆酰氨基丙基)-二甲基铵基}-I-丙烷-磺酸盐)、CHAPSO(3-{(3-胆酰氨基丙基)二甲基-铵基}-2-羟基-l-丙烷-磺酸盐)、3-(癸基二甲基铵基)丙烷磺酸盐、3-(十二烷基二甲基铵基)丙烷磺酸盐、3-(N,N-二甲基肉豆蔻基铵基)丙烷磺酸盐、3-(N,N-二甲基十八烷基铵基)丙烷磺酸盐、3-(N,N-二甲基辛基铵基)丙烷磺酸盐和3-(N,N-二甲基棕榈基铵基)丙烷磺酸盐。
表面活性剂包括本领域已知的或者可发现的那些。表面活性剂可合成或者可从很多卖主中的任何卖主(例如，Sigma Aldrich Corp.,St.Louis,Mo.,USA,www.sigmaaldrich.com)商购。通过针对不使用表面活性剂处理加工的样品和针对用已知减少染色伪影的表面活性剂或者其它阳性对照处理加工的样品来评估用试验表面活性剂处理的样品，可测试给出的表面活性剂的减少伪影的能力。通过在将溶液静置至少两周后针对不含表面活性剂的溶液来目视检查含有表面活性剂的溶液，可测试给出的表面活性剂的减少制剂组分沉淀的能力。
固定溶液可包含将染料与细胞组分如乙二醇、丙二醇和/或聚乙二醇的非特异性结合最小化的试剂。在一些实施方案中，所述固定溶液可包含约0.5％(例如，约0.75％、约1％、约2％、约3％，或者约4％)至约5％(例如，约4％、约3％、约2％、约1％，或者约0.75％)液体非特异性结合最小化试剂(以体积计)，或者固体非特异性结合最小化试剂(以重量计)。例如，固定溶液可包含约5mL/L(例如，约10mL/L、约15mL/L、约20mL/L、约25mL/L、约30mL/L、约35mL/L、约40mL/L，或者约45mL/L)至约50mL/L(例如，约45mL/L、约40mL/L、约35mL/L、约30mL/L、约25mL/L、约20mL/L、约15mL/L，或者约10mL/L)乙二醇。在一些实施方案中，所述固定溶液包含约10mL/L(例如，约15mL/L、约20mL/L，或者约25mL/L)乙二醇。
固定溶液可包含缓冲剂。缓冲剂的实例包括HEPES缓冲剂(例如，HEPES钠盐和/或HEPES游离酸)、MES、vis-tris和其它有机缓冲剂。固定溶液可包含约0.5mM(例如，约1mM、约3mM、约5mM、约7mM，或者约9mM)至约10mM(例如，约9mM、约7mM、约5mM、约3mM，或者约1mM)缓冲剂。例如，固定溶液可包含约1.5mM(例如，约2mM或者约1mM)HEPES钠盐。固定溶液可包含约0.1g/L至约10g/L HEPES(例如，约0.5g/L至约10g/L，约0.25g/L至约0.38，约0.32g/L)。
当以约1:10固定溶液与水的比率在水中稀释时，固定溶液的pH可为约6至约8(例如，pH为约6.3至约7.7，pH为约6.5至约7.5，pH为约6.7至约7.3，pH为约6.8至约7.2，pH为约6.9至约7.1，或者pH为约7.0)。在一些实施方案中，以1:1000固定溶液与水的稀释度，所述固定剂可在约640至约650nm(例如，约646至约648nm)的峰值波长具有约0.1至1(例如，约0.1至0.8、约0.1至0.7、约0.1至0.5、约0.1至0.4、约0.1至0.3、约0.15至0.3、约0.15至0.2、约0.185至0.205、约0.19，或者约0.2)的吸光度。
作为实例，为制备固定溶液，首先可将有机溶剂如甲醇添加至混合容器，达到最终希望体积的少于100％(例如，约90％)。可将计算量的非特异性结合最小化试剂(例如，乙二醇)、表面活性剂(例如，聚山梨酯20)、细胞学染料(例如，天青B)和缓冲剂(例如，HEPES钠盐)添加至甲醇。可添加另外的甲醇以使溶液达到最终希望体积。可将混合物用磁力搅拌板/搅拌子和/或叶轮混合最少约30分钟。在混合后，可制备固定溶液在蒸馏水中的1:10稀释液和可使用pH计(例如，Mettler pH计)读取pH。在一些实施方案中，如果pH不在希望的范围内，那么可将其它缓冲剂添加至未稀释的固定溶液，直到固定溶液在蒸馏水中的1:10稀释液达到希望的pH。
可使用UV-分光光度计(例如，Hitachi UV-分光光度计)测量固定溶液吸光度。首先可在分光光度计上运行基线。例如，可将固定溶液的10mL样品经0.45μm注射器式滤器滤过，可将溶液用蒸馏水以1:1000稀释并在分光光度计上在约500至约700nm之间运行。可记录在约640至约650nm的吸光度。包含天青B的固定溶液的代表性UV-Vis吸收光谱例如在图2中示出。如果需要，可将另外的细胞学染料添加至固定溶液以使吸光度达到希望的范围。如果将另外的细胞学染料添加至固定溶液，那么将溶液混合最少约30分钟，并重复测量过程(例如，过滤10mL等分试样，在蒸馏水中以1:1000的比率稀释等分试样，并进行吸光度测量)。溶液的pH也可通过上述方法重新测量并调节(如果需要的话)。
最后，可将固定溶液经0.45μm滤器滤过以在装瓶之前除去任何微粒。在一些实施方案中，可使用较细或者较粗的滤器。例如，可使用0.1至1μm滤器(例如，0.2μm滤器、0.4μm滤器，或者0.8μm滤器)以除去固定溶液中的任何微生物和/或微粒。在一些实施方案中，可将所述固定剂贮存在500mL瓶中并装填至396g±1g，如通过天平测量。如果希望的话，可测量最终产物的pH。在一些实施方案中，可得到固定溶液的HPLC色谱图，例如，用于评估溶液纯度。
在一些实施方案中，所述固定溶液包含HEPES缓冲剂(例如，HEPES钠盐和/或HEPES游离酸)，因为它在甲醇中可溶，与天青B相容和/或可调节pH至约7.8。天青B可优先染色某些细胞组分(例如，细胞核、嗜碱性粒细胞、细胞质、颗粒等)以提供增强的对照。聚山梨酯20可增强固定溶液在基底(例如，显微镜载玻片)上的铺展能力和/或可打底随后用于递送水溶液的喷嘴。乙二醇可减少染料与细胞组分(例如，染色质，以提供相比于核较浅着色的核仁)的非特异性结合，以在染色试样中提供较好的对照。
例如，细胞学固定溶液可包含约0.5g/L至约5.0g/L天青B；约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20；约5mL/L至约50mL/L乙二醇、丙二醇，或者聚丙二醇；约0.1g/L至约10g/LHEPES钠盐；和甲醇。
作为另一实例，细胞学固定溶液可包含约0.8g/L至约1.2g/L天青B；约0.8mL/L至约1.2mL/L聚山梨酯20；约9mL/L至约11mL/L乙二醇；约0.25g/L至约0.38g/L HEPES钠盐；和甲醇。
例如，细胞学固定溶液可包含约1g/L天青B；约1mL/L聚山梨酯20；约10mL/L乙二醇；约0.32g/L HEPES钠盐；和甲醇。
作为另一实例，细胞学固定溶液可包含约1g/L天青B；约0.5mL/L聚山梨酯20；约10mL/L丙二醇；约0.32g/L HEPES钠盐；和甲醇。
作为又一实例，细胞学固定溶液可包含约1g/L天青B；约1.5mL/L聚山梨酯20；约10mL/L聚丙二醇；约0.32g/L HEPES钠盐；和甲醇。
第一和第二染色溶液
通常，第一染色溶液可为水溶液。溶剂可包含蒸馏水或者去离子水。第一染色溶液包含细胞学染料。第一染色溶液可提供红色染色剂。染料可提高试样的染色并可包含，例如，曙红Y和荧光素衍生物。在一些实施方案中，曙红Y可染色试样中的细胞质和核，所述试样例如从血液样品制备。在一些实施方案中，嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞优选用曙红Y染色。染料可为至少约80％纯(例如，至少约85％纯、至少约90％纯、至少约95％纯，或者约100％纯)。曙红Y的代表性HPLC色谱图例如在图3中示出。在第一染色溶液中染料的浓度可为约0.5g/L(例如，约0.75g/L、约1g/L、约2g/L、约3g/L，或者约4g/L)至约5g/L(例如，约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L，或者约0.75g/L)。例如，第一染色溶液可包含约0.75g/L(例如，约1g/L、约2g/L、约3g/L、约4g/L，或者约5g/L)曙红Y。
通常，第二染色溶液可为水溶液。溶剂可包含蒸馏水或者去离子水。第二染色溶液可包含两种或者更多种细胞学染料。第二染色溶液可提供蓝色染色剂。染料可提高试样染色并可包含例如，天青B、亚甲蓝和/或其它噻嗪染料中的至少两种。在一些实施方案中，天青B可优选染色细胞核，而亚甲蓝可主要染色试样中的细胞质和少量地染色试样中的细胞核，所述试样例如从血液样品制备。染料可各自独立地为至少约80％纯(例如，至少约85％纯，至少约90％纯，至少约95％纯，或者约100％纯)。在第二染色溶液中每种染料可独立地具有以下浓度：约0.25g/L(例如，约0.3g/L、约0.4g/L、约0.45g/L、约0.5g/L、约0.75g/L、约1g/L、约1.5g/L，或者约2g/L)至约2.5g/L(例如，约2g/L、约1.5g/L、约1g/L、约0.75g/L，或者约0.5g/L、约0.45g/L、约0.4g/L，或者约0.3g/L)。例如，第二染色溶液可包含约0.5g/L天青B和约0.45g/L亚甲蓝水合物。在一些实施方案中，当在对应于每种染料的最大吸光度(例如，在约630nm和约660nm)的波长监测吸光度时，第二染色溶液可包含约1:4至约4:1(例如，约3:1、约2:1、约1:1、约1:2，或者约1:3)比率的两种染料，如通过每种染料的最大HPLC峰下的面积评估。包含约1:1比率的天青B和亚甲蓝的第二染色溶液的代表性HPLC色谱图例如在图5中示出。
第一和第二染色溶液可各自独立地包含表面活性剂。不希望被任何理论束缚，据信，表面活性剂降低溶剂的表面张力，并可提供溶液在样品基底上的良好铺展性。在一些实施方案中，所述表面活性剂为非离子的，并可将从溶液沉淀的可能性最小化，所述沉淀例如可来自于与制剂中的组分如离子电荷染料的离子相互作用。具有极少沉淀或者没有沉淀的溶液可更容易从分配喷嘴排出，并可减低分配喷嘴阻塞或者液体流变小的可能性。在一些实施方案中，所述表面活性剂可降低非特异性结合的可能性或者将伪影最小化，所述伪影可由非特异性结合导致。具有极少沉淀或者没有沉淀的溶液也可将可存在于样品中的伪影最小化。
第一和第二染色溶液可各自独立地包含约0.05％(例如，约0.075％、约0.1％、约0.2％、约0.3％，或者约0.4％)至约0.5％(例如，约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％，或者约0.075％)液体表面活性剂(以体积计)或者固体表面活性剂(以重量计)。在一些实施方案中，所述第一和第二染色溶液可各自独立地包含约0.5至约2mL/L表面活性剂(例如，非离子的表面活性剂)。例如，第一和第二染色溶液可各自独立地包含约1ml/L聚山梨酯20(例如，吐温20)。
表面活性剂可为非离子的、阳离子的、阴离子的或者两性离子的。也可使用表面活性剂混合物。表面活性剂的示例性类别包括醇醚硫酸盐、醇硫酸盐、烷醇酰胺、烷基磺酸盐、胺氧化物、两性表面活性剂、阴离子表面活性剂、甜菜碱衍生物、阳离子表面活性剂、二磺酸盐、十二烷基苯、磺酸、乙氧基化醇、乙氧基化烷基酚、乙氧基化脂肪酸、甘油酯助水溶物、月桂基硫酸盐、单甘油酯和二甘油酯、非离子的表面活性剂、磷酸酯、季铵表面活性剂和脱水山梨糖醇衍生物。示例性表面活性剂前面在标题为“固定溶液”的段落下提供。
第一和第二染色溶液可各自独立地包含将染料与细胞组分的非特异性结合最小化的试剂，例如乙二醇、丙二醇、聚乙二醇。在一些实施方案中，所述第一和第二染色溶液可各自独立地包含约0.5％(例如，约0.75％、约1％、约2％、约3％，或者约4％)至约5％(例如，约4％、约3％、约2％、约1％，或者约0.75％)液体非特异性结合最小化试剂(以体积计)，或者固体非特异性结合最小化试剂(以重量计)。例如，第一和第二染色溶液可各自独立地包含约5mL/L(例如，约10mL/L、约15mL/L、约20mL/L、约25mL/L、约30mL/L、约35mL/L、约40mL/L，或者约45mL/L)至约50mL/L(例如，约45mL/L、约40mL/L、约35mL/L、约30mL/L、约25mL/L、约20mL/L、约15mL/L，或者约10mL/L)乙二醇。在一些实施方案中，所述第一和第二染色溶液可各自独立地包含约10mL/L(例如，约15mL/L、约20mL/L，或者约25mL/L)乙二醇。
第一和第二染色溶液可各自独立地包含缓冲剂。缓冲剂的实例包括bis-tris缓冲剂、磷酸盐、HEPES、MES、Tris和pH为约5至约8的有机缓冲剂。第一和第二染色溶液可各自独立地包含约5mM(例如，约25mM、约50mM、约100mM、约150mM，或者约200mM)至约250mM(例如，约200mM、约150mM、约100mM、约50mM，或者约25mM)缓冲剂。例如，第一和第二染色溶液可各自独立地包含约50mM bis-tris。在一些实施方案中，在第二染色剂溶液中的缓冲剂与在第一染色剂溶液中的缓冲剂相同，以提高在染色剂溶液之间的相容性。
第一和第二染色溶液可各自独立地包含盐，例如氯化钠、氯化钾、乙酸钠、氯化钙、氯化镁、硫酸钠、硫酸镁和硫酸铵。第一和第二染色溶液可各自独立地包含约1g/L(例如，约2g/L、约5g/L、约10g/L，或者约15g/L)至约20g/L(例如，约15g/L、约10g/L、约5g/L，或者约2g/L)的盐浓度。例如，第一和第二染色溶液可各自独立地包含约4g/L(约3g/L或者约2g/L)盐，例如氯化钠。例如，第二染色溶液可包含约2g/L(例如，约3g/L，或者约4g/L)盐，例如氯化钠。盐可减少细胞学染料与试样的非特异性结合。不希望被任何理论束缚，据信，通过例如与试样中的带电物质结合，盐的阴离子和阳离子可屏蔽在染料和试样之间的非特异性电荷-电荷相互作用。
第一和第二染色溶液可各自独立地包含抗微生物剂。抗微生物剂可抑制微生物的生长和提高染色溶液的贮存期限。抗微生物剂可包括苯扎氯铵、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、(例如，ProClin)、叠氮化物、硫柳汞类和/或抗生素。在一些实施方案中，所述抗微生物剂包括5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。例如，抗微生物剂可为300，其可含有在惰性溶剂(例如，改性乙二醇和羧酸烷基酯)中的约2.3％5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和约0.7％2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮，可得自Sigma-Aldrich。第一和第二染色剂溶液可各自独立地包含浓度为约0.2ppm(例如，约1ppm、约5ppm、约10ppm、约20ppm、约30ppm，或者约40ppm)至约50ppm(例如约40ppm、约30ppm、约20ppm、约10ppm、约5ppm，或者约1ppm)的抗微生物剂。在一些实施方案中，所述第一和第二染色溶液可各自独立地含有约15ppm(约10ppm、约5ppm，或者约2ppm)ProClin
