CN107296959A

CN107296959A - 脂蟾毒配基的环糊精包合物及制备和用途

Info

Publication number: CN107296959A
Application number: CN201610226766.0A
Authority: CN
Inventors: 刘东春; 王东; 曹子薇; 陈换平; 夏明钰; 代英辉; 白雷; 毛心蕊; 孙晓媛; 李园园
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2016-04-13
Filing date: 2016-04-13
Publication date: 2017-10-27

Abstract

本发明涉及一种脂蟾毒配基‑环糊精包合物及其制备方法，该方法由下述原料按摩尔比组成：脂蟾毒配基:包合材料=1:1‑100；通过将脂蟾毒配基、环糊精及其衍生物溶于适量的溶剂中，搅拌、干燥即得脂蟾毒配基‑环糊精包合物。本发明所提供的脂蟾毒配基‑环糊精包合物水溶性好、毒性低、血管刺激性小、稳定性高，可保证制剂的均匀性，具有明显的抗肿瘤作用，有望做成口服片剂、胶囊剂或静脉注射针剂，具有重要的临床应用价值。

Description

脂蟾毒配基的环糊精包合物及制备和用途

技术领域

本发明属于药学领域，涉及一种新的脂蟾毒配基与环糊精的包合物，以及该包合物的制备方法。本发明还涉及脂蟾毒配基环糊精包合物的用途。

背景技术

脂蟾毒配基(Resibufogenin，化学式C₂₄H₃₂O₄)是蟾酥(蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾酥B.melanostictus Schoeider的耳后及皮肤腺分泌的白色浆液,经加工干燥制成)中主要的活性成分，具有抗肿瘤、强心、局部麻醉等多种活性(刘俊珊,张冬梅,栗原博,叶文才.蟾酥及其活性成分抗肿瘤作用研究进展.国际药学研究杂志[J].2009,36:115-120；唐信威,肖洁,宋健,邹强,汪瑞雪,李晏齐,阳泰.脂蟾毒配基选择性杀伤肿瘤细胞的研究.中国癌症杂志[J].2012,03:196-199.)。其结构式如下：

脂蟾毒配基难溶于水，治疗有效剂量与中毒剂量接近，限制了其在临床上的应用。增加脂蟾毒配基的水溶性，保证制剂的均一性、降低毒副作用有利于其安全有效利用。

发明内容

为了解决脂蟾毒配基毒副作用大、溶解度低，不利于制备成液体制剂、以及制备成固体制剂均匀度难以控制等问题，本发明提供了一种脂蟾毒配基环糊精包合物及其制备方法和用途。

一种脂蟾毒配基环糊精包合物，其特征在于：

(1)脂蟾毒配基与环糊精投料摩尔比为：1:1～100；较优为1:2～30；最优1:5～20。

(2)本发明所述的脂蟾毒配基环糊精包合物，环糊精选自β-环糊精、γ-环糊精及环糊精的衍生物包括但不限于羟丙基β-环糊精、羟乙基β-环糊精、甲基β-环糊精或羧甲基β-环糊精。

(3)本发明所述的脂蟾毒配基环糊精包合物的制备可以通过溶剂法实现：将环糊精溶于适当的溶剂I中，将脂蟾毒配基用适量溶剂II溶解后滴加入环糊精溶液中持续搅拌至包合物生成，回收溶剂，干燥，所得粉末状物质用溶剂III洗去未包合的脂蟾毒配基，干燥后得包合物产品。

(4)本发明所述的溶剂I选自但不限于水、甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、异丙醇、丙二醇、丙三醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸甲酯、二氯甲烷、三氯甲烷或它们的混合物；溶剂II选自但不限于甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、异丙醇、丙二醇、丙三醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、石油醚、环己烷、正己烷或它们的混合物。溶剂III选自但不限于水、甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、异丙醇、丙二醇、丙三醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、石油醚、环己烷、正己烷及它们的混合物。

(5)本发明所述的脂蟾毒配基环糊精包合物的制备可以通过研磨法实现，其特征在于，将脂蟾毒配基与环糊精混匀后经适当溶剂I调制成糊状，加入上述糊状物中充分研磨至包合物形成，干燥，干燥物用溶剂III洗涤后，再次干燥即成。

