CN107382987A - 一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于天然药物和药物治疗领域，公开了一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物及其制备方法和用途。该化合物是由双环醇与硫辛酸偶联而成，结构式如式(Ⅰ)。制备包括步骤：将双环醇与硫辛酸溶解在无水二氯甲烷中，在吡啶和4‑二甲氨基吡啶的催化下，室温反应过夜，过滤，过硅胶色谱柱，旋蒸，干燥，即可获得目标化合物。药理实验发现本发明的药物可使内源性VEGF表达增加，改善脑神经功能，增加脑部微血管密度，说明药物可能通过复杂的信号通路，如调控炎性因子释放、NO和氧自由基的释放和微血管再生等，修复受损脑组织，改善TBI大鼠的神经功能等，达到治疗TBI，改善症状的目的。

Description

一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物及其制备方 法和用途

技术领域

本发明属于天然药物和药物治疗领域，特别涉及一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物及其制备方法和用途。

背景技术

脑血管疾病是当今世界严重危害人类生命健康的主要疾病之一，是我国的常见病、多发病。创伤性脑损伤(traumaitc brain injury，TBI)是神经外科领域常见的急症之一，尤其是重型TBI，死亡率达到30％-50％；即便存活下来，其中轻度损伤患者中的10％会遗留永久残疾，中度和重度患者可达到66％和100％。据统计，TBI目前已成为全世界35岁以下青壮年人群第一位死亡和致残原因。在我国，随着经济的快速发展，交通运输业、建筑业、体育事业发展十分迅速，交通事故、建筑工伤、运动意外事故等意外伤害大大增加，由此造成脑外伤的发病率逐年增高，对社会和病人家庭造成极大的经济和心理负担。近20年来,有兴奋性氨基酸学说、Ca²⁺超载学说、血管损伤学说等，但依据这些理论设计和制造的许多神经保护剂，疗效不佳。深入研究TBI具体的病理机制及保护机制，开拓有效治疗TBI的药物已成为不容忽视的社会性问题，研发理想的TBI保护剂和治疗策略显得十分紧迫和必要。

双环醇(bicyclol,BC)，化学名称为(E)-3，5，4-三羟基二苯乙烯。为联苯双酯结构类似物，具有抗肝炎病毒和抗肝细胞损伤两方面的作用(BMC Cancer.2016；16(1):742.)。双环醇是多酚类化合物，其化学式为4，4'-二甲氧基-5，6，5'，6'-双(亚甲二氧基)-2-羟甲基-2'-甲氧羰基联苯，分子式为C₁₉H₁₈O₉，临床上可用于治疗慢性肝炎所致的氨基转移酶升高。最近，本发明人研究发现BC的硫辛酸衍生物在治疗创伤性脑损伤时具有不错的疗效，为创伤性脑损伤的治疗提供了新机会。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物；该复方药物组合物由双环醇与硫辛酸组成。

本发明的另一目的在于提供一种上述具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供一种上述具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物，该化合物是由双环醇与硫辛酸偶联而成，具有如下式(Ⅰ)所示的结构式：

所述化合物由双环醇和硫辛酸通过酯键偶联。

上述的一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物的制备方法，包括以下步骤：将双环醇与硫辛酸溶解在无水二氯甲烷中，在吡啶和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化下，室温反应过夜，过滤，过硅胶色谱柱，旋蒸，干燥，即可获得目标化合物。

所述室温为25-30℃。

所述吡啶和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为(1～3):1。

所述硅胶色谱柱所用的洗脱溶剂为乙酸乙酯和石油醚，溶剂体积比为(2～10):7。

上述的一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物及其药学上可接受的盐在制备创伤性脑损伤药物中的用途。

上述的一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物及其药学上可接受的盐在制备脑神经损伤修复药物中的用途。

一种药物组合物，其中含有治疗有效量的上述的具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物或其药学上可接受的盐及载体。

上述的一种药物组合物在制备创伤性脑损伤药物中的用途。

所述的创伤性脑损伤(TBI)包括：由作用在脑底或脊柱的物理力，局部缺血，中风，呼吸停止，心跳停止，脑血检形成或检塞，AIDS所致神经障碍，和大脑出血，脑脊髓炎，脑积水，术后事件，脑感染，震荡或颅内压升高所引起的创伤性脑损伤，和/或上述病症的后遗症。