在一些实施方案中，所述第一和第二染色溶液可各自独立地进一步含有调节pH的酸。酸可为常用于调节溶液pH的任何酸。例如，可使用乙酸、硝酸、盐酸、磷酸、甲酸、硫酸，或者柠檬酸。
第一和第二染色溶液可各自独立地具有约5至约8(例如，约5.5至约8，约5.5至约7.5，约5.5至约7，约5.5至约6，约5.8至约6.2，约5.9至约6.1，约6，或者约7的pH)的pH。在一些实施方案中，以1:500第一染色溶液与水的水中稀释度，第一染色溶液可在约510至约530nm(例如，约510至约520nm，或者约515至约517nm)的最大峰值波长具有约0.1至约1(例如，约0.1至约0.8，约0.1至约0.7，约0.1至约0.5，约0.1至约0.4，约0.1至约0.3，约0.15至约0.3，约0.15至约0.2，约0.185至约0.205、约0.19，或者约0.2)的吸光度。在一些实施方案中，以1:1000第二染色溶液与水的稀释度，第二染色溶液可在约630至约660nm(例如，约640至约660nm、约640至约655nm、约645至约655nm、约650至约655nm，或者约650.5至约652.5nm)的峰值波长具有约0.1至约1(例如，约0.1至约0.8，约0.1至约0.7，约0.1至约0.5，约0.1至约0.4，约0.1至约0.3，约0.15至约0.3，约0.15至约0.2，约0.185至约0.205、约0.19，或者约0.2)的吸光度。
在一些实施方案中，为制备第一或者第二染色溶液，首先将蒸馏水或者去离子水添加至混合容器，达到最终希望体积的少于100％(例如，约90％)。可将计算量的非特异性结合最小化试剂(例如，乙二醇)、表面活性剂(例如，聚山梨酯20)、一种或者多种细胞学染料(例如，曙红Y，或者天青B和亚甲蓝)、盐(例如，NaCl)、抗微生物剂(例如，ProClin)、酸(例如，乙酸)和/或缓冲剂(例如，bis tris)添加至水。此外，可添加水，以使溶液达到最终希望体积。可将混合物用磁力搅拌板/搅拌子和/或叶轮混合最少约30分钟。在混合后，使用pH计(例如，Mettler pH计)在第一或者第二染色溶液的等分试样上读取pH。在一些实施方案中，如果pH不在希望范围(例如，5至8)内，那么可将其它酸添加至第一或者第二染色溶液，直到得到希望的pH。
可使用UV-分光光度计(例如，Hitachi UV-分光光度计)测量第一染色溶液吸光度。首先可在分光光度计上运行基线。例如，可将第一染色溶液的10mL样品经0.45μm注射器式滤器滤过，用蒸馏水以1:500稀释，然后在分光光度计上在500-700nm之间扫描。可记录在510至530nm的吸光度。包含曙红Y的第一染色溶液的代表性UV-Vis吸收光谱例如在图4中示出。如果需要，可将另外的细胞学染料添加至第一染色溶液以使吸光度达到希望的范围。如果将另外的细胞学染料(例如，曙红)添加至第一染色溶液，那么可将溶液混合最少约30分钟，并可重复测量过程(例如，过滤10mL等分试样，在蒸馏水中以1:500的比率稀释等分试样，并进行吸光度测量)。溶液的pH可通过上面方法重新测量并调节至pH 5-8(如果需要的话)。
可使用UV-分光光度计(例如，Hitachi UV-分光光度计)测量第二染色溶液吸光度。首先可在分光光度计上运行基线。可将第二染色溶液的10mL样品经0.45μm注射器式滤器滤过，用蒸馏水以1:1000稀释，然后在分光光度计上在500-700nm之间扫描。可记录630-660nm的吸光度。包含1:1亚甲蓝与天青B的第二染色溶液的代表性UV-Vis吸收光谱例如在图6中示出。如果需要，可将另外的细胞学染料添加至第二染色溶液，以使吸光度达到希望的范围。也可将一部分滤过的样品使用高效液相色谱法(HPLC)色谱处理，并可记录对应于样品中的每种染料的最高吸收峰的面积。在不同染料组分之间的峰面积可为大约相等。
如果第二染色溶液中的染料的HPLC峰面积不是大约相等，那么可将另外的细胞学染料(例如，天青B和/或亚甲蓝)添加至第二染色溶液，直到溶液可包含约相等量(如通过峰面积评估)的每种染料。在添加一种或者多种染料后，可将第二染色溶液最少混合约30分钟，并可重复测量过程(例如，过滤10mL等分试样，在蒸馏水中以1:500的比率稀释等分试样，并进行吸光度和HPLC测量)。溶液的pH可通过上述方法重新测量并调节至希望的范围(如果需要的话)。
最后，可将第一和第二染色溶液各自独立地经0.45μm滤器滤过，以在装瓶之前除去任何微粒。在一些实施方案中，可使用较细或者较粗的滤器。例如，可使用0.1至1μm滤器(例如，0.2μm滤器、0.4μm滤器，或者0.8μm滤器)除去第一或者第二染色溶液中的任何微生物和/或微粒。在一些实施方案中，可将所述第一或者第二染色溶液各自独立地贮存在250mL瓶中并装填至250g±1g，如通过天平测量。可测量最终产物的pH，如果希望的话。在一些实施方案中，可得到第一染色溶液的HPLC色谱图，例如，用于评估溶液纯度。在一些实施方案中，可得到第二染色溶液的HPLC色谱图，例如，用于评估溶液纯度和/或得到溶液中的染料比率。
在一些实施方案中，第一染色溶液可染色试样的某些细胞，所述试样由例如血液样品(例如，嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞)制备。第一染色溶液可含有bis-tris缓冲剂，并且所得染色溶液可提供较红颜色和视觉上更愉悦的染色试样。bis-tris缓冲剂可与曙红Y相容。在一些实施方案中，天青B包含在超过一种制剂中，例如包含在固定溶液和第二染色溶液中。当试样超过一次暴露于天青B时，据信，相比于单次暴露于天青B，可发生较好的试样染色。
第一和第二染色溶液可各自独立地含有NaCl和乙二醇，其结合起来可提供对非特异性结合的协同屏蔽效果，即，与含有相等浓度的NaCl或者乙二醇的制剂相比，其中含有NaCl和乙二醇的制剂可具有较少的非特异性结合。例如，包含NaCl和乙二醇的制剂可提供与剩余核相比较浅颜色的核仁，而不含NaCl和乙二醇的制剂可提供均一的深色核(darknucleus)。在一些实施方案中，相比于不含NaCl的染色溶液，包含NaCl的染色溶液可具有降低的背景染色。
例如，第一细胞学染色溶液可包含约0.5g/L至约5.0g/L曙红Y；约5mM至约250mMbis-tris或者磷酸盐缓冲剂；约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20；约1g/L至约20g/L氯化钠；约5mL/L至约50mL/L乙二醇；约0.2ppm至约50ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
作为另一实例，第一细胞学染色溶液可包含约0.6g/L至约0.9g/L曙红Y；约45mM至约55mM bis-tris缓冲剂；约0.8mL/L至约1.2mL/L聚山梨酯20；约3g/L至约5g/L氯化钠；约9mL/L至约11mL/L乙二醇；约10ppm至约20ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
例如，第一细胞学染色溶液可包含约0.75g/L曙红Y；约50mM bis-tris缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20；约4g/L氯化钠；约10mL/L乙二醇；约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
作为另一实例，第一细胞学染色溶液可包含约0.75g/L曙红Y；约50mM bis-tris缓冲剂；约0.5mL/L聚山梨酯20；约6g/L氯化钠；约20mL/L乙二醇；约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
作为又一实例，第一细胞学染色溶液可包含约0.75g/L曙红Y；约50mM磷酸盐缓冲剂；约2.0mL/L聚山梨酯20；约4g/L氯化钠；约50mL/L乙二醇；约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约5.8至约6.2。
例如，第二细胞学染色溶液可包含约0.25至约2.5g/L天青B；约0.25g/L至约0.5g/L亚甲蓝；约5mM至约250mM bis-tris或者HEPES缓冲剂；约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20、约1g/L至约20g/L氯化钠和约0.2ppm至约50ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
作为另一实例，第二细胞学染色溶液可包含约0.4至约0.6g/L天青B；约0.4g/L至约0.5g/L亚甲蓝；约45mM至约55mM bis-tris缓冲剂；约0.8mL/L至约1.2mL/L聚山梨酯20、约1.8g/L至约2.2g/L氯化钠和约10ppm至约20ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
例如，第二细胞学染色溶液可包含约0.5g/L天青B；约0.45g/L亚甲蓝；约50mMbis-tris缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20、约2g/L氯化钠和约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
作为另一实例，第二细胞学染色溶液可包含约0.5g/L天青B；约0.45g/L亚甲蓝；约50mM HEPES缓冲剂；约0.5mL/L聚山梨酯20、约2g/L氯化钠和约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
作为又一实例，第二细胞学染色溶液可包含约0.5g/L天青B；约0.45g/L亚甲蓝；约50mM HEPES缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20、约1g/L氯化钠和约15ppm ProClin乙酸；和水，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。
漂洗溶液
通常，漂洗溶液可为水溶液。溶剂可包含蒸馏水或者去离子水。漂洗溶液可包含非特异性结合最小化试剂，例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚糖和/或其它亲水性水溶性聚合物。在一些实施方案中，所述非特异性结合最小化试剂可包含乙二醇或者丙二醇。不希望被任何理论束缚，据信，非特异性结合最小化试剂可制备在样品制备期间用于干燥过程的试样。非特异性结合最小化试剂可在整个试样上提供漆并可向试样提供增强的外观。在漂洗溶液中非特异性结合最小化试剂的浓度可为约1g/L(例如，约2g/L、约3g/L、约4g/L、约5g/L、约6g/L、约7g/L、约8g/L，或者约9g/L)至约10g/L(例如，约9g/L、约8g/L、约7g/L、约6g/L、约5g/L、约4g/L、约3g/L，或者约2g/L)。例如，漂洗溶液可包含约5g/L聚乙二醇(例如，聚乙二醇1450)。
漂洗溶液可包含表面活性剂。不希望被任何理论束缚，据信，表面活性剂降低溶剂的表面张力，并可提供溶液在样品基底上的良好铺展能力。在一些实施方案中，所述表面活性剂为非离子的，并可将溶液组分沉淀的可能性最小化，所述沉淀可例如由与制剂中的组分如离子电荷染料的离子相互作用导致。具有极少沉淀物或者没有沉淀物的溶液可更容易从分配喷嘴排出，并可降低分配喷嘴阻塞的可能性或者液体流变小的可能性。在一些实施方案中，所述表面活性剂可降低非特异性结合的可能性，或者将伪影最小化，所述伪影可作为非特异性结合的结果发生。具有极少沉淀物或者没有沉淀物的溶液可将可存在于试样中的伪影最小化。
漂洗溶液可包含约0.05％(例如，约0.075％、约0.1％、约0.2％、约0.3％，或者约0.4％)至约0.5％(例如，约0.4％、约0.3％、约0.2％、约0.1％，或者约0.075％)液体表面活性剂(以体积计)或者固体表面活性剂(以重量计)。在一些实施方案中，所述漂洗溶液可包含约0.5至约2mL/L表面活性剂(例如，非离子的表面活性剂)。例如，漂洗溶液可包含约1ml/L聚山梨酯20(例如，吐温20)。
表面活性剂可为非离子的、阳离子的、阴离子的或者两性离子的。也可使用表面活性剂混合物。表面活性剂的示例性类别包括醇醚硫酸盐、醇硫酸盐、烷醇酰胺、烷基磺酸盐、胺氧化物、两性表面活性剂、阴离子表面活性剂、甜菜碱衍生物、阳离子表面活性剂、二磺酸盐、十二烷基苯、磺酸、乙氧基化醇、乙氧基化烷基酚、乙氧基化脂肪酸、甘油酯助水溶物、月桂基硫酸盐、单甘油酯和二甘油酯、非离子的表面活性剂、磷酸酯、季铵表面活性剂和脱水山梨糖醇衍生物。示例性表面活性剂如前面在标题为“固定溶液”的部分下提供。
漂洗溶液可包含缓冲剂。缓冲剂的实例包括HEPES缓冲剂(例如，HEPES钠盐和/或HEPES游离酸)、bis-tris缓冲剂、磷酸盐、MES、Tris和pH为5至8的有机缓冲剂。漂洗溶液可包含约5mM(例如，约25mM、约50mM、约100mM、约150mM，或者约200mM)至约250mM(例如，约200mM、约150mM、约100mM、约50mM，或者约25mM)缓冲剂。例如，漂洗溶液可包含约50mMHEPES。
漂洗溶液可包含抗微生物剂。抗微生物剂可抑制微生物生长和提高漂洗溶液的贮存期限。抗微生物剂可包括苯扎氯铵、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、(ProClin)、叠氮化物、硫柳汞类和/或抗生素。在一些实施方案中，所述抗微生物剂包括5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮。例如，抗微生物剂可为ProClin其可含有在惰性溶剂(例如，改性乙二醇和羧酸烷基酯)中的约2.3％5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和约0.7％2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮，可得自Sigma-Aldrich。抗微生物剂的存在浓度可为约0.2ppm(例如，约1ppm、约5ppm、约10ppm、约20ppm、约30ppm，或者约40ppm)至约50ppm(例如约40ppm、约30ppm、约20ppm、约10ppm、约5ppm，或者约1ppm)。在一些实施方案中，所述漂洗溶液含有约15ppm(约10ppm、约5ppm，或者约2ppm)ProClin
