CN107318657B - 一种假秦艽的组培育苗方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中草药育苗领域，具体涉及一种假秦艽的组培育苗方法，包括如下步骤：S1、脱毒；S2、脱分化；S3、增殖培养；S4、再分化；S5、炼苗。本发明提高了假秦艽的组培苗质量和缩短了育苗时间；解决了假秦艽种子发芽率低制约人工种植假秦艽的问题。

Description

一种假秦艽的组培育苗方法
技术领域
本发明属于中草药育苗领域，具体涉及一种假秦艽的组培育苗方法。
背景技术
假秦艽(Phlomis betonicoide s)，别名粗弓，甘草、土甘草、白洋参、白元参，白玄参。唇形科糙苏属草本植物，根茎肥厚、疙瘩状串联。茎高30-80厘米，直立，四棱形、密被射线不等长的星状糙硬毛、不分枝。分布于云南西北部，四川西南部及西藏东部。该种根可入药。
随着制药和香料行业发展，假秦艽需求量不断扩大，自然生长的假秦艽供不应求。自然生长的假秦艽种子发芽率特别低，一直制约着假秦艽的人工种植。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种假秦艽的组培育苗方法，用以解决假秦艽种子发芽率低制约人工种植假秦艽的问题。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：
一种假秦艽的组培育苗方法，包括如下步骤：
S1、脱毒：将假秦艽的外植体放置于0.05～0.3％(m/v)氯化汞溶液中消毒3～30分钟，然后无菌水清洗0～5次；
S2、脱分化：将消毒后的外植体置于含2,4-D 0.2～2mg/L的植物组培培养基上，先进行5～10天暗培养，然后改为有光培养，10～50天后转至含6-BA 0.3～1mg/L的植物组培培养基上培养，重复此步骤5～8次完成脱分化；
S3、增殖培养：将脱分化后的组织置于含6-BA 0.2～1.0mg/L、萘乙酸0.05～0.5mg/L的植物组培培养基中，于15～28℃、光照强度100～5000Lx、光照时间8～20h/天的条件下培养；
S4、再分化：将增殖后的组织转接到含萘乙酸0.2～1.0mg/L、吲哚丁酸0～2.0mg/L和吲哚乙酸0～10mg/L的植物组培培养基中，在15～28℃、光照强度1000～5000Lx、光照时间8～20h/天的条件下培养10～20天，得生根苗；
S5、炼苗：将生根苗从培养瓶中取出，用清水将根部洗净，移栽至pH值为5～8、EC值为500～25000μS/cm的营养土中，光照强度2000～20000Lx，炼苗15～25天。
在本发明提供的假秦艽的组培育苗方法中，优选地，步骤S1中所述的外植体为叶片、叶柄、根、茎或种子。
在本发明提供的假秦艽的组培育苗方法中，优选地，所述植物组培培养基为MS培养基、N6培养基或B5培养基。进一步优选地，所述植物组培培养基为MS培养基。
在本发明提供的假秦艽的组培育苗方法中，优选地，所述叶片、叶柄和茎置于0.05～0.3％(m/v)氯化汞溶液中消毒3～8分钟，所述根置于0.05～0.3％(m/v)氯化汞溶液中消毒8～12分钟，所述种子置于0.05～0.3％(m/v)氯化汞溶液中消毒10～30分钟。进一步优选地，所述叶片、叶柄和茎置于0.05～0.3％(m/v)氯化汞溶液中消毒5～6分钟，所述根置于0.05～0.3％(m/v)氯化汞溶液中消毒9～10分钟，所述种子置于0.05～0.3％(m/v)氯化汞溶液中消毒15～20分钟。
在本发明提供的假秦艽的组培育苗方法中，优选地，在步骤S2中，所述植物组培培养基中2,4-D的含量为0.2～0.5mg/L、6-BA的含量为0.4～0.5mg/L；所述暗培养为6～8天，培养温度为15℃。
进一步优选地，在步骤S3中，所述植物组培培养基中6-BA的含量为0.4～0.5mg/L、萘乙酸的含量为0.2mg/L；培养温度为有光照时18℃、无光照时15℃；光照强度为5000Lx；光照时间为14小时。
再进一步优选地，在步骤S4中，所述植物组培培养基中萘乙酸的含量为0.5～0.6mg/L、吲哚丁酸的含量为0.8～1.2mg/L、吲哚乙酸的含量为5～8mg/L；有光照时温度为18℃，无光照时温度为15℃；光照强度为5000Lx；光照时间为14小时/天。
更进一步优选地，在步骤S5中，所述pH值5～6；所述EC值(可溶性盐浓度)为800～1200μS/cm；光照强度为10000～20000Lx。
