CN107400634B - 一种抑菌棉片及其在食用菌菌种组织分离或纯化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑菌棉片及其在食用菌菌种组织分离或纯化中的应用，其是将小孔径海绵剪切成直径6 mm、厚1 mm的圆形海绵片，经灭菌后在海绵片中滴加含链霉素、庆大霉素及卡那霉素的无菌抗生素溶液，常温晾干，制得每片含200μg链霉素、100μg庆大霉素以及100μg卡那霉素的抑菌棉片，然后将其用于食用菌菌种的组织分离或食用菌母种的纯化。本发明可极大的提高食用菌菌种组织分离及纯化的成功率，具有极大的应用推广价值。

Description

一种抑菌棉片及其在食用菌菌种组织分离或纯化中的应用

技术领域

本发明属于食用菌及生物技术领域，具体涉及一种抑菌棉片及其在食用菌菌种组织分离或纯化中的应用。

背景技术

食用菌是一类具有极高营养和药用价值的大型真菌，广泛分布于不同自然生境。由于野生食用菌产量极其有限，不能满足人们对食用菌不断增长的需求。因此，食用菌人工栽培已成为一种必然要求。目前食用菌栽培主要利用农业、林业、食品业等生产中所产生的废弃物，如木屑、棉籽壳、甘蔗渣、稻草、麦秆、酒渣、茶渣等作为主要栽培原料，并添加麸皮等有机氮源。由于这些原料来源广泛，价格低，且均为可再生原料，因此食用菌栽培属可持续发展产业。此外，食用菌栽培过程可实现废弃物的再利用，还可减少其对环境的破坏作用，因此，食用菌栽培不仅具有重要的经济效益且具有良好的社会效益，具有巨大的发展空间。

食用菌菌种是食用菌栽培的基础。食用菌菌种分离主要有组织分离法、基质分离法以及孢子分离法，其中以组织分离法应用最为普遍，已广泛应用于野生食用菌菌种的分离以及优良菌种的选育。组织分离法是以食用菌子实体内部少量组织作为接种物进行培养，实现菌种分离的目的，但由于食用菌组织通常有不同程度的细菌污染，易导致菌种分离失败。因此，食用菌组织分离时为防止细菌污染，通常在培养基中添加单一抗生素如青霉素、链霉素等，以抑制污染细菌生长。但抗生素不耐热，通常须在融化的培养基温度降至约60-70℃时加入，因此使制备过程更为繁琐。此外，培养基中含较高浓度的抗生素也可能对食用菌的生长造成影响。

另外，食用菌菌种（包括母种、原种及栽培种）的制备、操作及培养过程中极易发生细菌污染，尤其是生产中广泛使用的食用菌母种，其在转管操作和保藏过程中易发生细菌污染，因此，食用菌工作者通常需要对所污染菌种进行纯化操作，以提高菌种纯度。但目前大多数菌种纯化操作步骤繁琐，成功率低。因此，针对食用菌菌种组织分离和纯化过程中存在的问题，有必要开发一种使用方便、能有效抑制污染细菌且不影响食用菌生长的方法，以改进食用菌菌种组织分离和纯化步骤，大幅提高菌种分离和纯化的成功率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抑菌棉片及其在食用菌菌种组织分离或纯化中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种抑菌棉片，其是将孔径为120 ppi的小孔径海绵剪切成直径6mm、厚1mm的圆形海绵片，将其灭菌后，在其中滴加含链霉素、庆大霉素及卡那霉素的无菌抗生素溶液，常温晾干制得；每片绵片中含链霉素200 μg、庆大霉素100 μg、卡那霉素100 μg。

所述抑菌棉片在食用菌菌种组织分离中的应用方法为，在食用菌菌种组织分离时，将抑菌棉片放置于斜面培养基表面（其表面残留水分应尽可能少），将黄豆粒大小的食用菌子实体内部组织块置于距抑菌棉片边缘3-5mm处的培养基上，然后恒温进行培养，待菌落长至直径6cm大小时，用接种钩挑取菌落边缘含培养基的尖端菌丝进行转管培养，即获得组织分离种。

所述抑菌棉片在食用菌菌种纯化中的应用方法为，在食用菌母种纯化时，挑取绿豆粒大小的细菌污染母种至斜面培养基表面（其表面残留水分应尽可能少），在距其3-5mm处放置抑菌棉片，然后恒温培养至菌落直径为3-5cm时，再进行转管培养，即获得纯化的母种。

本发明的有益效果在于：

（1）本发明提供的抑菌棉片中所含的抗生素在培养基中有扩散作用，可抑制污染细菌的生长，且在斜面培养基上，随距离的增加，抗生素浓度下降，对食用菌菌丝体的生长基本无影响。

（2）本发明含复合抗生素的抑菌棉片具有使用方便、成本低、可一次大量制备等优点，使食用菌菌种组织分离及纯化时无须反复制备含有抗生素的培养基，从而显著提高工作效率。

（3）采用本发明含复合抗生素的抑菌棉片进行食用菌菌种组织分离和纯化时，可有效提高组织分离和纯化的成功率，具有极大的推广应用前景。

具体实施方式

本发明提供了一种抑菌棉片及其在食用菌菌种组织分离或纯化中的应用，下面实施例来进一步描述本发明的使用方法，但这些实施例仅是规范性的，并不对本发明的范围构成任何限制。此外，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换仍在本发明保护范围。