在一些实施方案中，所述漂洗溶液还包含酸以调节pH。酸可为常用于调节溶液pH的任何酸。例如，可使用乙酸、硝酸、盐酸、磷酸、甲酸、硫酸，或者柠檬酸。
漂洗溶液可包含醇，例如甲醇、乙醇，或者丙醇。醇可除去过量染料，可促进漂洗溶液在试样和/或基底上的较快干燥。在一些实施方案中，DMSO或者其它有机溶剂(染料在其中可溶)可在漂洗溶液中使用并可提供从递送喷嘴的完全流体排出。例如，漂洗溶液可包含约10mL/L(例如，约25mL/L、约50mL/L、约75mL/L、约100mL/L、约125mL/L、约150mL/L，或者约175mL/L)至约200mL/L(例如，约175mL/L、约150mL/L、约125mL/L、约100mL/L、约75mL/L、约50mL/L，或者约25mL/L)醇。在一些实施方案中，所述漂洗溶液包含约50mL/L甲醇。在一些实施方案中，所述漂洗溶液可具有至多约200mL/L有机溶剂，使得漂洗溶液不能从染色生物样品洗涤过量的希望的染料。
漂洗溶液的pH可为约5至约8(例如，约5.5至约8，约5.5至约7.5，约5.5至约7，约5.5至约6，约5.8至约6.2，约5.9至约6.1，约7.0，或者约6.0的pH)。例如，漂洗溶液的pH可为约7.0。
为制备漂洗溶液，可将蒸馏水或者去离子水添加至混合容器，达到最终希望体积的少于100％(例如，约90％)。可将计算量的醇(例如，甲醇)、非特异性结合最小化试剂(例如，PEG)、缓冲剂(例如，HEPES钠盐和HEPES游离酸)、表面活性剂(例如，聚山梨酯20)、酸(如果使用的话)和抗微生物剂(例如，ProClin)添加至水。可添加另外的水以使溶液达到最终希望体积。可将混合物用磁力搅拌板/搅拌子和/或叶轮混合至少约30分钟。在混合后，pH可在漂洗溶液的等分试样上使用pH计(例如，Mettler pH计)读取。在一些实施方案中，如果pH不在希望范围(例如，约5至约8)内，那么可将其它酸添加至第二染色溶液，直到得到希望的pH。
最后，可将漂洗溶液经0.45μm滤器滤过，以在装瓶之前除去任何微粒。在一些实施方案中，可使用较细或者较粗滤器。例如，可使用0.1至1μm滤器(例如，0.2μm滤器、0.4μm滤器，或者0.8μm滤器)除去漂洗溶液中的任何微生物和/或微粒。在一些实施方案中，可将所述漂洗溶液贮存在500mL瓶中并装填至500g±1g，如通过天平测量。可测量最终产物的pH，如果希望的话。
在一些实施方案中，与用不含聚乙二醇的漂洗溶液处理的试样相比，在染色应用结束时施用的包含聚乙二醇的漂洗溶液可改善试样的外观。在一些实施方案中，通过提供在红色和蓝色之间较好的颜色平衡，pH为约6.8的包含HEPES缓冲剂的漂洗溶液可改善细胞如红细胞的外观。
在一些实施方案中，漂洗溶液的组分的存在浓度可低于上述浓度(例如，低于5倍)。
漂洗溶液的聚乙二醇组分的浓度可为约0.2g/L(例如，约0.4g/L、约0.6g/L、约0.8g/L、约1g/L、约1.2g/L、约1.4g/L、约1.6g/L，或者约1.8g/L)至约2g/L。例如，漂洗溶液可包含约1g/L聚乙二醇(例如，聚乙二醇1450)。
漂洗溶液可包含约0.01％(例如，约0.015％、约0.02％、约0.04％、约0.06％，或者约0.8％)至约0.1％液体表面活性剂(以体积计)或者固体表面活性剂(以重量计)。在一些实施方案中，所述漂洗溶液可包含约0.0501％至0.306％表面活性剂。在一些实施方案中，所述漂洗溶液可包含约0.1至约0.4mL/L表面活性剂(例如，非离子的表面活性剂)。例如，漂洗溶液可包含约0.2ml/L聚山梨酯20(例如，吐温20)。
漂洗溶液可包含约1mM(例如，约5mM、约10mM、约20mM、约30mM，或者约40mM)至约50mM缓冲剂。例如，漂洗溶液可包含约10mM HEPES。
抗微生物剂的存在浓度可为约0.04ppm(例如，约0.2ppm、约1ppm、约2ppm、约5ppm、约6ppm，或者约8ppm)至约10ppm。在一些实施方案中，所述漂洗溶液含有约3ppm(约2ppm、约1ppm，或者约0.4ppm)ProClin
漂洗溶液可包含约2mL/L(例如，约5mL/L、约10mL/L、约15mL/L、约20mL/L、约25mL/L、约30mL/L，或者约35mL/L)至约40mL/L醇。在一些实施方案中，所述漂洗溶液包含约10mL/L甲醇。在一些实施方案中，所述漂洗溶液可具有至多约40mL/L有机溶剂，使得漂洗溶液不能从染色生物样品洗涤过量的希望的染料。
例如，漂洗溶液可包含约0.2g/L至约10g/L聚乙二醇；约1mM至约250mM HEPES、MES，或者bis-tris缓冲剂；约0.1mL/L至约2.40mL/L聚山梨酯20；约0.04ppm至约50ppmProClin约9mL/L至约200mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
例如，漂洗溶液可包含约1g/L至约10g/L聚乙二醇；约5mM至约250mM HEPES、MES，或者bis-tris缓冲剂；约0.5mL/L至约2.0mL/L聚山梨酯20；约0.2ppm至约50ppm ProClin约10mL/L至约200mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
作为另一实例，漂洗溶液可包含约4.5g/L至约5.5g/L聚乙二醇；约45mM至约55mMHEPES缓冲剂；约0.8mL/L至约1.2mL/L聚山梨酯20；约10ppm至约20ppm ProClin约45mL/L至约55mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
例如，漂洗溶液包含约5g/L聚乙二醇；约50mM HEPES缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20；约15ppm ProClin约50mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
作为另一实例，漂洗溶液包含约10g/L聚乙二醇；约50mM MES缓冲剂；约1mL/L聚山梨酯20；约15ppm ProClin约50mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
作为又一实例，漂洗溶液包含约10g/L聚乙二醇；约50mM bis-tris缓冲剂；约0.5mL/L聚山梨酯20；约15ppm ProClin约50mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
例如，漂洗溶液可包含约0.2g/L至约2g/L聚乙二醇；约1mM至约50mM HEPES缓冲剂；约0.16mL/L至约0.24mL/L聚山梨酯20；约0.04ppm至约10ppm ProClin约9mL/L至约11mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
作为另一实例，漂洗溶液可包含约0.9g/L至约1.1g/L聚乙二醇；约9mM至约11mMHEPES缓冲剂；约0.16mL/L至约0.24mL/L聚山梨酯20；约2ppm至约10ppm ProClin约9mL/L至约11mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
在又一实例中，漂洗溶液包含约1g/L聚乙二醇；约10mM HEPES缓冲剂；约0.2mL/L聚山梨酯20；约3ppm ProClin约10mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH为约6.6至约7.0。
试剂盒
在一些实施方案中，试剂盒可包含一瓶或者多瓶固定溶液、第一染色溶液、第二染色溶液和/或漂洗溶液中的每种。试剂盒可包含使用说明书和标签。标签可包括例如批次信息和有效期。图25显示包含固定溶液、第一和第二染色溶液和漂洗溶液的试剂盒的实例。
在一些实施方案中，所述加工步骤包括施用固定溶液，施用固定溶液，施用第一染色溶液，施用第二染色溶液，施用漂洗溶液，并施用漂洗溶液。
试样制备系统和方法
上面的固定、染色和漂洗制剂可在装置或者机器中用于制备试样(例如，如2011年11月9日提交的美国申请13/293,050中所述，将其全部内容并入本申请作为参考)，以增强试样中的某些特征的可视外观。图7示出装置或者机器1的实施方案，所述装置或者机器1用于在基底2如显微镜载玻片、盖玻片或者其它透明表面上制备用于检查或者成像的试样。可将机器1结合至整体系统中，所述整体系统用于制备和分析包含体液或者含有细胞的其它生物样品的试样，例如在图21中示出并且下述的系统2000。通常，机器1可包括以下系统，或者形成以下系统的一部分，所述系统的特征在于得到试样的第一站、将试样施用至基底的第二站、分别用于固定和染色试样的第三和第四站、干燥试样的第五站、成像试样的第六站和分析得自试样的图像和数据的第七站。机器1的某些实施方案与系统2000相容；机器1的一些实施方案可用于其它试样制备系统和/或用作独立设备。
通常，机器1可包括一个或者多个(例如，2、3、4、5，或者超过5)如图7-9中所示的用于试样加工的平台60A和60B。如图8中所示，平台60A可包括用于支撑平台顶面的侧面。图7和9中所示的屏蔽物100可位于平台60A和60B之间以防止流体在平台60之间的泼溅。在一些实施方案中，屏蔽物100可由透明材料形成，其阻碍平台60A和60B中的一个的流体污染另一平台。在某些实施方案中，屏蔽物100可由半透明的或者不透明的材料形成。在图7和9中，将屏蔽物100表示为由透明材料形成，以允许在同一图中显示位于屏蔽物100后面的其它构件。也可将屏蔽物100显示为由不透明材料形成，在这种情况中，一些构件如平台60A和模块80A的部分会被掩蔽。
图9B显示索引机构50A，其可用于调动机器1以提供从每个基底夹持器20A、20B至试样加工位置的基底2。索引机构50A可呈许多形式，例如机电设备(例如，由电动机提供动力的齿条和小齿轮组)、线性致动器(例如，气动致动器、液压致动器，或者电磁致动器)。尽管在所示实施方案中，索引机构50A在两个位置之间线性地调动机器1，但是其它调动路线也是可能的，这是基于在机器1上包括的平台数目和它们的构造和布局，例如圆形或者半圆形(例如，可在弓形路线中移动的分度台)。如图中所示，索引机构50A可包括与机器1的基座50C连接的齿条50B和与固定至基座50C的电动机50E连接的小齿轮50D。机器1可使用一个或者多个滑动设备50F连接至基座50C，使得当由索引机构50A调动时，机器1可平滑地移动。在使用中，索引机构50A可移动机器1，使得可向用于样品加工的基底移动器120提供机器1的多个基底夹持器20A和/或20B，以从基底移动器120(在图11中示出)接收基底2，使得布置在基底2上的样品可通过机器1制备，以及使得一旦制备，那么基底夹持器20A和/或20B可提供具有制备的样品的基底2。
对于具有两个平台60A和60B的机器，如在所示实施方案中，通常将基底2以可选方式提供至基底移动器120和从基底移动器120提供。在一些实施方案中，将第一基底2从基底移动器120至第一基底夹持器20A提供，以在第一平台60A处加工，同时机器1处于第一位置。当第一基底2在第一平台60A处加工时，索引机构50A可将机器1调动至第二位置，使得第二基底夹持器20B可从基底移动器120接收第二基底，以在第二平台60B处加工。当第二基底在第二平台60B处加工时，索引机构50A可将机器1调动返回至第一位置，使得基底移动器120可从第一基底夹持器20A移除第一基底2。一旦基底2从第一夹持平台20A移除，可将下一基底提供至第一夹持平台20A。这种将基底提供至交替夹持平台的方法可对于超过两个(例如，3、4、5，或者超过5)平台实施，由此提高针对进一步评估制备的试样的生产量。
平台60A和60B通常由一种或者多种材料形成，这些材料对于在试样加工中使用的流体而言是相对化学惰性的并提供适合的表面张力。可用于形成平台60A和60B的示例性材料包括工程热塑性塑料，例如聚甲醛(例如，DuPont制造的)、高分子量氟碳化合物如聚四氟乙烯(PTFE)(例如，DuPont制造的)和金属如铝、钢和钛，条件是：将它们提供、制造和/或处理以提供适合的表面张力，其用于帮助均匀分布和限制加工流体至基底2和平台之间的空间，并同样允许加工流体的适当排出。通过选择适合的材料，平台也可有利地将在分布的流体中气泡或者空间的形成减少或者最小化，并同时维持足够的表面张力，使得在平台和基底2之间的间隔的流体泄露减少或者消除。
通常，平台60A和60B的表面面积可出于基底处理和流体递送的目的按需要选择。诸如平台60A和60B的表面面积的因素也可影响选择的基底2的表面面积。例如，在一些实施方案中，平台60A的表面面积(例如，面对基底2的平台60A的表面面积)稍小于面对平台60A的基底2的表面面积。通过在平台60A和基底2的相对表面的面积之间维持这种关系，可减少或者消除从表面之间的区域的流体泄露。通常，例如，面向基底2的基底60A的表面面积比基底2的表面面积小2％或者更多(例如，3％或者更多，5％或者更多，7％或者更多，10％或者更多，15％或者更多，20％或者更多，25％或者更多，30％或者更多)。
平台60A和60B可分别与模块80A和80B连接。模块80A包括支撑顶面85A的侧面81A-84A，如图8中所示。模块80A和80B可由与用于平台的材料相同或者相似的材料制成，包括金属、陶瓷和/或塑料。因此，诸如的材料可用于形成模块80A和80B，具体地，在实施试样的Romanowsky染色的实施方案中。可在实施方案中使用的其它材料包括金属和牌聚四氟乙烯涂覆的铝、钢，或者钛。
在一些实施方案中，平台60A和/或60B可升起，如图7-9中所示。可选择地，在某些实施方案中，平台60A和/或60B可分别与模块80A和80B的上表面齐平。在任一情况中，机器1的某些特征以及流体的表面张力和平台或者模块的表面能防止过量流体流过平台60A/60B和/或模块80A/80B的边缘。
如图7和8中所示，平台60A可包括偏置70A-70D以在平台60A和基底2的表面之间提供间隔，并防止基底2接触平台60A。平台60B可包括对应的一组偏置71A-71D。偏置可包括支架(standoffs)、销子(pins)、支柱(pegs)、杆、珠、壁，或者在平台60A和/或60B和基底2的表面之间提供间隔的其它机构。偏置70A-70D和71A-71D确保当基底2接触偏置时平台60A和60B和基底2的表面保持基本平行。维持这两个表面平行的益处是，由此限定在这两个表面之间包围的体积并可精确控制。如果两个表面不基本平行，以及在它们之间的角度改变，那么在它们之间的体积也改变并且不固定和不精确控制。另外，如果这两个表面不基本平行，那么流体不可均匀地施用至试样。
