CN107299060A - 一种青霉素高产菌株及其筛选方法和应用 - Google Patents

一种青霉素高产菌株及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种青霉素高产菌株，同时提供上述菌株的筛选方法，以及提供上述菌株在青霉素生产中的应用，属于抗生素生产及其应用的技术领域。本发明的菌株将青霉素发酵单位提高了13.2％，有效地提高了青霉素的产量、降低了生产成本，其筛选方法包括以下步骤：(A)原生质体制备；(B)高能电子诱变；(C)理性化筛选；(D)摇瓶筛选。本发明提供了一种筛选方法目的性强、突变株几率高的青霉素筛选方法及其应用。

Description

一种青霉素高产菌株及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及一种用于抗生素生产的工业菌株及其筛选方法和在发酵领域中的应用，具体涉及一种青霉素高产菌株及其筛选方法和应用。
背景技术
青霉素(Penicillin)属于β-内酰胺类抗生素，是一种高效、低毒、临床应用广泛的重要抗生素；青霉素还可以作为原料，合成一系列的半合成青霉素类和半合成头孢菌素类抗生素。青霉素是由产黄青霉菌(Penicillium Chrysogenum)在发酵过程中通过次级代谢而合成的。目前，产黄青霉菌优良菌种的选育方法通常采用杂交育种、化学诱变剂诱变育种、物理诱变剂诱变育种和基因工程育种等，但筛选出来用于青霉素发酵的产黄青霉菌菌种，其生产能力较低。王成等公开了一种利用高能电子照射青霉素孢子的诱变方法(王成，张军剪，尹贵超.产黄青霉菌高能电子诱变选育.煤炭与化工2014，37(2)： 68-69.)，该方法利用高能电子直接诱变青霉素孢子，由于真菌孢子壁厚，具有照射剂量大，致死率高，突变率低等缺点；利用高浓度苯乙酸平板筛选耐受高浓度苯乙酸的突变株，筛选得到的突变株13-6-55号发酵单位比对照提高3.6％，其提高幅度较低，而且苯乙酸加入量增多。在青霉素发酵领域，如何提高青霉素菌种的发酵能力，进而提高青霉素产量，降低生产成本，一直是本领域生产企业及科研人员的重点研究课题和努力的方向。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是如何提供一种青霉素高产突变株几率高的青霉素及其筛选方法和应用。
为实现本发明的目的，本发明提供了一种青霉素高产菌株，该菌株的名称为产黄青霉(Penicillium Chrysogenum)B131536，保藏编号为CGMCC No.13576，保藏日期为2017年1月9日，保藏单位为CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号。
本发明所提供的B131536菌株其微生物学特征如下：
单菌落的形态为：菌落呈白色、圆形、中间凸起、菌落布满规则褶皱；孢子呈白色或灰白色，显微镜下孢子呈圆形。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种青霉素高产菌株的筛选方法，包括以下步骤：
(A)原生质体制备：
A-1)将出发菌株接种到菌丝培养基摇瓶中培养，得到菌丝培养液；
A-2)将菌丝培养液进行离心处理，弃上清液，向下层沉淀中加入等体积的无菌水，振荡后再离心处理；弃上层清液后加入缓冲液，搅拌后离心，弃去上清后在下层沉淀中加入Lyzing enzymes L-1412混合酶，水浴中振荡进行酶解，得到酶解液；
A-3)将酶解液过滤除去残余未酶解的菌丝，离心收集，得到原生质体，用缓冲液洗涤两次，镜检计数，原生质体悬液浓度达到107/mL时，停止酶解，将原生质体悬液装入至两组无菌西林瓶中，备用；
(B)高能电子诱变：利用电子直线加速器照射的一组西林瓶中的原生质体悬液；
