CN107105674A

CN107105674A - 使用枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌菌株治疗或预防凤梨病的方法

Info

Publication number: CN107105674A
Application number: CN201580071001.8A
Authority: CN
Inventors: F·布兰迪; S·特雷纳; D·韦斯特豪斯
Original assignee: Bayer CropScience LP
Current assignee: Bayer CropScience LP
Priority date: 2014-12-22
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2017-08-29
Anticipated expiration: 2035-12-17
Also published as: BR112017013579A2; US20160174567A1; US20180177193A1; MX2017008019A; AU2015369924A1; PH12017501164A1; WO2016106063A8; BR112017013579B1; WO2016106063A1; CN107105674B; AU2015369924B2; EP3240423A1; EP3240423B1

Abstract

本发明提供一种用于防治植物中的长喙壳属种和/或减少采收作物损失的方法，所述方法包括将有效量的至少一种选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及其产生的代谢物的生物防治剂施用于植物和/或植物生长位点。本发明还涵盖了包含至少一种生物防治剂的组合物用于防治植物中的长喙壳属种的用途，其中所述至少一种生物防治剂选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌及其产生的代谢物。

Description

使用枯草芽孢杆菌或短小芽孢杆菌菌株治疗或预防凤梨病的方法

相关申请的交叉引用

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求于2014年12月22日提交的美国临时专利申请第62/095,393号的权益。上述专利申请的内容在此以引用的方式纳入本公开内容中。

技术领域

本发明涉及在植物中由长喙壳属种(Ceratocystis spp.)、特别是在甘蔗中由奇异长喙壳菌(Ceratocystis paradoxa)(凤梨病)引起的病害的生物防治。

背景技术

甘蔗是有重要经济意义的禾本科植物。甘蔗的种植面积正在不断增加，且其用途包括生产糖、法勒诺姆(Falernum)、糖蜜、朗姆酒、甘蔗酒(巴西的国魂)和燃料乙醇。甘蔗破碎后残留的甘蔗渣既可用于提供工厂中所使用的热能，又可提供通常出售给用户电网的电能，以及作为用于生产乙醇的原料。

甘蔗属于丛生禾草科植物。甘蔗通过种植整个甘蔗茎或含有一个或更多个芽的甘蔗茎的插条(cutting)进行繁殖。这些插条有时是指种块或种段(billet)。商业甘蔗种植涉及人工或机械地种植整个甘蔗茎或种块。

凤梨病是经济上重要的甘蔗病害，其出现在几乎所有种植甘蔗的国家。该病害是真菌奇异长喙壳菌引起的，这种真菌导致种块在种植后腐烂。这种病害的名字来源于种块腐烂过程中所产生的气味，该气味与成熟菠萝的气味相似。

合成的杀真菌剂通常是非特异性的，因此可作用于除了目标生物以外的其他生物，包括其他天然存在的有益生物。全世界的消费者越来越关注与化学残留物相关的潜在的环境和健康问题，尤其是在食品方面。这导致越来越多的来自消费者的减少化学(即合成)农药的使用或者至少减少其用量的压力。因此，需要控制食物链的需求，同时仍可有效地防治害虫。

使用合成杀真菌剂所带来的另一个问题是，重复且单独地施用一种杀真菌剂通常导致选择出抗性微生物。通常，这类菌株还对其他具有相同作用方式的活性成分产生交叉抗性。然后，就不再可能采用所述活性化合物来有效地防治病原体了。然而，具有新的作用机理的活性成分的研发既困难又昂贵。

病原体群体的抗性发展的风险以及对环境和人类健康的关注促进了在鉴定用于控制植物害虫和病害的合成杀真菌剂的替代物方面的兴趣。

使用生物防治剂(BCA)是一种替代方案。在某些情况下，大多数BCA的功效尚未达到与传统杀真菌剂相同的水平，特别是在严重感染压力的情况下。因此，在某些情况下，生物防治剂、其突变体和由其产生的代谢物，特别是在低施用率的情况下，并不能完全令人满意。

因此，持续需要开发新的、替代的植物保护剂，其至少在某些领域有助于满足上述需求。具体而言，需要更有效的方法来防治甘蔗的凤梨病。

发明内容

鉴于此，本发明的一个特别的目的是提供表现出对抗植物病原体(如，奇异长喙壳菌)的活性的组合物。此外，本发明另一特定的目的是减少生物防治剂和/或合成杀真菌剂的施用率并拓宽其活性谱，并从而提供这样一种组合物，其优选地在所施用的活性化合物总量降低的情况下，具有提高的对抗植物病原体的活性。特别地，本发明的另一目的是提供这样一种组合物，当其施用于作物时，能减少作物上的残留物的量，从而降低抗性形成的风险，但是仍然可提供有效的害虫和/或病害防治。

因此，已发现这些目的至少部分地由以下所定义的本发明的组合物和方法解决。本发明的组合物优选地满足上述需求。令人惊讶地发现，将本发明的组合物施用于植物、植物部位、采收的水果、蔬菜和/或植物生长位点优选能够有效地防治植物病原体，且特别是凤梨病的病原体——奇异长喙壳菌。

在一些实施方案中，本发明涉及一种用于防治植物中的长喙壳属种和/或减少采收作物的损失的方法，所述方法包括将有效量的至少一种选自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、其产生的代谢物及其结合物的生物防治剂施用于植物和/或植物生长位点。所述长喙壳属种可为多脂长喙壳(Ceratocystisadipose)、天蓝色长喙壳(Ceratocystis coerulescens)、Ceratocystis fagacearum、甘薯长喙壳(Ceratocystis fimbriata)、奇异长喙壳菌、毛长喙壳菌(Ceratocystispilifera)、Ceratocystis platani、Ceratocystis pluriannulata或其结合物。在一个实施方案中，所述长喙壳属种为奇异长喙壳菌。

在某些方面，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。在其他方面，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌QST713、枯草芽孢杆菌QST30002、枯草芽孢杆菌QST30004，或枯草芽孢杆菌QST713、枯草芽孢杆菌QST30002，或枯草芽孢杆菌QST30004的突变体。在其他方面，所述短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌QST2808或其突变体。

在其他实施方案中，在施用之前鉴定植物和/或植物生长位点是否需要处理。所述植物可包含繁殖材料。繁殖材料的非限制性实例包括幼苗、根茎、苗圃植物、插条和种子。

所述植物可为甘蔗、凤梨、香蕉、可可、椰子和油棕榈中的任一种。在某些实施方案中，所述植物为甘蔗。

本发明还提供处理植物以防治长喙壳属种的方法，其中所述方法包括将有效量的至少一种选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、其产生的代谢物及其结合物的生物防治剂施用于植物、植物部位和/或植物周围的位点(例如施用于植物生长培养基)。

在一些实施方案中，这种施用提高了产量和/或改善了植物健康。因此，例如，本发明还提供这样的方法，其中将本发明的组合物施用于土壤。例如，所述组合物可在植物或植物部位与土壤接触之前、接触过程中或接触之后施用。作为其他实施例，本发明的方法包括但不限于，使用例如土壤表面浸透、插柄(shanked-in)、注入或沿犁沟施用的施用方法来施用所述组合物。在一些方面，将枯草芽孢杆菌QST713、短小芽孢杆菌QST2808或其突变体施用于与植物根系接触的土壤或植物基部的土壤。

在某些方面，所述方法还包含将杀虫剂和/或杀真菌剂施用于植物和/或植物生长位点。所述杀虫剂和/或杀真菌剂可与枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和/或其产生的代谢物依序或同时施用。

在其他方面，所述至少一种生物防治剂为发酵产物。例如，所述发酵产物可包含枯草芽孢杆菌QST713细胞或枯草芽孢杆菌QST713的突变体细胞、代谢物和残余发酵液。在另一方面，所述发酵产物包含短小芽孢杆菌QST2808细胞和/或短小芽孢杆菌QST2808的突变体细胞、代谢物和残余发酵液。

在其他实施方案中，本发明涉及包含至少一种生物防治剂的组合物用于防治植物中的长喙壳属种的用途，其中所述至少一种生物防治剂选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、其产生的代谢物及其结合物。在一些方面，所述至少一种生物防治剂为枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。在其他方面，所述至少一种生物防治剂为枯草芽孢杆菌QST713。在一些实施方案中，所述至少一种生物防治剂为短小芽孢杆菌QST2808或其突变体。

