CN108169377A - 一种新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法：取牛磺鹅去氧胆酸‑sigma对照品为已知对照品，用稀释剂溶解成对照品溶液，取牛磺鹅去氧胆酸样品用稀释剂溶解对照品供试品溶液；分别取20ul注入液相色谱仪中，记录峰面积，按照外标法，以牛磺鹅去氧胆酸的无水物来计算；取中检所对照品鹅去氧胆酸，再用流动相溶解成杂质对照品溶液，取牛磺鹅去氧胆酸样品用稀释剂溶解为样品溶液；分别取20ul注入液相色谱仪中，记录色谱图中鹅去氧胆酸的峰面积，再按照外标法计算牛磺鹅去氧胆酸样品中有关物质的大小。在同一个液相色谱条件下有效的分离和准确定量检测牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸两种极性相差比较大的胆酸类物质。

Description

一种新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法

技术领域

本发明涉及一种新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法。

背景技术

牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)是由鹅去氧胆酸(CDCA)的羧基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型胆汁酸。牛磺鹅去氧胆酸化学名为2-[[(3α，5β，7α)-3，7-二羟基-24-氧代胆甾烷-24-基]氨基]乙烷磺酸二水合物。牛磺鹅去氧胆酸为鸡胆汁中主要胆汁酸，动物胆汁、是历史悠久的传统中药，其性味苦寒、无毒，具有清热解毒、止咳平喘、利胆明目等功效。其中鸡胆汁就是一种由来已久的有效的中药材，早在汉代《神农本草经》中就有记载。临床研究表明，鸡胆汁具有抗炎、解热、镇痛、镇咳、平喘、祛痰、抑菌、免疫、抗氧化等多方面的生物活性和作用。结合胆汁酸是胆汁镇咳、祛痰和抗炎作用的有效成分，它是胆汁药理作用的主要物质基础。牛磺鹅去氧胆酸是鸡胆汁中结合胆汁酸的主要成分，占结合胆汁酸的70％～85％。现有的文献和发明关于高效液相测定牛磺鹅去氧胆酸的含量和其中有关物质大小主要有以下三个文献和发明。

1：“HPLC-ELSD法测定熊胆粉中牛磺鹅去氧胆酸和牛磺熊去氧胆酸的含量”(赵勇、咎丽霞、孙文基；《药物分析杂志》，2006，26(1),127)

2：“高效液相色谱法测定熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸含量的研究”(许学哲、张小勇、金星华；《延边大学学报》，1999，25(2)，93)

3：“人工蛇胆汁中牛磺胆酸、牛磺鹅去氧胆酸和牛磺去氧胆酸的反向高效液相色谱法测定；《华中科技大学学报(医学版)》，2000，29(3)，220)

由于结合型胆酸类物质如牛磺鹅去氧胆酸，以及游离型胆酸类物质如鹅去氧胆酸。这两种类型的胆酸类物质在紫外低波长，末端吸收附近响应值差距非常大，在紫外低波长条件下结合型胆酸类物质响应值是游离型胆酸类物质100倍左右。同时游离型胆酸类物质的极性相对于游离型胆酸类物质来说是非常小的，因此在十八烷基硅胶柱即C18柱的条件下，保留时间非常靠后，该条件下游离型胆酸类物质不出峰。当检测牛磺鹅去氧胆酸样品时，现有高效液相色谱检测条件下鹅去氧胆酸等游离型胆酸类物质的响应值和保留时间不符合液相方法验证的要求。因此现有的液相检测方法只能够分析和检测结合型、极性较大的结合型胆酸物质，如牛磺鹅去氧胆酸，而对于其合成原料中的鹅去氧胆酸以及鹅去氧胆酸中的极性较小的游离型胆酸类物质却无法在一个液相色谱条件下分离，因此现有的检测方法大部分是通过薄层色谱法、HPLC-UV、HPLC-ELSD法来检测牛磺鹅去氧胆酸中的鹅去氧胆酸残留。因此对于工业化生产牛磺鹅去氧胆酸的中间产品控制，存在非常大的不便。不能有效、准确的监控牛磺鹅去氧胆酸合成过程中鹅去氧胆酸的残留以及牛磺鹅去氧胆酸含量。