(C)理性化筛选：将照射组的原生质体悬液和未经照射组的原生质体悬液分别稀释后，涂布在含有等渗分离培养基皿中进行培养，并从照射组中挑选目标菌落；
(D)摇瓶筛选：
D-1)将目标菌落接种到斜面培养基上培养，斜面上菌种成熟后进行摇瓶初筛，将斜面挖块儿接种到种子培养基摇瓶中培养，菌种成熟后将其接种到30～ 40mL发酵培养基摇瓶中培养，得到发酵液；
D-2)测定两组发酵液中青霉素的效价，效价高于未经照射组15％的发酵液所对应的菌株再次进行摇瓶筛选确认，摇瓶复筛与步骤(D-1)相同，摇瓶筛选发酵液中青霉素效价最高的发酵液对应的菌株即为高产的产黄青霉菌。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤A-1)所用的菌丝培养基按质量体积比加入，其成分组成为：蔗糖1.5～3.5％，蛋白胨0.5～2.5％，酵母粉1.5～ 3.0％，硫酸铵0.1～0.5％，磷酸二氢钾0.1～0.6％，其余为蒸馏水，将菌丝培养基的pH调节至6.0±0.2，菌丝培养的温度为25±0.5℃，相对湿度为40％～60％，培养2～3天，离心转速为3000～4000rpm，离心时间为10～15min。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤A-2)的缓冲液为0.7mol/L氯化钾溶液与0.01mol/L磷酸溶液的混合液，缓冲液的pH为6.5，Lyzing enzymes L-1412混合酶的重量百分数为0.4％～0.5％，加入量为30～40mL，步骤A-3) 中的温度为30±0.5℃，水浴振荡酶解的转速为100～200r/min，时间为3～5小时。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤(B)中采用的是BF-5型电子直线加速器，距离为20～30cm，辐射剂量为30～90Gy/s，照射时间为10～90秒。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤(C)中原生质体悬液稀释10-3～ 10-5倍，筛选的温度为25±0.5℃，相对湿度40％～60％条件下避光培养12～15 天，挑选的目标菌落为诱变后菌落直径大于未经照射组的菌落直径10％以上的菌落，所用等渗分离培养基按质量体积比加入，其成分组成为：红糖0.5～2.5％，酵母粉0.1～0.6％，甘油0.5～1.5％，氯化钠0.5～2.0％，硫酸钙0.01～0.08％，磷酸二氢钾0.0005～0.002％，硫酸镁0.0004～0.002％，硫酸铜0.0001～0.001％，硫酸亚铁0.0001～0.001％，琼脂1.5～2.0％，用0.7mol/L氯化钾溶液配制，加入苯乙酸至0.4～0.6mg/mL，将菌丝培养基的pH调节至6.8±0.2。
本发明技术方案的进一步改进在于：步骤(D)斜面培养的温度是25±0.5℃，相对湿度40％～60％条件下避光培养5～8天，摇瓶中培养的温度为25±0.5℃，相对湿度40％～60％，摇瓶培养的转速为220～250rpm，培养时间为38～170 小时。
一种利用青霉素高产菌株在青霉素发酵生产中的应用，将该高产菌株菌液接种到小米孢子培养基中，小米孢子成熟后接种到种子罐培养基中，菌种成熟后将其接种到发酵罐培养基中，培养后制得青霉素发酵液。
本发明技术方案的进一步改进在于：小米孢子培养的温度是25±0.5℃，相对湿度40～60％条件下避光培养6～8天，种子罐培养基在25±0.5℃，120～ 150rpm，通气比1:0.8～1:1.2的条件下培养60～70小时，发酵罐培养基的培养温度为25±0.5℃，100～130rpm，通气比1:1～1:1.5，残糖含量0.01～0.03mg/mL，氨氮含量0.1～0.3mg/mL，苯乙酸含量0.2～0.3mg/mL，pH值6.2～6.6的条件下培养6～8天。
