CN107382826B - 一种金荞麦中的荞麦碱及其含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种金荞麦中荞麦碱及其含量测定方法，采用了先水提后醇沉并通过阴阳树脂纯化的工艺，样品处理方法简便，提取率较高，并能获得纯度相对较高的荞麦碱产品，适合工业化生产。同时所提供的荞麦碱的含量测定方法能够快速、简便的测定金荞麦药材及提取纯化产物中荞麦碱的含量，无需进行衍生化处理，方便、快捷，重复性好，比较适用于常规生产实践中荞麦碱的含量测定。

Description

一种金荞麦中的荞麦碱及其含量测定方法
技术领域
本发明涉及从中药植物金荞麦中提取与检测荞麦碱的相关技术领域，具体涉及一种金荞麦中荞麦碱的提取纯化工艺及含量快速测定方法。
背景技术
金荞麦为蓼科植物金荞麦Fagoptrum dibotrys(D.Don)Hara的干燥根茎，味酸、苦，性寒，归肺、胃、肝经，具有清热解毒、活血消痈、祛风除湿等功效，主治肺痈、肺热咳喘、咽喉肿痛、痢疾、风湿痹症、跌打损伤、痈肿疮毒及蛇虫咬伤等。金荞麦以“赤地利”之名始载于唐《新修本草》，云“叶似萝藦蔓生，根皮赤黑，肉黄赤。二、八月采根，日干”；《本草拾遗》记载“生江东平地，花、叶如荞麦，根紧硬似狗脊，一名五戢，一名蛇罔”；以后诸家本草及医(药)书也多有相关收载，考其文图，均与药用金荞麦一致。
金荞麦主要含有黄酮类、生物碱类、萜类、酚类、挥发油、多糖类及其他甾体或蒽醌类化学成分。现代药理研究也表明其具有良好的降血糖、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎及免疫调节等作用。荞麦碱为金荞麦中的一种多羟基生物碱类成分，具有调节血糖的作用，目前在桑叶药材相关研究中被报道较多。目前尚未有金荞麦中荞麦碱的提取纯化工艺及含量测定的相关研究报道。同时金荞麦资源较为丰富，在亚洲各处广为分布，且对环境适应性较强，易栽培，故具有广阔的开发应用前景。
离子交换法主要以离子交换树脂作为固定相，用水或含水溶剂装柱。当流动相流过交换柱时，溶液中的中性分子及不与离子交换树脂交换基团发生交换的化合物将通过柱子从柱底流出，而具有可交换的离子则与树脂上的交换基团进行离子交换并被吸附到柱上，随后改变条件，并用适当溶剂从柱上洗脱下来，即可实现物质分离。
发明内容
本发明旨在解决提供一种适宜工业化生产的合理、稳定、生产周期相对较短的金荞麦中荞麦碱的提取和纯化方法，并建立相应的测定方法以保障工艺和产品的稳定。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案如下：
一种金荞麦中的荞麦碱，其通过如下方法提取得到：
(1)将金荞麦干燥并粉碎，将粉碎后的药材以1∶6～14的固液比用纯化水回流提取1～3次，每次1～2小时，过滤后，合并滤液；
(2)过滤后减压浓缩至相对密度1.10～1.20，得浸膏；
(3)将浸膏加95％乙醇醇沉至含醇量30％～70％，离心取上清；
(4)选择所使用的强酸性阳离子交换树脂，湿法装柱后进行预处理，以0.5～1.5ml/min的流速将醇沉上清液进行动态饱和吸附；
(5)选用0.5mol/L～1.2mol/L的氨水洗脱液以3～6倍柱体积对吸附饱和的强酸性阳离子交换树脂进行洗脱，控制洗脱液流速0.5～1.5ml/min，收集洗脱液；
(6)将收集的洗脱液浓缩去氨，加至预处理好的强碱性阴离子交换树脂上，以除色素和阴离子杂质，用4～8倍柱体积的纯化水洗脱，收集洗脱液；
(7)将上述收集的洗脱液，减压浓缩至相对密度1.10～1.20，放入洁净干燥的玻璃培养皿中，置低温冰箱中冷冻3小时，再置于冷冻干燥机中冷冻干燥36～72小时，干燥后得浅黄色粉末状固体，取出后称重，立即置于干燥器中存放，即得到金荞麦中荞麦碱。
优选地，步骤(1)中金荞麦药材以1∶10的固液比用纯化水回流提取2次，每次1.5小时；步骤(2)中过滤后减压浓缩至相对密度1.15；步骤(3)中将浸膏加95％乙醇醇沉至含醇量50％。