本申请使用的短语“基本平行”意味着，两个表面完全平行或者接近平行，使得当基底2接触偏置时，基底2的表面平坦度的瑕疵减少或者消除。例如，尽管在基底的制造中非常小心，但是某些基底可能具有瑕疵如扭曲和/或非共面角。在本申请公开的系统和方法中，通过在需要时改善基底2的表面平坦度，偏置的使用帮助校正这些瑕疵，从而在方法中使基底2与平台60A和60B基本平行。短语“基本平行”涵盖以下情况：其中两个表面不完全平坦，但是偏置全部具有相同尺寸或者高度，使得具有偏置的基底的表面的接触点至少在相同平面内。
图12A显示基底2、基底夹持器20B、模块80A、80B、平台60A、60B、偏置70A-70D和71A-71D和在基底2和平台60B之间的间隔92。间隔92允许流体在含有端口40B-45B的平台60B和基底2的表面之间行进。最佳试样固定、染色和漂洗所需要的间隔距离将取决于以下因素而改变：从端口40B-45B(和/或端口40A-45A)分配的流体的流速、端口直径、在加工期间施用的流体的粘度和从基底、间隔和平台移除流体可利用的吸力的量。
在一些实施方案中，例如，在平台60B和基底2的表面之间提供约100-200微米的间隔92的偏置使得在实施方案中包含血细胞的试样的固定、染色和漂洗能够从直径为500至1,500微米的端口40B-45B以约50至约300微升/秒的流速分配流体。通常，对于某些实施方案，间隔92的尺寸或者高度可为约50微米至1,000微米(例如，约50至500微米，约75至250微米，约100至200微米)，条件是：这种实施方案能够在试样加工期间分配和移除流体时克服间隔中的流体的表面张力。另外，在某些实施方案中，位于平台60A和/或60B上的端口的直径可为约125微米至5,000微米。
图12B和6C显示球接机构25，其可用于使基底夹持器20A与平台60A平行。球接机构25可包括牢固固定至基底夹持器20A的球元件25A、偏转元件25B(例如，弹簧)、牢固连接至基底臂10A的下插座25C、上插座25D、固定至下插座25C(例如，使用紧固件)的帽25E和固定螺丝25F。在一些实施方案中，在制造和/或装配机器1和基底夹持器20A和/或20B期间，可调节球接机构25以补偿由于公差叠加或者制造问题可能存在的任何错位。在一些实施方案中，为调节球接机构25，松开所述固定螺丝25F并将基底臂10A移动至关闭位置。由于固定螺丝25F松开，基底夹持器20A在夹持基底2时能够基本平行于平台60A，同时基底2沿着接触偏置70定位。可选择地，在一些实施方案中，在平台60上的偏置的数目可减少或者完全消除；可在装配或者校正机器1期间连同球接机构25临时使用厚度相当于希望的间隔距离的衬垫，以设置间隔92为用于试样加工的希望的距离。尽管球接机构25松开，但是偏转元件25B施加力以保持基底夹持器20A半固定至基底臂10A，使得它能够独立移动，但是它不过于松开和不自由移动，从而不干扰机器1的其它构件，或者不导致机器1的其它构件损坏。一旦基底2在关闭位置被压紧以使得基底2基本平行于平台60A，那么固定螺丝25F可拧紧以固定球接机构25。如图中所示，当拧紧时，固定螺丝25F在上插座25D上施加向下的力并由此经上插座25D向球元件25A的顶部施加摩擦力。由于下插座25C固定至帽25E，由固定螺丝25F产生的力也抬起下插座25C，使得下插座25C向球元件25A的底侧施加摩擦力，以约束球元件25A在上和下插座25C,25D内。一旦约束至球元件25A，那么基底夹持器20A变得固定至基底臂10A。
通常，一旦基底夹持器20A用固定螺丝25F定位并约束，那么在正常使用期间不需要再次调节球接机构25。然而，如果基底夹持器20A变得错位并因此球接机构25需要调节(例如，由于损坏、机器修理、性能差，或者其它原因)，那么可将固定螺丝25F松开，可将基底夹持器20A移动至关闭位置以定位，使得由基底夹持器20A夹持的基底基本平行于平台60A，然后可将固定螺丝25F紧固以固定球接机构25。
通常，可配置致动器30A和/或30B以调节基底臂10A和/或10B的位置，从而改变在平台60A和/或60B和基底2的表面之间的间隔的范围。改变这种间隔在允许调节分配至每一端口的流体、流速、流体粘度和来自平台60A和/或60B的排出力(evacuation forces)的实施方案中提供更大的灵活性。例如，当从平台60A施用的流体从端口直径为500微米至1,500微米的端口40A-45A以115微升/秒的流速分配时，100微米间隔92可提供足够的试样固定、染色和漂洗。可选择地，使用在平台60A和基底2的表面之间的约200微米的间隔92距离，可使用从端口40A-45A分配的流体的较高流速如140微升/秒以用于试样加工。
如上所公开，机器1可含有一系列端口和管道，用于分配和移除在试样加工期间施加的流体。以下讨论描述与平台60A相关的各个端口、管道和其它构件，但是类似的想法适用于平台60B和它的相关构件。图8显示图7中所示装置的全貌图，并详细显示平台60A上的端口40A-45A和与模块80A连接的管道50A-55A。管道52A-55A将包含一种或者多种固定剂、染色剂和漂洗溶液的某些流体分布穿过平台，进入间隔中，并到达基底上。如图8中所示，平台60A的顶面包括6个端口40A-45A，其与管道50A-55A连接。将流体通过一个或者多个泵驱动经过管道和端口到达基底2上。一个或者多个流体贮存器210A-213A(例如第一染色剂贮存器211A、第二染色剂贮存器212A、固定剂贮存器210A和漂洗溶液贮存器213A)，例如，如图10中所示，可将流体引导至平台60A和基底2上。图7-9中所示的端口40A-45A的直径为约500微米至1,500微米，不过在某些实施方案中直径也可较小或者较大。在一些实施方案中，真空端口40A和41A的直径超过流体端口42A-45A的直径的两倍。
端口40A-45A中的每个通常专注于特定流体或者真空源。可选择地，超过一个端口可用于每一流体或者真空源，或者来自各种流体和真空源的多个管道可与位于平台60A上的单一端口连接。例如，在一些实施方案中，在平台60A上仅一个端口可用于废物去除，但是当使用更粘的流体时，单一端口可能无法提供足够的吸力以从平台排出残留流体。因此，在某些实施方案中理想的是在平台上的不同位置提供两个抽吸端口(例如，在平台的每个末端有一个抽吸端口)，用于去除过量染色剂、固定剂和漂洗流体，如在图8中用端口40A-41A所示。进一步强调流体-对-端口构造的变化性，在某些实施方案中，平台60A上的单一端口可专注于特定染色剂，而在其它实施方案中，在试样加工期间使用多个端口以施用染色剂。实际上，涉及端口数目、端口位置和分配至每一端口和流体管道的流体的各种组合可在本发明的不同实施方案中使用。
端口40A-45A通常可按需要位于平台60A上，以提供向基底2的流体递送和从基底2的流体去除。通常，流体端口中的每个位于平台60A上，使得当加工试样时，端口的开口不直接与基底2上的试样3相邻或者位于基底2上的试样3下面。对于试样和染色剂的某些组合，例如，如果染色剂从直接与试样3的一部分相邻或者位于试样3的一部分下面的端口分配，那么与试样的其它部分的细胞相比，较大量的染色剂可施用至该部分(端口附近)的细胞。结果，接收较大量染色剂的细胞在试样图像中可显得较深，并且这种试样细胞的不均匀染色可将错误引入基于图像的诊断测量和分析结果中。因此，将染色剂递送至试样3的流体端口可与基底(例如，载玻片)的含试样区域隔开一定距离，以改善染色结果。
另外，位置彼此相对的端口对，例如，多个端口对的使用也可改善染色均匀性。例如，在一些实施方案中，使用两个端口将染色剂递送至试样3。两个端口可位于平台60A上，与试样3的边缘隔开一定距离(例如，偏置)，并在平行于平台60A的短边的方向上彼此相对。当染色剂从两个隔开的端口分配时，相对均匀数量的染色剂沉积于试样3的不同区域中的细胞上，并在试样图像中观察到改善的染色均匀性。
类似地，尽管端口40A-45A通常可按需要定位以使用一个或者多个真空源从基底2的表面除去过量流体，但是在一些实施方案中，用于流体去除的端口与平台60A上的直接在基底2上的试样3中的细胞下面的位置隔开一定距离。以此方式定位废物除去端口可减少当促使这种端口从基底2排出流体时，试样3的细胞无意地也卷入流体除去端口中的机会。在某些实施方案中，由于平台60A的长边和短边的长度差，废物除去端口与试样区域的边缘隔开并沿着平行于平台60A的长边的方向彼此相对设置。
机器1可包括或者连接至图10中所示的控制系统5，其提供机器1的另一透视图。控制系统5可包括一个或者多个计算机，每个计算机含有中央处理器，所述中央处理器能够执行存储在计算机可读介质如硬盘、光盘或者内存上的软件指令。另外，控制系统5可包括用于执行软件指令的电子电路。控制系统5可包括用户界面，其用于接收用户命令以控制机器1的操作。储存在计算机上或者向计算机提供的软件可包括程序，其控制在试样加工期间的机器1的构件的操作，例如流体泵和真空。例如，软件可包括使用说明书，其指导机器1将各种固定剂、染色剂和漂洗剂施用至试样和在试样加工期间实施数个搅动步骤。
另外，软件可包括默认设置，以及用户界面可含有定制特征，用于向用户提供改变这些默认设置的能力。例如，用户界面可含有定制特征，用于允许用户定制固定、染色和漂洗阶段的速度、频率或者次序，以及搅动参数(下面进一步描述)。控制系统5也可经网络协议(例如IPX，或者TCP/IP)通讯。例如，网络协议可使用电缆(例如双扭线电缆)和/或无线连接如WiFi。控制系统可使用网络协议连接至实验室信息系统。实验室信息系统可含有服务器和/或数据库，用于储存涉及在机器1上加工的试样的信息。例如，数据库可含有表格，其提供关于试样的人或者来源的信息(例如，名称、出生日期(DOB)、地址、采集试样的时间、性别等)、涉及试样加工的信息(加工日期##/##/####、试样编号#等)、试样的得到的任何图像的拷贝和通过分析图像得到的任何结果的拷贝。
图7还显示，机器1可包括支撑物110A和110B以将设备固定至系统或者实验室工作站中的特定位置。机器1还包括一个或者多个基底臂10A和10B，其各自在它们的基座处与致动器30A和30B连接。基底臂10A和10B的相对末端包括基底夹持器20A和20B，用于在试样加工期间接收和支持基底。每个基底夹持器20A和20B接收和支持基底2，同时机器1完成所有试样加工步骤(下述)。基底可为或者包括显微镜载玻片、盖玻片，或者适于在试样加工期间支持试样并在试样加工后显微镜检查的其它透明材料。图7的实施方案示出玻璃显微镜载玻片，基底2，其包括试样3。通过使用抽吸端口，基底夹持器20A,20B可在试样加工期间将基底2固定至基底臂10A,10B。抽吸管道23通过抽吸端口21A和21B，以及22A和22B(注意，端口21A和22A在图7中位于载玻片2后面，并以虚线示出)向基底夹持器20A和20B提供吸力。
在图7-9中示出的机器1实施方案为双基底机器，能够在基底臂10A和10B中的每个上支持和加工基底。为了加工，其它实施方案提供单一基底或者顺序地或者同时地提供三个或者较多个基底。此外，尽管在图7-12中示出的实施方案使用吸力使基底2附着于基底臂10A和10B，但是可选择的实施方案在试样加工期间使用各种类型的夹具、指状物，或者磁体(如果基底为磁化的)使基底2附着于基底臂10A。
在图11和24A-B中示出的实施方案中，机器1从自动基底移动器120或者手动地从个人接收携带试样3的基底2。作为实例，基底移动器120可为在站(例如，站121至站122至站123至站124和至站125)之间运输基底的设备。图11显示系统，其具有第一标签阅读站121、施用站122、包括机器1的染色站123、相机或者成像站124和第二标签阅读站125。第一标签阅读站121设置成阅读基底2的信息如条形码和/或“指纹”信息，其用于识别在第一标签阅读站121上的特定基底2和试样3。第二标签阅读站125以相同的方式起作用，以及它阅读的信息用于识别在站124处成像的试样3与被加工的基底相同。
基底移动器120可包括用于保持基底2的夹持器127和使得移动器120能够测定是否基底2安装在移动器120中的登记电路或者软件。在一个实施方案中，基底移动器120可包括液压缸，其用于将基底2从第一站121移动至第二站122。在试样加工后，基底移动器120可从染色站123移除经加工的基底并将基底2运输至其它站进行基底检查，例如显微镜或者站124。可选择地，在试样加工后个人可从机器1手动移除基底。
基底臂10A和10B可绕轴旋转，以使得基底能够从用于加载的打开位置移动至试样加工位置和在试样加工后返回至打开位置用于卸载。图13A显示流程图500，其包括用于将基底臂从打开位置移动至加工位置的一系列步骤。下面参照图13B(其显示机器1的示意图)进一步描述流程图500。
注意，将图7中的机器1设置成接收和检查两个基底。在下面的讨论和图中，可仅提及机器1中的一组构件(例如，基底夹持器20A、致动器30A、基底臂10A等)。然而，应理解的是，关于一组构件公开的相同步骤、特征和属性也可适用于机器1中的其它组的构件(例如，基底夹持器20B、致动器30B、基底臂10B等)。因此，尽管为了清楚和简洁本申请的讨论仅集中于一组构件，但是应理解的是，用于试样检查的机器如机器1可包括两组或者甚至超过两组构件，每组具有本申请讨论的一些或者所有特征。
返回图13A和13B，在流程图500的第一步骤502中，基底移动器120使基底2接触基底夹持器20A。在步骤504中，基底2以“试样向上(specimen up)”或者“打开”位置位于基底夹持器上。然后，在步骤506中，致动器30A旋转基底臂10A约180°(参见图13B)，以在平台60A正上方将基底2定位在“试样向下”或者“试样加工”或者“关闭”位置(步骤508)，使得基底2在步骤510中处于加工位置。
然后，在步骤512中，通过引导从贮存器210A、211A、212A和213A泵送的适合的流体(包含染色剂、漂洗流体和固定剂)通过端口42A、43A、44A和45A接触试样3，机器1染色位于基底2上的试样3。过量流体通过真空泵送经过端口40A和41A从试样3移除，并收集在废物收集器230和231中。
在步骤514中，在染色试样3后，致动器30A旋转基底臂10约180°(逆转步骤506的旋转)，以使基底返回至“试样向上”位置。最后，在步骤516中，基底移动器120从基底夹持器20A移除加工了的基底。也可使用其它打开或者“试样向上”位置，条件是操作者或者自动基底移动器可从机器1加载和卸载基底。例如，可将试样向上位置从试样加工位置旋转100°或者更大(例如，120°或者更大，130°或者更大，140°或者更大)。在一些实施方案中，可将试样向上位置从试样加工位置旋转少于100°(例如，少于90°，少于80°，少于70°)，条件是操作者或者基底移动器可从机器1加载和卸载基底。