附图说明

图1描绘了未处理的对照(UTC)植物、以不同施用率采用 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)处理的植物和采用(甲氧乙氯汞)处理的植物所出现的甘蔗芽的平均数。 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)和(甲氧乙氯汞)各自与500 EC(毒死蜱(chlorpyrifos))结合施用。

图2示出了奇异长喙壳菌被枯草芽孢杆菌QST713(图2A)和短小芽孢杆菌QST2808(图2B)抑制的区域。

具体实施方式

所有公开物、专利和专利申请，包括文中的任何附图和附录通过引证的方式纳入本说明书，其引用程度就如同说明每一份单个公开物或专利申请特别且单独地通过引证的方式纳入本说明书一样。

以下描述包括有助于理解本发明的信息。但这并不是承认本文提供的任何信息都是现有技术或者与本发明有关，或者明确或隐含地参考的任何出版物都是现有技术。

产品(EPA登记号69592-12)含有枯草芽孢杆菌的唯一菌株(菌株QST713)和许多不同的脂肽，它们发挥协同作用以破坏病害病原体并提供优异的抗微生物活性。产品被用于保护植物，例如蔬菜、水果、坚果和蔓生作物以抵抗病害，例如火疫病、灰霉病、酸腐病、锈病、菌核病、白粉病、细菌性斑点病、白霉病。产品以可通过叶面处理和/或土壤处理而施用的液体制剂和/或干制剂的形式获得。产品的EPA主标签的副本(包括 ASO、 MAX、 OPTIMUM(或OPTI)和SERENADE )可通过国家农药信息检索系统USEPA/OPP农药产品标签系统(PPLS)而公开地获得。

ASO(水性悬浮液-有机)含有1.34％的干的QST713作为活性成分和98.66％的其他成分。 ASO被配制成含有最少1×10⁹cfu/g的QST713，且QST713的最大量被确定为3.3×10¹⁰cfu/g。 ASO的替代商品名包括SERENADESERENADE 和 GARDENDISEASE。对于其他信息，参见于2010年1月4日的 ASO的U.S.EPA主标签和SERENADE其各自在此以引证的方式全部纳入本发明书中。

MAX含有14.6％的干的QST713作为活性成分和85.4％的其他成分。 MAX被配制成含有最少7.3×10⁹cfu/g的QST713，而QST713的最大量被确定为7.9×10¹⁰cfu/g。对于其他信息，参见 MAX的U.S.EPA主标签，其全部内容在此以引用的方式纳入本说明书中。

OPTIMUM(或OPTI)含有26.2％的干的QST713作为活性成分和73.8％的其他成分。 OPTIMUM(或OPTI)被配制成含有最少1.31×10¹⁰cfu/g的QST713。对于其他信息，参见 OPTIMUM(或OPTI)的U.S.EPA主标签，其全部内容在此以引用的方式纳入本说明书中。

短小芽孢杆菌QST2808的合适制剂可以以商品名(EPA登记号264-1153)购得，其含有1.38％的干的QST2808，并且其被配制成含有最少1×10⁹cfu/g的QST2808。短小芽孢杆菌QST2808的另一合适的制剂可以以商品名 PLUS(EPA登记号69592-13)购得，其含有1.38％的干的QST2808，并且被配制成含有最少1×10¹⁰cfu/g的QST2808。

NRRL是美国农业研究培养物保藏中心(Agricultural Research ServiceCulture Collection)的简称，是一个在《国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯公约》之下的用于保藏微生物菌种的国际保藏单位，其地址是：美国伊利诺伊州Peroira市北部大学街1815号，美国农业部农业研究服务局农业应用研究国家中心，邮编61604。

短小芽孢杆菌QST713、其突变体、其上清液和其脂肽代谢物，以及它们用于防治植物病原体和昆虫的方法详细地记载于美国专利第6,060,051、6,103,228、6,291,426、6,417,163和6,638,910号中，在此以引证的方式将它们各自所教导的一切具体且完整地纳入本说明书中。在这些美国专利中，菌株是指AQ713，其与QST713同义。枯草芽孢杆菌QST713根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯公约》的规定于1997年5月7日保藏于NRRL，登记号B-21661。在该说明书中，任何对QST713的提及均是指产品中存在的枯草芽孢杆菌QST713(aka AQ713)，其保藏在NRRL登记号B-21661下，或在刺激产生产品的条件下在生物反应器或摇瓶中制备。

在1998年提交美国专利申请第09/074,870号(其对应于上述专利)时，基于经典的生理学、生化和形态学方法将QST713菌株称为枯草芽孢杆菌。特别是鉴于遗传学和测序技术的进步，芽孢杆菌属种的分类学从那时起已经逐步地发展，因此物种命名主要基于DNA序列而不是1998年使用的方法。在对解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)FZB42，枯草芽孢杆菌168和QST713蛋白质序列进行比对后，在解淀粉芽孢杆菌FZB42中发现的约95％的蛋白质与QST713中发现的蛋白质具有85％或更高的同一性。然而，即使通过更加可靠的遗传学，在相关科学文献和法规文件中仍然存在模糊的分类，这反映了过去15年来对芽孢杆菌属分类学的不断变化的认识。例如，基于枯草芽孢杆菌株FZB24(其与QST713以及FZB42的亲缘关系密切)的农药产品在环境保护机构的文档中的分类为枯草芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌变种(B.subtilis var.amyloliquefaciens)。由于命名的这些复杂性，这种特定的芽孢杆菌属种被不同地定名——取决于文件——枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌解淀粉芽孢杆菌变种。因此，我们保留了QST713的枯草芽孢杆菌的定名，而不是将其改变为解淀粉芽孢杆菌，如目前仅基于序列比较以及所推断的分类学而预期的。由于各国的监管部门可能需要根据任何一种可能的分类学的分类进行注册，为了本专利申请的目的，应理解作为枯草芽孢杆菌QST713而保藏的菌株和被指定为NRRL保藏号B-21661的菌株等同于解淀粉芽孢杆菌QST713。

如在国际专利公开第WO2012/087980号(在此以引证的方式将其全部内容纳入本说明书中)中所详细说明的，枯草芽孢杆菌QST713的培养物实际上是野生型细胞和相对较小百分比的变异细胞类型的混合物，根据它们的菌落的形态，将其称为“砂纸细胞”。

枯草芽孢杆菌菌株AQ30002(aka QST30002)或AQ30004(aka QST30004)，其以登记号NRRL B-50421和NRRL B-50455保藏，记载于国际专利出版物第WO2012/087980号中；或者这些具有枯草芽孢杆菌菌株AQ30002(aka QST30002)或AQ30004(aka QST30004)所有生理和形态特征的枯草芽孢杆菌菌株的突变体也可用于本发明的方法中，可单独使用或以与枯草芽孢杆菌QST713混合物的形式使用。

短小芽孢杆菌QST2808、其突变体、上清液和用于防治植物病原体和昆虫的方法详细地记载于美国专利第6,245,551和6,586,231号中；在此以引证的方式将它们各自所教导的一切具体且完整地纳入本说明书中。在这些美国专利中，菌株是指NRRL No.B-30087，其与QST2808同义。短小芽孢杆菌QST2808根据《国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯公约》的规定于1999年1月14日保藏于NRRL，登记号B-30087。在本说明书中，任何关于QST2808的提及均是指短小芽孢杆菌QST2808。

在一些实施方案中，所述枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌AQ30002或枯草芽孢杆菌AQ30004。在其他实施方案中，所述枯草芽孢杆菌菌株为枯草芽孢杆菌3610。

术语“突变体”是指衍生自QST713或QST2808的遗传变体。在一个实施方案中，所述突变体具有QST713或QST2808的所有鉴定特征。在一个特定的实例中，所述突变体至少与亲本QST713或QST2808菌株同样防治植物病原体(例如长喙壳属种)。在另一实施方案中，突变体为基因组序列与QST713或QST2808菌株具有大于约85％、大于约90％、大于约95％、大于约98％、更大于约99％的序列同一性的遗传变体。突变体可通过以下方式获得：使用化学品或辐射处理QST713或QST2808细胞或通过选择来自QST713或QST2808细胞种群的自发突变体(例如抗噬菌体突变体)或通过本领域技术人员熟知的其他方式。

