CN107385105A - 与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记、引物及应用 - Google Patents

与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记、引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学技术领域，具体公开了一种与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记，所述分子标记为MRI325，位于谷子第7条染色体17265937bp至17288536bp区间内。本发明还公开了上述分子标记的扩增引物以及应用。本发明公开的分子标记可以对谷子颖壳颜色进行良好分型，可以用于谷子颖壳颜色性状的分子标记辅助育种，对于加快谷子品种的遗传选育和改良进程具有重要的理论和实践指导意义。

Description

与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记、引物及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记、引物及应用。
背景技术
我国是谷子的原产地和世界上栽培面积最大、产量最高的国家，产量约占全世界总量的80％。同时，我国也是谷子遗传资源数量最多、多样性最丰富的国家，谷子在国内外享有米中"营养之王"的美誉，被列为"保健食品"。谷子籽粒主要由颖壳和颖果两部分构成，颖壳和种皮的颜色是谷子品种的标志性状，其颜色构成主要是类黄酮类物质。而类黄酮类物质具有抗氧化性功能，对人类在食品加工和医疗保健中的重要性也愈来愈明显。因此发掘谷子颖壳颜色基因对深入认识谷子的营养价值具有重要意义。
InDel(insertion-deletion)，插入缺失标记，指在近缘种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失，即一个序列上某一位点相比同源的另一个序列插入或缺失了一个或多个碱基。InDel标记基于PCR扩增技术，本质上属于长度多态性标记。InDel标记因其稳定性好、多态性高、分型系统简单，开始应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种等领域。
因此，开展谷子性状InDel标记的开发，利用与某些功能基因或QTL间的连锁关系，可以将功能基因或QTL定位在染色体上，并建立辅助选育体系，对于提高谷子品质，节约育种成本具有重要意义。然而现有技术并未发现基于上述技术的与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记。
发明内容
本发明提供的一种与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记、引物及应用，可准确判定谷子材料的颖壳颜色性状，可以对谷子颖壳颜色进行良好分型。
本发明的第一个目的是提供一种与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记，所述分子标记为MRI325，位于谷子第7条染色体17265937bp至17288536bp区间内。
本发明的第二个目的是提供一种获得上述与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记的引物，MRI325的引物为MRI325F和MRI325R，其中引物序列如下：
MRI325F：5’-ACCCTGGTAAACTCATGCCT-3’
MRI325R：5’-TGGGTTTGGAGCATCAGGAT-3’。
本发明的第三个目的是提供一种应用上述与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记鉴定谷子颖壳颜色的方法，包括以下步骤：
S1，提取待检测谷子材料的基因组DNA；
S2，PCR扩增：
a.反应体系：10μL体系，各组分物质的含量分别为:1μL基因组DNA、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、1μL 10×Buffer、0.8μL dNTPs、0.1μL Taq酶、ddH2O 6.1μL，混匀；
其中，上游引物为MRI325F、下游引物为MRI325R；
b.PCR反应程序：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，运行35个循环；最后72℃延伸10min；
S3，电泳
扩增后的产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶，120V电压，电泳1.5h。
S4，结果判定
如果扩增后的产物片段大小为151bp，则待测谷子材料的谷子颖壳颜色为黄色，如果扩增后的产物片段大小为189bp，则待测谷子材料的谷子颖壳颜色为白色。
本发明的第四个目的是提供一种与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记在谷子颖壳颜色早期鉴定或者分子筛选育种中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记的引物在谷子颖壳颜色早期鉴定或者分子筛选育种中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种鉴定谷子颖壳颜色的方法在谷子颖壳颜色早期鉴定或者分子筛选育种中的应用。
与现有技术相比，本发明的一种与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记、引物及应用，具有以下有益效果：
本发明设计的特异性引物可以对谷子颖壳颜色进行良好分型。本发明提供的谷子颖壳颜色性状分子标记可以用于谷子颖壳颜色性状的分子标记辅助育种，用于谷子颖壳颜色的早期鉴定，对于加快谷子品种的遗传选育和改良进程具有重要的理论和实践指导意义。
本发明的目的是定位谷子颖壳颜色相关QTL，根据序列信息开发鉴定谷子颖壳颜色的特异性标记，通过该分子标记可以预测谷子颖壳颜色，为实现谷子颖壳颜色性状的早期鉴定和筛选育种提供分子辅助技术支持。
附图说明
图1是MRI325序列比对结果；
图2是MRI325在双亲和部分F2群体中的电泳图片；
其中，A泳道表示母本矮宁黄，J泳道表示父本晋谷21，1-20泳道表示20个不同的F2群体样本。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。下面实例中未注明具体条件的实验方法，均按照本领域的常规方法和条件进行。
本发明提供的一种与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记，所述分子标记为MRI325，位于谷子第7条染色体17265937bp至17288536bp区间内，其中MRI325在母本矮宁黄中的序列如SEQ ID NO.1所示，在父本晋谷21中的序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例1：分子标记MRI325的获得方法
选择以农家种矮宁黄，颖壳颜色为黄色为母本；晋谷21，颖壳颜色为白色为父本，杂交后鉴定F1，单株F1自交获得543个F2分离群体。采用穴播方式，将F2种植于山西农科院谷子研究所试验田，行长6m，行距0.33m，株距15cm，双亲各1行，田间试验中的栽培管理措施同当地大田管理一致。苗期对亲本和543个F2单株进行取样。成熟收获后对各个F2单株进行颖壳颜色调查，使用Microsoft Excel 2010进行数据统计分析。
利用RAD-seq方法，对亲本和543个F2单株基因组DNA并进行DNA质量检测，对合格的DNA进行酶切，电泳回收的DNA片段，并加上接头进行cluster制备，最后上机测序。对545个样本(其中543个F2、2个亲本)进行酶切建库测序，得到88.33Gb原始数据，平均每个个体162.08Mb。将测序序列比对到参考基因组上，平均比对率89.77％，平均覆盖率6.92％，平均测序深度为4.55X。
通过测序和信息分析，获得亲本间有多态的48790个SNP标记。根据窗口滑动的方法，选取15个SNP为一个窗口每次滑动一个位点，获得每个个体的基因型和交换位点。最后生成bin基因型和bin图。利用bin基因型数据，用JoinMap软件构建bin遗传图谱，
利用所构建的谷子高密度遗传图谱，采用WinQTLCart2.5的复合区间作图分析(CIM)，对谷子颖壳颜色性状表型进行QTL分析，以LOD≥2.5为阈值判断QTL位点，最后得到颖壳颜色QTL的物理区间17265937-17288536，该QTL解释表型变异率为18.5％。