本发明技术方案的进一步改进在于：所用小米孢子培养基，按质量体积比计算，其成分组成为：蔗糖0.2～0.8％，玉米浆1.0～1.5％，氯化钠0.1～0.3％，硫酸镁0.0004～0.002％，硫酸亚铁0.0001～0.001％。
由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术进步是：
本发明采用高能电子照射产黄青霉菌原生质体的诱变方法，由于原生质体去除了真菌表面较厚的细胞壁层，对物理诱变剂更加敏感，具有照射剂量小，致死率低，突变率高等的优点。
苯乙酸作为前体对青霉素合成是必需的，但其对青霉素菌丝具有毒性，抑制青霉素菌丝的生长，苯乙酸浓度越高对青霉素菌丝生长抑制越强。本发明利用高能电子主动诱变产黄青霉菌，使产黄青霉菌的基因组发生变化，然后利用含有较高浓度苯乙酸的平皿进行初步筛选，该筛选方法更加具有针对性：挑选的目标菌落为，诱变后菌落直径大于对照菌落直径10％以上的菌落，说明目标菌落对较高浓度苯乙酸具有耐受力；该筛选方法具有高通量特性：筛选条件简单，筛选的菌落数目多，符合筛选条件的菌落特征明显。筛选得到的耐受苯乙酸的突变株在正常苯乙酸浓度下菌丝生长状态会更好，产抗能力更强，在正常苯乙酸浓度下再利用摇瓶筛选青霉素效价高的菌株以得到高产菌株。本发明提供的青霉素高产菌株筛选方法优点在于：诱变方法适合，筛选通量大，目的性强，经过平皿和摇瓶双重筛选。
本发明所述产黄青霉菌B131536经菌株复试及稳定性考察结果可知，其具有良好的传代稳定性，同时用于青霉素生产时，可以有效的提高青霉素的发酵单位和产量；本发明所述的诱变和筛选方法高效可靠。
具体实施方式
下面对本发明内容做进一步说明：
一种青霉素高产菌株的筛选方法，包括以下步骤，
(A)原生质体制备：
A-1)将出发菌株即B1123号孢子液(华北制药河北华民药业有限责任公司自有生产菌株)接种到菌丝培养基摇瓶中培养，得到菌丝培养液，其中菌丝培养基按质量体积比加入，其成分组成为：蔗糖1.5～3.5％，蛋白胨0.5～2.5％， 1酵母粉1.5～3.0％，硫酸铵0.1～0.5％，磷酸二氢钾0.1～0.6％，其余为蒸馏水，将菌丝培养基的pH调节至6.0±0.2，菌丝培养的温度为25±0.5℃，相对湿度为 40％～60％，培养2～3天，离心转速为3000～4000rpm，离心时间为10～15min；
A-2)将菌丝培养液进行离心处理，弃上清液，向下层沉淀中加入等体积的无菌水，振荡后再离心处理；弃上层清液后加入缓冲液，搅拌后离心，弃去上清后在下层沉淀中加入Lyzing enzymes L-1412混合酶，水浴中振荡进行酶解，得到酶解液，缓冲液为0.7mol/L氯化钾溶液与0.01mol/L磷酸溶液的混合液，缓冲液的pH为6.5，Lyzing enzymes L-1412混合酶的重量百分数为0.4％～0.5％，加入量为30～40mL，步骤A-3)中的温度为30±0.5℃，水浴振荡酶解的转速为 100～200r/min，时间为3～5小时；
A-3)将酶解液过滤除去残余未酶解的菌丝，离心收集，得到原生质体，用缓冲液洗涤两次，镜检计数，原生质体悬液浓度达到107/mL时，停止酶解，将原生质体悬液装入至两组无菌西林瓶中，备用；
(B)高能电子诱变：利用BF-5型电子直线加速器照射其中一组西林瓶中的原生质体悬液，照射的距离为20～30cm，辐射剂量为30～90Gy/s，照射时间为10～90秒；
(C)理性化筛选：将照射组的原生质体悬液和未经照射组的原生质体悬液分别稀释10-3～10-5倍后，筛选的温度为25±0.5℃，相对湿度40％～60％条件下避光培养12～15天，涂布在含有等渗分离培养基皿中进行培养，并挑选目标菌落。；
(D)摇瓶筛选：