(6)本发明所述的脂蟾毒配基环糊精包合物可用于药物制剂中，特别是抗癌、强心药物制剂的应用。

为了进一步了解本发明及其实质，说明如下：

本发明的目的通过以下技术方案实现：

(一)溶液法制备：将环糊精加入到适量的溶剂I中，配制成质量浓度为1-65％的溶液，5-60％较优，脂蟾毒配基溶解于适合的溶剂II中，加至上述环糊精的溶液中持续搅拌至包合物生成，回收溶剂，干燥，所得粉末状物质用溶剂III洗去未包合脂蟾毒配基，干燥后得包合物产品。

溶解环糊精的溶剂I可以但不限于水、甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、异丙醇、丙二醇、丙三醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸甲酯、二氯甲烷、三氯甲烷或它们的混合物。优选溶剂为水。

溶解脂蟾毒配基的溶剂II可以但不限于甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、异丙醇、丙二醇、丙三醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、石油醚、环己烷、正己烷。优选为乙醇。

洗涤包和产品的溶剂III可以但不限于水、甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、异丙醇、丙二醇、丙三醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、石油醚、环己烷、正己烷及它们的混合物。优选为乙酸乙酯、乙醚。

(二)研磨法制备：脂蟾毒配基与环糊精经适当溶剂I调制成糊状，将上述糊状物充分研磨至包合物形成，干燥，干燥物用溶剂III洗涤后，再次干燥即成。

调制环糊精糊状物的溶剂I的优选溶剂为水。洗涤溶剂III优选为乙酸乙酯、乙醚。

研磨法推荐的研磨设备为球磨机、胶体磨、兰式研磨机。

制备工艺的干燥过程可以采用热风干燥、减压干燥、冷冻干燥或者喷雾干燥，即可得固体包合物。

本发明所述的脂蟾毒配基环糊精包合物及制备包合物工艺过程中脂蟾毒配基与环糊精投料摩尔比为：1:1～100；较优为1:2～30；最优1:5～20。

本发明中的脂蟾毒配基与环糊精包合物主要通过以下方法验证：

验证方法一、薄层色谱法(TLC)：

取脂蟾毒配基乙酸乙酯溶液(1mg/ml)，脂蟾毒配基包合物乙醇溶液(1mg/ml)，脂蟾毒配基包合物乙酸乙酯溶液(1mg/ml)，分别点样1-5μl，在硅胶G-CMC板上展开，展开剂为环己烷-二氯甲烷-丙酮(4:3:3),显色剂为10％硫酸乙醇溶液，结果见图1。薄层色谱图显示脂蟾毒配基乙酸乙酯溶液与脂蟾毒配基包合物乙醇溶液斑点完全一致(R_f＝0.49)，而脂蟾毒配基包合物乙酸乙酯溶液无斑点，说明形成了包合物。

验证方法二、傅里叶红外光谱法(FT-IR)

FT-IR结果见图2。脂蟾毒配基分子中芳香环上酚羟基的吸收峰在3419cm^-1波数处，羰基吸收峰在1719cm^-1左右，芳环骨架上C-H伸缩振动在2937cm^-1左右；β环糊精(β-CD)在3385cm^-1波数处为多缔合体-OH伸缩振动峰，2930cm^-1波数处为甲基、亚甲基的C-H伸缩振动峰；在物理混合物的谱图(c)中脂蟾毒配基和β-CD的吸收峰都明显存在，只是吸收峰的强度稍有减弱；而包合物的谱图(d)中脂蟾毒配基的羰基吸收峰明显向低波处移动(1719cm^-1～1708cm^-1)，且羰基的吸收峰强度减弱。羟丙基β环糊精包合物(HP-β-CD)在3395cm^-1波数处为多缔合体-OH伸缩振动峰，2932cm^-1波数处为甲基、亚甲基的C-H伸缩振动峰；在物理混合物的谱图(f)中脂蟾毒配基和HP-β-CD的吸收峰都明显存在，只是吸收峰的强度稍有减弱；而包合物的谱图(g)中脂蟾毒配基的羰基吸收峰明显向低波处移动(1719cm^-1～1709cm^-1)，且羰基的吸收峰强度减弱。以上光谱变化，说明脂蟾毒配基分子可能进入β-CD、HP-β-CD的空腔中。

验证方法三、差示扫描量热法(DSC)