故此，现有牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法有待于进一步完善。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种有效测定牛磺鹅去氧胆酸中有关物质以及其中鹅去氧胆酸限度的方法，本发明采用高效液相色谱法应用RID检测器来测定牛磺鹅去氧胆酸的全部有关物质和牛磺鹅去氧胆酸的含量。本方法在同一个液相色谱条件下有效的分离和准确定量检测牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸两种极性相差比较大的胆酸类物质的方法的问题。

为了达到上述目的，本发明采用以下方案：

一种新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法，所述有关物质为牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸，其特征在于包括以下步骤：

A、取牛磺鹅去氧胆酸-sigma对照品为已知对照品，用稀释剂溶解成浓度为0.1-1mg/ml的对照品溶液，取牛磺鹅去氧胆酸样品用稀释剂溶解为浓度为0.1-1mg/ml的对照品供试品溶液；

B、分别取20ul注入液相色谱仪中，记录色谱图中牛磺鹅去氧胆酸的峰面积，按照外标法，以牛磺鹅去氧胆酸的无水物来计算，HPLC含量不小于99％；

C、取中检所对照品鹅去氧胆酸，再用流动相溶解成浓度为2-8ug/ml的杂质对照品溶液，取牛磺鹅去氧胆酸样品用稀释剂溶解为浓度为0.1-1mg/ml的样品溶液；

D、分别取20ul注入液相色谱仪中，记录色谱图中鹅去氧胆酸的峰面积，再按照外标法计算牛磺鹅去氧胆酸样品中有关物质的大小，鹅去氧胆酸不超过1.0％。

如上所述的新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法，所述有关物质为牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸，其特征在于包括以下步骤：

E、取牛磺鹅去氧胆酸-sigma对照品为已知对照品，用稀释剂溶解成浓度为0.5mg/ml的对照品溶液，取牛磺鹅去氧胆酸样品用稀释剂溶解为浓度为0.5mg/ml的对照品供试品溶液；

F、分别取20ul注入液相色谱仪中，记录色谱图中牛磺鹅去氧胆酸的峰面积，按照外标法，以牛磺鹅去氧胆酸的无水物来计算，HPLC含量不小于99％；

G、取中检所对照品鹅去氧胆酸，再用流动相溶解成浓度为5ug/ml的杂质对照品溶液，取牛磺鹅去氧胆酸样品用稀释剂溶解为浓度为0.5mg/ml的样品溶液；

H、分别取20ul注入液相色谱仪中，记录色谱图中鹅去氧胆酸的峰面积，再按照外标法计算牛磺鹅去氧胆酸样品中有关物质的大小，鹅去氧胆酸不超过1.0％。

如上所述新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法，其特征在于所述流动相按以下方法制得：按0.05mol/L甲酸铵水溶液：乙醇：四氢呋喃＝6:5:1的比例混合后，用三乙胺调节溶液pH为7.50。

如上所述新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法，其特征在于所述的液相色谱仪中采用C4色谱柱，流速：1.0ml/min，柱温：35℃，检测器采用示差折光检测器。

如上所述新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法，其特征在于所述的稀释剂为流动相。

如上所述新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法，其特征在于还包括有系统适应性测定：

分别取约25mg牛磺鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸对照品用稀释剂溶解，摇匀并定容到50ml；取20ul进样记录色谱图各峰的分离度和理论塔板数，分离度的大小要不小于1.5，理论踏板数不小于2000。