采用上述技术方案，由于在步骤S2中先进行暗培养、各步骤中采用合适的培养基、生长素浓度、培养温度和光照强度，提高了假秦艽的组培苗质量和缩短了育苗时间；在该组培育苗过程中暗培养、步骤S2中转至含6-BA的MS培养基上培养和步骤S3培养基的萘乙酸对组培苗的苗高、叶片、生根率和根系状况具有增效协同作用。本发明解决了假秦艽种子发芽率低制约人工种植假秦艽的问题。
附图说明
图1为假秦艽增殖培养过程的图片；
图2和图3为假秦艽再分化过程的图片；
图4为假秦艽炼苗过程的图片。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
实施例1
本实施例提供了一种假秦艽的组培育苗方法，包括如下步骤：
S1、脱毒：将假秦艽的叶柄放置于0.05％(m/v)氯化汞溶液中消毒3分钟，然后无菌水清洗5次；
S2、脱分化：将消毒后的外植体置于2,4-D 0.2mg/L的N6培养基上，先进行10天暗培养、培养温度为15℃，然后改为有光培养，25天后转至含6-BA 1mg/L的N6培养基上培养10天，重复此步骤5次完成脱分化；
S3、增殖培养：将脱分化后的组织置于含6-BA 0.4mg/L、萘乙酸0.05mg/L的N6培养基中，于有光照时18℃、无光照时15℃、光照强度1000Lx、光照时间10h/天的条件下培养10天；
S4、再分化：将增殖后的组织转接到含萘乙酸0.2mg/L、吲哚丁酸2.0mg/L和吲哚乙酸1mg/L的N6培养基中，在有光照时温度为18℃，无光照时温度为15℃、光照强度2000Lx、光照时间8h/天的条件下培养20天，得生根苗；
S5、炼苗：将生根苗从培养瓶中取出，用清水将根部洗净，移栽至pH值为5、EC值为500μS/cm的营养土中，光照强度20000Lx，炼苗15天。
实施例2
本实施例提供了一种假秦艽的组培育苗方法，包括如下步骤：
S1、脱毒：将假秦艽的叶片放置于0.1％(m/v)氯化汞溶液中消毒8分钟，然后无菌水清洗2次；
S2、脱分化：将消毒后的外植体置于2,4-D 2mg/L的B5培养基上，先进行5天暗培养、培养温度为15℃，然后改为有光培养，50天后转至含6-BA 0.3mg/L的B5培养基上培养12天，重复此步骤8次完成脱分化；
S3、增殖培养：将脱分化后的组织置于含6-BA 1.0mg/L、萘乙酸0.5mg/L的B5培养基中，于有光照时18℃、无光照时15℃、光照强度5000Lx、光照时间20h/天的条件下培养8天；
S4、再分化：将增殖后的组织转接到含萘乙酸1.0mg/L、吲哚丁酸0.05mg/L和吲哚乙酸10mg/L的B5培养基中，在有光照时温度为18℃，无光照时温度为15℃、光照强度5000Lx、光照时间20h/天的条件下培养10天，得生根苗；
S5、炼苗：将生根苗从培养瓶中取出，用清水将根部洗净，移栽至pH值为8、EC值为25000μS/cm的营养土中，光照强度2000Lx，炼苗25天。
实施例3
本实施例提供了一种假秦艽的组培育苗方法，包括如下步骤：
S1、脱毒：将假秦艽的叶柄放置于0.1％(m/v)氯化汞溶液中消毒5分钟，然后无菌水清洗3次；
S2、脱分化：将消毒后的外植体置于2,4-D 0.3mg/L的MS培养基上，先进行6天暗培养、培养温度为15℃，然后改为有光培养，10天后转至含6-BA 0.5mg/L的MS培养基上培养10天，重复此步骤6次完成脱分化；
S3、增殖培养：将脱分化后的组织置于含6-BA 0.4mg/L、萘乙酸0.2mg/L的MS培养基中，于有光照时18℃、无光照时15℃、光照强度5000Lx、光照时间14h/天的条件下培养15天；
S4、再分化：将增殖后的组织转接到含萘乙酸0.5mg/L、吲哚丁酸0.8mg/L和吲哚乙酸5mg/L的MS培养基中，在有光照时温度为18℃，无光照时温度为15℃、光照强度5000Lx、光照时间14h/天的条件下培养10天，得生根苗；
S5、炼苗：将生根苗从培养瓶中取出，用清水将根部洗净，移栽至pH值为5、EC值为800μS/cm的营养土中，光照强度10000Lx，炼苗15天。
实施例4
本实施例提供了一种假秦艽的组培育苗方法，包括如下步骤：
S1、脱毒：将假秦艽的种子放置于0.2％(m/v)氯化汞溶液中消毒15分钟，然后无菌水清洗4次；