DSC结果见附图3。从DSC图谱看出，脂蟾毒配基作为晶体物质，在168℃处有明显的吸热峰，为其熔融峰；β-CD由于失水的原因，在92℃处有很宽的脱水峰；脂蟾毒配基与β-CD物理混合物、的DSC图谱(c)基本为药物与β-CD的叠加；而脂蟾毒配基/β-CD包合物中药物的熔融峰完全消失，形成一种新的物相。HP-β-CD也由于失水的原因，在66℃处有很宽的脱水峰；脂蟾毒配基与HP-β-CD物理混合物的DSC图谱(f)基本为药物与环糊精的叠加；而脂蟾毒配基/HP-β-CD包合物中药物的熔融峰完全消失，形成一种新的物相。以上热力学性质的变化，说明脂蟾毒配基与β-CD、HP-β-CD可能形成了包合物。

验证方法四、X-射线衍射法(XRD)

XRD结果见图4。由图可见，脂蟾毒配基在2θ为7.50°,15.58°,16.66°,18.83°,19.43°,20.55°,22.35°,24.23°位置有一系列强烈的衍射峰，说明它具有晶体性质；β-CD作为晶体物质，其在2θ为9.09°,12.73°,22.71°,32.01°处具有明显的特征衍射峰；物理混合物为脂蟾毒配基与β-CD的简单叠加，除峰的强度有所减弱外没有出现新的峰，而脂蟾毒配基/β-CD包合物中RBG的特征衍射峰消失，出现了新的XRD图谱，说明药物与β-CD己经形成了包合物。而HP-β-CD则表现很宽的峰，说明HP-β-CD的无定形性质；物理混合物为脂蟾毒配基与HP-β-CD的简单叠加，除峰的强度有所减弱外没有出现新的峰；脂蟾毒配基/β-CD包合物中脂蟾毒配基的特征衍射峰消失，表现为HP-β-CD的无定形态。通过以上XRD图谱分析，证明脂蟾毒配基可能进入了β-CD、HP-β-CD的内腔中。

验证方法五、相溶解度的研究

分别配制一系列不同浓度(0～0.015mol/L)的β-CD水溶液，各取5mL上述溶液置10mL具塞试管中，分别加入过量的脂蟾毒配基密封，置于25℃恒温振荡器(120r·min^-1)振荡48h。待溶液达到平衡，取上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤，分别取续滤液1mL用甲醇稀释到合适的倍数，使浓度在标准曲线浓度范围内。精密吸取上述溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定脂蟾毒配基的浓度。以β-CD的浓度(mmol/L)为横坐标，脂蟾毒配基的浓度(mmol/L)为纵坐标，绘制平衡相溶解图。

分别配制一系列不同浓度(0～0.015mol/L)的HP-β-CD水溶液，各取5mL上述溶液置10mL具塞试管中，分别加入过量的脂蟾毒配基密封，置于25℃恒温振荡器(120r·min^-1)振荡48h。待溶液达到平衡，取上清液经0.45μm的微孔滤膜过滤，分别取续滤液1mL用甲醇稀释到合适的倍数，使浓度在标准曲线浓度范围内。精密吸取上述溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定脂蟾毒配基的浓度。以HP-β-CD的浓度(mmol/L)为横坐标，脂蟾毒配基的浓度(mmol/L)为纵坐标，绘制平衡相溶解图。

实验结果表明(图5)，在研究浓度范围内，脂蟾毒配基的溶解度随β-CD浓度的增加先增加再经历平台期，当β-CD浓度大于12mmol/L时，由于微晶态的包合物沉淀的出现其溶解度逐渐下降。而脂蟾毒配基的溶解度随HP-β-CD浓度的增加呈非线性增加且负向偏离直线，说明有可溶性包合物的形成。

相溶解度图通常分为A型和B型，A型是药物浓度随着环糊精浓度增大而增加，可进一步分为三个亚型：A_L、A_P和A_N；若环糊精对药物以摩尔比1:1进行包合物，相溶解度呈线性增加，表现为A_L型。A_P和A_N型分别为线性增加的正偏差和负偏差。B型又分为Bs和B_l型，Bs型为随环糊精浓度增加，药物溶解度先上升再经历平台期，最后由于微晶态的包合物沉淀出现而下降；B_l型为随着环糊精浓度增加，药物溶解度起初不变，然后逐渐下降，表明难溶性包合物的形成。因此判断脂蟾毒配基与β-CD、HP-β-CD的相溶解度图分别为B_S型和A_N型，表明脂蟾毒配基与β-CD、HP-β-CD之间最终均以1:2摩尔比进行包合。