D-1)将目标菌落接种到斜面培养基上培养，斜面培养的温度是25±0.5℃，相对湿度40％～60％条件下避光培养5～8天，按质量体积比计算，其组成成分为：红糖0.5～2.5％，酵母粉0.1～0.6％，甘油0.5～1.5％，氯化钠0.5～2.0％，硫酸钙0.01～0.08％，磷酸二氢钾0.0005～0.002％，硫酸镁0.0004～0.002％，硫酸铜0.0001～0.001％，0硫酸亚铁.0001～0.001％，琼脂1.5～2.0％，用蒸馏水配制，将斜面培养基的pH调节至6.8±0.2；
斜面上菌种成熟后进行摇瓶初筛，种子中培养的温度为25±0.5℃，相对湿度40％～60％，摇瓶培养的转速为220～250rpm，培养时间为38～45小时。将斜面挖块儿接种到种子培养基摇瓶中培养，种子培养基按质量体积比计算，其成分为：1.5～3.5％蔗糖，4.0～8.0％玉米浆，0.2～0.6％硫酸铵，0.4～1.0％碳酸钙，用蒸馏水配制，将种子培养基的pH调节至5.8±0.2；
菌种成熟后将其接种到30～40mL发酵培养基摇瓶中培养，培养的温度为 25±0.5℃，相对湿度40％～60％，摇瓶培养的转速为220～250rpm，培养时间为150-170小时，得到发酵液；发酵培养基按质量体积比计算，其组成成分为：乳糖13～15％，麸质粉0.3～0.6％，玉米浆4.0～8.0％，硫酸铵0.3～0.8％，磷酸二氢钾0.2～0.7％，硫酸钠0.1～0.3％，硫酸锰0.001～0.003％，硫酸亚铁0.01～ 0.03％，碳酸钙0.4～1.0％，用蒸馏水配制，将发酵培养基的pH调节至pH5.8±0.2，每天补入10％苯乙酸0.3mL。
D-2)测定两组发酵液中青霉素的效价，效价高于未经照射组15％的发酵液所对应的菌株再次进行摇瓶筛选确认，摇瓶复筛与步骤(D-1)相同，摇瓶筛选发酵液中青霉素效价最高的发酵液对应的菌株即为青霉菌高产菌株。
一种青霉素高产菌株在青霉素发酵生产中的应用，将该高产菌株菌液接种到小米孢子培养基中，小米孢子培养的温度是25±0.5℃，相对湿度40～60％条件下避光培养6～8天，按质量体积比计算小米孢子培养基，其成分组成为：蔗糖0.2～0.8％，玉米浆1.0～1.5％，氯化钠0.1～0.3％，硫酸镁0.0004～0.002％，硫酸亚铁0.0001～0.001％；其制备方法为：将小米孢子培养基的pH调节至 6.8±0.2，每100mL小米孢子培养基加入230～260克干燥的小米，搅匀后在消毒柜中100±2℃蒸20分钟，将蒸好的米放在风扇口吹凉、搓散，将小米分装入茄子瓶中(20g/瓶)，将茄子瓶放入消毒柜121℃，30min即可。
小米孢子成熟后接种到种子罐培养基中，种子罐培养基在25±0.5℃，120～150rpm，通气比1:0.8～1:1.2的条件下培养60～70小时，菌种成熟后将其接种到发酵罐培养基中，发酵罐培养基的培养温度为25±0.5℃，100～130rpm，通气比1:1～1:1.5，残糖含量0.01～0.03mg/mL，氨氮含量0.1～0.3mg/mL，苯乙酸含量0.2～0.3mg/mL，pH值6.2～6.6的条件下培养6～8天培养后制得青霉素发酵液；按质量体积比计算种子罐培养基，其组成成分为：蔗糖1.5～3.5％，玉米浆4.0～8.0％，硫酸铵0.2～0.6％，碳酸钙0.1～0.6％，种子罐培养基用深井水配制，将种子培养基的pH调节至6.0±0.2；所用发酵罐培养基，按质量体积比计算，其组成成分为：麸质粉0.3～0.6％，玉米浆4.0～8.0％，硫酸铵0.3～ 0.8％，磷酸二氢钾0.2～0.7％，硫酸钠0.1～0.3％，0硫酸锰.001～0.003％，硫酸亚铁0.01～0.03％，碳酸钙0.1～0.6％；在发酵过程中补入无菌的含量为90～95％葡萄糖，无菌的含量为28～30％硫酸铵，无菌的含量为18～20％氨水和无菌的含量为28～30％苯乙酸。