本发明的组合物可通过根据本领域熟知的方法培养枯草芽孢杆菌QST713或其突变体而获得，包括使用美国专利第6,060,051号中记载的培养基和其他方法。在其他实施方案中，本发明的组合物可通过根据本领域熟知的方法培养短小芽孢杆菌，且特别是短小芽孢杆菌菌株QST2808而获得，其包括使用美国专利第6,245,551号中记载的培养基和其他方法。常规的大规模微生物培养方法包括深层发酵、固态发酵或液体表面发酵。在发酵结束时，由于营养物耗尽，枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌细胞开始从生长阶段转变为孢子形成阶段，使得发酵的最终产物主要为孢子、代谢物和残余发酵培养基。孢子形成是枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的自然生命周期的一部分且通常由细胞响应营养限制而引发。设置发酵条件以获得高水平的枯草芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的菌群形成单位，并促进孢子形成。由发酵产生的于培养基中的细菌细胞、孢子和代谢物可以直接使用或通过常规工业方法(例如离心、切向流过滤、滤床过滤和蒸发)浓缩。发酵培养液和培养液浓缩物在本文中均是指“发酵产物”。本发明的组合物包括发酵产物。在一些实施方案中，经浓缩的发酵培养液例如通过渗滤方法洗涤以除去残余的发酵培养液和代谢物。

使用常规干燥过程或方法(如喷雾干燥、冷冻干燥、盘式干燥、流化床干燥、转鼓式干燥或蒸发)、添加或不添加载体来干燥发酵培养液或培养液浓缩物。

所得干燥产物可例如通过研磨或造粒进一步处理以实现特定粒度或物理形式。下文描述的载体也可在干燥后加入。

本发明的芽孢杆菌的新变体和菌株的发酵液的无细胞制剂可通过本领域已知的任何方法获得，例如发酵培养液的萃取、离心和/或过滤。本领域技术人员将理解，所谓的无细胞制剂不可能没有细胞，而是在很大程度上是无细胞的或基本上无细胞，这取决于去除细胞所使用的技术(例如，离心速度)。所得无细胞制剂可以进行干燥和/或采用有助于其施用于植物或植物生长培养基的组分进行配制。上述用于发酵培养液的浓缩方法和干燥技术也适用于无细胞制剂。

枯草芽孢杆菌的代谢物可通过美国专利第6,060,051号中所述的方法获得。短小芽孢杆菌(包括短小芽孢杆菌菌株QST2808)的代谢物可通过美国专利第6,245,551号中所述的方法获得。本文中所使用的术语“代谢物”可以是指半纯的和纯的或基本上纯的代谢物或是指尚未与枯草芽孢杆菌和/或短小芽孢杆菌分离的代谢物。在一些实施方案中，在通过发酵培养液的离心而制备无细胞制剂后，代谢物可通过尺寸排阻过滤进行纯化，所述尺寸排阻过滤为例如Sephadex树脂，包括LH-20、G10、G15和G25，由于脂肽的分子量在800道尔顿与1600道尔顿之间，所述Sephadex树脂基于截留分子量将代谢物分成不同流分，例如分子量小于约2000道尔顿、小于约1500道尔顿、小于约1000道尔顿等的流分。

上述用于发酵培养液的制剂的浓缩方法和干燥技术也适用于代谢物。

本发明的组合物可包括加入到包含细胞、无细胞制剂或代谢物的组合物中的制剂惰性物，以改善功效、稳定性和可用性和/或有利于加工、包装和最终应用。这种制剂惰性物和成分可包括载体、稳定剂、营养物或物理性能改进剂，其可单独或组合地添加。在一些实施方案中，所述载体可包括液体材料，例如水、油和其他有机或无机溶剂；以及固体材料，例如矿物质、聚合物、生物学上衍生的或通过化学合成衍生的聚合物复合物。在一些实施方案中，所述载体为促进组合物粘附于植物部位(例如种子或根)的粘合剂(binder)或粘结剂(adhensive)。参见，例如Taylor，A.G.，et al.，“Concepts and Technologies ofSelected Seed Treatments”，Annu.Rev.Phytopathol.28：321-339(1990)。所述稳定剂可包括防结块剂、抗氧化剂、干燥剂、保护剂或防腐剂。所述营养物可包括碳源、氮源和磷源，例如糖、多糖、油、蛋白质、氨基酸、脂肪酸和磷酸盐。所述物理性能改进剂可包括填充剂、润湿剂、增稠剂、pH调节剂、流变改性剂、分散剂、佐剂、表面活性剂、防冻剂或着色剂。在一些实施方案中，通过发酵而制备的包含细胞、无细胞制剂或代谢物的组合物中可加入或不加入作为稀释剂的水而直接使用，而无需制备成任何其它制剂。在一些实施方案中，所述制剂惰性物在浓缩发酵培养液之后且在干燥过程中和/或之后加入。

本发明的组合物可包括载体，所述载体为加入到包含含脂肽的发酵产物、脂肽的无细胞制剂或脂肽的纯化的、半纯化的或粗的提取物的组合物中的惰性制剂成分，以改进回收、功效或物理性能和/或有助于包装和管理。这样的载体可以单独或组合地添加。

在本文中以其“通用名”所示的活性成分是已知的且记载于例如农药手册(“ThePesticide Manual”，14th Ed.，British Crop Protection Council 2006)中或可在互联网中搜索(如http://www.alanwood.net/pesticides)。

本发明用于防治长喙壳属种(如，奇异长喙壳菌，凤梨病的致病菌)的组合物可与其他化学品和非化学添加剂、佐剂和/或处理混合使用和/或依序使用，其中这种处理包括但不限于化学和非化学的杀真菌剂、杀虫剂、杀螨剂、杀线虫剂、肥料、营养物、矿物质、植物生长素、生长刺激剂等。在一些实施方案中，当本发明的组合物与其他化学品和非化学添加剂、佐剂和/或处理混合或依序使用时，在防治长喙壳属种中产生协同或超加和效果。

在一个实施方案中，将枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和/或其产生的代谢物与杀虫剂混合和/或依序使用。

根据本发明的一个优选实施方案，优选的杀虫剂选自：

(1)乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂，例如

氨基甲酸酯类，例如，棉铃威(alanycarb)(I1)、涕灭威(aldicarb)(I2)、噁虫威(bendiocarb)(I3)、丙硫克百威(benfuracarb)(I4)、丁酮威(butocarboxim)(I5)、丁酮砜威(butoxycarboxim)(I6)、甲萘威(carbaryl)(I7)、克百威(carbofuran)(I8)、丁硫克百威(carbosulfan)(I9)、乙硫苯威(ethiofencarb)(I10)、仲丁威(fenobucarb)(I11)、伐虫脒(formetanate)(I12)、呋线威(furathiocarb)(I13)、异丙威(isoprocarb)(I14)、甲硫威(methiocarb)(I15)、灭多威(methomyl)(I16)、速灭威(metolcarb)(I17)、杀线威(oxamyl)(I18)、抗蚜威(pirimicarb)(I9)、残杀威(propoxur)(I20)、硫双威(thiodicarb)(I21)、久效威(thiofanox)(I22)、唑蚜威(triazamate)(I23)、混杀威(trimethacarb)(I24)、XMC(I25)和灭杀威(xylylcarb)(I26)；或