本发明提供了一种药物组合物，其包括脂蟾毒配基环糊精包合物和制药学上可接受的载体。本发明的脂蟾毒配基环糊精包合物可采用本领域专业人员所公知的方法，制成可作为人用药物使用的适当的使用形式或剂量形式。

所述的药物组合物，包括但不限定于，液体脂蟾毒配基环糊精或环糊精衍生物包合物直接用于制备的输液、水针、粉针、口服液、糖浆剂等液体剂型；固体脂蟾毒配基环糊精或环糊精衍生物包合物制成片剂、胶囊、颗粒剂、分散片、口崩片、含片等多种固体剂型。

优选的液体剂型包括脂蟾毒配基羟丙基β-环糊精包合物的注射液，注射液的浓度为0.001～10(mg/ml)，较优为0.01～1(mg/ml)；注射液的pH值为4～7.5；注射液中可含有氯化钠、葡萄糖等渗透压调节剂。

优选的液体剂型还包括脂蟾毒配基羟丙基β-环糊精包合物脂质体的注射液，注射液的浓度为0.01～1(mg/ml)，胆固醇与磷脂的质量比较优为1:2～10；注射液中可含有氯化钠、葡萄糖等渗透压调节剂。

所述的粉针剂包括脂蟾毒配基羟丙基β-环糊精包合物的粉针剂，粉针剂溶解后的pH值为4～7.5，注射液中可含有甘露醇、乳糖等支撑剂。

本发明的有益效果：

通过环糊精对脂蟾毒配基进行包合，使脂蟾毒配基分子包埋于环糊精分子的管状结构中，成为脂蟾毒配基环糊精的包合物，从而提高了脂蟾毒配基的水溶性。本发明所述的包合物在分子结构上的优势摩尔比为，脂蟾毒配基:环糊精＝1:2。经测定在25℃时，脂蟾毒配基β-环糊精包合物在水中的溶解度可达到312μg/ml，比药物的溶解度(10.35μg/ml)增大30倍；其在pH6.8PBS溶液中的累积溶出度5min就可达到90％，溶出速率远远高于药物、药物与环糊精及其衍生物的物理混合物，解决了脂蟾毒配基难溶于水的问题。

本发明的脂蟾毒配基-环糊精包合物具有较好溶解性和抗肿瘤活性，使脂蟾毒配基这一活性成分以包合物的形式直接应用于各种固体、液体剂型。

本发明的脂蟾毒配基-环糊精包合物，具有水溶性好、毒性低、血管刺激性小的特点，特别适用于制备液体制剂。解决了脂蟾毒配基水溶性差、剂量小、准确分剂量困难，尤其是注射剂型的技术问题，为临床提供更安全、稳定、疗效显著的药物。

附图说明

图1为包合物的薄层色谱检查；

a：脂蟾毒配基的β环糊精包合物；b：脂蟾毒配基的羟丙基β环糊精包合物；

1脂蟾毒配基对照品；2包合物的乙醇溶液；3包合物的乙酸乙酯溶液。

图2为脂蟾毒配基及其环糊精包合物傅里叶红外光谱；

a：脂蟾毒配基(RBG)，b：β环糊精(β-CD),c：RBG与β-CD的物理混合物，d：RBG的β-CD包合物，e：羟丙基β环糊精(HP-β-CD)，f：RBG与HP-β-CD物理混合物，g：RBG的HP-β-CD包合物。

图3为脂蟾毒配基及其环糊精包合物差示扫描量热法结果(DSC)；

图4为脂蟾毒配基及其环糊精包合物的X射线衍射分析结果；

图5为脂蟾毒配基与其环糊精包合增溶效应及相溶解度研究

RBG：脂蟾毒配基；β-CD：β环糊精；HP-β-CD：羟丙基β环糊精。

图6为采用本发明方法制备的脂蟾毒配基β-环糊精包合物的溶出曲线图。

图7为采用本发明方法制备的脂蟾毒配基羟丙基β-环糊精包合物的溶出曲线图。

图8为采用本发明方法制备的脂蟾毒配基环糊精包合物的肿瘤细胞生长抑制曲线。

RBG：脂蟾毒配基；5-FU：5-氟尿嘧啶。

图9为采用本发明方法制备的脂蟾毒配基β-环糊精包合物的胃黏膜刺激性实验的胃黏膜病理组织切片。

阴性对照组(a)、药物组(b)、脂蟾毒配基β-环糊精包合物组(c)。

具体实施方式

实施例1 溶剂法制备一种脂蟾毒配基β-环糊精包合物

精密称取7.69mg脂蟾毒配基和22.70mgβ-环糊精,加入到20mL50％乙醇溶液中,400r/min,50℃磁力搅拌2h使其完全溶解,溶液在50℃水浴旋转蒸干,减压真空干燥得白色粉末.用10mL乙酸乙酯洗涤3-5次至洗涤液TLC层析未显示药物斑点,抽干得白色疏松状粉末，即得脂蟾毒配基β-环糊精包合物。