下面通过具体实施例对本发明内容做进一步的说明，但不以任何方式对本发明进行限制。
实施例1、(青霉素高产菌株的筛选)
菌丝培养基制备：称取2.5g蔗糖，1.5g蛋白胨，2.0g酵母粉，0.3g硫酸铵， 0.4g磷酸二氢钾，加蒸馏水定容至100mL，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节pH至6.0±0.2，每个250mL三角瓶分装30mL菌丝培养基，8层纱布封口，121℃下灭菌20min，冷却后得菌丝培养基；
(A)原生质体制备：
A-1)将出发菌株B1123号孢子液(华北制药河北华民药业有限责任公司自有生产菌株)接种到30mL菌丝培养基摇瓶中，在25±0.5℃、相对湿度40％～ 60％条件下培养2天，获得菌丝培养液；
A-2)取10mL培养液于无菌离心管中3000rpm离心10min，弃上清后加入10mL无菌水，转入装有玻璃珠和10mL水的三角瓶中，220rpm振荡20min，振荡后取10mL移入无菌离心管3000rpm离心10min，弃上清后加入10mL PB 等渗缓冲液(0.7mol/L氯化钾溶液，0.01mol/L磷酸缓冲液，pH6.5)，用玻璃棒搅拌均匀后3000rpm离心10min，弃去上清后在沉淀中加入30mL 0.4％浓度的Lyzing enzymes L-1412混合酶(PB等渗缓冲液溶解)，30±0.5℃水浴100r/min 振荡酶解5小时，得到酶解液；
A-3)酶解液镜检有大量原生质体释放后，用2层纱布过滤除去大部分残余未酶解的菌丝，加脱脂棉的无菌针管过滤几次，至镜检无菌丝残留，1500rpm 离心收集原生质体，用PB等渗缓冲液洗涤两次，镜检计数，原生质体悬液浓度约为107/mL，将原生质体悬液装入至两组无菌西林瓶中，备用；
(B)高能电子诱变：利用BF-5型电子直线加速器照射装入西林瓶中的原生质体悬液，距离20cm、辐射剂量50Gy/s、照射时间30秒；
(C)理性化筛选：
等渗分离培养基制备：称取150g红糖，30g酵母粉，75g甘油，100g氯化钠，4g硫酸钙，0.08g磷酸二氢钾，0.06g硫酸镁，0.01g硫酸铜，0.02g硫酸亚铁，180g琼脂，加入苯乙酸至0.5mg/mL，用0.7mol/L氯化钾溶液定容至 10000mL，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节pH至6.8±0.2，121℃下灭菌20min，灭菌完成后倒入无菌平皿中，自然冷却凝固后得等渗分离培养基；
理性化筛选：将照射后的原生质体悬液稀释10-3倍，将对照原生质体悬液稀释10-5倍，稀释后分别涂布在含有0.5mg/mL苯乙酸的等渗分离培养基平皿上，在25±0.5℃、相对湿度40％～60％条件下避光培养14天，挑选的目标菌落为，诱变后菌落直径大于对照菌落直径10％以上的菌落；
(D)摇瓶筛选：
D-1)斜面培养基制备：称取称取30g红糖，6g酵母粉，15g甘油，20g氯化钠，0.8g硫酸钙，0.016g磷酸二氢钾，0.012g硫酸镁，0.002g硫酸铜，0.004g 硫酸亚铁，36g琼脂，蒸馏水定容至2000mL，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节pH至6.8±0.2，121℃下灭菌20min，灭菌完成后分装置若干试管中，铺成斜面，凝固后得到斜面培养基；
种子培养基制备：称取25g蔗糖，60g玉米浆，3g硫酸铵，5g碳酸钙，蒸馏水定容至1000mL，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节pH至 5.8±0.2，每个250mL三角瓶分装30mL种子培养基，8层纱布封口，121℃下灭菌30min，冷却后得种子培养基；