有机磷酸酯类，例如，乙酰甲胺磷(acephate)(I27)、甲基吡恶磷(azamethiphos)(I28)、益棉磷(azinphos-ethyl)(I29)、保棉磷(azinphos-methyl)(I30)、硫线磷(cadusafos)(I31)、氯氧磷(chlorethoxyfos)(I32)、毒虫畏(chlorfenvinphos)(I33)、氯甲硫磷(chlormephos)(I34)、毒死蜱(chlorpyrifos)(I35)、甲基毒死蜱(chlorpyrifos-methyl)(I36)、蝇毒磷(coumaphos)(I37)、杀螟腈(cyanophos)(I38)、甲基内吸磷(demeton-S-methyl)(I39)、二嗪磷(diazinon)(I40)、敌敌畏/DDVP(dichlorvos/DDVP)(I41)、百治磷(dicrotophos)(I42)、乐果(dimethoate)(I43)、甲基毒虫畏(dimethylvinphos)(I44)、乙拌磷(disulphoton)(I45)、苯硫磷(EPN)(I46)、乙硫磷(ethion)(I47)、灭线磷(ethoprophos)(I48)、伐灭磷(famphur)(I49)、苯线磷(fenamiphos)(I50)、杀螟硫磷(fenitrothion)(I51)、倍硫磷(fenthion)(I52)、噻唑磷(fosthiazate)(I53)、庚烯磷(heptenophos)(I54)、imicyafos(I55)、异柳磷(isofenphos)(I56)、O-(甲氧基氨基硫代磷酰基)水杨酸异丙酯(Isopropyl O-(methoxyaminothio-phosphoryl)salicylate)(I57)、异噁唑磷(isoxathion)(I58)、马拉硫磷(malathion)(I59)、灭蚜磷(mecarbam)(I60)、甲胺磷(methamidophos)(I61)、杀扑磷(methidathion)(I62)、速灭磷(mevinphos)(I63)、久效磷(monocrotophos)(I64)、二溴磷(naled)(I65)、氧乐果(omethoate)(I66)、亚砜磷(oxydemeton-methyl)(I67)、对硫磷(parathion)(I68)、甲基对硫磷(parathion-methyl)(I69)、稻丰散(phenthoate)(I70)、甲拌磷(phorate)(I71)、伏杀硫磷(phosalone)(I72)、亚胺硫磷(phosmet)(I73)、磷胺(phosphamidon)(I74)、辛硫磷(phoxim)(I75)、甲基嘧啶磷(pirimiphos-methyl)(I76)、丙溴磷(profenofos)(I77)、胺丙畏(propetamphos)(I78)、丙硫磷(prothiofos)(I79)、吡唑硫磷(pyraclofos)(I80)、哒嗪硫磷(pyridaphenthion)(I81)、喹硫磷(quinalphos)(I82)、治螟磷(sulfotep)(I83)、丁基嘧啶磷(tebupirimfos)(I84)、双硫磷(temephos)(I85)、特丁硫磷(terbufos)(I86)、杀虫畏(tetrachlorvinphos)(I87)、甲基乙拌磷(thiometon)(I88)、三唑磷(triazophos)(I89)、敌百虫(triclorfon)(I90)和蚜灭磷(vamidothion)(I91)；

(2)GABA门控氯离子通道拮抗剂类，例如

环戊二烯有机氯类，例如，氯丹(chlordane)(I92)和硫丹(endosulfan)(I93)；或

苯基吡唑类(fiproles)，例如，乙虫腈(ethiprole)(I94)、氟虫腈(fipronil)(I95)；

(3)钠通道调节剂/电压依赖性钠通道阻断剂，例如拟除虫菊酯类，例如，氟丙菊酯(Acrinathrin)(I96)、烯丙菊酯(Allethrin)(I97)、(d-顺-反)烯丙菊酯(d-cis-transAllethrin)(I98)、(d-反)烯丙菊酯(d-trans Allethrin)(I99)、氟氯菊酯(Bifenthrin)(I100)、生物烯丙菊酯(Bioallethrin)(I101)、生物烯丙菊酯-S-环戊烯基异构体(Bioallethrin S-cyclopentenyl isomer)(I102)、生物苄呋菊酯(Bioresmethrin)(I103)、乙氰菊酯(Cycloprothrin)(I104)、氟氯氰菊酯(Cyfluthrin)(I105)、β-氟氯氰菊酯(beta-Cyfluthrin)(I106)、氯氟氰菊酯(Cyhalothrin)(I107)、λ-氯氟氰菊酯(Iambda-Cyhalothrin)(I108)、γ-氯氟氰菊酯(gamma-Cyhalothrin)(I109)、氯氰菊酯(Cypermethrin)(I110)、α-氯氰菊酯(alpha-Cypermethrin)(I111)、β-氯氰菊酯(beta-Cypermethrin)(I112)、θ-氯氰菊酯(theta-Cypermethrin)(I113)、ζ-氯氰菊酯(zeta-Cypermethrin)(I114)、苯醚氯菊酯(1R-反式异构体)(Cyphenothrin[(1R)-transisomers])(I115)、溴氰菊酯(Deltamethrin)(I116)、烯炔菊酯((EZ)-(1R)异构体)(Empenthrin[(EZ)-(1R)isomers))(I117)、高氰戊菊酯(Esfenvalerate)(I118)、醚菊酯(Etofenprox)(I119)、甲氰菊酯(Fenpropathrin)(I120)、氰戊菊酯(Fenvalerate)(I121)、氟氰戊菊酯(Flucythrinate)(I122)、氟氯苯菊酯(Flumethrin)(I123)、τ-氟胺氰菊酯(tau-Fluvalinate)(I124)、苄螨醚(Halfenprox)(I125)、炔咪菊酯(Imiprothrin)(I126)、噻恩菊酯(Kadethrin)(I127)、氯菊酯(Permethrin)(I128)、苯醚菊酯((1R)-反式异构体)(Phenothrin[(1R)-trans isomer))(I129)、右旋炔丙菊酯(Prallethrin)(I130)、除虫菊素(除虫菊)(Pyrethrine(pyrethrum))(I131)、苄呋菊酯(Resmethrin)(I132)、氟硅菊酯(Silafluofen)(I133)、七氟菊酯(Tefluthrin)(I134)、胺菊酯(Tetramethrin)(I135)、胺菊酯(1R异构体)(Tetramethrin[(1R)isomers)])(I136)、四溴菊酯(Tralomethrin)(I137)、四氟菊酯(Transfluthrin)(I138)；或DDT(I139)；或甲氧滴滴涕(Methoxychlor)(I140)；

(4)烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)激动剂类，例如新烟碱，例如，啶虫脒(acetamiprid)(I141)、噻虫胺(clothianidin)(I142)、呋虫胺(dinotefuran)(I143)、吡虫啉(imidacloprid)(I144)、烯啶虫胺(nitenpyram)(I145)、噻虫啉(thiacloprid)(I146)、噻虫嗪(thiamethoxam)(I147)；或烟碱(nicotine)(I148)；或砜虫啶(Sulfoxaflor)(I149)；

(5)烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)变构激活剂，例如多杀霉素类(spinosyns)，例如乙基多杀霉素(spinetoram)(I150)和多杀菌素(spinosad)(I151)；

(6)氯离子通道激活剂类，例如阿维菌素类(avermectins)/米尔贝霉素类(milbemycins)，例如，阿维菌素(abamectin)(I152)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(emamectinbenzoate)(I153)、雷皮菌素(lepimectin)(I154)弥拜菌素(milbemectin)(I155)；

(7)保幼激素模拟物，例如保幼激素类似物类，例如，烯虫乙酯(hydroprene)(I156)、烯虫炔酯(kinoprene)(I157)、烯虫酯(methoprene)(I158)；或苯氧威(fenoxycarb)(I159)；吡丙醚(pyriproxifen)(I160)；

(8)其他非特异性(多位点)抑制剂，例如烷基卤化物类，例如，溴甲烷(Methylbromide)(I161)和其他烷基卤化物；或氯化苦(chloropicrin)(I162)；或硫酰氟(sulfurylfluoride)(I163)；或硼砂(borax)(I164)；或吐酒石(tartar emetic)(I165)；

(9)选择性同翅目昆虫进食阻断剂类，例如，吡蚜酮(pymetrozine)(I166)；或氟啶虫酰胺(flonicamid)(I167)；

(10)螨生长抑制剂类，例如，四螨嗪(clofentezine)(I168)、噻螨酮(hexythiazox)(I169)、氟螨嗪(diflovidazin)(I170)、乙螨唑(etoxazole)(I171)；