实施例2 溶剂法制备一种脂蟾毒配基羟丙基β-环糊精包合物

精密称取7.69mg脂蟾毒配基和28.62mg羟丙基β-环糊精,加入到20mL50％乙醇溶液中,400r/min,50℃磁力搅拌2h使其完全溶解,溶液在50℃水浴旋转蒸干,减压真空干燥得白色粉末.用10mL乙酸乙酯洗涤3-5次至洗涤液TLC层析未显示药物斑点,抽干得白色疏松状粉末，即得脂蟾毒配基羟丙基β-环糊精包合物。

实施例3 溶剂法制备一种脂蟾毒配基γ-环糊精包合物

精密称取7.69mg脂蟾毒配基和25.94mgγ-环糊精,加入到20mL50％乙醇溶液中,400r/min,50℃磁力搅拌2h使其完全溶解,溶液在50℃水浴旋转蒸干,减压真空干燥得白色粉末。用10mL乙酸乙酯洗涤3-5次至洗涤液TLC层析未显示药物斑点,抽干得白色疏松状粉末，即得脂蟾毒配基γ-环糊精包合物。

实施例4 溶剂法制备一种脂蟾毒配基羟丙基β-环糊精包合物工艺的参数优化。操作过程如实施例2所述。具体参数及结果见表1及表2。

表1因素与水平正交设计表

表2正交试验结果

根据表2结果进行直观极差比较。因素A>D>B>C。直观最优条件为A3D2B2C2，即药物与环糊精比例1:30，乙醇浓度为50％，包合温度为40℃，包合时间为3h时包合率最高。但是我们注意到，当环糊精比例提高到5倍(A2，A3)以上时，包合率增加不明显。所以环糊精的比例是药物的5倍即可保证较高的包和率。

实施例5 研磨法制备脂蟾毒配基环糊精包合

取脂蟾毒配基100mg，加入5倍摩尔比的β-环糊精混匀后，加入适量水调成糊状，置球磨机内研磨24h，取出研磨样品干燥，干燥后样品用50mL乙酸乙酯洗涤2次，减压干燥至完全、粉碎过筛即得。

脂蟾毒配基的羟丙基-β-环糊精、γ-环糊精包合物制备方法同上。

所得产品的包和率分别为：93.1，97.2，91.1％。

实施例6、包合稳定常数的测定

药物与环糊精形成包合物的过程是一个动态平衡过程，该过程涉及到影响包合物稳定性的重要参数，即包合物的稳定常数(Kc)，其值大小反映了药物与环糊精衍生物形成包合物时结合力的强弱，该值越大，表明形成的包合物越稳定。

包合物稳定常数测定结果见表1。结果显示，脂蟾毒配基与HP-β-CD形成的包合物稳定常数大于β-CD，说明脂蟾毒配基与HP-β-CD进行包合时反应较容易进行，且形成的包合物比β-CD稳定。药物与环糊精的包合常数(Kc)一般在100-20000L/mol之间，Kc值太小则包合物不稳定，容易解离，Kc值太大则药物很难从包合物中游离出来。本发明所得脂蟾毒配基与环糊精的包合物的稳定常数适中，适合用于药物制剂中。

表1.脂蟾毒配基的两种环糊精包合物的稳定常数(Kc)

实施例7 一种脂蟾毒配基环糊精包合物脂质体

精密称定处方量的大豆磷脂、胆固醇(胆固醇:磷脂＝1:5，质量比)，至10mL无水乙醇中，65℃磁力搅拌至完全熔融，趁热注入到350mL预热至65℃的含脂蟾毒配基环糊精包合物(按实施例4优化工艺制备)的磷酸盐缓冲液(pH＝6.5)中，剪切乳化10-20min，再加入 150mL预热至65℃的含脂蟾毒配基环糊精包合物的磷酸盐缓冲液(pH＝6.5),剪切乳化3-5min，即得脂蟾毒配基环糊精包合物脂质体。