致动器30A和/或30B可包括电动机、气动装置、磁力系统，或者其它部件(例如，蜗轮)，以移动臂10A和/或10B。当基底臂10A和10B如图7中所示处于打开位置时，夹持器20A和20B可各自接收基底2。一旦加载至基底夹持器20A或者20B上，那么致动器30A和/或30B旋转臂10A和/或10B，并由此将基底2从打开(“试样向上”)位置旋转至加工位置(“试样向下”，如在图9中对于臂10B所示)以用于施用固定、染色和漂洗(包括搅动步骤)，并在加工后返回至打开位置用于卸载。
参照图9A，致动器30B已经将基底臂10B从图1中所示的打开位置旋转至“关闭”或者加工位置。图9A显示，基底臂10B上的基底2已经从图7中所示的加载位置翻转和旋转约180°，达到朝下位置，其中基底2上的试样3基本平行于平台60B表面。如上面关于图13A所讨论，在基底2以所示的试样加工位置邻近平台60B时，机器1通过数个加工阶段将各种固定剂、染色剂和漂洗剂施用至基底2上的试样3，其将在下面更详细地描述。为从加工位置移除基底2，致动器30B旋转基底臂10B返回至图7(两个臂)和图9A(其中仅臂10A处于打开位置)中所示的打开位置。
在某些实施方案中，控制系统5可使用一个或者多个传感器105A和105B检测臂的位置，以检测指示臂101A和101B(如图7和9中所示)。传感器105A和105B可为使用例如红外光或者各种其它技术(激光、运动检测器等)的接近传感器(例如，光电传感器)，以检测臂的存在或者不存在。例如，接近传感器105A或者105B可具有检测领域，并且通过检测指示臂101A和/或101B，传感器可测定是否基底臂(例如，臂10A和/或10B)或者基底夹持器(例如，夹持器20A和/或20B)在检测领域内。控制系统5可从传感器接收信息，以测定基底臂10的位置。例如，当基底臂10B(在图9中未示出)旋转至加工位置时，在指示臂101B的近端上的接近传感器105B感觉到目标基底夹持器20B，并通知控制系统5基底臂10B旋转至试样加工位置。在此位置，在指示臂101B的远端上的接近传感器105B将不向控制系统5发送信号，因为传感器检测不到任何目标(例如，基底臂或者基底夹持器)。
当基底臂10B旋转至打开位置(如图7中所示)时，在指示臂101B的远端上的接近传感器105B感觉到目标基底夹持器20B，并通知控制系统5基底臂10B旋转至打开位置。换句话说，当基底臂10B从传感器105B旋转离开时，传感器向控制系统5发送“不存在”信号。当臂10B旋转至打开位置时，臂10B更接近传感器105B，并且传感器可向控制系统5发送“存在”信号。在可选构造中，传感器可安装在基底10B上并可检测指示臂101B的存在。在一些实施方案中，控制系统5可用于校正致动器30A和30B相对于已知打开位置和试样加工位置的位置和/或主动监测基底臂10A和10B的移动和位置，基于控制信号和/或从致动器30A和30B接收的反馈。
在图7中的基底臂10A和10B的结构和旋转轴可在本发明的其它实施方案中改变。图14A显示流程图600，其包括用于将基底臂从打开位置移动至加工位置的一系列可选步骤。下面参照图14B(其显示机器1的示意图)进一步描述流程图600。
在流程图600的步骤602中，基底移动器120将基底2以“试样向上”取向置于基底夹持器20A上。然后，在步骤604中，第一致动器30A在垂直于图14B的平面的平面内旋转基底2约180°，使得基底2仍然在平台60A上方以“试样向上”位置取向。在步骤606中，第二致动器35A接收以“试样向上”位置取向的基底2。然后，在步骤608中，第二致动器35A(例如，位于基底臂10A和基底夹持器20A之间)将基底2旋转至“试样向下”取向。第二致动器35A也可向着平台60A向下移动基底2，使得基底2接触偏置70A和70B。
接着，在基底2处于步骤610中的加工位置的情况下，通过如上面关于流程图500的步骤512所讨论施用染色剂、固定剂和漂洗溶液，机器1染色基底2上的试样3。在染色完成后，第二致动器35A将基底2从“试样向下”取向旋转至“试样向上”取向(步骤614)，然后第一致动器30A旋转基底2约180°(例如，在垂直于图14B的平面的平面内，逆转在步骤606中施用的旋转)，使得基底仍然以“试样向上”位置取向。最后，在步骤618中，基底移动器120从基底夹持器20A移除加工了的基底。
固定阶段
参见图10，可将流体管道52A-55A和52B-55B定位，以在试样加工期间将固定剂递送至平台60A和60B、间隔92、基底2和试样3。一个或者多个流体管道52-55A可连接至平台60A内的端口和相应的固定剂贮存器210A。流体管道也可包括与泵200A和/或阀的连接，其能够将固定剂从贮存器引导经过管道和位于平台上的端口，并到达基底和试样上。作为实例，泵200A可将固定溶液引导经过管道54A，离开模块80A，经过端口44A，到达平台60A上，进入在平台60A和基底2之间的间隔92，并到达含有试样3的基底2上。在将特定数量的固定溶液施用至基底2后，真空或者其它抽吸源220A和/或221A可从平台60A、间隔92和基底2排出残留固定溶液，经端口40A和/或41A中的一个或者多个，通过废物管道50A和51A进入废物容器230A和/或231A中。
图15显示流程图700，其包括将固定溶液施用至试样的一系列步骤。在步骤702中，泵(例如，泵200A)将固定溶液(例如，甲醇)从贮存器(例如，贮存器210A)引导进入固定溶液管道(例如，管道54A)中。在步骤704中，将固定溶液引导进入与模块80A连接的端口44A中。然后，在步骤706中，将固定溶液引导离开平台60A中的端口44A。在步骤708中，将固定溶液通过端口44A导出并进入在基底2和平台60A之间的间隔92中。最后，在步骤710中，将基底2上的试样3通过固定溶液固定。
在一些实施方案中，泵200A以约50μL或者更多(例如，75μL或者更多，100μL或者更多，150μL或者更多，200μL或者更多，或者250μL或者更多)和/或约300μL或者更少(例如，250μL或者更少，200μL或者更少，150μL或者更少，100μL或者更少，或者75μL或者更少)微升/秒的流速引导固定溶液通过管道54A和端口44A，到达平台60A上并进入间隔92中，历时约2(例如，3、4，或者5)秒。例如，流速可为约115μL/s(例如，约70μL/s、约100μL/s，或者约150μL/s)，历时约2秒(例如，3秒，或者4秒)。然后，真空或者其它抽吸源220A和/或221A使用端口40A和/或41A和废物管道50A和/或51A(下面进一步描述)移除存在于间隔92中和/或平台60A和基底2上的残留固定溶液。接下来，泵200A可再次以约50μL或者更多(例如，75μL或者更多，100μL或者更多，150μL或者更多，200μL或者更多，或者250μL或者更多)和/或约300μL或者更少(例如，250μL或者更少，200μL或者更少，150μL或者更少，100μL或者更少，或者75μL或者更少)微升/秒的流速引导固定溶液通过管道54A和端口44A，并到达平台60A上，历时约2(例如，3、4，或者5)秒。例如，流速可为约115μL/s(例如，约70μL/s、约100μL/s，或者约150μL/s)，历时约2秒(例如，3秒，或者4秒)。可将这种固定和排出的过程使用相同或者不同固定剂再次重复，取决于需要固定的试样类型。此外，机器1能够针对每一固定阶段改变频率和流速。也可使用足以克服位于间隔92中的流体中的任何表面张力的其它流速。通过调节固定阶段的频率和/或流速，使用数种不同的固定剂，机器1可实现针对不同试样的最佳固定。用于不同类型试样的机器指令可在控制单元5中嵌入固定或者预先程序化并由系统操作员按需要选择。
通常，在固定阶段中可将很多种固定剂施用至试样。例如，可使用85％甲醇作为固定剂。对于一些染色剂，可使用基于乙醇或者甲醛的固定剂。本申请公开的固定溶液的实施方案可用于制备用于检查的试样。
染色阶段
机器1也包括管道和端口，其设置成在一个或者多个染色阶段中将一种或者多种染料或者染色剂施用至固定至基底的试样。当在显微镜或者其它成像设备下观察或者成像时，染色试样提高试样的对比度。
图16为流程图800，其包括用于将染色剂施用至试样的一系列步骤。在步骤802中，泵(例如，泵201A)将染色溶液从贮存器(例如，贮存器211A)引导进入染色剂管道(例如，管道52A)中。在步骤804中，将染色溶液引导进入与模块80A连接的端口(例如，端口42A)中。接着，在步骤806中，染色溶液流出平台60A中的端口42A。在步骤808中，染色溶液流进在基底2和平台60A之间的间隔92中。最后，在步骤810中，将染色剂施用至基底2上的试样3。
在一些实施方案中，可使用多个管道和端口将染色剂施用至试样3。例如，第二泵(例如，泵202A)可将染色溶液(例如，与从贮存器211A分配的染色剂相同的染色剂或者不同的染色剂)从贮存器212A引导通过管道53A和端口43A并到达平台60A上。在某些实施方案中，可将两个或者更多个流体管道连接至共用的染色剂贮存器或者泵和/或阀，用于引导染色剂通过端口并到达平台上。返回参照图8，管道52A可将红色染色剂如曙红Y递送至平台、基底3和试样2。管道53A可递送蓝色染色剂，例如噻嗪染料(例如，天青B、亚甲蓝)。在图7-12中，选择在平台60A上的端口的数目、位置和尺寸，以将固定至基底的试样的染色剂的施用最佳化。如果选择其它染色剂，那么端口的不同数目、位置和尺寸可为优选的，取决于染色剂粘度。
端口40A-45A(和40B-45B)中的每个可包括用于接收流体的输入通道和用于输出流体的输出通道。在一些实施方案中，漂洗端口45A、固定端口44A和染色端口42A-43A的输出通道在平台60A的上表面上，以及真空端口40A和41A的输入通道可在平台60A的上表面的相对端上。漂洗端口45A、固定端口44A和染色端口42A-43A的输入通道可位于模块80A的相同侧面上，以及真空端口40A和41A的输出通道可位于模块80A的相对侧面上。
举例并参照图8和16，控制系统5指示步骤802中的泵(例如，泵201A)将第一染色溶液(例如，包含曙红Y的染色剂)从染色剂贮存器导入流体管道52A中。在步骤804中，第一染色溶液从流体管道进入端口42A。然后，在步骤806中，第一染色溶液离开端口42A，以及在步骤808中，第一染色溶液以约50μL或者更多(例如，75μL或者更多，100μL或者更多，150μL或者更多，200μL或者更多，或者250μL或者更多)和/或约300μL或者更少(例如，250μL或者更少，200μL或者更少，150μL或者更少，100μL或者更少，或者75μL或者更少)微升/秒的流速沉积在平台60A和基底2之间的间隔92中，历时约2(例如，3、4，或者5)秒。例如，流速可为约115μL/s(例如，约70μL/s、约100μL/s，或者约150μL/s)，历时约2秒(例如，3秒，或者4秒)。在步骤810中，将基底2上的试样3用第一染色溶液染色。在染色后，真空或者其它抽吸源(例如，泵220和/或221)可使用端口40A-41A和废物管道50A-51A排出存在于间隔92中，平台60A上和基底3上的残留第一染色溶液。
可将机器1程序化以在第一染色阶段后的延迟(例如，3秒-10秒的延迟，例如5秒延迟)后重复这些染色和排出阶段。可通过控制系统5指示第二泵202A以将第二染色溶液(包含噻嗪染料的溶液)从染色剂贮存器以约50μL或者更多(例如，75μL或者更多，100μL或者更多，150μL或者更多，200μL或者更多，或者250μL或者更多)和/或约300μL或者更少(例如，250μL或者更少，200μL或者更少，150μL或者更少，100μL或者更少，或者75μL或者更少)微升/秒的流速引导通过流体管道53A，离开端口43A，历时约2(例如，3、4，或者5)秒到达平台60A上。例如，流速可为约115μL/s(例如，约70μL/s、约100μL/s，或者约150μL/s)，历时约2秒(例如，3秒，或者4秒)。然后真空或者其它抽吸源(例如，泵220A和/或221)可使用端口40A-41A和废物管道50A-51A排出存在于间隔92中和/或平台60A上和/或基底2上的残留第二染色溶液。与固定阶段一样，机器1能够针对每一染色阶段改变频率和流速。流速可为例如50-300微升/秒，或者可小于或者大于该范围的外侧界限(例如，10-500微升/秒)，条件是流速足以克服存在于位于间隔92中的流体中的任何表面张力。
可施用至试样的示例性染色剂包括但不限于Wright-Giemsa染色剂、Giemsa染色剂和Romanowsky染色剂，包括本申请公开的第一和第二染色溶液的实施方案。也可将其它试剂如免疫细胞化学试剂或者其它特异性细胞组分标记物施用至试样。
废物流体去除
如上所述，真空或者其它抽吸源220和/或221可在固定和染色阶段期间或者在固定和染色阶段之间从基底2、间隔92和平台60A排出残留流体。参见图7，一个或者多个废物管道可与模块80A的侧面82A和84A连接。废物或者真空管道50A和51A用于将流体和小颗粒物质从平台60A、间隔92和基底2抽出，使其进入废物容器或者与机器1分离的其它场所。参见图8，废物管道51A和51B可在废物管道的远端与分离的真空源220和221以及废物容器230和231连接。可选择地，两个或者更多个废物管道可连接至单一真空源和相同废物容器，如图10中所示。废物管道50A和50B可分别通过夹管阀(pinch valves)90A和90B延伸。
真空源或者用于施加抽吸的其它源(例如，真空泵220和/或221)可与废物管道50A、50B、51A和51B中的一个或者多个连接，以将流体从平台60A和/或60B、间隔92和基底2抽入废物容器230和231中。当在基底2和平台之间的间隔为100至200微米时，为除去流体，在废物管道中施加的真空力可等于负1至负5磅/平方英寸(“psi”)，以提供足够的吸力。通常，本申请使用的“负”压力是指小于机器1中的环境压力或者机器1周围的环境压力的压力。例如，在一些实施方案中，机器1周围的环境的环境空气压力为约1个大气压。“负”压是指少于这种环境空气压力的压力(例如，施加至流体的-1psi压力是比施加在流体上的环境空气压力小1psi的压力)。可使用0.1psi至14psi，或者更大的其它真空，条件是这种真空足以克服存在于间隔中的流体中的任何表面张力。另外，在即将施加真空从间隔排出流体之前，致动器30A可将基底2的近边缘从试样加工位置提升15-35微米的距离。这种增加的在基底2和平台60之间的间隔可在真空期间改善间隔92中的任何残留流体的排出。