实施例1 抑菌棉片的制备

1. 将孔径为120ppi的小孔径海绵剪切成直径6mm、厚1mm的圆形海绵片；

2. 将所得圆形海绵片灭菌后，在其中滴加过滤法制备的含链霉素、庆大霉素及卡那霉素的无菌抗生素溶液，常温晾干，即得抑菌棉片。

所得每片抑菌绵片中含链霉素200 μg、庆大霉素100 μg、卡那霉素100 μg。

实施例2 秀珍菇的组织分离

1. 将新鲜采收的秀珍菇子实体表面用75%的乙醇擦拭消毒；

2. 将消毒后的秀珍菇子实体、酒精灯、解剖刀、接种钩、新鲜空白斜面培养基等所需器具放置在超净工作台中，紫外照射灭菌30 min；

3. 紫外消毒后，在超净工作台中用75%的乙醇擦拭双手消毒；

4. 将秀珍菇子实体沿菌柄对半掰开，露出菌盖中间的菌肉，朝上放置；

5. 用无菌的锋利小刀切取黄豆粒大小的菌肉接种至空白斜面培养基上；

6. 将实施例1所得抑菌棉片放置于菌肉近边缘，距菌肉不超过5 mm，然后25℃恒温培养；

7. 培养约7 d至菌落直径为6cm大小后，用接种钩取菌落边缘含培养基的尖端菌丝转接至空白斜面培养基上，培养后即为秀珍菇组织分离菌株；其分离成功率在70%以上。

实施例3 糙皮侧耳的组织分离

1. 将新鲜采收的糙皮侧耳子实体表面用75%的乙醇擦拭消毒；

2. 将消毒后的糙皮侧耳子实体、酒精灯、解剖刀、接种钩、新鲜空白斜面培养基等所需器具放置在超净工作台中，紫外照射灭菌30 min；

3. 紫外消毒后，在超净工作台中用75%的乙醇擦拭双手消毒；

4. 将糙皮侧耳子实体沿菌柄对半掰开，露出菌盖中间的菌肉，朝上放置；

5. 用无菌锋利小刀切取黄豆粒大小的菌肉接种至空白斜面培养基上；

6. 将实施例1所得抑菌棉片放置于菌肉近边缘，距菌肉不超过5 mm，然后25℃恒温培养；

7. 培养约7 d至菌落直径为6cm大小后，用接种钩取菌落边缘含培养基的尖端菌丝转接至空白斜面培养基上，培养后即为糙皮侧耳组织分离菌株；其分离成功率在90%以上。

实施例4 野生食用菌花脸香蘑的组织分离

1. 将新鲜采收的花脸香蘑子实体表面用75%的乙醇擦拭消毒；

2. 将消毒后的花脸香蘑子实体、酒精灯、解剖刀、接种钩、新鲜空白斜面培养基等所需器具放置在超净工作台中，紫外照射灭菌30 min；

3. 紫外消毒后，在超净工作台中用75%的乙醇擦拭双手消毒；

4. 将花脸香蘑子实体沿菌柄对半掰开，露出菌盖中间的菌肉，朝上放置；

5. 用无菌的锋利小刀切取黄豆粒大小的菌肉接种至空白斜面培养基上；

6. 将实施例1所得抑菌棉片放置于菌肉近边缘，距菌肉不超过5 mm，然后25℃恒温培养；

7. 培养约7 d至菌落直径为6cm大小后，用接种钩取菌落边缘含培养基的尖端菌丝转接至空白斜面培养基上，培养后即为花脸香蘑组织分离菌株；其分离成功率在70%以上。

实施例5 灵芝母种的纯化

1. 将细菌污染的灵芝母种、酒精灯、接种钩、新鲜空白斜面培养基等所需使用的器具放置于超净工作台中，紫外照射灭菌30 min；

2. 紫外消毒后，在超净工作台中75%乙醇擦拭双手消毒；

3. 在火焰附近用灼烧后冷却的接种钩将实施例1所得抑菌棉片放置于斜面培养基约中间位置；

4. 用接种钩切取绿豆粒大小的细菌污染的灵芝母种（琼脂块）放置于抑菌棉片近边缘，距其不超过5 mm；

5. 接种后的斜面于25℃下进行培养；

6. 待菌丝生长至直接约3-5 cm时，用接种钩将含培养基的尖端菌丝转接至空白斜面培养基上，培养后即为纯化的灵芝菌种；其纯化成功率近100%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (2)

1. 一种抑菌棉片在食用菌菌种纯化中的应用，其特征在于：所述抑菌棉片直径6mm、厚1mm，其中含链霉素200 μg、庆大霉素100 μg、卡那霉素100 μg；

在食用菌母种纯化时，挑取绿豆粒大小的细菌污染母种至斜面培养基表面，在距其3-5mm处放置抑菌棉片，然后恒温培养至菌落直径为3-5cm时，再进行转管培养，即获得纯化的母种。

2.根据权利要求1所述抑菌棉片在食用菌菌种纯化中的应用，其特征在于：所述抑菌棉片的制备方法为：将小孔径海绵剪切成圆形海绵片，经灭菌后在其中滴加含链霉素、庆大霉素及卡那霉素的无菌抗生素溶液，常温晾干，即得；

所用海绵的孔径为120ppi。