实施例8 脂蟾毒配基β-环糊精包合物片剂的制备

取按实施例5方法制备的脂蟾毒配基β-环糊精包合物适量，与可压性淀粉、羧甲基淀粉钠或交联PVP粉末，同时混入硬脂酸镁、滑石粉等混匀，按直压法进行压片，得分散片。

实施例9 脂蟾毒配基β-环糊精包合物胶囊剂的制备

取按实施例5方法制备的脂蟾毒配基β-环糊精包合物适量，与适量辅料混匀，直接制粒或制成微丸后，装胶囊，即得胶囊。将制成的微丸以不同的包衣材料进行包衣后，混匀，装胶囊，即得缓释/控释胶囊。

实施例10 脂蟾毒配基羟丙基β-环糊精包合物粉针剂的制备

取按实施例4优化工艺所制得的脂蟾毒配基羟丙基β-环糊精包合物适量溶于注射用水中，加入适量乳糖和0.1％活性炭，加热20分钟以除热原后，过滤除去活性炭，用0.22μm的微孔滤膜过滤，用注射用水调至规定量，所得溶液分装于西林瓶中，进行冷冻干燥，得脂蟾毒配基冻干粉针剂。

实施例11 脂蟾毒配基羟丙基β-环糊精包合物注射液的制备

取按实施例4优化工艺所制得脂蟾毒配基羟丙基β-环糊精包合物适量溶于注射用水中，加入适量注射用葡萄糖和0.3％活性炭，加热20分钟以除热原后，过滤除去活性炭，用0.22μm的微孔滤膜过滤，用注射用水调至规定量，所得溶液分装，110℃灭菌30分钟，得脂蟾毒配基葡萄糖注射液。

实施例12 脂蟾毒配基β-环糊精包合物的溶出度实验

按照《中国药典》2010版二部附录XC溶出度测定法第二法(桨法),溶出介质为900mL pH6.8 PBS溶液,温度为(37±0.5)℃,转速为100rpm。分别精密称取脂蟾毒配基3mg、脂蟾毒配基与β-环糊精物理混合物、按实施例5工艺制备的脂蟾毒配基β-环糊精包合物(相当于脂蟾毒配基3mg)，分别于5、15、30、45、60、90、120、150、180、240min时取样5mL(同时补充等量溶出介质)，0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液20μL,HPLC测定药物含量.计算脂蟾毒配基的累积溶出百分率。由结果可以看出，将脂蟾毒配基制备成β-环糊精包合物后药物溶出迅速，结果见附图6。

实施例13 脂蟾毒配基HP-β-环糊精包合物的溶出度实验

按照《中国药典》2010版二部附录XC溶出度测定法第二法(桨法),溶出介质为900mL pH6.8 PBS溶液,温度为(37±0.5)℃,转速为100rpm。分别精密称取脂蟾毒配基3mg、脂蟾毒配基与HP-β-环糊精物理混合物、按照实施例5工艺制备的脂蟾毒配基HP-β-环糊精包合物(相当于脂蟾毒配基3mg)，分别于5、15、30、45、60、90、120、150、180、240min时取样5mL(同时补充等量溶出介质)，0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液20μL,HPLC测定药物含量.计算脂蟾毒配基的累积溶出百分率。由结果可以看出，将脂蟾毒配基制备成HP-β-环糊精包合物后药物溶出迅速，结果见附图7。

实施例14 脂蟾毒配基-环糊精包合物的抗肿瘤活性实验

人肺癌A549细胞株以含10％胎牛血清DMEM培养液培养，培养箱温度37℃、湿度95％，CO₂浓度5％。细胞单层贴壁生长至80％-90％细胞发生融合时，用0.5‰胰酶消化液(含EDTA)消化细胞以传代培养，收集对数生长期细胞用于实验。精密称取脂蟾毒配基3mg、脂蟾毒配基β-环糊精包合物21.26mg(相当于脂蟾毒配基3.0mg)、脂蟾毒配基HP-β-环糊精包合物21.15mg(相当于脂蟾毒配基3.0mg)，用DMSO配制成100μmol/L母液。取处于对数生长期的细胞，以5×10⁴/mL的细胞密度接种于96孔培养板，置37℃、5％CO₂培养箱中培养24h后，弃去上清液，依次加入含药物浓度为0.001、0.01、0.1、1、10、100μM的DMEM培养液，每个浓度设置3个复孔，37℃、5％CO₂培养箱中培养48h后，弃去上清液，以每孔加入DMEM配制5mg/mL MTT溶液100μL，空白对照组加100μL DMEM培养液，37℃、5％CO₂培养箱中孵育3h后终止培养。然后弃去上清，每孔加入150μL DMSO，震荡10min，使细胞内紫色沉淀结晶物充分溶解于DMSO。用酶标仪于492nm波长处检测各孔光密度(OD)值。按以下公式计算药物不同浓度下肿瘤细胞的抑制率，绘制肿瘤细胞生长抑制率曲线。