发酵培养基制备：称取390g乳糖，12g麸质粉，180g玉米浆，12g硫酸铵，15g磷酸二氢钾，6g硫酸钠，0.006g硫酸锰，0.3g硫酸亚铁，15g碳酸钙，蒸馏水定容至3000mL，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节pH至5.8±0.2，每个250mL三角瓶分装30mL发酵培养基，8层纱布封口，121℃下灭菌30min，冷却后得发酵培养基；
D-2)测定两组发酵液中青霉素的效价：挑取符合标准的单菌落接种到斜面培养基上，在25±0.5℃、相对湿度40％～60％条件下避光培养7天，斜面菌种成熟后进行摇瓶初筛，将斜面挖块儿接种到30mL种子培养基摇瓶中，在 25±0.5℃、相对湿度40％～60％、220rpm的条件下培养40小时，菌种成熟后将其接种到30mL发酵培养基摇瓶中，在25±0.5℃、相对湿度40％～60％、220rpm 的条件下培养168小时，得到发酵液，HPLC测定各发酵液中青霉素的效价，效价高于对照15％的发酵液所对应的菌株进行摇瓶复筛，复筛过程同初筛，复筛和初筛发酵液中最高青霉素效价为28325μ/mL和28920μ/mL，将其对应的菌株命名为高产黄青霉菌B131536；
将B131536菌株进行超低温冷冻保藏：向保存有B131536菌株的斜面中加入8mL含有20％甘油的无菌水溶液，用接种环将孢子刮下，混匀后用吸管分装至冷冻管中(0.5mL/支)，注明菌株名称，制备时间和有效期，冷冻至超低温冰箱中，其保藏单位是CGMCC-中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.13576，保藏日期为2017年1月9日。
实施例2、(青霉素高产菌株的遗传稳定性考察)
取实施例1中保藏的高产黄青霉菌B131536接种于实施例1制备的斜面培养基，在25±0.5℃、相对湿度40％～60％条件下避光培养7天，斜面菌种成熟后将其再次接种于斜面培养基中进行培养，重复四次；将这五次培养出的菌株分别各自转接至实施例1制备的种子培养基中，在25±0.5℃、相对湿度40％～ 60％、220rpm的条件下培养40小时，菌种成熟后各自转至接实施例1制备的发酵培养基中，在25±0.5℃、相对湿度40％～60％、220rpm的条件下培养7天，制得五组含有青霉素的发酵液，HPLC测定发酵液中青霉素的效价，按照传代培养顺序依次为：28423μ/mL、28122μ/mL、28905μ/mL、28268μ/mL、28750μ/mL；从实验结果可以看出，高产黄青霉菌B131536具有较好的传代稳定性。
实施例3、(青霉素高产菌株的生产应用)
小米孢子培养基制备：称取6g蔗糖，10g玉米浆，2g氯化钠，0.008g硫酸镁，0.005g硫酸亚铁，用蒸馏水定容至1000mL，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节pH至6.8±0.2，倒入装有2400克干燥小米的锅中，搅匀后在消毒柜中100±2℃蒸20分钟，将蒸好的小米放在风扇口吹凉、搓散，将小米分装入茄子瓶中(20g/瓶)，将茄子瓶放入消毒柜中，121℃下灭菌30min，冷却后得小米孢子培养基；
种子罐培养基制备：称取375kg蔗糖，900kg玉米浆，300kg硫酸铵，200kg 碳酸钙，用深井水定容至13m3，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节 pH至6.0±0.2，对种子罐进行实消，121℃下灭菌30min，利用循环水冷却，冷却后得15m3种子培养基；