在一些实施方案中，将控制系统5设置成在试样加工期间改变针对流体去除所施加的频率和真空。图17A包括流程图900，其特征在于用于从基底除去过量流体的一系列步骤。在固定阶段后，例如，控制系统5可在步骤902中打开夹管阀90A和/或90C并在废物管道(例如，废物管道50A和51A)中施加5psi的真空，历时5秒。在此期间，将固定溶液通过端口40A和41A从间隔、基底和平台除去(步骤904)。流体在步骤906中通过废物管道行进，并在步骤908中沉积在一个或者多个废物容器(例如，容器230和/或231)中。一旦排出期结束，控制系统5可在步骤910中指示夹管阀90A,90C中的一个或者多个关闭废物管道50A和/或51A，由此防止真空220-221导致的进一步排出。控制系统5可在每个固定阶段后指导机器1重复这种流体去除步骤。
图17B包括流程图1000，其特征在于用于从基底除去过量流体的一系列可选步骤。在流程图1000中的方法不使用夹管阀密封废物管道。相反，在染色阶段后，将抽吸源220和/或221在步骤1002中初始化并在步骤1004中进入活动状态。在步骤1006中抽吸源在废物管道50A和/或51A中施加3psi的压力，历时4秒，以通过端口40A和41A从间隔92、基底2和平台60A除去染色剂。排出的流体在步骤1008中通过废物管道50A和/或51A行进，并在步骤1010中沉积在一个或者多个废物容器230,231中。机器1可在每个染色阶段后重复这种流体去除步骤。通过改变在流体去除步骤中施加的频率和压力，机器1可实现试样的最佳固定和染色。
夹管阀90A、90B、90C和90D关闭废物管道50A、50B、51A和51B，如图7中所示。夹管阀90A-90D可通过包括在阀中或者阀外的致动器机械地、电力地、液压地，或者气动地开动。夹管阀90A-90D用于阻止流体流过废物管道50A、50B、51A和51B。例如，当从机器1改变或者清空充满的废物容器230时，关闭夹管阀(90A-90D)可能是理想的，以防止存在于废物管道中的残留流体的泄露。不同阀类型或者其它机构如夹具或者塞子可用于机器1的实施方案，以关闭废物管道50A、50B、51A和51B。
漂洗阶段
漂洗溶液可在试样加工期间用机器1在一个或者多个漂洗阶段中施用。例如，在固定阶段之间、在染色阶段之间和/或在固定和染色阶段之间清洗基底2、间隔92和平台60A和/或60B可能是理想的。
图18包括流程图1100，其特征在于用于漂洗试样的一系列步骤。在步骤1102中，泵(例如，泵203A)将漂洗溶液(例如，包含蒸馏水)从贮存器(例如，贮存器213A)引导至漂洗管道(例如，漂洗管道55A)中。在步骤1104中，漂洗溶液进入与模块80A连接的端口45A。在步骤1106中，漂洗溶液通过端口45A的输出通道流至平台60A上，以及在步骤1108中，漂洗溶液进入基底2和平台60A之间的间隔92。在步骤1110中，实施试样3的漂洗。最后，在步骤1112中，真空源220,221向废物管道50A和51A中的一个或者多个施加吸力，以从间隔92和基底2除去漂洗溶液；将漂洗溶液运输至废物容器230和/或231。在一些实施方案中，前述步骤在第二漂洗阶段中重复。
在一些实施方案中，控制系统5可指导泵203A以约50μL或者更多(例如，75μL或者更多，100μL或者更多，150μL或者更多，200μL或者更多，或者250μL或者更多)和/或约300μL或者更少(例如，250μL或者更少，200μL或者更少，150μL或者更少，100μL或者更少，或者75μL或者更少)微升/秒的流速施用漂洗溶液，历时约2(例如，3、4，或者5)秒。例如，流速可为约115μL/s(例如，约70μL/s、约100μL/s，或者约150μL/s)，历时约2秒(例如，3秒，或者4秒)。与固定阶段一样，控制系统5可改变每个漂洗阶段的持续时间和流速和漂洗阶段的数目。另外，控制系统5可在试样加工期间调节一个或者多个漂洗阶段的布置。例如，控制系统5可指导，在结束所有固定阶段后漂洗阶段进行一次，以及，在结束所有染色阶段后第二漂洗阶段进行一次。可选择地，漂洗阶段可散置在两种或者更多种固定阶段之间或者在两种或者更多种染色阶段之间。
在一些实施方案中，染色操作可包括(1)固定阶段、(2)第二固定阶段、(3)使用第一染色溶液的第一染色阶段、(4)使用第二染色溶液的第二染色阶段、(5)漂洗阶段和(6)第二漂洗阶段。在一些实施方案中，多种(例如，第一和第二)染色阶段和/或溶液可以以任何次序使用和/或以任何次序重复。例如，第一和第二染色阶段和/或溶液可互换。每个阶段可包含约50μL或者更多(例如，75μL或者更多，100μL或者更多，150μL或者更多，200μL或者更多，或者250μL或者更多)和/或约300μL或者更少(例如，250μL或者更少，200μL或者更少，150μL或者更少，100μL或者更少，或者75μL或者更少)微升/秒的沉积流速，历时约2(例如，3、4，或者5)秒。例如，流速可为约115μL/s(例如，约70μL/s、约100μL/s，或者约150μL/s)，历时约2秒(例如，3秒，或者4秒)。
搅动阶段
在某些实施方案中试样加工可包括一个或者多个搅动阶段，以在固定、染色和/或漂洗阶段中在整个间隔92、基底2和平台60A和/或60B中分散固定溶液、染色溶液和/或漂洗溶液。图19包括流程图1200，其特征在于用于搅动试样的一系列步骤。图9中所示的致动器30A和/或30B可提供精细移动调节，用于改变基底2相对于平台60A和/或60B的位置。
控制系统5可包括用于指示致动器30A和/或30B开始搅动阶段的软件和/或硬件。致动器30A和/或30B可设置成通过来自控制系统的搅动开始命令来上下移动基底臂20A和/或20B。搅动阶段可重复预定数目的循环。本申请使用的术语“循环”是指从起始位置向上运动，接着与向上的方向相反地向下运动。在一些实施方案中，一个或者多个搅动循环在每个循环结束时，或者至少在一些循环结束时使基底2返回至起始位置。在某些实施方案中，基底2在一些或者所有搅动循环结束时不返回至起始位置，但是每个循环仍然包括向上运动和接下来的向下运动。致动器30A和/或30B通常在一个或者多个搅动循环中连续移动基底2，直到停止命令从控制系统5发送至致动器。搅动阶段可临时增加在基底2和平台60A和/或60B的表面之间的间隔尺寸(间隔距离)，然后使基底返回至试样加工位置。另外，搅动阶段可包括在相对于平台60A和/或60B的表面和试样加工位置的角位置之间移动基底2的一系列运动。当基底在搅动阶段中从试样加工位置移动时，在分配至平台和基底2之间的间隔中的流体中的表面张力导致流体分子在基底上的重新分配，并可有利地改善在整个试样中的流体分布。
在搅动阶段中，也可使用其它方法以相对于平台移动基底2。例如，在一些实施方案中，偏置70A-D和/或71A-D中的一个或者多个的位置(例如，在平台60A和/或60B的表面上方的偏置延伸量)可快速调节以搅动试样3。在某些实施方案中，可调节平台60A和/或60B的位置以导致试样3搅动。例如，平台60A和/或60B可交替地上下移动(例如，对应于上述基底2的移动方向)，以导致试样3搅动。
在一些实施方案中，当基底臂由可弯曲材料制成时，试样3的搅动可通过以下方法进行：改变致动器30A和/或30B朝向偏置70A-D和/或71A-D驱动基底2的程度，如下面讨论。通过检测在基底臂中作为时间函数的应变变化，应变计可用于测量和调节施加至基底2的搅动的频率。
参见图19，在第一步骤1202中，开始搅动阶段。在步骤1204中，控制系统5指示致动器30A开始搅动循环。响应于该指示，致动器30A在步骤1206中向上旋转基底2，从而增加在基底2和平台60A之间的距离。然后，在步骤1208中，致动器30A朝向平台60A向下旋转基底2，从而减少在基底和平台60A之间的距离。在决定步骤1210中，如果搅动阶段继续，那么控制返回至步骤1204并且再次在其它搅动循环中通过致动器30A旋转基底2。如果搅动阶段结束，那么控制从步骤1210传递至步骤1212，其中随着搅动结束，基底2返回至它的初始位置。
搅动阶段可包括通过致动器30A和/或30B施加的一个或者多个搅动循环。此外，搅动阶段可在固定溶液、染色溶液和/或漂洗阶段中的每个期间发生一次或者多次，并且在固定、染色和/或漂洗阶段中的每个之间频率可改变。例如，并参见图9，致动器30A和/或30B可将基底2的近边缘从试样加工位置垂直提高35微米的距离，随后使基底2返回至试样加工位置，历经三次，在每个固定、染色和漂洗阶段后一次。致动器30A和/或30B可在2秒内完成每个搅动循环(例如，1秒用于将基底2的近边缘从试样加工位置垂直提高35微米的距离，以及1秒用于使基底返回至试样加工位置)。机器1能够实施指示，以针对每个搅动循环和/或阶段改变搅动频率和距离。例如，搅动阶段可包括致动器30A和/或30B将基底2的近边缘从试样加工位置垂直提高5微米的距离，然后使基底返回至试样加工位置，10至20次/秒。
也可使用搅动距离和频率的可选组合。例如，在一些实施方案中，所述搅动距离为25微米或者更多(例如，50微米或者更多，100微米或者更多，150微米或者更多，200微米或者更多，250微米或者更多，300微米或者更多，500微米或者更多，700微米或者更多，1mm或者更多。例如，在某些实施方案中，搅动距离为35微米至350微米。
在一些实施方案中，所述搅动循环频率为1循环/秒或者更多(例如，2循环/秒或者更多，3循环/秒或者更多，4循环/秒或者更多，5循环/秒或者更多，7循环/秒或者更多，10循环/秒或者更多)。
也可使用另外的搅动技术。例如，在一些实施方案中，基底夹持器20A和/或20B可包括致动器，所述致动器围绕垂直于图7和9中所示的致动器30A和/或30B的旋转轴的轴旋转基底。
可选择地，平台60A和/或60B可配有偏置调节器，用于在固定、染色和漂洗阶段中提高或者降低一个或者多个偏置70A-D和/或71A-D。为执行偏置调节器，平台60A和/或60B可包括偏置，其与平台中的内板连接。板的高度可使用内部致动器改变，由此改变偏置的高度。可选择地，通过指示致动器移动平台60A和/或60B，或者模块80A和/或80B，偏置70A-D和71A-D相对于基底2的位置可变化，由此在搅动阶段中改变间隔距离。通过在试样制备过程中使用与常规染色和制备技术相比显著较小的流体体积，控制系统5可调节流体循环频率、流速、偏置高度、间隔距离，以及搅动参数和频率，以更有效地加工试样。
在一些实施方案中，基底臂可由可弯曲的材料制成，使得如果基底在试样加工位置仅倚靠从平台伸出的两个偏置，那么致动器或者其它推进力元件可朝向平台表面进一步旋转载玻片，直到载玻片倚靠所有四个偏置。改变基底在这两个位置之间的位置可在试样加工期间实现足够搅动。基底臂可包括应变计以监测基底臂中的应变，并可用于通知控制系统5基底相对于平台偏置的位置。另外，控制系统可包括对应于基底的厚度瑕疵的信息，当将基底置于试样加工位置中时或者在搅动阶段中控制系统可考虑该信息。
干燥阶段
在某些实施方案中，控制系统5可使用连接至机器1的干燥器4干燥试样。图20包括流程图1300，其特征在于干燥试样的一系列步骤。在起始步骤1302(其中核实染色和其它阶段(例如，一个或者多个漂洗阶段)的完成)后，在步骤1304中，干燥器4引导空气流过试样。干燥过程在步骤1306中继续，直到从控制单元接收停止干燥的信号。当接收信号时，干燥器停止经过试样的空气流并在步骤1308停止干燥阶段。
通常，可控制机器1以改变施加的空气流的空气温度、流速、持续时间和在试样加工期间用于干燥试样3的一个或者多个阶段。例如，在结束染色阶段后，干燥器4可引导空气流在约120°F以10升/分钟的速度经过试样，历时7秒。也可使用其它空气温度(例如，从环境温度至最高300°F)、空气流速(例如，1升/分钟至100升/分钟)和空气流动期限(例如，从数秒至数分钟)。
试样检查系统
本申请公开的自动试样制备机器和装置(包括机器1)通常可与较大试样检查系统一起使用和/或结合至较大试样检查系统中，例如在美国申请12/430,885和13/293,050中描述的较大试样检查系统，将其全部内容并入本申请作为参考。例如，图21显示示意图，其说明试样检查系统2000的一个可能的实施方案。系统2000包括平台2100、光接收设备2200、计算机2300、施用器2400、气体循环设备2500、光源2600、分配器2800、放电设备2900、载玻片贴标签机3000和载玻片标签阅读器3100。行进器2110可设置成接收一个或者多个载玻片或者其它基底2700。行进器2110可附着至平台的表面，例如顶表面2101。行进器2110可采取带的形式，以及系统可使用机械臂、重力、磁力、液压技术、齿轮，或者其它移动技术，以沿着平台的表面2101移动基底安装的试样。
平台2100也可包括进料器2102和收集器2106，其分别用于从堆叠或者架子进料基底2700(例如，载玻片)和将基底2700(例如，载玻片)收集至堆叠或者架子。进料器2102可配有进料器推进机构2103(例如经橡胶处理的轮)，用于将试样推至行进器2110上。可选择地，可使用机械臂抓住基底2700并将基底直接置于行进器上。可使用将基底推出进料器2102的备选机构，例如磁体或者液压装置。进料器可包括传感器，用于测定存在多少载玻片。传感器可测量例如基底2700的重量，以测定存在多少基底。收集器2106也可包括传感器，用于测定存在多少基底。在继续进行的基础上，传感器可设置成当分析了预定数目的试样时通知计算机2300和/或可通知计算机安装在基底上的试样的接收。
光接收设备2200可为显微镜(例如明视野显微镜)、摄像机、照相机，或者其它接收光的光学设备。包括标准明视野显微镜的实施方案也可包括自动阶段(例如，基底移动器2201)和自动对焦。在一些实施方案中，显微镜可与机动化阶段和对焦马达附件连接。显微镜可具有机动化管嘴，以允许在计算机2300的控制下选择不同放大倍率镜头。可使用滤光轮，以使得计算机2300能够自动选择光路中的窄带滤色片。LED照明可替代滤器，以及与滤光轮旋转所需要的时间相比，LED的使用可减少图像采集时间。例如，可使用1600x 1200像素(IEEE1394High Performance Serial Bus)相机获得窄带图像。
在一些实施方案中，光接收设备2200接收从基底2700反射的光并储存一个或者多个由反射光形成的图像。可替换地或者另外地，在一些实施方案中，从基底上的试样的荧光发射可通过光接收设备2200检测。
在某些实施方案中，光接收设备2200设置成得到基底上的试样的传输图像。例如，光发射源2600可位于平台下面并且可引导光，使得它通过平台2100和基底2700进入光接收设备2200。
光接收设备2200和图21中示出的任何其它构件可通过连接(2011-2014)与计算机2300连接，其可向构件提供能量，提供从计算机2300至构件的指令和/或允许构件向计算机2300发送信息。连接2011-2014可为有线连接或者无线连接。