优选地，，步骤(4)中，强酸性阳离子交换树脂的型号为lewatit-100、Amberlite200、Ionresin 004、Ionresin IR-102中的任意一种，所述强酸性阳离子交换树脂的预处理方法为：先用2BV、95％乙醇浸泡12小时，再用95％乙醇洗至清亮，然后用纯水洗至无醇味为止；再用2倍树脂体积的4％HCl处理，然后用蒸馏水洗至中性，再用2倍树脂体积的4％NaOH洗柱，再用蒸馏水洗至中性；最后强酸性阳离子交换树脂用4倍量4％HCl，使其转成H型，再用蒸馏水洗至中性备用。
步骤(6)中，所示的强碱性阴离子交换树脂的型号为D290、Amberlite IRA400、Amberlite IRA402、Lewait MP500中的任意一种，所述强碱性阴离子交换树脂的预处理方法为：先用2BV、95％乙醇浸泡12小时，再用95％乙醇洗至清亮，然后用纯水洗至无醇味为止；再用2倍树脂体积的4％HCl处理，然后用蒸馏水洗至中性，再用2倍树脂体积的4％NaOH洗柱，再用蒸馏水洗至中性；最后强碱性阴离子交换树脂用4倍量4％NaOH，使其转成OH型，再用蒸馏水洗至中性备用。
步骤(4)、步骤(5)中控制流速均为0.8ml/min，步骤(5)、步骤(6)洗脱的柱体积分别为5BV、6BV。
步骤(7)中洗脱液减压浓缩至相对密度1.10，冷冻干燥48小时，干燥后提取物中荞麦碱的纯度≥65％。
本发明进一步提出了上述金荞麦中的荞麦碱的含量测定方法，包含如下步骤：
(1)色谱条件：选用Hypersil NH2色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相为乙腈-0.15％醋酸水溶液，流速0.9ml/min，柱温30℃，检测波长205nm，进样量10μL，理论塔板数以荞麦碱计不低于3000；
(2)对照品溶液的制备：精密称定荞麦碱对照品20mg，置25ml的容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得，作储备液；
(3)供试品溶液的制备：精密称取干燥并经粉碎的金荞麦药材1g，置100ml圆底烧瓶中，加入石油醚20mL进行脱脂处理，在水浴回流提取1h，滤过，再用少量石油醚洗涤残渣，挥干溶剂，精密加入甲醇-0.05M的盐酸溶液40mL，涡旋混合，超声，离心后取上清，重复操作一次，合并提取液，放冷，转移至100ml量瓶中，甲醇定容，摇匀即得。
优选地，步骤(1)中，乙腈-0.15％醋酸水溶液中乙腈和0.15％醋酸水溶液的体积比为54∶46。
步骤(3)中，甲醇-0.05M的盐酸溶液中甲醇和0.05M的盐酸溶液的体积比为1∶1。
步骤(3)中，精密加入甲醇-0.05M的盐酸溶液后涡旋混合20～30s，超声2～3min，离心15～20分钟，转速12000～15000转/分。
有益效果：与现有技术相比，本发明所提供的提取纯化工艺采用了先水提后醇沉并通过阴阳树脂纯化的工艺，提取率较高，适合工业化生产。同时所提供的荞麦碱的含量测定方法能够快速、简便的测定金荞麦药材及提取纯化产物中荞麦碱的含量。
附图说明
图1为提取纯化的工艺流程图；
图2为快速测定荞麦碱的HPLC法中对照品的特征谱图；
图3为供试品的特征图谱。
具体实施方式
如图1所示，本发明提供了一种种金荞麦中荞麦碱的提取纯化工艺，其包含如下步骤：
A.称取适量金荞麦干燥并粉碎，将粉碎后的药材以1∶6～14的固液比用纯化水回流提取1～3次，每次1～2小时；
B.过滤后减压浓缩至相对密度1.10～1.20，得浸膏；
C.将浸膏加95％乙醇醇沉至含醇量30％～70％，离心取上清；
D.选择所使用的强酸性阳离子交换树脂型号，湿法装柱后进行预处理，以0.5～1.5ml/min的流速将醇沉上清液进行动态饱和吸附；
E.选用0.5mol/L的氨水洗脱液以3～6倍柱体积对吸附饱和的强酸性阳离子交换树脂进行洗脱，控制洗脱液流速0.5～1.5ml/min，收集洗脱液；
F.将收集的洗脱液浓缩去氨，加至预处理好的强碱性阴离子交换树脂上，以除色素和阴离子杂质，用4～8倍柱体积的纯化水洗脱，收集洗脱液；
G.将上述收集的洗脱液，减压浓缩至相对密度1.10～1.20，放入洁净干燥的玻璃培养皿中，置低温冰箱中冷冻3小时，再置于冷冻干燥机中冷冻干燥36～72小时，干燥后得浅黄色粉末状固体，取出后称重，立即置于干燥器中存放。
H.通过建立的测定金荞麦中荞麦碱的HPLC法测定本发明的提取纯化后提取物中荞麦碱的纯度≥65％。
其中，色谱条件为：