(11)昆虫肠膜的微生物干扰剂，例如苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillusthuringiensis subspecies israelensis)(I172)、苏云金芽胞杆菌鲇泽亚种(Bacillusthuringiensis subspecies aizawai)(I173)、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(I174)、苏云金芽孢杆菌拟步行甲亚种(Bacillus thuringiensis subspecies tenebrionis)(I175)，以及b.t.作物蛋白：Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa、Cry1A.105、Cry2Ab、Vip3A、mCry3A、Cry3Ab、Cry3Bb、Cry34Ab1/35Ab1(I176)；或球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)(I177)；

(12)线粒体ATP合成酶抑制剂，例如丁醚脲(diafenthiuron)(I178)；或有机锡杀螨剂类，例如三唑锡(azocyclotin)(I179)、三环锡(cyhexatin)(I180)、苯丁锡(fenbutatin oxide)(I181)；或炔螨特(propargite)(I182)；或三氯杀螨砜(tetradifon)(I183)；

(13)通过破坏质子梯度而起作用的氧化磷酸化解偶联剂类，例如虫螨腈(chlorfenapyr)(I184)、二硝甲酚(DNOC)(I185)、氟虫胺(sulfluramid)(I186)；

(14)烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)通道阻断剂类，例如杀虫磺(bensultap)(I187)、杀螟丹盐酸盐(cartap hydrochloride)(I188)、杀虫环(thiocylam)(I189)和杀虫双(thiosultap-sodium)(I190)；

(15)0型几丁质生物合成抑制剂类例如，双三氟虫脲(bistrifluron)(I191)、定虫隆(chlofluazuron)(I192)、氟脲杀(diflubenzuron)(I193)、氟螨脲(flucycloxuron)(I194)、氟虫脲(flufenoxuron)(I195)、氟铃脲(hexaflumuron)(I196)、氟丙氧脲(lufenuron)(I197)、双苯氟脲(novaluron)(I198)、多氟脲(noviflumuron)(I199)、伏虫磷(teflubenzuron)(I200)和杀虫隆(triflumuron)(I201)；

(16)1型几丁质生物合成抑制剂类，例如噻嗪酮(buprofezin)(I202)；

(17)脱皮干扰剂类，例如灭蝇胺(cyromazine)(I203)；

(18)蜕皮激素受体激动剂类，例如环虫酰肼(chromafenozide)(I204)、氯虫酰肼(halofenozide)(I205)、甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)(I206)和虫酰肼(tebufenozide)(I207)；

(19)章鱼胺受体激动剂类，例如双甲脒(amitraz)(I208)；

(20)线粒体复合体III电子转移抑制剂类，例如灭蚁腙(hydramethylnone)(I209)；或灭螨醌(acequinocyl)(I210)；或嘧螨酯(fluacrypyrim)(I211)；

(21)线粒体复合体I电子转移抑制剂类，例如

METI杀螨剂类，例如喹螨醚(fenazaquin)(I212)、唑螨酯(fenpyroximate)(I213)、嘧螨醚(pyrimidifen)(I214)、哒螨灵(pyridaben)(I215)、吡螨胺(tebufenpyrad)(I216)、唑虫酰胺(tolfenpyrad)(I217)；或鱼藤酮(rotenone(Derris))(I218)；

(22)电压依赖性钠离子通道阻断剂，例如茚虫威(I219)；或氰氟虫胺(I220)；

(23)乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类，例如特窗酸和特特拉姆酸衍生物，例如螺螨酯(spirodiclofen)(I221)、螺甲螨酯(spiromesifen)(I222)和螺虫乙酯(spirotetramat)(I223)；

(24)线粒体复合体IV电子转移抑制剂，例如膦类，例如磷化铝(Aluminiumphosphide)(I224)、磷化钙(Calcium phosphide)(I225)、膦(Phosphine)(I226)、磷化锌(Zinc phosphide)(I227)；或氰化物(Cyanide)(I228)；

(25)线粒体复合体II电子转移抑制剂类，例如，β-开托利(β-ketonitrile)衍生物，例如唑螨氰(cyenopyrafen)(I229)和丁氟螨酯(Cyflumetofen)(I230)；

(26)兰尼碱(ryanodine)受体调节剂类，例如，二酰胺类，例如氯虫酰胺(chlorantraniliprole)(I231)、溴氰虫酰胺(cyantraniliprole)(I232)、氟虫酰胺(flubendiamide)(I233)；