光接收设备2200能够进行X、Y和Z轴移动(在其它实施方案中，机动化阶段或者基底移动器2201可提供X、Y和Z移动)。光接收设备2200可包括盘(pan)、斜面(tilt)和/或推动力致动器(locomotive actuators)，以使得计算机2300能够将光接收设备2200定位在适当位置。光接收设备2200可包括聚焦入射光的透镜2210。
可选择光接收设备2200，以捕获黑和白和/或彩色图像。在一些实施方案中，可使用两种或者更多种光接收设备，以分割与捕获图像相关的加工时间。例如，低倍率成像站可在高倍率成像站前面。类似地，在一些实施方案中，系统2000、平台2100、计算机2300和/或光接收设备2200可引导基底移动器2201移动基底2700，以确保在基底上或者在基底的特定部分上全部或者大部分细胞的一个或者多个图像的捕获和储存。
计算机2300可为手提式电脑、服务器、工作站，或者任何其它类型的计算设备。计算机可包括处理器、显示器2320、接口2310和内部存储器和/或磁盘驱动器。计算机2300也可包括软件，其储存在存储器中或者在计算机可读的有形介质如光驱上。软件可包括指令，用于导致计算机操作光接收设备2200、施用器2400、气体循环设备2500、平台2100、行进器2110、光源2600、分配器2450和/或2800、试样制备机器1，或者在这些构件之一中或者与这些构件之一连接的任何构件。类似地，计算机设置成从任何这些构件接收信息。
例如，软件可控制基底从进料器2102的分散速率，以及进料器2102可通知计算机存在的基底的数目。另外，计算机2300也可负责实施由光接收设备2200捕获的图像的分析。通过分析过程，可设置和控制计算机，以计算在特定体积的血液中特定类型的细胞的数目，例如对于血液，红细胞、白细胞和血小板数以及全血细胞计数的其它测量的和导出的组分，例如：可计算血红蛋白含量、红细胞形态，或者白细胞计数差异。图像分析软件可分析每个单独的视野并将总的红细胞和白细胞数加和。为计算每微升患者血液样品的总数，在载玻片上计数的数目可乘以稀释比率和次级样品的体积。来自载玻片的红血细胞和白血细胞的计数、形态学测量和图像的结果可在显示器2320上示出。
在一些实施方案中，计算机2300设置成显示数值数据、细胞群直方图、散点图和使用在监视器上显示的血细胞图像的细胞形态的直接评估。显示细胞形态的能力提供系统2000的使用者快速确定细胞形态的异常存在或者不存在的能力，其可保证制备另外的载玻片用于由有经验的技术人员或者其它专业人员人工审核。软件也可向计算机提供指令以显示从光接收设备接收的图像2331或者可导致显示器2330显示图像分析的结果2332(例如，也许在表或者图中)。类似地，可控制计算机2300以列举在特定血液体积中的特定类型的细胞的数目或者列举在特定体积的血液中的受损细胞、癌细胞，或者溶解的细胞的数目。软件使得计算机能够实施分析过程。计算机在分析期间可使用一个或者多个倍率。
尽管显示为一个构件，但是计算机2300可包括多个计算机；第一计算机可用于控制系统2000的构件，以及第二计算机可用于加工来自光接收设备2200的图像。多个计算机可连接在一起以允许计算机共享信息。计算机2300也可连接至网络或者实验室信息系统，以允许计算机向其它计算机发送和接收信息。
在某些实施方案中，施用器2400可包括注射器、手动或者电动驱动的移液器，或者通过管道连接至吸管端的电机控制的泵。施用器2400以受控的方式将试样施加至基底2700。使用施用器2400的示例性特征、属性和方法例如在美国专利申请US 2009/0269799中公开。试样可包括一种或者多种血液组分、细胞、组织，或者其它生物组分。
一旦试样施用至基底2700，那么使用机器1加工施用的试样。如本申请所述，机器1用于将一种或者多种染色溶液、固定溶液和/或其它溶液施用至基底上的试样。
在一些实施方案中，系统2000可设置成通过从施用器2400的尖端放下细胞的非接触行，在基底2700上沉积的细胞之间实现最小重叠。增加经稀释的流体的粘度或者稀释剂的类型或者量可影响来自施用器的试样流的最终沉降位置的宽度。通过选择行间距离以允许血液样品的典型变化，所有细胞可在所有样品中计数。
气体移动设备2500(其可为图21中所示的独立设备，或者可如上所述结合至机器1中)可包括扇子和/或可包括其它气体移动设备如压缩机或者风箱。气体移动设备2500可直接连接至计算机2300或者可通过其它构件如平台2100或者施用器2400连接。气体移动设备推动气体(在一些情况中，大气)经过基底，以控制基底上的物质的干燥速度。由于快速干燥，太快地移动太多空气(即，太高的扇子速度)经过基底可导致试样中的细胞破裂，以及太慢地移动太少空气(即，太低的扇子速度)经过基底可导致细胞太慢地干燥和看起来皱缩。
基于气体移动设备与基底的距离、分析的流体的类型、流的宽度、气体(例如，空气)的温度和流的平均厚度，计算机2300可选择和控制在一段时间内移动经过基底的空气量(即，立方英尺或者立方厘米的空气/秒)。可定位气体移动设备2500，使得设备引导空气，使得气体以30°-60°(例如，45°)的角度冲击基底，历时约15至20秒。在一些实施方案中，计算机2300可将湿度和温度设定控制在系统附近，以允许在不使用气体移动设备2500的情况下发生干燥过程。
光发射设备2600及其各种构件在美国专利申请US 2009/0269799中通过实施例描述。光的各种波长可通过光发射设备2600产生和通过光接收设备2200检测。例如，波长如415nm用于得到血红蛋白专用影像，用于评估RBC形态和血红蛋白含量。在600nm发射的光可用于提供血小板和细胞核的高对比度图像。可选择其它波长，以最好地区别嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞(全部蓝色色调)、嗜酸性粒细胞(红色)和嗜中性粒细胞(中性色)的颜色。
实施例
本公开通过以下实施例进一步描述，其不意图限制权利要求引用的本发明的范围。
实施例1
图22为流程图1400，其显示用于加工安装在基底上的试样的一系列示例性步骤。流程图1400中的步骤可用于制备用于检查的试样。尽管这种方法的描述有时是指具有具体范围的具体步骤或者公开了在具体序列中发生的步骤，但是这种描述意图仅说明一种实例方法。参考图22，机器1连接至控制系统5，控制系统5用于在加工步骤中指挥各种机器构件的操作。在试样开始步骤中，将来自血液等分试样的包含红细胞、白细胞和血小板的试样3施用至由玻璃显微镜载玻片组成的基底2。这可使用不同的站如在共同待决的美国专利申请2008/0102006中描述的一个或者多个站实施。在定位步骤1402中，将含有试样3的基底2加载至基底臂10A的基底夹持器20A上，如图7中所示。控制系统5指导抽吸源222(步骤1404)从基底夹持器20A排出空气。在试样加工期间通过抽吸端口21和22(步骤1406)施加的吸力使基底2附着于基底夹持器20A。控制系统5指导(步骤1408)致动器30A将基底3从图7中所示的打开位置旋转至图9A中所示的试样加工位置。在试样加工位置中，试样3面对平台60A的表面，而基底2倚靠图8中所示的偏置70A-D。偏置防止基底2接触平台60A的表面。在这种示例性方法中，在基底2的含有试样的表面和平台60A的表面之间的间隔92为约100微米或者200微米(例如，200微米)。
在第一固定阶段(步骤1412，也参见图15)中，在步骤1414中泵将固定溶液施用至试样3。与图8中所示的流体管道54A连接的泵200A将包含甲醇的固定溶液从固定剂贮存器210推动通过管道54A，离开端口44A，到达平台60A上，到达基底2上，并进入平台60A和基底2之间的间隔92中。泵200A从端口44A以115微升/秒的流速推动固定溶液，历时2秒时段T1，由此将总共230微升固定溶液V1引导至基底2上。
接着，在第一搅动步骤1416中，控制系统5通过以下方法搅动基底：指导致动器30A(步骤1418)将基底2的近边缘从试样加工位置垂直提高35微米的距离并使试样返回至它的试样加工位置。机器1再重复这种搅动步骤4次。机器1在约10秒(T2)内完成五次搅动运动，如图23中所示。在搅动后，控制系统开始真空步骤1420。将–0.10psi的真空力施加1.5秒(T3)，从而经端口40A和41A和废物管道50A和51A排出存在于间隔中、平台上或者基底上的任何残留固定溶液(步骤1422)。将排出的固定溶液收集在废物容器230和/或231中。
然后，在包括第二搅动步骤的第二固定阶段中，重复第一固定阶段和第一搅动步骤的前述步骤。
在固定阶段后，控制系统5开始(步骤1424)第一染色阶段。其中，控制系统5指导机器1染色试样(步骤1426)。参考图8和图16的流程图，与流体管道52A连接的泵201推动包含曙红Y的第一染色溶液从染色剂贮存器211A离开端口42A，到达平台60A上，到达基底2上，并进入平台60A和基底2之间的间隔92中。泵201通过端口42A以115微升/秒的流速分配第一染色溶液，历时2秒时段(T4)，由此将230微升第一染色溶液V2引导至基底上。
在将第一染色溶液施加至试样3后，机器1通过以下方法实施第二搅动步骤1428：指导致动器30A在步骤1430中将基底2的近边缘从试样加工位置垂直提高35微米的距离，然后使试样返回至试样加工位置。控制系统5导致机器1将这种搅动步骤再重复2次，并完成三次搅动，历时约6秒(T5)，如图23中所示。
接着，第二真空阶段在步骤1432中开始。在步骤1434中施加5psi的真空，历时3秒(T6)，以经端口40A和/或41A和废物管道50A和51A排出存在于间隔92中或者在平台和基底上的任何残留第一染色溶液。排出的第一染色溶液收集在废物容器230A和/或231A中。
在用包含曙红Y的第一染色溶液染色试样后，机器1在步骤1436中使用包含天青B和亚甲蓝的第二染色溶液开始第二染色阶段。与流体管道53A连接的泵202将第二染色溶液从染色剂贮存器推动经过端口43A，到达平台60A上，到达基底2上，并进入平台60A和基底2之间的间隔92中(步骤1438)。机器1通过端口43A以115微升/秒的流速分配第二染色溶液，历时2秒时段(T7)，由此将总共230微升第二染色溶液V3引导至基底上。
在将染色剂施用至试样3后，机器1通过以下方法在步骤1440中开始第三搅动阶段：指导致动器30A将基底2的近边缘(步骤1442)从试样加工位置提高35微米的距离，然后使试样3返回至它的试样加工位置。机器1再重复这种搅动步骤三次。机器完成四次搅动运动，历经约8秒的时段(T8)。
然后开始第三真空步骤1444。施加5psi的真空，历时2秒(T9)，以在搅动后在步骤1446中经端口40A和/或41A和废物管道50A和/或51A排出存在于间隔中或者在平台60A和基底2上的残留第二染色溶液。将排出的第二染色溶液收集在废物容器230A和/或231A中。
然后机器1实施两个漂洗-搅动-真空阶段序列。第一阶段序列在步骤1448当控制系统5指示机器1开始第一漂洗阶段时开始。使含有漂洗溶液的贮存器213A与泵203和流体管道55A连接。泵203引导漂洗溶液通过洗涤管道55A，进入端口45A中，进入间隔92中，并到达平台60A和基底2上，以在步骤1450中漂洗试样3。可选择地，在一些实施方案中，将漂洗溶液引导通过流体端口42A-45A中的两个或者更多个。泵203引导漂洗溶液以115微升/秒的流速离开端口45A，历时2秒(T10)，由此将总共230微升(V4)水引导至基底上。
接着，控制系统5在步骤1452中开始第四搅动阶段，从而指导致动器30A(步骤1454)将基底2的近边缘从试样加工位置垂直提高5微米的距离，并使试样返回至它的试样加工位置。控制系统5可指导机器1重复这种搅动阶段，并在约4秒(T11)内完成两次搅动。
然后，真空阶段在步骤1456中开始。在步骤1458中施加5psi的真空，历时5.5秒(T12)，在搅动后经端口40A和/或41A和废物管道50A和/或51A排出存在于间隔92中或者在平台60A和基底2上的残留漂洗溶液。
然后，在步骤1460中，控制系统5指导机器1通过开始第二漂洗阶段来开始第二漂洗-搅动-真空阶段序列。第二漂洗阶段(步骤1460,1462)、第五搅动阶段(步骤1464,1466)和第五真空阶段(步骤1468,1470)如上面对于第一漂洗-搅动-真空阶段所公开以相同方式实施。在第二漂洗-搅动-真空阶段中，漂洗溶液V5的量，以及加工时间T13、T14和T15通常与在第一漂洗-搅动-真空阶段序列中相同。
在将试样固定、用包含曙红Y的第一染色溶液和包含天青B和亚甲蓝的第二染色溶液染色和漂洗后，机器1在步骤1472中开始干燥阶段。干燥器4以10升/分钟的流速引导约120°的空气流(步骤1474)经过试样，历时8秒时段(T16)。
在完成这些步骤后，在步骤1476中使基底2返回至它的起始位置。在此步骤中，致动器30A将基底2从试样加工位置旋转至打开位置，如图7中所示。然后可将基底2通过基底移动器移除，并可加载新的基底以加工新的试样。
如在上述示例性试样加工步骤中所说明和在图23中所示，与包括自动和手动试样制备技术的常规试样加工方法相比，本申请公开的系统和方法通过消耗较少试剂提供更有效的试样加工。参见图23，例如，对于在示例性加工步骤中固定、染色和漂洗试样，机器1消耗少于1.5毫升试剂(例如，460微升固定溶液+230微升第一染色溶液+230微升第二染色溶液+460微升漂洗溶液＝1380微升试剂)。在一些实施方案中，多于或者少于1380微升流体可在试样加工期间使用。例如，在加工试样中使用的流体量可为约1150微升(例如，通过消除漂洗阶段中的一个)。
上述流体体积通常涉及在基底和平台之间的约100微米的间距。当在基底和平台之间的间距较大时，在试样加工期间通常消耗较大流体体积。例如，当间距为约200微米时，消耗的流体的总体积需要超过1380微升。
更一般地，消耗的流体的总体积可为500微升或者更多(例如，520微升或者更多，540微升或者更多，560微升或者更多，580微升或者更多，600微升或者更多，650微升或者更多，700微升或者更多，750微升或者更多)和/或2mL或者更少(例如，1.5mL或者更少，1.4mL或者更少，1.3mL或者更少，1.2mL或者更少，1.1mL或者更少，1.0mL或者更少，900微升或者更少)。
再次参见图23，试样制备过程在稍超过1分钟内完成(例如，在每个固定阶段中13.5秒流逝，固定总共流逝27秒+在第一染色阶段中流逝11秒+在第二染色阶段中流逝12秒+在漂洗阶段中流逝23秒+在干燥阶段中流逝8秒＝总共流逝时间81秒)。在某些实施方案中，试样制备可在多于或者少于81秒内完成。例如，试样加工可在180秒或者更少时间(例如，150秒或者更少时间，120秒或者更少时间，90秒或者更少时间，80秒或者更少时间，70秒或者更少时间，60秒或者更少时间，50秒或者更少时间，或者40秒或者更少时间)内完成。
