CN107356762A - 检测猪弓形虫病循环抗原免疫胶体金试纸条及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测猪弓形虫病循环抗原免疫胶体金试纸条及制备方法，利用胶体金免疫层析技术检测猪弓形虫血液中循环抗原，本发明T线的包被与金标垫的制备分别应用的是抗弓形虫表面抗原SAG3的两株单克隆抗体，该试纸条与两份猪囊虫阳性血清无交叉反应，故特异性较强；具有生物安全性，金标垫的制备与T线的包被均应用的是抗弓形虫表明抗原SAG3的两株单抗，C线包被的是羊抗小鼠抗体，均无毒，不会造成环境污染。

Description

检测猪弓形虫病循环抗原免疫胶体金试纸条及制备方法

技术领域

本发明提供一种检测猪弓形虫病循环抗原免疫胶体金试纸条及制备方法，利用胶体金免疫层析技术检测猪弓形虫血液中循环抗原，属于血清学检测技术领域。

背景技术

弓形虫病（Toxoplasmosis ）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii ）引起的一种严重的人兽共患寄生虫病，弓形虫病给人类健康及养猪业的发展带来了严重的影响。人感染弓形虫病主要是通过食用没有完全熟制的含有弓形虫包囊的肉类而感染，因此，诊断猪弓形虫病具有公共卫生学意义。现有的弓形虫病的诊断方法中，病原学诊断结果确实可靠，但虫体不典型则会出现误诊、漏诊，敏感性低；分子生物性诊断敏感性、特异性较高，但对实验仪器及操作人员的技术要求较高，不适合应用于临床基层单位的应用；免疫学诊断是诊断弓形虫病常用的试验方法，其中染色试验（Dye test, DT）是最早被公认的检测弓形虫病的“金标准”，敏感性高、特异性强，但实验涉及到活虫体，所以危险性较大。

已经报道的弓形虫的诊断抗原种类也较多如致密颗粒抗原、棒状体抗原和表面抗原（Surface antigen ,SAG）等。弓形虫表面抗原是一个超家族，具有对宿主细胞的黏附、信号传递、入侵及免疫反应等作用。据报道该家族中的SAG1、SAG2、SAG3研究较多，前两者是只存在于弓形虫速殖子期的表面抗原，而SAG3在弓形虫的各个时期均有表达，具有较高的诊断价值。目前，用弓形虫表面抗原SAG3制备单克隆抗体包被NC膜T线组装试纸条并用于检测猪弓形虫血清循环抗原，还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测猪弓形虫病血清循环抗原的免疫胶体金试纸条，具有操作简单、使用方便、省时省力、无需精密仪器和技术人员便可进行检测，因此该方法更适合临床基层单位及流行病学调查的应用。

本发明还公开了一种检测猪弓形虫病循环抗原免疫胶体金试纸条的制备方法，利用两株抗弓形虫表面抗原SAG3单克隆抗体（Anti-A-SAG3-7和Anti-A-SAG3-23），制备了检测猪弓形虫病血清中循环抗原的免疫胶体金试检测试纸条，适用于工业化生产。

本发明所述的一种检测猪弓形虫病循环抗原免疫胶体金试纸条，包括PVC底板、样品垫、硝酸纤维素膜（NC）、吸水垫和胶体金垫；其特征在于：

利用弓形虫表面抗原SAG3重组蛋白制备单克隆抗体Anti-A-SAG3-23包被在NC膜上的检测线；另一株抗弓形虫表面抗原SAG3单克隆抗体Anti-A-SAG3-7包被有金标抗体，用于包被金标垫。

本发明所述的一种检测猪弓形虫病循环抗原免疫胶体金试纸条制备方法，是利用柠檬酸三钠还原法制备40nm粒径的胶体金溶液，用胶体金标记Anti-A-SAG3-7制备金标垫，用Anti-A-SAG3-23及羊抗小鼠二抗包被于硝酸纤维素膜上，分别作为检测线（T线）和质控线（C线），其中：

一、重组蛋白SAG3的克隆、表达及纯化

1、SAG3成熟肽基因的引物设计与合成

根据GenBank中弓形虫的SAG3基因序列（AF3402271）用Primer5.0软件设计了一对特异的寡核苷酸引物；并引入 EcoRI、HindIII酶切位点。

上游引物：5-TATGAATTCGAGCACGGACTGTTCGTC -3′

下游引物：5-ATAAAGCTTTTAGGCAGCCACATGCACAAG-3′（划线部分为酶切位点）。

2、SAG3基因的PCR扩增及产物回收

以弓形虫速殖子转录组cDNA为模板，进行体外扩增。按小量胶回收试剂盒说明（TAKARA）进行PCR产物回收。

3、目的基因克隆载体的构建及鉴定

将纯化的PCR产物与pMD18-T克隆载体连接。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态中。阳性重组质粒pMD18-T-SAG3的筛选及EcoR I、HindIII双酶切鉴定。

