CN107200764A - 狐狸胆汁中胆汁酸的hplc分离技术 - Google Patents

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肖向红
黄金野
张晶钰
柴龙会
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0055—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives
    • C07J41/0061—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of at least three carbon atoms which may or may not be branched, e.g. cholane or cholestane derivatives, optionally cyclised, e.g. 17-beta-phenyl or 17-beta-furyl derivatives one of the carbon atoms being part of an amide group
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Abstract

本发明提供了一种利用高效液相色谱(HPLC)对狐狸胆囊胆汁中胆酸类物质分离的方法。目前尚缺乏有效分离狐胆囊中胆汁酸的方法，本发明提供了一种HPLC技术分离牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺去氧胆酸(TDCA)。该方法将新鲜的狐胆囊胆汁制成冻干粉，甲醇溶解，HPLC分离。HPLC技术采用等度洗脱方式，甲醇‑磷酸氢盐溶液(0.25～0.35mol/L，PH＝3～4)为流动相，柱温为15～20℃，流速为0.9～1.1ml/min。本方法填补了目前尚无有效分离狐胆囊中胆汁酸的方法，本方法所采用的色谱条件操作简便易掌握，分离效果稳定，检测信号强、结果准确可靠，可以用于狐胆囊中胆汁酸类物质的分离。

Description

狐狸胆汁中胆汁酸的HPLC分离技术
技术领域
本发明涉及狐狸胆囊胆汁中胆汁酸的分离，以狐狸胆汁为原料利用HPLC技术，使狐狸胆囊胆汁中的胆汁酸类物质得以分离。此技术适用于废弃狐胆囊胆汁原料的有效利用。
背景技术
HPLC自20世纪70年代问世以来，经过几十年的发展，在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已经趋于成熟，现在已成为最有优势的分离分析方法之一。它采用高压泵及梯度调配器输送流动相，经过色谱柱把样品中各组分进行分离，再结合紫外、荧光、视差等不同检测器，通过计算机自动调控、采集和处理数据，并可对已分离的组分进行收集。动物胆汁中胆汁酸的组成复杂，利用HPLC技术可以快速将各组分分离且收集简便。
发明内容
本发明的目的在于使狐胆囊胆汁得到有效利用，应用HPLC技术将狐胆汁中胆汁酸类物质快速分离收集。
本发明采用的技术方案是：新鲜狐胆囊胆汁的冻干处理，狐冻干胆粉溶液的制备，HPLC技术分离。
本发明提供的一种利用HPLC技术对狐胆囊胆汁中胆汁酸类物质的分离制备方法，其特征是：取新鲜狐胆囊胆汁，冷冻干燥制成冻干粉，用甲醇溶解胆汁冻干粉，过滤后备用。用甲醇和磷酸氢盐溶液(PH3～4)作为色谱柱的流动相，对冻干粉溶液中的胆汁酸类物质进行分离，依照保留时间分别收集检测器流出液。
其中，胆汁酸类物质包括牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺去氧胆酸(TDCA)。
其中，将新鲜狐胆囊胆汁置入-20℃冰箱中72小时后，用冷冻干燥机真空干燥成冻干粉。
其中，加入甲醇溶解胆汁冻干粉的条件是超声波(功率300W，频率25kHz)溶解15分钟。
其中，胆汁冻干粉溶液过滤膜为0.45μm的脂溶性微孔滤膜。
其中，色谱柱为Waters SunFireTM C18色谱柱。
其中，磷酸氢盐为K2HPO4和/或KH2PO4。
其中，磷酸氢盐溶液摩尔浓度为0.25～0.35M，用无机酸调节PH到3～4。
其中，流动相为甲醇:磷酸氢盐溶液＝80:20，流速为0.9～1.1ml/min。
其中，无机酸为H3PO4。
其中，检测器为紫外检测器。
其中，检测器流出的液体顺序依次含牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺去氧胆酸(TDCA)。
本发明的方法具有以下优点：
1.首次提供了一种从狐胆囊胆汁中分离获得4种胆汁酸的有效方法；
2.为胆汁酸获得提供了新的原料来源。
3.本方法分离效果稳定，操作简便易掌握。
附图说明
附图1，狐胆囊胆汁的HPLC色谱图；
附图2，标准品与狐胆汁的色谱图比较。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1制备狐胆汁样品溶液
取新鲜狐胆汁100g盛于烧杯内，置于-20℃冰箱中冷冻72小时，用冷冻干燥机真空干燥，最终可获得约2～3g胆汁冻干粉。精密称取冻干粉350mg，溶于50ml甲醇中，超声波溶解10min，0.45μm脂溶性微孔滤膜过滤后备用。
实施例2分离狐胆汁样品溶液
准备超声脱气的流动相，流动相分为A、B两部分，A为色谱纯甲醇，B为0.3mol/L磷酸氢盐溶液(PH＝4)。在205nm紫外检测波长下，将流动相以A:B＝80:20、流速1.1ml/min的色谱系统平衡30min。色谱系统稳定后，进样狐胆汁样品溶液10ul，得到狐胆汁HPLC色谱图(见图1)。
实施例3收集分离流出液
样品分离后需注意观察色谱峰信号，检测器可先后检测出8个色谱峰。其中，4号峰为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)，5号峰为牛磺胆酸(TCA)，7号峰为牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)，8号峰为牛磺去氧胆酸(TDCA)。因此，需要对以上色谱峰依次分别进行收集。
利用上述方法可获得狐胆汁中已经分离的牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺去氧胆酸(TDCA)。
在实施例2的色谱条件下，对上述4种胆汁酸标准品的HPLC色谱图和狐胆汁样品的HPLC色谱图进行比对(见图2)，由此确定狐胆汁中含有牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺去氧胆酸(TDCA)。