(1)色谱条件：选用Hypersil NH2色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相为乙腈-0.15％醋酸水溶液(54∶46)，流速0.9ml/min，柱温30℃，检测波长205nm，进样量10μL，理论塔板数以荞麦碱计不低于3000；
(2)对照品溶液的制备：精密称定荞麦碱对照品20mg，置25ml的容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得，作储备液；
(3)供试品溶液的制备：精密称取干燥并经粉碎的金荞麦药材1g，置100ml圆底烧瓶中，加入石油醚20mL进行脱脂处理，在水浴回流提取1h，滤过，再用少量石油醚洗涤残渣，挥干溶剂，精密加入甲醇-0.05M的盐酸溶液(1∶1)40mL，涡旋混合20～30s，超声2～3min，离心15～20分钟，转速12000～15000转/分，重复操作一次，合并提取液，放冷，转移至100ml量瓶中，甲醇定容，摇匀即得。
方法特异性：将对照品溶液和供试品溶液分别按“色谱条件”进样，对照品及供试品的色谱峰均分离度良好，结果如图2和图3所示。
线性关系考察：取对照品储备液适量制成浓度分别为0.004、0.008、0.016、0.032、0.048、0.064mg/mL的系列对照品溶液，按“色谱条件”测定峰面积，并以峰面积(A)对对照品溶液浓度(C)进行线性回归，得标准曲线，结果荞麦碱在0.1～1.6mg/mL范围内线性关系良好，其回归方程为A＝251183C+19967.5(R＝0.9997)。
精密度试验：精密吸取荞麦碱浓度0.8mg/mL的对照品溶液10μL，按“色谱条件”重复进样6次，记录三者的峰面积，结果荞麦碱峰面积的RSD分别为0.82％，表明仪器精密度良好。
重复性试验：称取干燥并经粉碎的金荞麦药材6份(每份约1g)，按“供试品溶液的制备”配制供试品溶液，再按“色谱条件”进样，记录荞麦碱的峰面积，计算含量。结果6份样品中荞麦碱含量为0.0811％，RSD为0.89％，表明方法重复性良好。
稳定性试验：称取干燥并经粉碎的金荞麦药材6份(每份约1g)，按“供试品溶液的制备”配制供试品溶液，再按“色谱条件”分别在0，2，4，8，12，24h进样测定，记录荞麦碱峰面积，结果荞麦碱峰面积的RSD分别为1.07％，表明供试品溶液在24h内稳定。
加样回收率试验：称取已知含量的金荞麦药材6份(每份约0.5g)，加入0.5mL荞麦碱对照品储备溶液，按“供试品溶液的制备”项下方法进行制备，0.45μm微孔滤膜滤过，10μL进样分析，记录峰面积，结果平均回收率为99.12％，RSD为0.97％。
样品测定：取干燥并经粉碎的金荞麦药材6份(每份约1g)，按“供试品溶液的制备”配制供试品溶液，再按“色谱条件”进样，计算得金荞麦药材中荞麦碱的平均含量为0.0813％，RSD为1.78％。
方法评价：荞麦碱为多羟基生物碱，结构缺少共轭双键，紫外吸收弱，且在C18色谱柱上不易保留，故此类成分的测定如1-脱氧野尻霉素均利用荧光试剂芴甲氧酰氯(FMOC-Cl)与其柱前衍生，然后用高效液相色谱法进行分离测定，方法耗时较长(衍生化反应时间长)，且易受环境等影响(反应条件限制)，故在实际的生产质量检测中一般不采用。本测定方法采用氨基柱和示差检测，可以较好地保留荞麦碱，并能较好地实现与其他色谱峰的良好分离，方法简便、快捷，可以用于金荞麦中荞麦碱的快速测定。
下面结合具体实施实例对本发明的金荞麦中荞麦碱的提取纯化工艺及快速测定方法作进一步的说明。下述实施例中，低温冰箱为-15℃，冷冻干燥的机器为低温真空冻干机，工作温度-60℃。
此外，强酸性阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂的预处理方法为均先用2BV、95％乙醇浸泡12小时，再用95％乙醇洗至清亮，然后用纯水洗至无醇味为止。再用2倍树脂体积的4％HCl处理，然后用蒸馏水洗至中性，再用2倍树脂体积的4％NaOH洗柱，再用蒸馏水洗至中性。最后强酸性阳离子交换树脂用4倍量4％HCl，使其转成H型，再用蒸馏水洗至中性备用。强碱性阴离子交换树脂用4倍量4％NaOH，使其转成OH型，再用蒸馏水洗至中性备用。
实施例1：
一种金荞麦中荞麦碱的提取纯化工艺及快速测定方法，包括如下步骤：