综上所述，本发明的有益效果：

一、本发明方法能够快速准确的测定牛磺鹅去氧胆酸的含量以及其中有关物质鹅去氧胆酸等的限度。

二、相对现有的一些应用ELSD检测器的液相检测方法，本发明方法应用普通的RID检测器，检测成本大大降低，非常有利于工业化大生产。

三、现有的HPLC检测方法中，无法在一个液相条件下分离结合型和游离型的胆酸类物质，即无法同时分离和检测极性差异非常大的两类胆酸类物质，如无法同时定量牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸，而本方法解决了这个问题，在RID检测器的条件下，结合型胆酸和游离型胆酸的响应值一样的情况下，同时分离和定量了两种极性相差比较大的胆酸类物质。

四、该方法应用RID检测器，反相高效液相色谱法，本方法灵敏度高、可靠性强，检测成本低，适用于牛磺鹅去氧胆酸生产中任何一步中间体的考察，也适用于牛磺鹅去氧胆酸本身的质量控制。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：

本发明新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法中所述有关物质为鹅去氧胆酸；

1、本发明所采用的色谱条件：

1.1色谱柱：C4色谱柱

1.2流动相：按0.05mol/L甲酸铵水溶液：乙醇：四氢呋喃＝6:5:1比例混合后，用三乙胺调节溶液pH为7.50。

1.3稀释剂：流动相

1.4流速：1.0ml/min柱温：35℃进样体积：20ul

1.5检测器：示差折光检测器

2：HPLC牛磺鹅去氧胆酸有关物质以及含量测定的方法

2.1取牛磺鹅去氧胆酸-sigma对照品为已知对照品，用稀释剂溶解成浓度为0.5mg/ml的对照品溶液，取牛磺鹅去氧胆酸样品用稀释剂溶解为浓度为0.5mg/ml的对照品供试品溶液。分别取20ul进样记录色谱图中牛磺鹅去氧胆酸的峰面积，按照外标法，以牛磺鹅去氧胆酸的无水物来计算HPLC含量，不小于99％。

2.2取中检所对照品鹅去氧胆酸，再用流动相溶解成浓度为5ug/ml的杂质对照品溶液，取牛磺鹅去氧胆酸样品用稀释剂溶解为浓度为0.5mg/ml的样品溶液。分别取20ul进样记录色谱图中鹅去氧胆酸的峰面积，再按照外标法计算牛磺鹅去氧胆酸样品中有关物质的大小，鹅去氧胆酸不超过1.0％。

为了验证本发明方法的系统适应性，进行了以下试验：

分别取约25mg牛磺鹅去氧胆酸，鹅去氧胆酸对照品用稀释剂溶解，摇匀并定容到50ml。取20ul进样记录色谱图各峰的分离度和理论塔板数，分离度的大小要不小于1.5，理论踏板数不小于2000。

为了进一步验证本方法，进行了以下试验：

一、牛磺鹅去氧胆酸线性试验

取牛磺鹅去氧胆酸的化学对照品适量，用稀释剂分别配置为0.1mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、1.0mg/ml的供试品溶液。分别取20ul溶液，注入液相色谱仪中，记录色谱图，各浓度的峰面积见下表1。

表1牛磺鹅去氧胆酸线性实验

以浓度对峰面积做线性回归，得线性方程相关系数r²＝0.9999。

结果表明：牛磺鹅去氧胆酸在0.1mg/ml～1.0mg/ml浓度范围内线性良好。

二、鹅去氧胆酸线性实验

取鹅去氧胆酸的化学对照品适量，用稀释剂分别配置为1ug/ml、2.0ug/ml、2.5ug/ml、3.0ug/ml、4.0ug/ml的供试品溶液。分别取20ul溶液，注入液相色谱仪中，记录色谱图，各浓度的峰面积见下表2。

