CN108587943A - 一种用于消除玉米自毒作用的复合菌剂及应用 - Google Patents

一种用于消除玉米自毒作用的复合菌剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于消除玉米自毒作用的复合菌剂及应用，其特征是：复合菌剂由伯克霍尔德菌、木霉菌按1:3‑3:1组成；伯克霍尔德菌（Burkholderia phytofirmans），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15326，菌株编号为20180101辽CK1，保藏日期为2018年1月29日；本发明采用种子包衣的方法。本发明的复合菌剂为植物内生菌和木霉益生菌的混合菌，在玉米植株的根际定殖能力好并且安全可靠，对连作玉米土壤中的自毒物质具有良好的降解作用，明显改善了土壤理化性质，同时对玉米植株的抗逆能力具有明显的促进作用，提高玉米的产量和果实品质；该复合菌剂制备方法简单，配方合理，可以用于玉米连作障碍的治理。

Description

一种用于消除玉米自毒作用的复合菌剂及应用
技术领域
本发明涉及微生物和连作障碍修复领域，具体涉及一种用于消除玉米自毒作用的复合菌剂及应用。
背景技术
玉米是我国北方重要的大田作物，连续种植导致保护地土壤生态环境发生改变，植物病残体及根系分泌物与病原微生物的代谢物对下茬玉米具有毒害作用，影响种子萌发、植株生长、细胞分裂、病原菌活性和土壤微生物结构，从而引发玉米的自毒作用，从而产生连作障碍。
研究表明，可以采用拮抗菌等手段缓解并修复由自毒作用和根系土传病害等引起的连作障碍的发生，目前大多采用杀菌剂和化肥进行土壤治理玉米上的连作障碍，其后果是导致土壤板结酸化、养分失衡、次生盐渍化等问题，缺乏安全有效的生物菌治理严重制约了玉米连作障碍的治理和可持续发展，已成为玉米农业生产亟需解决的瓶颈问题之一。
植物内生菌能够提高植株的抗逆能力，并与有害菌竞争营养和生存空间，降低土壤病原菌的数量及其对根系的侵染能力，从而降低土传病害发病率，解决实际生产中的连作障碍问题。不是所有的内生菌对作物都有增强抗逆能力的作用，必须经过大量的筛选拮抗研究，获得既可以降解玉米根系分泌物中自毒物质又可以提高植株本身防御酶体系的内生益生菌。
发明内容
为了弥补上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于消除玉米自毒作用的复合菌剂及应用，用于降解玉米根际的自毒物质，解决玉米连作障碍问题，起到促进植株生长和降解自毒作用的目的。
本发明的目的是通过以下技术解决方案实现的：一种用于消除玉米自毒作用的复合菌剂及应用，其技术要点是：复合菌剂由伯克霍尔德菌、木霉菌按1:3-3:1组成；伯克霍尔德菌在菌液的浓度为1.5-3.5×107-8cfu/ml，木霉在菌液中的浓度为1.5-3.5×107-8cfu/mL。
伯克霍尔德菌(Burkholderia phytofirmans)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15326，菌株编号为20180101辽CK1，保藏日期为2018年1月29日。
该菌株的菌落及菌体特征为：该自毒物质降解菌在NA培养基(酵母浸粉1g；牛肉膏3g；蛋白胨5g；蔗糖10g；琼脂18g；蒸馏水1000ml；121℃灭菌30min)上培养48h后菌落成白、圆形、表面光滑、隆起、边缘整齐、直径2～4mm。菌体杆状，丛生鞭毛，革兰氏染色阴性，不产芽孢。
该菌株生理生化特征为：氧化酶试验阴性或阳性、接触酶试验阴性或阳性、淀粉水解试验阴性、明胶液化试验阳性，硝酸盐还原试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、丙二酸盐利用试验阳性、H2S试验阳性、甲基红试验阳性、葡萄糖利用试验阳性、蔗糖利用试验阳性、麦芽糖利用试验阴性。
培养伯克霍尔德菌菌株的适宜培养基和LB培养基，配方包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L，接种量为培养基重量的2％，发酵温度为28℃，搅拌速度为120rpm，发酵时间为5天，得到菌悬液。
修复剂的使用方法：采用种子包衣的方法，播种前将玉米种子用75％乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗5次。采用5mL/50g(发酵液体积/种子质量)的比例进行种子处理，即将50g玉米种子与5mL发酵液搅拌充分混和，静置3-5个小时后播种。
进一步的，所述的木霉菌为绿色木霉菌或哈茨木霉菌。
本发明的有益效果：该微生物菌剂为植物内生菌和木霉益生菌的混合菌，在玉米植株的根际定殖能力好并且安全可靠，对连作玉米土壤中的自毒物质具有良好的降解作用，明显改善了土壤理化性质，同时对玉米植株的抗逆能力具有明显的促进作用，提高玉米的产量和果实品质；该复合菌剂制备方法简单，配方合理，可以用于玉米连作障碍的治理。