S2、脱分化：将消毒后的外植体置于2,4-D 1.2mg/L的MS培养基上，先进行7天暗培养、培养温度为15℃，然后改为有光培养，12天后转至含6-BA 0.7mg/L的MS培养基上培养10天，重复此步骤5次完成脱分化；
S3、增殖培养：将脱分化后的组织置于含6-BA 0.3mg/L、萘乙酸0.1mg/L的N6培养基中，于有光照时18℃、无光照时15℃、光照强度4000Lx、光照时间15h/天的条件下培养14天；
S4、再分化：将增殖后的组织转接到含萘乙酸0.8mg/L、吲哚丁酸0.5mg/L和吲哚乙酸7mg/L的N6培养基中，在有光照时温度为18℃，无光照时温度为15℃、光照强度3000Lx、光照时间14h/天的条件下培养16天，得生根苗；
S5、炼苗：将生根苗从培养瓶中取出，用清水将根部洗净，移栽至pH值为7、EC值为1200μS/cm的营养土中，光照强度15000Lx，炼苗16天。
实施例5
本实施例提供了一种假秦艽的组培育苗方法，包括如下步骤：
S1、脱毒：将假秦艽的种子放置于0.2％(m/v)氯化汞溶液中消毒15分钟，然后无菌水清洗4次；
S2、脱分化：将消毒后的外植体置于2,4-D 1.2mg/L的MS培养基上培养，光照时间为12h/天、12天后转至含6-BA 0.7mg/L的MS培养基上培养11天，重复此步骤6次完成脱分化；
S3、增殖培养：将脱分化后的组织置于含6-BA 0.6mg/L、萘乙酸0.2mg/L的MS培养基中，于有光照时18℃、无光照时15℃、光照强度4500Lx、光照时间12h/天的条件下培养10天；
S4、再分化：将增殖后的组织转接到含萘乙酸0.4mg/L、吲哚丁酸0.3mg/L和吲哚乙酸3mg/L的MS培养基中，在有光照时温度为18℃，无光照时温度为15℃、光照强度3600Lx、光照时间14h/天的条件下培养20天，得生根苗；
S5、炼苗：将生根苗从培养瓶中取出，用清水将根部洗净，移栽至pH值为7、EC值为1500μS/cm的营养土中，光照强度18000Lx，炼苗17天。
实施例6
本实施例提供了一种假秦艽的组培育苗方法，包括如下步骤：
S1、脱毒：将假秦艽的叶片放置于0.2％(m/v)氯化汞溶液中消毒7分钟，然后无菌水清洗3次；
S2、脱分化：将消毒后的外植体置于2,4-D 1.2mg/L的MS培养基上，先进行5天暗培养、培养温度为15℃，然后改为有光培养10天，重复此步骤7次完成脱分化；
S3、增殖培养：将脱分化后的组织置于含6-BA 0.6mg/L、萘乙酸0.3mg/L的MS培养基中，于有光照时18℃、无光照时15℃、光照强度4200Lx、光照时间10h/天的条件下培养15天；
S4、再分化：将增殖后的组织转接到含萘乙酸0.9mg/L、吲哚丁酸1.5mg/L和吲哚乙酸4mg/L的MS培养基中，在有光照时温度为18℃，无光照时温度为15℃、光照强度2500Lx、光照时间14h/天的条件下培养12天，得生根苗；
S5、炼苗：将生根苗从培养瓶中取出，用清水将根部洗净，移栽至pH值为6、EC值为1000μS/cm的营养土中，光照强度13000Lx，炼苗17天。
实施例7
本实施例提供了一种假秦艽的组培育苗方法，包括如下步骤：
S1、脱毒：将假秦艽的种子放置于0.25％(m/v)氯化汞溶液中消毒18分钟，然后无菌水清洗4次；
S2、脱分化：将消毒后的外植体置于2,4-D 1.0mg/L的MS培养基上，先进行8天暗培养、培养温度为15℃，然后改为有光培养，15天后转至含6-BA 0.4mg/L的MS培养基上培养18天，重复此步骤6次完成脱分化；
S3、增殖培养：将脱分化后的组织置于含6-BA 0.3mg/L的N6培养基中，于有光照时18℃、无光照时15℃、光照强度3600Lx、光照时间16h/天的条件下培养15天；
S4、再分化：将增殖后的组织转接到含萘乙酸0.6mg/L、吲哚丁酸0.5mg/L和吲哚乙酸6mg/L的N6培养基中，在有光照时温度为18℃，无光照时温度为15℃、光照强度3000Lx、光照时间14h/天的条件下培养16天，得生根苗；
S5、炼苗：将生根苗从培养瓶中取出，用清水将根部洗净，移栽至pH值为5、EC值为1500μS/cm的营养土中，光照强度18000Lx，炼苗18天。
为了验证本发明的有益效果，按以上各实施例的方法对假秦艽进行组培育苗，对各指标进行考查，结果见表1。
表1按各实施例的方法进行组培育苗移栽苗的各项目结果
组别 苗高/cm 叶片/片 生根率/％ 根系状况 其它
实施例1 >6 >9 96 完整、较发达、新鲜 无病害