利用Phytozome网站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)对颖壳颜色QTL物理区间进行基因注释，下载Seita.7G069000基因的基因组序列，对双亲进行克隆测序。根据测序结果设计了引物MRI325F/MRI325R分别以提取的父本和母本的基因组DNA为模板，利用引物MRI325F/MRI325R对父本和母本的基因组DNA进行扩增。MRI325为Indel标记，在晋谷21中有38bp插入(图1)，在双亲中的扩增大小分别为151bp(矮宁黄)和189bp(晋谷21)。具体地，分别以提取的父本和母本的基因组DNA为模板，利用引物MRI325F/MRI325对父本和母本的基因组DNA进行扩增，其中引物序列如下：
上游引物MRI325F：5’-ACCCTGGTAAACTCATGCCT-3’，如SEQ ID NO.3所示；
下游引物MRI325R：5’-TGGGTTTGGAGCATCAGGAT-3’，如SEQ ID NO.4所示；
其中，PCR反应体系如表1所示。
表1 PCR反应体系
PCR反应程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，运行35个循环；最后72℃延伸10min。
实施例2：谷子F2群体建库测序
实施例1中获得的谷子F2群体的建库方法如下：
(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mL 1.5×CTAB，研磨成匀浆转入15mL的离心管中，然后往研钵中加入1mL 1.5×CTAB冲洗再转入离心管中。混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。
其中1.5×CTAB配方如下(1L)：CTAB 15g、1mol/L的Tris.Cl(pH为8.0)75mL、0.5mol/L的EDTA 30mL、NaCl 61.4g，加去离子水定容至1L，使用前加入终浓度为0.2％(2ml)的巯基乙醇。
(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1，v/v)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。
(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15mL离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。
(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入50μL TE溶解DNA。
(5)检测DNA的浓度，并用水调整为20ng/μL。
(6)采用EcoR I酶进行酶切，打断基因组DNA，酶切体系如表2所示。
表2 EcoR I酶切体系
(7)进行连接反应，连接反应的体系如表3所示。
表3 连接反应体系
(8)每个样品各取1μL反应产物，加入在一个新的离心管中，总体积12μL。每12个样品一组。
(9)用3％回收胶电泳1h，EB染色后切取300-700bp大小片段。用QIAquick Kit进行胶纯化回收，回收产物溶于30μL EB solution。
(10)进行PCR反应，PCR反应体系如表4所示。
表4 PCR反应体系
PCR反应程序如下：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，运行10个循环；最后72℃延伸3min。
(11)磁珠纯化，完成建库。具体纯化方法为：
首先PCR后加入1.2倍体积磁珠，静置10min。然后，置于磁力架上吸附，去除上清。然后，加入500μL 70％酒精洗涤两次。之后，干热仪上蒸干后，加入15μL EB溶解，5min。最后，磁力架上吸附，转移上清于1.5ml离心管中。
(12)检测达到上机标准后上机测序。
实施例3：基因组DNA的提取
针对实施例1中获得的谷子F2群体，用CTAB法分别提取父母本及F2群体单株的基因组DNA，具体方法如下：
(1)称取1.0g新鲜叶片，剪碎放入研钵，用液氮研磨后加入3mL 1.5×CTAB，研磨成匀浆转入15mL的离心管中，然后往研钵中加入1mL 1.5×CTAB冲洗再转入离心管中。混匀后于65℃水浴30min，期间不时缓慢摇匀。
其中1.5×CTAB配方如下(1L)：CTAB 15g、1mol/L的Tris.Cl(pH为8.0)75mL、0.5mol/L的EDTA 30mL、NaCl 61.4g，加去离子水定容至1L，使用前加入终浓度为0.2％(2ml)的巯基乙醇。
(2)待冷却至室温，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1，v/v)，轻轻混匀，至下层液变为深绿色。
(3)4200rpm离心10min，将上层水相移到新的15mL离心管，加2倍体积预冷的无水乙醇，混合静止5min。于-20℃放置30min沉淀DNA。
(4)4200rpm离心10min，弃掉上清，加入1mL 75％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管干燥DNA，加入200μL TE溶解DNA。
(5)用0.8％的琼脂糖凝胶检测基因组DNA，将得到的父母本及F2群体单株的基因组DNA存于-20℃备用。
实施例4：一种应用与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记鉴定谷子颖壳颜色的方法，所述应用的方法包括以下步骤：
S1，按照实施例3的方法提取待检测谷子材料的基因组DNA；
S2，PCR扩增：
a.反应体系：10μL体系，各组分物质的含量分别为:1μL基因组DNA、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、1μL 10×Buffer、0.8μL dNTPs、0.1μL Taq酶、ddH2O6.1μL，混匀；
其中，上游引物为MRI325F、下游引物为MRI325R；
b.PCR反应程序：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，运行35个循环；最后72℃延伸10min；
S3，电泳
扩增后的产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶，120V电压，电泳1.5h。
S4，结果判定
如果扩增后的产物检测到有片段大小为151bp的条带，则待测谷子材料的谷子颖壳颜色与母本矮宁黄相同为黄色；如果扩增后的产物检测到有片段大小为189bp的条带，则待测谷子材料的谷子颖壳颜色与父本晋谷21相同为白色。
通过本发明提供的与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记可以检测谷子杂交后代是否含有该基因，可预测谷子颖壳颜色，大大提高谷子的选择效率，加快品质育种进程。
我们利用该方法对亲本矮宁黄、晋谷21以及F2群体的20个样本分别进行检测，结果如图2所示：A泳道表示母本矮宁黄，扩增片段大小为151bp，颖壳颜色为黄色；J泳道表示父本晋谷21，扩增片段大小为189bp,颖壳颜色为白色；1-20泳道表示20个不同的F2群体样本，F2群体中单株扩增片段大小为151bp，颖壳颜色为黄色；单株扩增片段大小为189bp,颖壳颜色为白色；其中，如果单株151bp和189bp两个扩增片段都有的颖壳颜色为白色。
需要说明的是，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<120> 与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记、引物及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 151
<212> DNA
<213> 谷子
<400> 1
accctggtaa actcatgcct tgttgattaa ctacttgtta attacattta gatgctagtg 60
ttctcgtgga tacctgtaca gcgttttttg tggtaacttt tggaaaacat tattacaaca 120
ggtgatggtc gatcctgatg ctccaaaccc a 151
<210> 2
<211> 189
<212> DNA
<213> 谷子
<400> 2
accctggtaa actcatgcct tgttgattaa ctacttgcta attacattta gatgctagtg 60
ttctcgtgga tacctgtact ttgttatggt tgatatatat atatttgttt aatttacagc 120
gttgtttgtg gtaacttttg gaaaacatta ttacaacagg tgatggtcga tcctgatgct 180
ccaaaccca 189
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
accctggtaa actcatgcct 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgggtttgga gcatcaggat 20