具体实施方式
1.材料和方法
1.1复合菌剂各成分的配制
(1)称取甜瓜根际土壤10g打磨后放入250mL的三角瓶中，加入90mL无菌水摇匀，在摇床上以120r·min-1摇30min，使土样充分混匀，配成10-1倍稀释液；用移液枪吸取1mL 10-1稀释液移入装有9mL无菌水的灭菌试管中，配成10-2倍稀释液；再用移液枪吸取1mL 10-2稀释液移入装有9mL无菌水的灭菌试管中，最终配成10-3倍稀释液。将无机盐培养基熔化，加入链霉素倒入灭菌培养皿中，待培养基冷却完全，用移液枪吸取0.1mL10-3倍稀释液于培养皿中，用无菌刮铲将培养液涂匀，每个处理重复3次，28℃温箱中培养48h，得到伯克霍尔德菌菌株。
伯克霍尔德菌(Burkholderia phytofirmans)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.15326，保藏日期为2018年1月29日。
培养伯克霍尔德菌菌株的适宜培养基和LB培养基，配方包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠(NaCl)10g/L，接种量为培养基重量的2％，发酵温度为28℃，搅拌速度为120rpm，发酵时间为5天，得到菌悬液。
(2)木霉菌
哈茨木霉菌可湿性粉剂(有效成分含量2×108cfu CFU/克，美国拜沃股份有限公司生产)
将伯克霍尔德菌和木霉菌按1:1:的比例，伯克霍尔德菌在菌液的浓度为2.0×108cfu/ml，木霉在菌液中的浓度为2.0×108cfu/mL。
1.2复合菌剂对玉米根际土壤中的酚酸物质的降解作用检测方法：
(1)取100g玉米连作土与复合菌剂50ml混合，25℃保湿条件下培养30天；100g连作土与50ml无菌水混合作空白对照；每个处理三次重复。
取25g的不同处理的土壤置于75mL的离心管中，向土壤中添加25mL的1mol·L-1的NaOH溶液，用漩涡震荡仪混匀后静置24h，次日经翻转摇匀仪混匀1h，超声波振荡器震荡30min，离心后分离上清液，采用12mol·L-1的盐酸调整土壤溶液pH值到2.5，静置2h后离心除去胡敏酸，分离上清液4℃保存准备分析测定。
(2)酚酸类物质HPLC分离和鉴定
标准溶液的配制：准确称量10mg香豆素、香草醛、对羟基苯甲酸、邻苯二甲酸二丁酯、苯甲酸、肉桂酸(由上海sigma生物科技有限公司提供)分别置入100mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至100mL，则该标准溶液每种酚酸的浓度100μg·mL-1。
(3)色谱条件：土壤中不同种类的酚酸的测定采用HPLC法(Agilent LC 1100，美国)。样品进样前必须经过用0.22μm的微孔滤膜过滤去除溶液中存在的杂质，色谱分离柱为SB-C18(Agilent 4.6mm×250mm)，设流速1mL·min-1，柱温25℃，样品检测波长280nm，每次进样量均为20μL，流动相A：甲醇(色谱级)和流动相B：pH＝2.8的乙酸水溶液(色谱级)，样品分离通过梯度洗脱的方法达到分离和缩短酚酸类物质保留时间的目的。洗脱条件B：70％(0min)→50％(15min)→30％(16min)→0％(30min)→end(30min)。采用保留时间进行定性，采用峰面积外标法进行定量。
(4)数据处理及统计分析
每试验重复3次，使用spss 17.0对数据进行统计分析，各处理间显著性差异分析使用Duncan法进行分析。
土壤中酚酸类物质含量R(mg·kg-1)的计算公式如下：R(mg·kg-1)＝
S样×V样×C标/S样×m(R-样品中某物质酚酸含量；S样-样品峰面积；V样-样品定容体积，mL；C标-标准溶液浓度，mg·L-1；S标-标准溶液峰面积；m-样品重量，g。)
降解率的计算公式：降解率＝对照组酚酸含量-处理组酚酸含量/对照组酚酸含量×100
1.3修复剂对玉米产量的影响
供试玉米品种：富友968。
试验地点：沈阳农业大学试验基地。
修复剂的使用方法：采用种子包衣的方法，播种前将玉米种子用75％乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗5次。采用5mL/50g(发酵液体积/种子质量)的比例进行种子处理，即将50g玉米种子与5mL发酵液搅拌充分混和，静置3-5个小时后播种。
2结果与分析
复合菌剂对玉米连作土壤中的酚酸物质的降解作用结果表明，该菌剂对玉米分泌物中的主要酚酸具有优异的降解作用，其中对香豆素、香草醛、对羟基苯甲酸等酚酸的降解最佳(见表1)。
表1复合菌剂对玉米连作土壤中的酚酸物质的降解作用
大田试验研究结果表明，外源施加修复剂可利于增强植株的生长和产量的提高，可利于增强植株的生长和产量的提高(见表2)。
表2修复剂对玉米株高、产量的作用