本发明与现有技术相比具有如下突出的优点及有益效果：

药理实验发现本发明的药物可使内源性VEGF表达增加，改善脑神经功能，增加脑部微血管密度，说明药物可能通过复杂的信号通路，如调控炎性因子释放、NO和氧自由基的释放和微血管再生等，修复受损脑组织，改善TBI大鼠的神经功能等，达到治疗TBI，改善症状的目的。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：化合物合成

将双环醇(1.3mmole)与硫辛酸(2.0eq)溶解在无水二氯甲烷(30ml)中，在吡啶(0.5g)和4-二甲氨基吡啶(0.5g)的催化下，室温25-30℃下反应过夜，过滤，过硅胶色谱柱(所用的洗脱溶剂为体积比(3～9):7的乙酸乙酯和石油醚)，旋蒸，干燥，即可获得白色固体目标化合物。经液相色谱质谱和核磁共振技术分析，所新制备的白色固体目标化合物为具有式(Ⅰ)所示结构的偶联物：

实施例2：采用实施例1所得偶联物作为药物进行以下创伤性脑损伤药理实验

1)动物和模型的建立：120只SPF级健康雄性Wistar大鼠，体重250-280g，由上海实验动物中心提供。随机分成正常组、模型组、药物组和溶剂组。每组又分为术后1、4、7d和14d亚组，每亚组6只(实验共120只大鼠，模型制作死亡20只，剔除)。参考Feeney’s落体法，用1％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉，将大鼠俯卧位并固定。头顶部剪毛、消毒、铺巾。沿头皮正中切开头皮，在右侧顶骨开骨窗，直径0.5cm，暴露硬脑膜。以25g重锤自32cm处自由落下(在圆形套管内)，击中骨窗下硬脑膜，造成右顶叶脑挫伤。药物组在制模后立即经静脉注入药物50mg/kg；溶剂组在静脉注入与药物组等量的溶剂，排除溶剂的影响；模型组用等量生理盐水建立模型；正常组仅麻醉与手术。

2)标本的收集与处理：实验动物在TBI后各个时间点经观察神经系统症状后，1％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉、迅速开胸暴露心脏，经升主动脉插管后，先用100ml生理盐水快速冲洗，随后用40g/L多聚甲醛磷酸缓冲液心脏灌注约30min，灌毕立即取脑浸入上述缓冲液中固定1d，常规脱水、浸蜡、包埋。予正中隆起水平行4μm连续冠状切片，备免疫组化使用。另外4只1％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉，迅速断头后取新鲜脑组织，液氮冷存，备Westem blot和real time RT-PCR使用。

3)神经行为评分：采用Menzies等大鼠走横木试验方法评价大鼠精细运动功能恢复情况。于TBI前1周及TBI后1、4、7d和14d由2人同时测试评分。

4)免疫组织化学检测微血管密度：取上述切片，在2g/L Triton×2100液中孵育40min(室温)，将切片分别浸入兔抗大鼠VIII因子相关抗原抗体，4℃孵育48h，PBS洗涤3次，然后利用SABC试剂盒(北京中杉)进行免疫组织化学反应，最后使用DAB显色试剂盒(北京中杉)进行显色反应30min，充分水洗，酒精脱水，二甲苯透明，封片，光镜观察。

5)Western-blot检测VEGF蛋白表达：取50mg标本组织，制成匀浆，冰浴下加入300μl预冷的细胞裂解液(50mM Tris-HCl,pH7.6，200Mm NaCl，2mM EDTA，1％(V/V)Tritonx-100，0.01Mm PMSF)，以12000rpm 4℃离心15min；提蛋白，BCA试剂盒以570nm于酶标仪上测定蛋白含量。制备12％SDS-PAGE(6％浓缩胶)，60μg蛋白质上样，120V运行1.5h，转移到硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶粉封闭2h后，分别加入兔抗大鼠VEGF抗体和抗β-actin单抗(SantaCruz)，37℃摇床1h，PBST洗涤3次，10min/次，然后加入与结合含有辣根过氧化物酶标记大鼠IGg，37℃摇床1h，PBST洗涤10min，3次，ECL显色试剂盒反应，X胶片显色，暗室，曝光。用Image master VDS成像系统摄影，图像分析灰度扫描。以目的蛋白VEGF与β-actin的蛋白产物条带灰度的比值表示。