细胞生长抑制率计算方法为:

IR％＝(1－样品组平均OD值/对照组平均OD值)×100％

由结果可以看出脂蟾毒配基制备成包合物后抗肿瘤活性没有降低，见图8。

实施例15 脂蟾毒配基β-环糊精包合物的胃黏膜刺激性实验

取健康昆明种小鼠15只，体重约(28±1.5)g。实验前禁食不禁水12h，随机分组，包括阴性对照组(0.5％CMCNa组)，实验组1(RBG 4mg/kg),实验组2(RBG-β-CD包合物4mg/kg)，每组5只。分别灌胃给予上述剂量的0.5％CMC-Na混悬液0.3ml。6h后处死小鼠,立即解剖取胃,沿胃大弯剪开并用生理盐水冲洗胃内容物,肉眼观察胃黏膜损伤情况，将小鼠胃浸泡在10％福尔马林溶液中固定，石蜡包埋切片，HE染色，做病理组织切片观察。由结果(图9)可见，未处理原药对胃粘膜有明显的刺激，可见胃粘膜细胞有明显脱落，而经环糊精包合后，未观察到明显的刺激性。

Claims

1.一种脂蟾毒配基的环糊精包合物，其特征在于：脂蟾毒配基与环糊精投料摩尔比为： 1:1~100；较优为1:2~30；最优1:5~20。

2.如权利要求1所述的脂蟾毒配基的环糊精包合物，其特征在于：环糊精选自β-环糊精、γ-环糊精及环糊精的衍生物，优选羟丙基β-环糊精、羟乙基β-环糊精、甲基β-环糊精或羧甲基β-环糊精。

3.如权利要求1所述的脂蟾毒配基的环糊精包合物的制备方法，其特征在于，通过溶剂法制备：将环糊精溶于适当的溶剂I中，将脂蟾毒配基用适量溶剂II溶解后滴加入环糊精溶液中持续搅拌至包合物生成，回收溶剂，干燥，所得粉末状物质用溶剂III洗去未包合的脂蟾毒配基，干燥后得包合物产品。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：溶剂I选自水、甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、异丙醇、丙二醇、丙三醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙酸乙酯、乙酸甲酯、二氯甲烷、三氯甲烷或它们的混合物；溶剂II选自甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、异丙醇、丙二醇、丙三醇、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、石油醚、环己烷、正己烷或它们的混合物；溶剂III选自水、甲醇、乙醇、丙酮、丙醇、异丙醇、丙二醇、丙三醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙醚、石油醚、环己烷、正己烷及它们的混合物。

5.如权利要求1所述的脂蟾毒配基环糊精包合物的制备方法，其特征在于，通过研磨法制备，其特征在于，将脂蟾毒配基与环糊精混匀后经适当溶剂I调制成糊状，加入上述糊状物中充分研磨至包合物形成，干燥，干燥物用溶剂III洗涤后，再次干燥即成。

6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的溶剂I优选水，溶剂III优选为乙酸乙酯、乙醚。

7. 一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1或2所述的脂蟾毒配基的环糊精包合物。

8. 一种药物制剂，其特征在于，包含权利要求1或2所述的脂蟾毒配基的环糊精包合物或权利要求7所述的药物组合物和药学上可接受的载体。

9.如权利要求1或2所述的脂蟾毒配基的环糊精包合物，其特征在于，所形成

的包合物在分子结构上的优势摩尔比为，脂蟾毒配基:环糊精=1:2。

10.如权利要求8所述的药物制剂，其特征在于，所述的药物制剂为脂质体，包含权利要求1或2所述的脂蟾毒配基的环糊精包合物、胆固醇、磷脂，其中，胆固醇:磷脂=1:2-1：10。