实施例2 >6 >9 95 完整、较发达、新鲜 无病害
实施例3 >6 >9 97 完整、较发达、新鲜 无病害
实施例4 >6 >8 96 完整、较发达、新鲜 无病害
实施例5 >4 <7 89 完整、较弱 无病害
实施例6 <4 <6 85 完整、较弱 无病害
实施例7 <4 <6 87 完整、较弱 无病害
由上表可以看出，实施例1至4中苗高均大于6cm，实施例5的苗高大于4cm，实施例6和7的苗高小于4cm；实施例1至4中叶片数均大于8片，实施例5的叶片数小于7片，实施例6和7的叶片数小于6片；实施例1至4的生根率大于95％，实施例5至7的生根率小于89％；实施例1至4的根系完整、较发达、新鲜，实施例5至7的根系完整、较弱。在实施例5中，步骤S2没有暗培养；在实施例6中，步骤S2中没有转至含6-BA的MS培养基上培养；在实施例7中步骤S3中培养基中不含萘乙酸。可见，暗培养、步骤S2中转至含6-BA的MS培养基上培养和步骤S3培养基的萘乙酸对组培苗的苗高、叶片、生根率和根系状况具有增效协同作用。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种假秦艽的组培育苗方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、脱毒：将假秦艽的外植体放置于0.05～0.3％(m/v)氯化汞溶液中消毒3～30分钟，然后无菌水清洗0～5次；
S2、脱分化：将消毒后的外植体置于含2,4-D 0.2～2mg/L的植物组培培养基上，先进行5～10天暗培养，然后改为有光培养，10～50天后转至含6-BA 0.3～1mg/L的植物组培培养基上培养，重复此步骤5～8次完成脱分化；
S3、增殖培养：将脱分化后的组织置于含6-BA 0.2～1.0mg/L、萘乙酸0.05～0.5mg/L的植物组培培养基中，于15～28℃、光照强度1000～5000Lx、光照时间8～20h/天的条件下培养；
S4、再分化：将增殖后的组织转接到含萘乙酸0.2～1.0mg/L、吲哚丁酸0.05～2.0mg/L和吲哚乙酸1～10mg/L的植物组培培养基中，在15～28℃、光照强度1000～5000Lx、光照时间8～20h/天的条件下培养10～20天，得生根苗；
S5、炼苗：将生根苗从培养瓶中取出，用清水将根部洗净，移栽至pH值为5～8、EC值为500～25000μS/cm的营养土中，光照强度2000～20000Lx，炼苗15～25天；
步骤S1中所述的外植体为叶片、叶柄或种子；
所述植物组培培养基为MS培养基、N6培养基或B5培养基。
2.根据权利要求1所述的假秦艽的组培育苗方法，其特征在于，所述叶片和叶柄置于0.05～0.3％(m/v)氯化汞溶液中消毒3～8分钟，所述种子置于0.05～0.3％(m/v)氯化汞溶液中消毒10～30分钟。
3.根据权利要求2所述的假秦艽的组培育苗方法，其特征在于，所述叶片和叶柄置于0.05～0.3％(m/v)氯化汞溶液中消毒5～6分钟，所述种子置于0.05～0.3％(m/v)氯化汞溶液中消毒15～20分钟。
4.根据权利要求1所述的假秦艽的组培育苗方法，其特征在于，所述植物组培培养基为MS培养基。
5.根据权利要求1所述的假秦艽的组培育苗方法，其特征在于，在步骤S2中，所述植物组培培养基中2,4-D的含量为0.2～0.5mg/L、6-BA的含量为0.4～0.5mg/L；所述暗培养为6～8天，培养温度为15℃。
6.根据权利要求5所述的假秦艽的组培育苗方法，其特征在于，在步骤S3中，所述植物组培培养基中6-BA的含量为0.4～0.5mg/L、萘乙酸的含量为0.2mg/L；培养温度为有光照时18℃、无光照时15℃；光照强度为5000Lx；光照时间为14小时。
7.根据权利要求6所述的假秦艽的组培育苗方法，其特征在于，在步骤S4中，所述植物组培培养基中萘乙酸的含量为0.5～0.6mg/L、吲哚丁酸的含量为0.8～1.2mg/L、吲哚乙酸的含量为5～8mg/L；有光照时温度为18℃，无光照时温度为15℃；光照强度为5000Lx；光照时间为14小时。
8.根据权利要求7所述的假秦艽的组培育苗方法，其特征在于，在步骤S5中，所述pH值5～6；所述EC值为800～1200μS/cm；光照强度为10000～20000Lx。
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