Claims (6)

1.一种与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记为MRI325，位于谷子第7条染色体17265937bp至17288536bp区间内。
2.一种获得权利要求1所述的与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记的引物，其特征在于，MRI325的引物为MRI325F和MRI325R，其中引物序列如下：
MRI325F：5’-ACCCTGGTAAACTCATGCCT-3’
MRI325R：5’-TGGGTTTGGAGCATCAGGAT-3’。
3.一种应用权利要求1所述的与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记鉴定谷子颖壳颜色的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，提取待检测谷子材料的基因组DNA；
S2，PCR扩增：
a.反应体系：10μL体系，各组分物质的含量分别为:1μL基因组DNA、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、1μL 10×Buffer、0.8μL dNTPs、0.1μL Taq酶、ddH2O 6.1μL，混匀；
其中，上游引物为MRI325F、下游引物为MRI325R；
b.PCR反应程序：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，运行35个循环；最后72℃延伸10min；
S3，电泳
扩增后的产物进行8％聚丙烯酰胺凝胶，120V电压，电泳1.5h。
S4，结果判定
如果扩增后的产物片段大小为151bp，则待测谷子材料的谷子颖壳颜色为黄色，如果扩增后的产物片段大小为189bp，则待测谷子材料的谷子颖壳颜色为白色。
4.一种权利要求1所述的与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记在谷子颖壳颜色早期鉴定或者分子筛选育种中的应用。
5.一种权利要求2所述的与谷子颖壳颜色性状紧密连锁的分子标记的引物在谷子颖壳颜色早期鉴定或者分子筛选育种中的应用。
6.一种权利要求3所述的鉴定谷子颖壳颜色的方法在谷子颖壳颜色早期鉴定或者分子筛选育种中的应用。
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