Claims (10)

1.一种利用HPLC对狐狸胆汁中胆汁酸类物质的分离制备方法，其特征是：取新鲜狐狸胆汁冷冻干燥成飞末状冻干粉，加入甲醇作为溶剂溶解狐狸胆汁冻干粉，经过滤后作为狐狸胆粉溶液备用，在色谱柱上以甲醇和用无机酸调节PH为3～4的磷酸氢盐溶液作为流动相，对狐狸胆粉溶液中胆汁酸类物质进行分离收集，依照保留时间分别收集检测器流出液。
2.根据权利要求1所述的利用HPLC对狐狸胆汁中胆汁酸类物质的分离制备方法，其特征是：将新鲜狐狸胆汁置入-20℃冰箱中72小时后，用冷冻干燥机真空干燥成冻干粉。
3.根据权利要求1所述的利用HPLC对狐狸胆汁中胆汁酸类物质的分离制备方法，其特征是：所述加入甲醇作为溶剂溶解狐狸胆汁冻干粉的条件是超声波(功率300W，频率25kHz)溶解15分钟，胆粉溶液过滤膜为0.45μm的脂溶性微孔滤膜。
4.根据权利要求1所述的利用HPLC对狐狸胆汁中胆汁酸类物质的分离制备方法，其特征是：所用的色谱柱为Waters SunFireTM C18色谱柱。
5.根据权利要求1所述的利用HPLC对狐狸胆汁中胆汁酸类物质的分离制备方法，其特征是：所用的磷酸氢盐为K2HPO4和/或KH2PO4。
6.根据权利要求1所述的利用HPLC对狐狸胆汁中胆汁酸类物质的分离制备方法，其特征是：所用磷酸氢盐溶液摩尔浓度为0.25～0.35M，用无机酸调节PH到3～4。
7.根据权利要求1所述的利用HPLC对狐狸胆汁中胆汁酸类物质的分离制备方法，其特征是：所述的流动相为甲醇:磷酸氢盐溶液＝80:20，流速为0.9～1.1ml/min。
8.根据权利要求1或6所述的利用HPLC对狐狸胆汁中胆汁酸类物质的分离制备方法，其特征是：所述的无机酸为H3PO4。
9.根据权利要求1所述的利用HPLC对狐狸胆汁中胆汁酸类物质的分离制备方法，其特征是：所用检测器为紫外检测器。
10.根据权利要求1所述的利用HPLC对狐狸胆汁中胆汁酸类物质的分离制备方法，其特征是：所述的检测器流出的液体顺序依次含牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺去氧胆酸(TDCA)。
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CN108169377A (zh) * 2017-12-29 2018-06-15 中山百灵生物技术有限公司 一种新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法
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