此外，尽管前述示例性方法描述了单一试样的加工时间，但是用于加工多个基底的系统和方法(例如，图7中的机器1，其设置成加工两个基底和/或设置成加工三个或者较多基底的系统)能够每小时加工超过100个试样(例如，每小时60个试样至120个试样)。与常规自动系统和手动试样制备技术相比，以实验室设置使用本申请公开的系统和方法可导致基于每个试样较快的生产能力，同时流体(例如，固定、染色和漂洗流体)的消耗减少。
实施例2
上面对于实施例1所述的加工步骤可在下面的本发明其它实施方案中调节。另外，本申请所述的固定、染色和漂洗溶液制剂可在下面的实施例加工步骤中使用。
在第一固定阶段(步骤1412，也参见图22)中，在步骤1414中泵将固定溶液施用至试样3。图8中所示的与流体管道54A连接的泵200A将包含甲醇的固定溶液从固定剂贮存器210推动通过管道54A，离开端口44A，到达平台60A上，到达基底2上，并进入平台60A和基底2之间的间隔92中。泵200A从端口44A以115微升/秒的流速推动固定溶液，历时2秒时段(T1)，由此将总共230微升固定溶液(V1)引导至基底2上。
接着，在第一搅动步骤1416中，控制系统5通过以下方法搅动基底：指导致动器30A(步骤1418)将基底2的近边缘从试样加工位置垂直提高35微米的距离并使试样返回至它的试样加工位置。机器1再重复这种搅动步骤五次。在约12秒内机器1完成六次搅动运动。在搅动后，控制系统开始真空步骤1420。施加-6psi的真空力，历时1.5秒(T3)，从而经端口40A和41A和废物管道50A和51A排出存在于间隔中、平台上或者基底上的任何残留固定溶液(步骤1422)。排出的固定溶液收集在废物容器230和/或231中。
然后，在包括第二搅动步骤的第二固定阶段中，重复第一固定阶段和第一搅动步骤的前述步骤。
在固定阶段后，控制系统5开始(步骤1424)第一染色阶段。其中，控制系统5指导机器1染色试样(步骤1426)。参考图8和图16的流程图，与流体管道52A连接的泵201推动包含曙红Y的第一染色溶液从染色剂贮存器211A离开端口42A，到达平台60A上，到达包含试样3的基底2上，并进入平台60A和基底2之间的间隔92中。泵201通过端口42A以115微升/秒的流速分配第一染色溶液，历时2秒时段(T4)，由此将230微升第一染色溶液V2引导至基底上。
在将第一染色溶液施加至试样3后，机器1通过以下方法实施第二搅动步骤1428：指导致动器30A在步骤1430中将基底2的近边缘从试样加工位置垂直提高35微米的距离，然后使试样返回至试样加工位置。控制系统5导致机器1将这种搅动步骤再重复2次，并完成三次搅动，历时约6秒(T5)，如图23中所示。
接着，第二真空阶段在步骤1432中开始。在步骤1434中施加-5psi的真空，历时3秒(T6)，以经端口40A和/或41A和废物管道50A和51A排出存在于间隔92中或者在平台和基底上的任何残留第一染色溶液。排出的第一染色溶液收集在废物容器230A和/或231A中。
在用包含曙红Y的第一染色溶液染色试样后，机器1在步骤1436中使用包含天青B和亚甲蓝的第二染色溶液开始第二染色阶段。与流体管道53A连接的泵202将第二染色溶液从染色剂贮存器推动经过端口43A，到达平台60A上，到达基底2上，并进入平台60A和基底2之间的间隔92中(步骤1438)。机器1通过端口43A以115微升/秒的流速分配第二染色溶液，历时2秒时段(T7)，由此将总共230微升第二染色溶液V3引导至基底上。
在将染色剂施用至试样3后，机器1通过以下方法在步骤1440中开始第三搅动阶段：指导致动器30A将基底2的近边缘(步骤1442)从试样加工位置提高35微米的距离，然后使试样3返回至它的试样加工位置。机器1再重复这种搅动步骤2次。机器完成3次搅动运动，历经约6秒的时段(T8)。
然后开始第三真空步骤1444。施加-6psi的真空，历时2秒(T9)，以在搅动后在步骤1446中经端口40A和/或41A和废物管道50A和/或51A排出存在于间隔中或者在平台60A和基底2上的残留第二染色溶液。将排出的第二染色溶液收集在废物容器230A和/或231A中。
然后机器1实施两个漂洗-搅动-真空阶段序列。第一阶段序列在步骤1448当控制系统5指示机器1开始第一漂洗阶段时开始。使含有漂洗溶液的贮存器213A与泵203和流体管道55A连接。泵203引导漂洗溶液通过洗涤管道55A，进入端口45A中，进入间隔92中，并到达平台60A和基底2上，以在步骤1450中漂洗试样3。可选择地，在一些实施方案中，将漂洗溶液引导通过流体端口42A-45A中的两个或者更多个。泵203引导漂洗溶液以115微升/秒的流速离开端口45A，历时2秒(T10)，由此将总共230微升(V4)水引导至基底上。
接着，控制系统5在步骤1452中开始第四搅动阶段，从而指导致动器30A(步骤1454)将基底2的近边缘从试样加工位置垂直提高35微米的距离，并使试样返回至它的试样加工位置。然后控制系统5指导机器1再重复这种搅动阶段3次，并在约8秒(T11)内完成4次搅动。
然后，真空阶段在步骤1456中开始。在步骤1458中施加5psi的真空，历时5.5秒(T12)，在搅动后经端口40A和/或41A和废物管道50A和/或51A排出存在于间隔92中或者在平台60A和基底2上的残留漂洗溶液。
然后，在步骤1460中，控制系统5指导机器1通过开始第二漂洗阶段来开始第二漂洗-搅动-真空阶段序列。第二漂洗阶段(步骤1460,1462)、在约12秒内完成的包含6次搅动的第五搅动阶段和第五真空阶段(步骤1468,1470)如上面对于第一漂洗-搅动-真空阶段所公开以相同方式实施。在第二漂洗-搅动-真空阶段中，漂洗溶液V5的量，以及加工时间T13、T14和T15通常与在第一漂洗-搅动-真空阶段序列中相同。另外，在即将开始真空阶段之前，致动器30A将基底2的近边缘从试样加工位置提高15-35微米的距离。这种增加的在基底2和平台60之间的间隔改善在最终真空阶段中在间隔92中任何残留流体的排出。
在将试样固定、用含有曙红Y的第一染色溶液和含有天青B和亚甲蓝的第二染色溶液染色，并漂洗后，机器1在步骤1472中开始干燥阶段。干燥器4以10升/分钟的流速引导约120°的空气流(步骤1474)经过试样，历时8秒时段(T16)。
在完成这些步骤后，在步骤1476中使基底2返回至它的起始位置。在此步骤中，致动器30A将基底2从试样加工位置旋转至打开位置，如图7中所示。然后可将基底2通过基底移动器移除，并可加载新的基底以加工新的试样。
如在上述实施例试样加工步骤中所说明，与包括自动和手动试样制备技术的常规试样加工方法相比，本申请公开的系统和方法通过消耗较少试剂提供更有效的试样加工。参见实施例2，对于在示例性加工步骤中固定、染色和漂洗试样，机器1消耗少于1.5毫升试剂(例如，460微升固定溶液+230微升第一染色溶液+230微升第二染色溶液+460微升漂洗溶液＝1380微升试剂)。在一些实施方案中，多于或者少于1380微升流体可在试样加工期间使用。例如，在加工试样中使用的流体量可为约1150微升(例如，通过消除漂洗阶段中的一个)或者少于1,000微升(例如，通过进一步消除固定阶段中的一个)。
关于图23，对于实施例1，机器1消耗少于1毫升试剂用于在示例性加工步骤中固定、染色和漂洗试样(例如，140微升甲醇固定剂+140微升荧光素染料+140微升噻嗪染料+280微升漂洗溶液＝700微升试剂)。在一些实施方案中，在试样加工中可使用多于或者少于700微升流体。例如，在加工试样中使用的流体量可为约560微升(例如，通过消除漂洗阶段中的一个)。
通常，消耗的流体总体积可为500微升或者更多(例如，520微升或者更多，540微升或者更多，560微升或者更多，580微升或者更多，600微升或者更多，650微升或者更多，700微升或者更多，750微升或者更多)和/或2mL或者更少(例如，1.5mL或者更少，1.4mL或者更少，1.3mL或者更少，1.2mL或者更少，1.1mL或者更少，1.0mL或者更少，900微升或者更少)。
参见图23和实施例1，试样制备方法在稍超过1分钟内完成(例如，在固定阶段中流逝13.5秒+在荧光素染料阶段中流逝11秒+在噻嗪染料阶段中流逝12秒+在漂洗阶段中流逝23秒+在干燥阶段中流逝8秒＝总共流逝时间67.5秒)。在某些实施方案中，试样制备可在多于67.5秒(如在实施例2中一样)，或者少于67.5秒内完成。例如，试样加工可在180秒或者更少时间(例如，150秒或者更少时间，120秒或者更少时间，90秒或者更少时间，80秒或者更少时间，70秒或者更少时间，60秒或者更少时间，50秒或者更少时间，或者40秒或者更少时间)内完成。
此外，尽管前述示例性方法描述了单一试样的加工时间，但是用于加工多个基底的系统和方法(例如，图7中的机器1，其设置成加工两个基底和/或设置成加工三个或者较多基底的系统)能够每小时加工超过100个试样(例如，每小时60个试样至120个试样)。与常规自动系统和手动试样制备技术相比，以实验室设置使用本申请公开的系统和方法可导致基于每个试样较快的生产能力，同时流体(例如，固定、染色和漂洗流体)的消耗减少。
实施例3
对于表1中的系列实验中的每个，使用例如在美国公开US20090269799中描述的样品制备技术制备血液样品。然后将样品通过固定、染色和漂洗大体上根据实施例1加工，以及对于固定溶液、染色溶液和漂洗溶液中的每个，流速为115μL/s，历时2秒。对于下面列举的每组实验，从至少5个血液样品制备基底(例如，显微镜载玻片)。接着，手动评估经加工的样品，并在显微镜下使用至少10X放大倍率评价样品染色和制备的质量(例如，染色的总体均匀性、颜色、细胞特征的区别、在背景中存在/不存在碎片等)。实施手动评估以相对于对照试样的染色和样品制备质量比较样品试样的染色和样品制备质量。通常使用"滚动对照条件(rolling control condition)"，其中使用提供最佳染色和样品制备的在先制剂作为对照，用于相对于不同制剂比较新的调节。因此(除非在下面另有说明)，在表1中任何给出的行通常表示在下面的行中总结的系列实验的对照条件。对于有限数目的样品和在人工审核后，样品在成像器上如US20090269799中所述加工，以测试制剂如何影响成像器的将存在于样品中的五种类型的WBC分类的能力。这些结果在表2中报告。
表1.制剂评估实验.
表2中列出的WBC分类结果比较了美国公开US20090269799(将其全部内容并入本申请作为参考)中所述的自动机器WBC分类结果和样品中的WBC的手动分类。百分数反映与样品中的WBC的人工审核和分类相比自动机器分类准确度。对于三个实验(2-1、2-2和2-3)中的每个，将使用当时最新的固定剂和染色溶液制备的最少10个样品在系统上加工并与每个样品中的WBC的人工审核相比。每个人工审核由在样品中的至少100个WBC上实施的WBC区分组成。
表2.白细胞(“WBC”)分类结果.
| 2-1 | 2-2 | 2-3 | |
| WBC细胞类型 | |||
| 淋巴细胞 | 60.3％ | 93.7％ | 97.2％ |
| 单核细胞 | 83.3％ | 88.2％ | 94.3％ |
| 嗜中性粒细胞 | 89.2％ | 97.6％ | 99.1％ |
| 嗜碱性粒细胞 | NA | NA | 100.0％ |
| 嗜酸性粒细胞 | 83.7％ | 94.9％ | 99.0％ |
实施例4.
许多市售血液学固定和染色产品在本申请所述的系统中测试；这种产品通常不适于与本申请所述的细胞鉴别、计数和分类系统一起使用。例如，将用这些产品实现的染色深度与用本申请所述制剂实现的染色深度相比。通常，测试的产品不像本申请所述制剂一样产生最佳样品制备结果(例如，不深色地或者均匀地染色样品)。例如，与本申请所述制剂相比，市售产品产生浅染色的核和细胞质。
其它实施方案
应理解的是，尽管结合详细描述描述了本发明，但是前面的描述意在示例说明而不限制本公开的范围，其由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修饰在所附权利要求的范围内。
将本申请提及的所有参考文献如专利申请、公开和专利的全部内容并入本申请作为参考。
Claims (21)
1.细胞学固定溶液，其包含：
细胞学染料；
表面活性剂；
缓冲剂；
有机溶剂；和
选自乙二醇、丙二醇、聚乙二醇和它们的任何组合的试剂。
2.权利要求1的细胞学固定溶液，其中所述细胞学染料以0.5至5g/L的量存在。
3.权利要求1的细胞学固定溶液，其中所述表面活性剂按体积计以0.05％至0.5％的量存在。
4.权利要求1的细胞学固定溶液，其中所述表面活性剂按体积计以0.05％至0.3％的量存在。
5.权利要求1的细胞学固定溶液，其中所述表面活性剂选自非离子的、阳离子的、阴离子的和两性离子的表面活性剂。
6.权利要求5的细胞学固定溶液，其中所述非离子的表面活性剂为聚山梨酯20。
7.权利要求6的细胞学固定溶液，其中聚山梨酯20以0.5mL/L至5.0mL/L的量存在。
8.权利要求1的细胞学固定溶液，其中所述缓冲剂选自bis-tris、磷酸盐、HEPES、MES、Tris和它们的任何组合。
9.权利要求8的细胞学固定溶液，其中所述溶液在水中的1:10稀释液具有6至8的pH且HEPES以0.5mM至10mM的量存在。
10.权利要求8的细胞学固定溶液，其中所述溶液在水中的1:10稀释液具有6.7至7.3的pH且HEPES以0.5mM至10mM的量存在。
11.权利要求1的细胞学固定溶液，其中所述试剂为乙二醇。
12.权利要求11的细胞学固定溶液，其中乙二醇按体积计以0.5至5％的量存在。
13.权利要求1的细胞学固定溶液，其中
所述固定溶液在水中的1:1000稀释液在640至650nm的峰值波长具有0.1至1的UV吸光度。
14.权利要求1的细胞学固定溶液，其中所述表面活性剂是非离子的。
15.权利要求1的细胞学固定溶液，其中所述细胞学染料为天青B。
16.权利要求1的细胞学固定溶液，其中所述细胞学染料为亚甲蓝、曙红或荧光素衍生物。
17.权利要求1的细胞学固定溶液，其中所述有机溶剂为醇。
18.权利要求17的细胞学固定溶液，其中所述醇为甲醇、乙醇或异丙醇。
19.权利要求1的细胞学固定溶液，其中所述有机溶剂为丙酮或乙醚。
20.细胞学固定溶液，其包含：
细胞学染料，其量为0.5g/L至5.0g/L；
0.5mL/L至5.0mL/L聚山梨酯20；
5mL/L至50mL/L乙二醇；
0.10g/L至10g/L HEPES钠盐；和
醇。
21.权利要求20的细胞学固定溶液，其中所述细胞学染料为天青B。
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