其他作用机理未知或不确定的活性化合物，例如磺胺螨酯(Amidoflumet)(I234)、印楝素(azadirachtin)(I235)、Benclothiaz(I236)、苯螨特(benzoximate)(I237)、联苯肼酯(bifenazate)(I238)、溴螨酯(bromopropylate)(I239)、灭螨锰(chinomethionat)(I240)、冰晶石(Cryolite)(I241)、三氯杀螨醇(Dicofol)(I242)、氟螨嗪(Diflovidazin)(I243)、5-氯-2-[(3，4，4-三氟丁-3-烯-1-基)磺酰基]-1，3-噻唑(Fluensulfone)(I244)、嘧虫胺(Flufenerim)(I245)、丁烯氟虫腈(Flufiprole)(I246)、氟吡菌酰胺(Fluopyram)(I247)、呋喃虫酰肼(Fufenozide)(I248)、氯噻啉(Imidaclothiz)(I249)、异菌脲(Iprodione)(I250)、氯氟醚菊酯(Meperfluthrin)(I251)、啶虫丙醚(Pyridalyl)(I252)、Pyrifluquinazon(I253)、四氟醚菊酯(Tetramethylfluthrin)(I254)、碘甲烷(iodomethane)(I255)；以及基于坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)(包括但不限于菌株CNCM I-1582，例如，BioNem，Votivo^TM)(I256)的产品，或下列已知的活性化合物之一：3-溴-N-{2-溴-4-氯-6-[(1-环丙基乙基)氨基甲酰基]苯基}-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺(I257)(已知于WO2005/077934)、4-{[(6-溴吡啶-3-基)甲基](2-氟乙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(I258)(已知于WO 2007/115644)、4-{[(6-氟吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(I259)(已知于WO 2007/115644)、4-{[(2-氯-1，3-噻唑-5-基)甲基](2-氟乙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(I260)(已知于WO 2007/115644)、4-{[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2-氟乙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(I261)(已知于WO 2007/115644)、Flupyradifurone(I262)、4-{[(6-氯-5-氟吡啶-3-基)甲基](甲基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(I263)(已知于WO2007/115643)、4-{[(5，6-二氯吡啶-3-基)甲基](2-氟乙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(I264)(已知于WO 2007/115646)、4-{[(6-氯-5-氟吡啶-3-基)甲基](环丙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(I265)(已知于WO 2007/115643)、4-{[(6-氯吡啶-3-基)甲基](环丙基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(I266)(已知于EP-A-0 539 588)、4-{[(6-氯吡啶-3-基)甲基](甲基)氨基}呋喃-2(5H)-酮(I267)(已知于EP-A-0539588)、{[1-(6-氯吡啶-3-基)乙基](甲基)氧-λ4-亚硫烷基}氨腈(I268)(已知于WO 2007/149134)及其非对映异构体(A){[(1R)-1-(6-氯吡啶-3-基)乙基](甲基)氧-λ4-亚硫烷基}氨腈(I269)和(B){[(1S)-1-(6-氯吡啶-3-基)乙基](甲基)氧-λ4-亚硫烷基}氨腈(I270)(同样已知于WO 2007/149134)以及非对映异构体(A1)[(R)-甲基(氧){(1R)-1-[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]乙基}-λ4-亚硫烷基]氨腈(I271)和(A2)[(S)-甲基(氧){(1S)-1-[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]乙基}-λ4-亚硫烷基]氨腈(I272)，被称为非对映异构体组A(已知于WO 2010/074747、WO 2010/074751)，(B1)[(R)-甲基(氧){(1S)-1-[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]乙基}-λ4-亚硫烷基]氨腈(I273)和(B2){(S)-甲基(氧){(1R)-1-[6-(三氟甲基)吡啶-3-基]乙基}-λ4-亚硫烷基]氨腈(I274)，被称为非对映异构体组B(同样已知于WO 2010/074747、WO 2010/074751)，和11-(4-氯-2，6-二甲基苯基)-12-羟基-1，4-二氧杂-9-氮杂二螺[4.2.4.2]十四-11-烯-10-酮(I275)(已知于WO2006/089633)、3-(4′-氟-2，4-二甲基联苯-3-基)-4-羟基-8-氧杂-1-氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮(I276)(已知于WO 2008/067911)、1-[2-氟-4-甲基-5-[(2，2，2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基]-3-(三氟甲基)-1H-1，2，4-三唑-5-胺(I277)(已知于WO 2006/043635)、Afidopyropen[(3S，4aR，12R，12aS，12bS)-3-[(环丙基羰基)氧基]-6，12-二羟基-4，12b-二甲基-11-氧代-9-(吡啶-3-基)-1，3，4，4a，5，6，6a，12，12a，12b-十氢-2H，11H-苯基[f]吡喃[4，3-b]苯并吡喃-4-基]环丙基甲酸甲酯(I278)(已知于WO2008/066153)、2-氰基-3-(二氟甲氧基)-N，N-二甲基苯磺酰胺(I279)(已知于WO 2006/056433)、2-氰基-3-(二氟甲氧基)-N-甲基苯磺酰胺(I280)(已知于WO 2006/100288)、2-氰基-3-(二氟甲氧基)-N-乙基苯磺酰胺(I281)(已知于WO 2005/035486)、4-(二氟甲氧基)-N-乙基-N-甲基-1，2-苯并噻唑-3-胺1，1-二氧化物(I282)(已知于WO 2007/057407)、N-[1-(2，3-二甲基苯基)-2-(3，5-二甲基苯基)乙基]-4，5-二氢-1，3-噻唑-2-胺(I283)(已知于WO 2008/104503)、{1′-[(2E)-3-(4-氯苯基)丙-2-烯-1-基]-5-氟螺[吲哚-3，4′-哌啶]-1(2H)-基}(2-氯吡啶-4-基)甲酮(I284)(已知于WO2003/106457)、3-(2，5-二甲基苯基)-4-羟基-8-甲氧基-1，8-二氮杂螺[4.5]癸-3-烯-2-酮(I285)(已知于WO2009/049851)、3-(2，5-二甲基苯基)-8-甲氧基-2-氧代-1，8-二氮杂螺[4.5]癸-3-烯-4-基碳酸乙酯(I286)(已知于WO2009/049851)、4-(丁-2-炔-1-基氧基)-6-(3，5-二甲基哌啶-1-基)-5-氟嘧啶(I287)(已知于WO2004/099160)、(2，2，3，3，4，4，5，5-入氟戊基)(3，3，3-三氟丙基)丙二腈(I288)(已知于WO2005/063094)、(2，2，3，3，4，4，5，5-八氟戊基)(3，3，4，4，4-五氟丁基)丙二腈(I289)(已知于WO2005/063094)、8-[2-(环丙基甲氧基)-4-(三氟甲基)苯氧基]-3-[6-(三氟甲基)哒嗪-3-基]-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷(I290)(已知于WO2007/040280)、Flometoquin(I291)、PF1364(CAS注册号1204776-60-2)(I292)(已知于JP2010/018586)、5-[5-(3，5-二氯苯基)-5-(三氟甲基)-4，5-二氢-1，2-噁唑-3-基]-2-(1H-1，2，4-三唑-1-基)苯甲腈(I293)(已知于WO2007/075459)、5-[5-(2-氟吡啶-4-基)-5-(三氟甲基)-4，5-二氢-1，2-噁唑-3-基]-2-(1H-1，2，4-三唑-1-基)苯甲腈(I294)(已知于WO2007/075459)、4-[5-(3，5-二氯苯基)-5-(三氟甲基)-4，5-二氢-1，2-噁唑-3-基]-2-甲基-N-{2-氧代-2-[(2，2，2-三氟乙基)氨基]乙基}苯甲酰胺(I295)(已知于WO2005/085216)、4-{[(6-氯吡啶-3-基)甲基](环丙基)氨基}-1，3-噁唑-2(5H)-酮(I296)、4-{[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基}-1，3-噁唑-2(5H)-酮(I297)、4-{[(6-氯吡啶-3-基)甲基](乙基)氨基}-1，3-噁唑-2(5H)-酮(I298)、4-{[(6-氯吡啶-3-基)甲基](甲基)氨基}-1，3-噁唑-2(5H)-酮(I299)(全部已知于WO2010/005692)、Pyflubumide N-[4-(1，1，1，3，3，3-六氟-2-甲氧基丙-2-基)-3-异丁基苯基]-N-异丁酰基-1，3，5-三甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺(I300)(已知于WO2002/096882)、2-[2-({[3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)-5-氯-3-甲基苯甲酰基]-2-甲基肼甲酸甲酯(I301)(已知于WO2005/085216)、2-[2-({[3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)-5-氰基-3-甲基苯甲酰基]-2-乙基肼甲酸甲酯(I302)(已知于WO2005/085216)、2-[2-({[3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)-5-氰基-3-甲基苯甲酰基]-2-甲基肼甲酸甲酯(I303)(已知于WO2005/085216)、2-[3，5-二溴-2-({[3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)苯甲酰基]-1，2-二乙基肼甲酸甲酯(I304)(已知于WO2005/085216)、2-[3，5-二溴-2-({[3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)苯甲酰基]-2-乙基肼甲酸甲酯(I305)(已知于WO2005/085216)、(5RS，7RS；5RS，7SR)-1-(6-氯-3-吡啶基甲基)-1，2，3，5，6，7-六氢-7-甲基-8-硝基-5-丙氧基咪唑并[1，2-a]吡啶(I306)(已知于WO2007/101369)、2-{6-[2-(5-氟吡啶-3-基)-1，3-噻唑-5-基]吡啶-2-基}嘧啶(I307)(已知于WO2010/006713)、2-{6-[2-(吡啶-3-基)-1，3-噻唑-5-基]吡啶-2-基}嘧啶(I308)(已知于WO2010/006713)、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺(I309)(已知于WO2010/069502)、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺(I310)(已知于WO2010/069502)、N-[2-(叔丁基氨基甲酰基)-4-氰基-6-甲基苯基]-1-(3-氯吡啶-2-基)-3-{[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺(I311)(已知于WO2010/069502)、N-[2-(叔丁基氨基甲酰基)-4-氰基-6-甲基苯基]-1-(3-氯吡啶-2-基)-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺(I312)(已知于WO2010/069502)、(1E)-N-[(6-氯吡啶-3-基)甲基]-N′-氰基-N-(2，2-二氟乙基)乙脒(ethanimidamide)(I313)(已知于WO2008/009360)、N-[2-(5-氨基-1，3，4-噻二唑-2-基)-4-氯-6-甲基苯基]-3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-甲酰胺(I314)(已知于CN102057925)、2-[3，5-二溴-2-({[3-溴-1-(3-氯吡啶-2-基)-1H-吡唑-5-基]羰基}氨基)苯甲酰基]-2-乙基-1-甲基肼甲酸甲酯(I315)(已知于WO2011/049233)和(I316)包含三种萜烯α-萜品烯、对异丙基甲苯和柠檬烯，以及任选地少量萜烯成分的农药萜烯混合物，包括包含三种萜烯(即，α-萜品烯、对异丙基甲苯和柠檬烯)且作为销售的仿天然农药。在本发明的一个优选实施方案中，所述杀虫剂为合成杀虫剂。如本文所使用的，术语“合成的”定义不是从生物防治剂获得的化合物。具体而言，合成的杀虫剂或杀真菌剂不是本发明生物防治剂的代谢物。