6)Real time PCR检测VEGF mRNA表达：取50mg标本组织匀浆，提取总RNA，用GeneQuant RNA/DNA定量仪进行RNA纯度测定和定量。保证A260/A280值在1.8-2.0之间。转录cDNA(Takana反转录试剂盒)，然后样品在iCycler iQ荧光PCR仪进行扩增。采用相对定量法，在测定目的基因VEGF的同时测定内源性看家基因GAPDH，两者比值表示最终结果。大鼠VEGF PCR引物：上游引物为5’-AGG AGG AGG GCA GAA TCA TCA-3’；下游引物：5’-CTC GATTGG ATG GCA GTA GCT-3’。GAPDH PCR引物：上游引物：5’-GCA CCG TCA AGG CTG ACA AC-3’；下游引物：5’-ATG GTG GTG AAG ACG CCA GT-3’。以上3对引物均由上海生工设计并合成。

7)药物对神经功能评分的影响：与正常组神经功能评分相比，模型组和溶剂组在TBI后1d，评分显著降低(P＜0.01)，4d后开始升高(P＜0.05)至14d基本恢复正常；而药物组，在TBI后1d评分开始下降(P＜0.05)，4d后显著升高并一直到14d(表1)。而药物组和模型组比较，神经功能评分在TBI后1d和4d比较有显著统计学差异(P＜0.01)。

8)药物对VEGF的影响：Western-blot结果显示，与正常组VEGF蛋白灰度值相比，模型组和溶剂组VEGF先升高(P＜0.05)，7d后又下降(P＞0.05)，两组比较无显著性差异(P＞0.05)；药物组VEGF从1d(P＜0.05)开始明显升高并维持至14d(P＜0.01)(表2)。

实时荧光定量RT-PCR结果显示，各组VEGF的mRNA表达变化与VEGF蛋白的表达变化一致。

表1各组大鼠神经功能评分比较(n＝5)

注：与正常组比较，☆P＜0.01；※P＜0.05；与模型组和溶剂组比较，▲P＜0.01。

表2各组VEGF蛋白表达的比较(n＝5)

注：与正常组比较，☆P＜0.01；※P＜0.05；与模型组和溶剂组比较，▲P＜0.01。

研究结果显示，TBI损伤后，大鼠神经功能评分显著降低，提示造模成功，经治疗后的大鼠评分轻度降低，并在TBI后第四天就基本恢复；同时经注射溶剂治疗后评分和模型组一致，说明药物可能通过复杂的信号通路，如调控炎性因子释放、NO和氧自由基的释放和微血管再生等，修复受损脑组织，改善TBI大鼠的神经功能等，达到治疗TBI，改善症状的目的，而且在大大降低用药量的情况下，治疗效果比单独使用组合物中的活性成分效果更好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 佛山市第五人民医院；佛山科学技术学院；佛山市康复医学会

<120> 一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物及其制备方法和用途

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物VEGF-F

<400> 1

aggaggaggg cagaatcatc 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物VEGF-R

<400> 2

ctcgattgga tggcagtagc t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物GAPDH-F

<400> 3

gcaccgtcaa ggctgacaac 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物GAPDH-R

<400> 4

atggtggtga agacgccagt 20

Claims (10)

1.一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物，其特征在于：该化合物是由双环醇与硫辛酸偶联而成，具有如下式(Ⅰ)所示的结构式：

2.根据权利要求1所述的一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物，其特征在于：所述化合物由双环醇和硫辛酸通过酯键偶联。

3.根据权利要求1所述的一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将双环醇与硫辛酸溶解在无水二氯甲烷中，在吡啶和4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化下，室温反应过夜，过滤，过硅胶色谱柱，旋蒸，干燥，即可获得目标化合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述室温为25-30℃。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述吡啶和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为(1～3):1。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述硅胶色谱柱所用的洗脱溶剂为乙酸乙酯和石油醚，溶剂体积比为(2～10):7。

7.根据权利要求1所述的一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物及其药学上可接受的盐在制备创伤性脑损伤药物中的用途。

8.根据权利要求1所述的一种具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物及其药学上可接受的盐在制备脑神经损伤修复药物中的用途。

9.一种药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1所述的具有预防和治疗创伤性脑损伤活性的化合物或其药学上可接受的盐及载体。

10.根据权利要求9所述的一种药物组合物在制备创伤性脑损伤药物中的用途。