称取干燥并粉碎的金荞麦药材50g，以1∶10的固液比用纯化水回流提取2次，每次1.5小时；合并滤液并过滤后，将其减压浓缩(温度60°)至相对密度1.15，得浸膏；将浸膏加95％乙醇醇沉至含醇量50％，离心(转速4000r/min，离心时间为10min)取上清；选择lewatit-100强酸性阳离子交换树脂(用量为100g，上样的上清液体积为200ml)，湿法装柱后进行酸碱预处理，以0.8ml/min的流速将醇沉上清液进行动态吸附；采用0.5mol/L的氨水洗脱液以5倍柱体积对上述强酸性阳离子交换树脂进行洗脱，控制洗脱液流速0.8ml/min，收集洗脱液；将收集的洗脱液浓缩去氨，加至预处理好的D290强碱性阴离子交换树脂上，以除色素和阴离子杂质，用6倍柱体积的纯化水洗脱，收集洗脱液；将上述收集的洗脱液，减压浓缩至相对密度1.10，放入洁净干燥的玻璃培养皿中，置低温冰箱中预冻3小时，再置于冷冻干燥机中冷冻干燥48小时，干燥后得浅黄色粉末状固体，取出后称重，立即置于干燥器中存放。通过建立的测定金荞麦中荞麦碱的HPLC法测定本发明的提取纯化后提取物中荞麦碱的纯度69.27％。
实施例2：
一种金荞麦中荞麦碱的提取纯化工艺及快速测定方法，包括如下步骤：
称取干燥并粉碎的金荞麦药材50g，以1∶12的固液比用纯化水回流提取3次，每次1小时；合并滤液并过滤后，将其减压浓缩至相对密度1.20，得浸膏；将浸膏加95％乙醇醇沉至含醇量40％，离心取上清；选择lewatit-100强酸性阳离子交换树脂，湿法装柱后进行酸碱预处理，以1.5ml/min的流速将醇沉上清液进行动态吸附；采用0.5mol/L的氨水洗脱液以6倍柱体积对上述强酸性阳离子交换树脂进行洗脱，控制洗脱液流速1.5ml/min，收集洗脱液；将收集的洗脱液浓缩去氨，加至预处理好的D290强碱性阴离子交换树脂上，以除色素和阴离子杂质，用8倍柱体积的纯化水洗脱，收集洗脱液；将上述收集的洗脱液，减压浓缩至相对密度1.15，放入洁净干燥的玻璃培养皿中，置低温冰箱中预冻3小时，再置于冷冻干燥机中冷冻干燥36小时，干燥后得浅黄色粉末状固体，取出后称重，立即置于干燥器中存放。通过建立的测定金荞麦中荞麦碱的HPLC法测定本发明的提取纯化后提取物中荞麦碱的纯度65.11％。
实施例3：
一种金荞麦中荞麦碱的提取纯化工艺及快速测定方法，包括如下步骤：
称取干燥并粉碎的金荞麦药材50g，以1∶8的固液比用纯化水回流提取2次，每次2小时；合并滤液并过滤后，将其减压浓缩至相对密度1.15，得浸膏；将浸膏加95％乙醇醇沉至含醇量70％，离心取上清；选择lewatit-100强酸性阳离子交换树脂，湿法装柱后进行酸碱预处理，以1.2ml/min的流速将醇沉上清液进行动态吸附；采用0.5mol/L的氨水洗脱液以4倍柱体积对上述强酸性阳离子交换树脂进行洗脱，控制洗脱液流速1.2ml/min，收集洗脱液；将收集的洗脱液浓缩去氨，加至预处理好的D290强碱性阴离子交换树脂上，以除色素和阴离子杂质，用8倍柱体积的纯化水洗脱，收集洗脱液；将上述收集的洗脱液，减压浓缩至相对密度1.10，放入洁净干燥的玻璃培养皿中，置低温冰箱中预冻3小时，再置于冷冻干燥机中冷冻干燥72小时，干燥后得浅黄色粉末状固体，取出后称重，立即置于干燥器中存放。通过建立的测定金荞麦中荞麦碱的HPLC法测定本发明的提取纯化后提取物中荞麦碱的纯度67.58％。

Claims (10)

1.一种从金荞麦中提取荞麦碱的方法，其特征在于，其通过如下方法提取得到：
（1）将金荞麦干燥并粉碎，将粉碎后的药材以1：6~14的固液比用纯化水回流提取1~3次，每次1~2小时，过滤后，合并滤液；
（2）过滤后减压浓缩至相对密度1.10~1.20，得浸膏；
（3）将浸膏加95%乙醇醇沉至含醇量30%~70%，离心取上清；
（4）选择强酸性阳离子交换树脂，湿法装柱后进行预处理，以0.5~1.5ml/min的流速将醇沉上清液进行动态饱和吸附；
（5）选用0.5mol/L~1.2mol/L的氨水洗脱液以3~6倍柱体积对吸附饱和的强酸性阳离子交换树脂进行洗脱，控制洗脱液流速0.5~1.5ml/min，收集洗脱液；
（6）将收集的洗脱液浓缩去氨，加至预处理好的强碱性阴离子交换树脂上，以除色素和阴离子杂质，用4~8倍柱体积的纯化水洗脱，收集洗脱液；