根据本发明优选的实施方案，所述杀虫剂选自：阿维菌素(I152)、高灭磷(I27)、啶虫脒(I141)、氟丙菊酯(I96)、α-氯氰菊酯(I111)、β-氟氯氰菊酯(I106)、联苯菊酯(I100)、噻嗪酮(I202)、噻虫胺(I142)、氯虫酰胺(I231)、虫螨腈(I184)、毒死蜱(I35)、克百威(I8)、溴氰虫酰胺(I232)、唑螨氰(I229)、丁氟螨酯(I230)、氟氯氰菊酯(I105)、氯氰菊酯(I110)、溴氰菊酯(I116)、丁醚脲(I178)、呋虫胺(I143)、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(I153)、乙虫腈(I94)、唑螨酯(I213)、氟虫腈(I95)、Flometoquin(I291)、氟虫酰胺(I233)、5-氯-2-[(3，4，4-三氟丁-3-烯-1-基)磺酰基]-1，3-噻唑(I244)、氟吡菌酰胺(I247)、Flupyradifurone(I262)、γ-氯氟氰菊酯(I109)、吡虫啉(I144)、茚虫威(I219)、λ-氯氟氰菊酯(I108)、氟丙氧脲(I197)、氰氟虫胺(I220)、甲硫威(I15)、甲氧虫酰肼(I206)、弥拜菌素(I155)、丙溴磷(I77)、Pyflubumide(I300)、Pyrifluquinazone(I253)、乙基多杀霉素(I150)、多杀菌素(I151)、螺螨酯(I221)、螺甲螨酯(I222)、螺虫乙酯(I223)、砜虫啶(I149)、吡螨胺(I216)、七氟菊酯(I134)、噻虫啉(I146)、噻虫嗪(I147)、硫双威(I21)、杀虫隆(I201)、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺(I309)(已知于WO2010/069502)、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺(I310)(已知于WO2010/069502)和1-{2-氟-4-甲基-5-[(2，2，2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1，2，4-三唑-5-胺(I277)、Afidopyropen(I278)。

在本发明的一个实施方案中，所述杀虫剂选自阿维菌素(I152)、坚强芽孢杆菌(I256)、克百威(I8)、噻虫胺(I142)、溴氰虫酰胺、环氧虫啶、氯氰菊酯(I110)、乙虫腈(I94)、氟虫腈(I95)、氟吡菌酰胺(I247)、吡虫啉(I144)、甲硫威(I15)、Rynaxypyr、多杀菌素(I151)、砜虫啶(I149)、七氟菊酯(I134)、噻虫嗪(I147)、硫双威(I21)。

在本发明的另一实施方案中，所述杀虫剂选自甲硫威(I15)、硫双威(I21)、氟虫腈(I95)、β-氟氯氰菊酯(I105)、七氟菊酯(I134)、噻虫胺(I142)、吡虫啉(I144)、噻虫啉(I146)、砜虫啶(I149)、乙基多杀霉素(I150)、多杀菌素(I151)、氯虫酰胺(I231)、溴氰虫酰胺(I232)、氟虫酰胺(I233)、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2，2，2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1，2，4-三唑-5-胺(I277)、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺(I310)。

在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括施用以下结合物之一，其中枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和/或其产生的代谢物称为“B1”：

B1+I1、B1+I2、B1+I3、B1+I4、B1+I5、B1+I6、B1+I7、B1+I8、B1+I9、B1+B10、B1+I11、B1+I12、B1+I13、B1+I14、B1+I15、B1+I16、B1+I17、B1+I18、B1+I19、B1+I20、B1+I21、B1+I22、B1+I23、B1+I24、B1+I25、B1+I26、B1+I27、B1+I28、B1+I29、B1+I30、B1+I31、B1+I32、B1+I33、B1+I34、B1+I35、B1+I36、B1+I37、B1+I38、B1+I39、B1+I40、B1+I41、B1+I42、B1+I43、B1+I44、B1+I45、B1+I46、B1+I47、B1+I48、B1+I49、B1+I50、B1+I51、B1+I52、B1+I53、B1+I54、B1+I55、B1+I56、B1+I57、B1+I58、B1+I59、B1+I60、B1+I61、B1+I62、B1+I63、B1+I64、B1+I65、B1+I66、B1+I67、B1+I68、B1+I69、B1+I70、B1+I71、B1+I72、B1+I73、B1+I74、B1+I75、B1+I76、B1+I77、B1+I78、B1+I79、B1+I80、B1+I81、B1+I82、B1+I83、B1+I84、B1+I85、B1+I86、B1+I87、B1+I88、B1+I89、B1+I90、B1+I91、B1+I92、B1+I93、B1+I94、B1+I95、B1+I96、B1+I97、B1+I98、B1+I99、B1+I100、B1+I101、B1+I102、B1+I103、B1+I104、B1+I105、B1+I106、B1+I107、B1+I108、B1+I109、B1+I110、B1+I111、B1+I112、B1+I113、B1+I114、B1+I115、B1+I116、B1+I117、B1+I118、B1+I119、B1+I120、B1+I121、B1+I122、B1+I123、B1+I124、B1+I125、B1+I126、B1+I127、B1+I128、B1+I129、B1+I130、B1+I131、B1+I132、B1+I133、B1+I134、B1+I135、B1+I136、B1+I137、B1+I138、B1+I139、B1+I140、B1+I141、B1+I142、B1+I143、B1+I144、B1+I145、B1+I146、B1+I147、B1+I148、B1+I149、B1+I150、B1+I151、B1+I152、B1+I153、B1+I154、B1+I155、B1+I156、B1+I157、B1+I158、B1+I159、B1+I160、B1+I161、B1+I162、B1+I163、B1+I164、B1+I165、B1+I166、B1+I167、B1+I168、B1+I169、B1+I170、B1+I171、B1+I172、B1+I173、B1+I174、B1+I175、B1+I176、B1+I177、B1+I178、B1+I179、B1+I180、B1+I181、B1+I182、B1+I183、B1+I184、B1+I185、B1+I186、B1+I187、B1+I188、B1+I189、B1+I190、B1+I191、B1+I192、B1+I193、B1+I194、B1+I195、B1+I196、B1+I197、B1+I198、B1+I199、B1+I200、B1+I201、B1+I202、B1+I203、B1+I204、B1+I205、B1+I206、B1+I207、B1+I208、B1+I209、B1+I210、B1+I211、B1+I212、B1+I213、B1+I214、B1+I215，B1+I216、B1+I217、B1+I218、B1+I219、B1+I220、B1+I221、B1+I222、B1+I223、B1+I224、B1+I225、B1+I226、B1+I227、B1+I228、B1+I229、B1+I230、B1+I231、B1+I232、B1+I233、B1+I234、B1+I235、B1+I236、B1+I237、B1+I238、B1+I239、B1+I240、B1+I241、B1+I242、B1+I243、B1+I244、B1+I245、B1+I246、B1+I247、B1+I248、B1+I249、B1+I250、B1+I251、B1+I252、B1+I253、B1+I254、B1+I255、B1+I256、B1+I257、B1+I258、B1+I259、B1+I260、B1+I261、B1+I262、B1+I263、B1+I264、B1+I265、B1+I266、B1+I267、B1+I268、B1+I269、B1+I270、B1+I271、B1+I272、B1+I273、B1+I274、B1+I275、B1+I276、B1+I277、B1+I278、B1+I279、B1+I280、B1+I281、B1+I282、B1+I283、B1+I284、B1+I285、B1+I286、B1+I287、B1+I288、B1+I289、B1+I290、B1+I291、B1+I292、B1+I293、B1+I294、B1+I295、B1+I296、B1+I297、B1+I298、B1+I299、B1+I300、B1+I301、B1+I302、B1+I303、B1+I304、B1+I305、B1+I306、B1+I307、B1+I308、B1+I309、B1+I310、B1+I311、B1+I312、B1+I313、B1+I314、B1+I315、B1+I316；

优选地，本发明的方法包括施用一种选自以下的结合物：

B1+I8、B1+I15、B1+I21、B1+I27、B1+I35、B1+I77、B1+I94、B1+I95、B1+I96、B1+I100、B1+I105、B1+I106、B1+I108、B1+I109、B1+I110、B1+I111、B1+I116、B1+I134、B1+I141、B1+I142、B1+I143、B1+I144、B1+I146、B1+I147、B1+I149、B1+I150、B1+I151、B1+I152、B1+I153、B1+I155、B1+I178、B1+I184、B1+I197、B1+I201、B1+I202、B1+I206、B1+I213、B1+I213、B1+I216、B1+I219、B1+I220、B1+I221、B1+I222、B1+I223、B1+I229、B1+I230、B1+I231、B1+I232、B1+I233、B1+I244、B1+I253、B1+I262、B1+I272、B1+I277、B1+I278、B1+I291、B1+I300、B1+I309、B1+I310。