发酵罐培养基制备：称取180kg麸质粉，2500kg玉米浆，135kg硫酸铵， 160kg磷酸二氢钾，120kg硫酸钠，1kg硫酸锰，1kg硫酸亚铁，400kg碳酸钙，用深井水定容至40m3，然后用质量分数为30％的氢氧化钠溶液调节pH至 6.0±0.2，对发酵罐进行实消，121℃下灭菌30min，利用循环水冷却，冷却后得 45m3发酵培养基；发酵过程中补入无菌的含量为95％葡萄糖、无菌的含量为 30％硫酸铵、无菌的含量为20％氨水和无菌的含量为30％苯乙酸；
高产菌株生产应用：将高产菌株B131536菌液接种到小米孢子培养基中，在25±0.5℃、相对湿度40％～60％条件下避光培养7天，米孢子成熟后接种到15m3种子罐培养基中，在培养温度为25±0.5℃，转速130rpm，通气比1:1的条件下培养65小时，菌种成熟后将其接种到45m3发酵罐培养基中，在25±0.5℃， 110rpm，通气比1:1.2残糖含量0.01mg/mL，氨氮含量0.2mg/mL，苯乙酸含量 0.25mg/mL，pH值6.4的条件下培养7天，制得青霉素发酵液。将该生产过程重复三次，HPLC测定发酵液中青霉素的效价，分别为126350μ/mL、 128250μ/mL、127050μ/mL，平均值为127217μ/mL。
实施例4、(出发菌株对比实验)
以高产黄青霉菌B131536的出发菌株B1123号孢子液(华北制药河北华民药业有限责任公司自有生产菌株)为发酵菌株，采用实施例3的生产条件进行三次平行实验，检测发酵液中青霉素的效价，分别为112580μ/mL、113572μ/mL、 110982μ/mL，平均值为112378μ/mL。比较出发菌株发酵液的平均效价与实施例3的发酵液效价可知，与出发株相比本发明所述的高产黄青霉菌B131536的青霉素发酵单位提高了13.2％。同样发酵条件下，该菌株有效的提高了青霉素的产量，节约了生产成本。

Claims (10)

1.一种青霉素高产菌株，其特征在于：该菌株的名称为产黄青霉菌(PenicilliumChrysogenum)B131536，保藏编号为CGMCC No.13576，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏日期为2017年1月9日。
2.一种权利要求1的青霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤，
(A)原生质体制备：
A-1)将出发菌株接种到菌丝培养基摇瓶中培养，得到菌丝培养液；
A-2)将菌丝培养液进行离心处理，弃上清液，向下层沉淀中加入等体积的无菌水，振荡后再离心处理；弃上层清液后加入缓冲液，搅拌后离心，弃去上清后在下层沉淀中加入Lyzing enzymes L-1412混合酶，水浴中振荡进行酶解，得到酶解液；
A-3)将酶解液过滤除去残余未酶解的菌丝，离心收集，得到原生质体，用缓冲液洗涤两次，镜检计数，原生质体悬液浓度达到107/mL时，停止酶解，将原生质体悬液装入至两组无菌西林瓶中，备用；
(B)高能电子诱变：利用电子直线加速器照射的一组西林瓶中的原生质体悬液；
(C)理性化筛选：将照射组的原生质体悬液和未经照射组的原生质体悬液分别稀释后，涂布在含有等渗分离培养基皿中进行培养，并从照射组中挑选目标菌落；
(D)摇瓶筛选：
D-1)将目标菌落接种到斜面培养基上培养，斜面上菌种成熟后进行摇瓶初筛，将斜面挖块儿接种到种子培养基摇瓶中培养，菌种成熟后将其接种到30～40mL发酵培养基摇瓶中培养，得到发酵液；
D-2)测定两组发酵液中青霉素的效价，效价高于未经照射组15％的发酵液所对应的菌株再次进行摇瓶筛选确认，摇瓶复筛与步骤(D-1)相同，摇瓶筛选发酵液中青霉素效价最高的发酵液对应的菌株即为高产的产黄青霉菌。