4、目的基因表达载体的构建

将已经鉴定的阳性重组质粒pMD18-T-SAG3，胶回收目的片段并进行纯化，转化至DH5α感受态，在含Kan的LB琼脂平板上涂板，挑取单个菌落，菌液培养，提取质粒，进行EcoR I、HindIII双酶切鉴定。

5、目的基因在大肠杆菌中的诱导表达

目的基因经IPTG诱导表达，离心收集菌体。SDS-PAGE结果表明该蛋白主要以包涵体的形式存在

6、目的基因SAG3纯化及Western blot 分析

利用8M尿素纯化SAG3蛋白。经Western blot 分析得知该重组蛋白可被猪弓形虫阳性血清识别，具有良好的反应原性。

二、弓形虫表面抗原SAG3单克隆抗体的制备

1、动物免疫

利用纯化的SAG3蛋白免疫SPF级BALB/c雌性小鼠。前三次皮下免疫，最后一次腹腔加强免疫，其效价达25600。

2、细胞融合实验

制备饲养层细胞，无菌取免疫后的小鼠脾细胞与状态良好的SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。杂交瘤细胞的培养及筛选过程中培养基的更换次序为，HAT、HT及1640，三种培养基有过渡的进行替换。

3、阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆

用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并将其克隆。

4、阳性杂交瘤细胞株的染色体分析

利用浓度为0.1mg/mL的秋水仙素和吉姆萨染色法处理杂交瘤细胞，进行染色体分析，计算染色体数目。

5、单克隆细胞亚型鉴定

应用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对单克隆抗体亚型进行鉴定，Anti-A-SAG3-7

Anti-A-SAG3-23的亚型分别为G2a、G2b。

6、腹水的制备

将杂交瘤细胞小鼠腹腔，收集腹水。

7、单克隆抗体的纯化

利用正辛酸-饱和硫酸铵法对对腹水中的单抗进行粗纯，再用亲和层析住进行精纯。结果得到Anti-A-SAG3-7、Anti-A-SAG3-23的 浓度分别为3.04mg/mL、2.54mg/mL。

三、胶体金试纸条的制备

首先将NC膜粘贴在载体板上，金标垫在NC膜的一端并压住NC膜2mm，样品垫压金标垫2mm，吸水纸在NC膜的另一端并压NC膜2mm粘贴在PVC底板上，最后统一压紧各层。抗弓形虫表面抗原SAG3单克隆抗体Anti-A-SAG3-23及羊抗小鼠IgG抗体设在NC膜上，分别包被检测线（T线）和质控线（C线）。

本发明的积极效果在于：

操作简单，不需特殊仪器和专业人员；方便快捷，检测过程只需10~15min，更适合基层单位现场检测。

特异性强，单克隆抗体具有单一抗原决定簇，本发明T线的包被与金标垫的制备分别应用的是抗弓形虫表面抗原SAG3的两株单克隆抗体，该试纸条与两份猪囊虫阳性血清无交叉反应，故特异性较强。

具有生物安全性，金标垫的制备与T线的包被均应用的是抗弓形虫表明抗原SAG3的两株单抗，C线包被的是羊抗小鼠抗体，均无毒，不会造成环境污染。

运输和保存方便，4℃条件即可。

附图说明

图1胶体金颗粒电镜图；

图2金标抗体电镜图；

图3胶体金试纸条检测结果示意图；

图4敏感性检测结果。

具体实施方式

本发明与以下实施例及附图结合进一步举例说明，但本发明的内容不局限于以下的实施例中。

实施例1

胶体金探针的制备

所述检测猪弓形虫血清循环抗原的免疫胶体金检测试纸条的具体制备方法如下：

（1）胶体金的制备

对所用玻璃器皿进行如下处理充分冲洗、泡酸、再冲洗、烘干备用。利用柠檬酸三钠还原法，制备40nm粒径的胶体金溶液。烧瓶中放入转子，加入去离子水99mL，用电子天平称其质量并记录下来，恒温磁力搅拌电热套加热，待转子上有大的气泡产生时打开转子开关，开始加入1mL的1%的氯金酸溶液。待再次有大的气泡产生时加入1%的柠檬三钠溶液，此时观察烧瓶中溶液的颜色变化，当溶液变成酒红色时开始计时5-10min。冷却至室温用去离子水补至最初记录下的总质量，置于玻璃瓶中4℃保存备用。

（2）胶体金标记单克隆抗体Anti-A-SAG3-7的制备

取6mL胶体金溶液用24μl 0.2M/L K₂CO₃混匀以调节胶体金溶液的PH值；按1毫升胶体金溶液加入10μg 单克隆抗体，要加Anti-A-SAG3-7 19.8μl，混匀静置30min；加入10%的BSA和2%的酪蛋白使其终浓度均为0.1%，混匀静置30min；4℃ 9000r/min离心30min；弃上清并小心吸出残液，用原体积1/10的复溶液重悬沉淀，所得则为金标抗体，置于4℃保存或直接制备金标垫。