表2鹅去氧胆酸的线性实验

以浓度对峰面积做线性回归，得线性方程相关系数r²＝0.9999。

结果表明：鹅去氧胆酸在2.0ug/ml～8.0ug/ml浓度范围内线性良好。

三、牛磺鹅去氧胆酸准确度试验

对照品溶液的制备：精密称取牛磺鹅去氧胆酸对照品约25mg，置于50ml量瓶中，稀释剂适量，使溶解，并用稀释剂定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：分别精密称取牛磺鹅去氧胆酸对照品及供试品，含量为99％；约20mg和20mg，25mg和25mg、30mg和30mg，分别置于100ml、100ml、100ml量瓶中，加稀释剂适量，使溶解，并用稀释剂定容至刻度，摇匀，即得80％、100％、120％的样品，每个浓度各配置三份。按含量测定项下分别测定回收率，结果如下表3：

表3回收率测定结果

结果表明：本法测定准确度良好。

四、牛磺鹅去氧胆酸精密度考察

取上述准确度项下100％的供试品溶液，连续进样6次，记录主成分峰面积的精密度如下表4。

表4精密度试验结果

结果提示：方法的精密度良好。

五、牛磺鹅去氧胆酸溶液稳定性试验

取上述准确度项下100％的供试品溶液，分别在常温下0、2、4、8、12、24、48小时，进样，记录主成分的峰面积变化，结果如下表5。

表5溶液稳定性考察

结果表明，常温下48小时内供试品溶液稳定性良好。

六、方法耐用性试验

取上述准确度项下为100％的供试品溶液，对色谱条件中的流动相的pH值、色谱柱温度等条件进行小范围改动，考察主成分的保留时间的影响及含量测定结果情况，流动相溶液PH值大概为7.5左右.考察结果见下表6。

表6含量测定方法耐用性考察

取本品，分别用两根不同的品牌的色谱柱，按该方法测定牛磺鹅去氧胆酸的含量，结果如下表7：

表7不同色谱柱间的耐用性

本发明方法应用RID检测器，反相高效液相色谱法，本方法灵敏度高、可靠性强，检测成本低，适用于牛磺鹅去氧胆酸生产中任何一步中间体的考察，也适用于牛磺鹅去氧胆酸本身的质量控制检测。

Claims (5)

1.一种新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法，所述有关物质为牛磺鹅去氧胆酸和鹅去氧胆酸，其特征在于包括以下步骤：

A、取牛磺鹅去氧胆酸-sigma对照品为已知对照品，用稀释剂溶解成浓度为0.1-1mg/ml的对照品溶液，取牛磺鹅去氧胆酸样品用稀释剂溶解为浓度为0.1-1mg/ml的对照品供试品溶液；

B、分别取20ul注入液相色谱仪中，记录色谱图中牛磺鹅去氧胆酸的峰面积，按照外标法，以牛磺鹅去氧胆酸的无水物来计算，HPLC含量不小于99％；

C、取中检所对照品鹅去氧胆酸，再用流动相溶解成浓度为2-8ug/ml的杂质对照品溶液，取牛磺鹅去氧胆酸样品用稀释剂溶解为浓度为0.1-1mg/ml的样品溶液；

D、分别取20ul注入液相色谱仪中，记录色谱图中鹅去氧胆酸的峰面积，再按照外标法计算牛磺鹅去氧胆酸样品中有关物质的大小，鹅去氧胆酸不超过1.0％。

2.根据权利要求1所述新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法，其特征在于所述流动相按以下方法制得：按0.05mol/L甲酸铵水溶液：乙醇：四氢呋喃＝6:5:1比例混合后，用三乙胺调节溶液pH为7.50。

3.根据权利要求1或2所述新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法，其特征在于所述的液相色谱仪中采用C4色谱柱，流速：1.0ml/min，柱温：35℃，检测器采用示差折光检测器。

4.根据权利要求3所述新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法，其特征在于所述的稀释剂为流动相。

5.根据权利要求3所述新的牛磺鹅去氧胆酸含量以及有关物质的检测方法，其特征在于还包括有系统适应性测定：

分别取约25mg牛磺鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸对照品用稀释剂溶解，摇匀并定容到50ml；取20ul进样记录色谱图各峰的分离度和理论塔板数，分离度的大小要不小于1.5，理论踏板数不小于2000。