3.根据权利要求1所述的一种青霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于：步骤A-1)所用的菌丝培养基按质量体积比加入，其成分组成为：蔗糖1.5～3.5％，蛋白胨0.5～2.5％，酵母粉1.5～3.0％，硫酸铵0.1～0.5％，磷酸二氢钾0.1～0.6％，其余为蒸馏水，将菌丝培养基的pH调节至6.0±0.2，菌丝培养的温度为25±0.5℃，相对湿度为40％～60％，培养2～3天，离心转速为3000～4000rpm，离心时间为10～15min。
4.根据权利要求3所述的一种青霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于：步骤A-2)的缓冲液为0.7mol/L氯化钾溶液与0.01mol/L磷酸溶液的混合液，缓冲液的pH为6.5，Lyzingenzymes L-1412混合酶的重量百分数为0.4％～0.5％，加入量为30～40mL，步骤A-3)中的温度为30±0.5℃，水浴振荡酶解的转速为100～200r/min，时间为3～5小时。
5.根据权利要求4所述的一种青霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于：步骤(B)中采用的是BF-5型电子直线加速器，距离为20～30cm，辐射剂量为30～90Gy/s，照射时间为10～90秒。
6.根据权利要求2所述的一种青霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于：步骤(C)中原生质体悬液稀释10-3～10-5倍，筛选的温度为25±0.5℃，相对湿度40％～60％条件下避光培养12～15天，挑选的目标菌落为诱变后菌落直径大于未经照射组的菌落直径10％以上的菌落，所用等渗分离培养基按质量体积比加入，其成分组成为：红糖0.5～2.5％，酵母粉0.1～0.6％，甘油0.5～1.5％，氯化钠0.5～2.0％，硫酸钙0.01～0.08％，磷酸二氢钾0.0005～0.002％，硫酸镁0.0004～0.002％，硫酸铜0.0001～0.001％，硫酸亚铁0.0001～0.001％，琼脂1.5～2.0％，用0.7mol/L氯化钾溶液配制，加入苯乙酸至0.4～0.6mg/mL，将菌丝培养基的pH调节至6.8±0.2。
7.根据权利要求1～5任一项所述的一种青霉素高产菌株的筛选方法，其特征在于：步骤(D)斜面培养的温度是25±0.5℃，相对湿度40％～60％条件下避光培养5～8天，摇瓶中培养的温度为25±0.5℃，相对湿度40％～60％，摇瓶培养的转速为220～250rpm，培养时间为38～170小时。
8.一种利用权利要求1所述的一种青霉素高产菌株在青霉素发酵生产中的应用，其特征在于：将该高产菌株菌液接种到小米孢子培养基中，小米孢子成熟后接种到种子罐培养基中，菌种成熟后将其接种到发酵罐培养基中，培养后制得青霉素发酵液。
9.根据权利要求8所述的一种青霉素高产菌株在青霉素发酵生产中的应用，其特征在于：小米孢子培养的温度是25±0.5℃，相对湿度40～60％条件下避光培养6～8天，种子罐培养基在25±0.5℃，120～150rpm，通气比1:0.8～1:1.2的条件下培养60～70小时，发酵罐培养基的培养温度为25±0.5℃，100～130rpm，通气比1:1～1:1.5，残糖含量0.01～0.03mg/mL，氨氮含量0.1～0.3mg/mL，苯乙酸含量0.2～0.3mg/mL，pH值6.2～6.6的条件下培养6～8天。
10.根据权利要求9所述菌株在青霉素发酵生产中的应用，其特征在于：所用小米孢子培养基，按质量体积比计算，其成分组成为：蔗糖0.2～0.8％，玉米浆1.0～1.5％，氯化钠0.1～0.3％，硫酸镁0.0004～0.002％，硫酸亚铁0.0001～0.001％。
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