（3）胶体金标记单克隆抗体Anti-A-SAG3-7的鉴定

采用透射电镜观察法对金标抗体进行鉴定：取50μl的金标抗体滴于封口膜上，将有膜的镍网盖于该液滴上，用滤纸将镍网边缘的残液吸取，干燥后用2%磷钨酸负染，电镜观察。

结果

（1）肉眼观察烧制的40nm胶体金溶液，呈酒红色，透明，无聚沉现象。电镜下观察，形状浑圆一致，大小及分散程度均匀（见图1）。

（2）电镜下观察金标抗体，可见金颗粒外周有明显的晕圈，表明金颗粒表面吸附有蛋白质，说明标记成功。（见图2）

实施例2

检测试纸条组装及测试

（1）样品垫的处理

将样品垫浸于样品垫处理液（含1%BSA、0.5%S17和0.5%的tx10）中10min，取出置于37℃温箱中烘干，干燥4℃密封保存。

（2）金标垫的制备

将金标垫裁剪成0.8cm×3.2cm的规格。经鉴定的优质的金标抗体滴加并均匀平铺在已裁剪好的金标垫上，置于37℃温箱中干燥2-3h，4℃干燥密封保存。

（3）包被T线、C线

将组装好的试纸条的NC膜上滴加抗体即包被T、C线，在距金标垫5-6mm处滴加1mg/mLAnti-A-SAG3-23 1μl此为T线，再距T线8-10mm处滴加1mg/mL羊抗小鼠IgG抗体1μl此为C线，充分干燥后4℃保存备用。

（4）试纸条的组装

首先将NC膜粘贴在PVC底板上，金标垫在NC膜的一端并压住NC膜2mm，样品垫压金标垫2mm，吸水纸在NC膜的另一端并压NC膜2mm粘贴在载体板上，最后统一压紧各层。

将PVC底板裁剪成宽为3.2cm/条，先将NC膜固定于PVC底板上，再依次将金标垫裁剪为0.8cm×3.2cm压NC膜2mm，剪样品垫2.2cm×3.2cm 压金标垫2mm，剪吸水纸3.2cm×3.2cm 压NC膜2mm粘贴在PVC底板上，最后统一压紧各层。用切纸机将组装好的试纸条裁切呈宽为4mm的小条，4℃保存备用。

（7）使用方法及判断标准

从铝箔袋中取出检测试剂条，将待检样品按1:20稀释后，滴加在样品垫上（滴加总体积约90-100μl），10-15min内可判断其检测结果。

判断标准：T线及C线均出现红色条带者为阳性结果；T线无条带但是C线出现红色条带者为阴性结果；T线及C线均未出现红色条带或T线出现红色条带而C线为出现,则试纸条无效。（见图3）

2.结果

（1）所选3种NC膜中检测样品时以流速适宜、背景颜色较浅和无弥散现象出现为佳，所以最佳选择是Millipore135。

（2）T线及C线的最佳包被浓度分别为Anti-A-SAG3-23 0.25mg/mL和羊抗小鼠IgG抗体0.25mg/mL。两种抗体的最佳包被体积均为0.8μl。

（3）检测猪弓形虫血清循环抗原阳性血清，发现NC膜上出现清晰的T、C线，说明试纸条有效。

通过以下试验表明本发明胶体金检测试纸条性能：

1、本发明胶体金检测试纸条的敏感性

将猪弓形虫参照阳性血清按1:10至1:640的比例稀释后进行检测，结果显示，而当血清的稀释比例为1:160时可看到红色的点，稀释至在1:320时，在5min之内有微弱的红色点，在5min之后，红点消失。说明该试纸条的敏感性可达1:160。（见图4）

2、本发明胶体金检测试纸条的特异性

用胶体金检测试纸条检测2份猪囊虫阳性血清，T线均不显色而C线均显色，说明该试纸条与猪囊虫无交叉反应。

3、胶体金检测试纸条的重复性

用不同批次的试纸条分别检测4份猪弓形虫阴性血清，进行批间重复性试验。另外用同一批次的试纸条检测3份阴性血清，进行批内重复性试验。得到的结果一致，该试纸条具有可重复性。