（7）将上述收集的洗脱液，减压浓缩至相对密度1.10~1.20，放入洁净干燥的玻璃培养皿中，置低温冰箱中冷冻3小时，再置于冷冻干燥机中冷冻干燥36~72小时，干燥后得浅黄色粉末状固体，取出后称重，立即置于干燥器中存放，即得到金荞麦中荞麦碱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中金荞麦药材以1：10的固液比用纯化水回流提取2次，每次1.5小时；步骤（2）中过滤后减压浓缩至相对密度1.15；步骤（3）中将浸膏加95%乙醇醇沉至含醇量50%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，强酸性阳离子交换树脂的型号为lewatit-100、Amberlite200、Ionresin 004、Ionresin IR-102中的任意一种，所述强酸性阳离子交换树脂的预处理方法为：先用2BV、95%乙醇浸泡12小时，再用95%乙醇洗至清亮，然后用纯水洗至无醇味为止；再用2倍树脂体积的4%HCl处理，然后用蒸馏水洗至中性，再用2倍树脂体积的4%NaOH洗柱，再用蒸馏水洗至中性；最后强酸性阳离子交换树脂用4倍量4%HCl，使其转成H型，再用蒸馏水洗至中性备用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）中，所示的强碱性阴离子交换树脂的型号为D290、Amberlite IRA400、Amberlite IRA402、Lewait MP500中的任意一种，所述强碱性阴离子交换树脂的预处理方法为：先用2BV、95%乙醇浸泡12小时，再用95%乙醇洗至清亮，然后用纯水洗至无醇味为止；再用2倍树脂体积的4%HCl处理，然后用蒸馏水洗至中性，再用2倍树脂体积的4%NaOH洗柱，再用蒸馏水洗至中性；最后强碱性阴离子交换树脂用4倍量4%NaOH，使其转成OH型，再用蒸馏水洗至中性备用。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）、步骤（5）中控制流速均为0.8ml/min，步骤（5）、步骤（6）洗脱的柱体积分别为5BV、6BV。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（7）中洗脱液减压浓缩至相对密度1.10，冷冻干燥48小时，干燥后提取物中荞麦碱的纯度≥65%。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对提取的荞麦碱的含量进行测定的步骤：
（1）色谱条件：选用Hypersil NH2色谱柱，250mm×4.6mm，5μm，流动相为乙腈-0.15%醋酸水溶液，流速0.9 ml/min，柱温30℃，检测波长205nm，进样量10μL，理论塔板数以荞麦碱计不低于3000；
（2）对照品溶液的制备：精密称定荞麦碱对照品20 mg，置25ml的容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得，作储备液；
（3）供试品溶液的制备：精密称取干燥并经粉碎的金荞麦药材1g，置100ml圆底烧瓶中，加入石油醚20 mL进行脱脂处理，在水浴回流提取1 h，滤过，再用少量石油醚洗涤残渣，挥干溶剂，精密加入甲醇-0.05M的盐酸溶液40 mL，涡旋混合，超声，离心后取上清，重复操作一次，合并提取液，放冷，转移至100ml量瓶中，甲醇定容，摇匀即得。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，乙腈-0.15%醋酸水溶液中乙腈和0.15%醋酸水溶液的体积比为54：46。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，甲醇-0.05M的盐酸溶液中甲醇和0.05M的盐酸溶液的体积比为1:1。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，精密加入甲醇-0.05M的盐酸溶液后涡旋混合20~30s，超声2~3min，离心15~20分钟，转速12000~15000转/分。
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