Claims (3)

1.一种用于消除玉米自毒作用的复合菌剂及应用，其特征是：复合菌剂由伯克霍尔德菌、木霉菌按1:3-3:1组成；伯克霍尔德菌在菌液的浓度为1.5-3.5×107-8cfu/ml，木霉在菌液中的浓度为1.5-3.5×107-8cfu/mL；
伯克霍尔德菌（Burkholderia phytofirmans），保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 15326，菌株编号为20180101辽CK1，保藏日期为2018年1月29日；
该菌株的菌落及菌体特征为：该自毒物质降解菌在NA培养基（酵母浸粉1g；牛肉膏3g；蛋白胨5g；蔗糖10g；琼脂18g；蒸馏水1000ml；121℃灭菌30min）上培养48h后菌落成白、圆形、表面光滑、隆起、边缘整齐、直径2~4mm；菌体杆状，丛生鞭毛，革兰氏染色阴性，不产芽孢；
该菌株生理生化特征为：氧化酶试验阴性或阳性、接触酶试验阴性或阳性、淀粉水解试验阴性、明胶液化试验阳性，硝酸盐还原试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、丙二酸盐利用试验阳性、H2S试验阳性、甲基红试验阳性、葡萄糖利用试验阳性、蔗糖利用试验阳性、麦芽糖利用试验阴性；
培养伯克霍尔德菌菌株的适宜培养基和LB培养基，配方包括胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠（NaCl）10g/L，接种量为培养基重量的2%，发酵温度为28℃，搅拌速度为120rpm，发酵时间为5天，得到菌悬液。
2.根据权利要求1所述的一种用于消除玉米自毒作用的复合菌剂及应用，其特征是：所述的复合菌剂的使用方法：采用种子包衣的方法，播种前将玉米种子用75%乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗 5次，采用5mL/50 g（发酵液体积/种子质量）的比例进行种子处理，即将50 g玉米种子与5mL复合菌剂搅拌充分混和，静置3-5个小时后播种。
3.根据权利要求1和2所述的一种用于消除玉米自毒作用的复合菌剂及应用，其特征是：所述的木霉菌为绿色木霉菌或哈茨木霉菌。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110041139A (zh) * 2019-05-30 2019-07-23 沈阳农业大学 一种用于连作土壤修复的生物菌多层带剂及使用方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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