4、胶体金检测试纸条的稳定性

将放置于4℃和室温保存的试纸条，分别在7d、30d、60d和90d进行检测，结果显示置于4℃的试纸条可保存90d有效。置于室温的试纸条可保存30d有效。

5、临床样品检测

对广东地区某猪场的94份猪待检血清以及吉林地区某猪场的94份猪待检血清进行检测，结果样品阳性率分别18.08%（17/94）、10.63%（10/94）。

<110> 吉林大学

<120>检测猪弓形虫病循环抗原免疫胶体金试纸条及制备方法

<140>

<160> 1

<210> 1

<211> 1042

<212> DNA

<213>刚地弓形虫表面抗原SAG3基因(Toxoplasma gondii surface antigen SAG3gene)

<400> 1

1 gagcacggac tgttcgtcgc cgcagggaaa tcgagaagta agataaccta ttttggcacg

61 ctcactcaga aggctccgaa ctggtaccgc tgctcttcaa cgagggcgaa tgaagaggtc

121 gtaggacatg tgacgctgaa caaagagcac cctgatatga caattgaatg cgtcgacgac

181 ggcttgggcg gagagttttt gccgctcgaa ggcgcgacgt cgtcgtaccc gcgagtatgt

241 cacattgatg ccaaggacaa gggcgactgc gagcgcaaca agggctttct gaccgactac

301 ataccgggcg cgaagcagta ctggtacaag atagaaaagg tggagaacaa cggcgagcaa

361 tccgttctgt acaaattcac agttccttgg atattccttc cgcccgccaa gcagcgatac

421 aaggttggat gccgataccc gaaccacgag tattgctttg ttgaggtcac cgtcgaaccc

481 acgccgccaa tggtcgaagg caagagagtg acctgcgggt accccgagtc cggccccgtg

541 aatctcgagg tggacttgtc aaaggacgcg aactttatcg agattcggtg cggcgaacag

601 caccacccgc agccgtcgac ctacacgctg cagtactgct caggtgactc ggtggacccg

661 cagaagtgtt cgccgcagtc cctgacgaac attttttatg actacagctc ttcgtggtgg

721 aaggggaaac tgaacgggcc tgacggggca actctcacca ttccacccgg cgggttcccc

781 gaagaagaca aatcttttct tgtcgggtgt tcactcactg tggacgggcc gcccttctgc

841 aacgtcaaag tgagagttgc cgggaacccc agaaagtggg ggagaggcgg aggcggccat

901 ccaggaagcg gaggattgca gccgggaact gaaggggaaa gtcaagctgg aacagaaagt

961 tcagccggcg cgagttcgcg aatggcttcc gttgccctgg cgttccttct cggtctcctt

1021 gtgcatgtgg ctgcctaa

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222> (1)..(18)

<223>

<400>2

gagcacggactgttcgtc 18

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物(primer)

<222> (1)..(21)

<223>

<400>3

ttaggcagccacatgcacaag 21

Claims (2)

1.一种检测猪弓形虫病循环抗原免疫胶体金试纸条，包括PVC底板、样品垫、硝酸纤维素膜（NC）、吸水垫和胶体金垫；其特征在于：

抗弓形虫表面抗原SAG3单克隆抗体Anti-A-SAG3-23包被在NC膜上的检测线；另一株抗弓形虫表面抗原SAG3单克隆抗体Anti-A-SAG3-7包被有金标抗体。

2.如权利要求1所说的一种检测猪弓形虫病循环抗原免疫胶体金试纸条制备方法，是利用柠檬酸三钠还原法制备40nm粒径的胶体金溶液，用胶体金标记Anti-A-SAG3-7制备金标垫，用Anti-A-SAG3-23及羊抗小鼠二抗包被于硝酸纤维素膜上，分别作为检测线（T线）和质控线（C线），其中：

所述的抗弓形虫表面抗原SAG3单克隆抗体Anti-A-SAG3-23的制备：

1）动物免疫

利用纯化的SAG3蛋白免疫SPF级BALB/c雌性小鼠；前三次皮下免疫，最后一次腹腔加强免疫，其效价达25600；

2）细胞融合实验

制备饲养层细胞，无菌取免疫后的小鼠脾细胞与状态良好的SP2/0细胞，采用PEG法进行融合；杂交瘤细胞的培养及筛选过程中培养基的更换次序为，HAT、HT及1640，三种培养基有过渡的进行替换；

3）阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆

用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，并将其克隆；

4）阳性杂交瘤细胞株的染色体分析

利用浓度为0.1mg/mL的秋水仙素和吉姆萨染色法处理杂交瘤细胞，进行染色体分析，计算染色体数目；

5）单克隆细胞亚型鉴定

应用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对单克隆抗体亚型进行鉴定，Anti-A-SAG3-7Anti-A-SAG3-23的亚型分别为G2a、G2b；

6）腹水的制备

将杂交瘤细胞小鼠腹腔，收集腹水；

7）单克隆抗体的纯化

利用正辛酸-饱和硫酸铵法对对腹水中的单抗进行粗纯，再用亲和层析住进行精纯，得到Anti-A-SAG3-7、Anti-A-SAG3-23。