在一个更优选的实施方案中，本发明的方法包括施用一种选自以下的结合物：

B1+I15、B1+I21、B1+I95、B1+I105、B1+I134、B1+I142、B1+I144、B1+I146、B1+I149、B1+I150、B1+I151、B1+I231、B1+I232、B1+I233、B1+I277、B1+I310。

在一个非常优选的实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括施用协同有效量的枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和/或其产生的代谢产物以及至少一种选自以下的杀虫剂：阿维菌素、乙酰甲胺磷、啶虫脒、氟丙菊酯、α-氯氰菊酯、β-氯氰菊酯、联苯菊酯、噻嗪酮、噻虫胺、氯虫酰胺、虫螨腈、毒死蜱、克百威、溴氰虫酰胺、唑螨氰、丁氟螨酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、丁醚脲、呋虫胺、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、乙虫腈、唑螨酯、氟虫腈、Flometoquin、氟虫酰胺、Fluensulfone、氟吡菌酰胺、Flupyradifurone、γ-氯氟氰菊酯、吡虫啉、茚虫威、λ-氯氟氰菊酯、氟丙氧脲、氰氟虫胺、甲硫威、甲氧虫酰肼、弥拜菌素、丙溴磷、Pyflubumide、Pyrifluquinazone、乙基多杀霉素、多杀菌素、螺螨酯、螺甲螨酯、螺虫乙酯、砜虫啶、吡螨胺、七氟菊酯、噻虫啉、噻虫嗪、硫双威、杀虫隆、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-1H-四唑-1-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺、1-{2-氟-4-甲基-5-[(2，2，2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1，2，4-三唑-5-胺和Afidopyropen。

根据本发明的一个实施方案，优选的杀虫剂选自：

啶虫脒、涕灭威、双甲脒、β-氟氯氰菊酯、甲萘威、噻虫胺、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯、硫丹、乙硫磷、乙虫腈、灭线磷、苯线磷、仲丁威、倍硫磷、氟虫腈、氟虫酰胺、氟吡菌酰胺、伐虫脒、庚烯磷、吡虫啉、甲胺磷、甲硫威、灭多威、氯硝柳胺、亚砜磷、伏杀硫磷、氟硅菊酯、螺螨酯、螺甲螨酯、螺虫乙酯、噻虫啉、硫双威、四溴菊酯、三唑磷、杀虫隆、蚜灭磷、1-{2-氟-4-甲基-5-[(R)-(2，2，2-三氟乙基)亚磺酰基]苯基}-3-(三氟甲基)-1H-1，2，4-三唑-5-胺和1-(3-氯吡啶-2-基)-N-[4-氰基-2-甲基-6-(甲基氨基甲酰基)苯基]-3-{[5-(三氟甲基)-2H-四唑-2-基]甲基}-1H-吡唑-5-甲酰胺和包含三种萜烯α-萜品烯、对异丙基甲苯和柠檬烯以及任选地少量萜烯成分的农药萜烯混合物，包括作为销售的包含三种萜烯(即，α-萜品烯、对异丙基甲苯和柠檬烯)的仿天然农药。

在本发明的一个优选实施方案中，所述杀虫剂为合成杀虫剂。如本文所使用的，术语“合成的”定义不是从生物防治剂获得的化合物。特别地，合成的杀虫剂或杀真菌剂不是本发明生物防治剂的代谢产物。

根据本发明的一个优选实施方案，所述杀虫剂选自：毒死蜱、噻虫胺、氯氰菊酯、乙虫腈、氟虫腈、氟吡菌酰胺、吡虫啉、甲硫威和硫双威。

将本发明的组合物和菌株施用于或处理植物繁殖材料、特别是种子的方法是本领域已知的，并且包括对繁殖材料进行包衣、涂覆、造粒和浸泡施用的方法。

在一些实施方案中，本发明的施用方法部分用于保护植物繁殖材料免受害虫的侵害，根据本发明，所述植物繁殖材料为在种植或播种到种植或播种位点后能发育成完整植物的任何植物材料，例如幼苗、根茎、苗圃植物、插条或特别是种子，例如果实、块茎、谷粒或鳞茎，所述施用方法的特征在于，例如，将合适的组合物以这样的方式施用，即空间上紧密接近所述繁殖材料种植或播种于种植或播种位点的方式，或者空间上与所述繁殖材料种植或播种于种植或播种位点一起的方式。根据本发明，以空间上紧密接近所述繁殖材料种植或播种于种植或播种位点的方式施用这些组合物优选发生在种植或播种繁殖材料之前，通过土壤施用直接将组合物施用于繁殖材料种植或播种位点而进行，例如优选发生在播种至播种沟或靠近种植或播种繁殖材料的位点周围限定的区域内之前。在空间上可与繁殖材料种植或施用于种植或播种的位点一起进行的这种组合物的施用应理解为表示可根据预期目的和当前环境将已采用这些组合物预处理的繁殖材料种植或播种在种植或播种的位点，对于所述繁殖材料的预处理例如通过将组合物喷洒、喷雾、撒粉或撒播在繁殖材料上或将组合物刷在或倾倒在繁殖材料上，或者在种子的情况下还特别地通过拌种而进行。当进行拌种(即，干种、湿拌种、液体拌种或浆液拌种)时，在将种子于拌种设备中进行播种之前，将枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和/或其代谢物加入至种子并例如通过将拌种设备中的内容物进行搅拌和/或通过旋转和/或振荡整个拌种设备而使组合物均匀地分布于种子上。这种拌种处理的特别的实施方案包括，例如将种子浸没在液体组合物中、采用固体组合物包被种子(种子包衣)或通过将组合物加入用于预浸泡种子的水中而实现使活性成分渗入种子(浸种)。

可以使用常规的处理技术和机器(例如流化床技术、滚压机法、旋转静态种子处理器和转筒式包衣机)将本发明的组合物和菌株施用于种子。也可以使用其它方法如喷动床。种子可以在包膜前预先选择大小。包膜后，通常将种子干燥并随后转移至径选机(sizingmachine)以选择大小。这种选择大小和处理的方法是本领域中已知的。

在一个实施方案中，可通过不引发萌芽的方法将本发明的组合物和菌株施用于植物繁殖材料或对繁殖材料进行处理；通常浸泡种子会引起萌芽，因为所得种子的含水量过高。因此，施用(或处理)植物繁殖材料如种子的合适方法的实例是拌种、种子包衣或种子造粒等。

在一个典型的实施方案中，所述植物繁殖材料为种子。尽管本方法被认为可以施用于任何生理状态的种子，然而优选种子处于能够足够耐受的状态，从而在处理过程中不引起损伤。通常，种子可以是收获自田间、从植物中分离的、与任何穗轴、茎、外壳和周围的果肉或其它非种子植物材料分离的种子。种子还可以优选是生物学上稳定的，使得处理不会对种子造成生物学损伤。认为可以在种子收获和种子播种之间或在播种过程期间的任何时间处理种子(针对种子的施用)。还可以根据本领域技术人员知晓的技术在处理之前或之后使种子做好准备。

在繁殖材料处理期间希望活性成分均匀地分布并粘附于种子。处理可以发生变化，从在植物繁殖材料如种子上含有本发明的组合物和菌株的制剂的薄膜(种衣)(此时，原始尺寸和/或形状是可辨认的)，到中间状态(如包衣)，然后直到具有多层不同材料(例如载体，如粘土；不同的制剂，如其他活性成分的制剂；聚合物；以及着色剂)的较厚的膜(例如造粒)(此时不再能够辨认出种子的原始形状和/或尺寸)。

在一些实施方案中，种子处理发生在未播种的种子上，术语“未播种的种子”意在包括介于种子收获与出于植物萌芽和生长目的而将种子播种在土地中之间的任何时期的种子。

对未播种种子的处理并不意图包括其中活性成分被施用于土壤中的那些实践，但是将包括在种植过程期间任何针对种子的施用实践。

在一些实施方案中，优选地，处理在种子播种之前发生，因此已采用本发明的组合物和菌株预处理过所述播种的种子。特别地，种子包膜或种子造粒在采用本发明的组合物和菌株的处理中是优选的。作为处理的结果，本发明的组合物和菌株附着于种子表面并因此可用于防治害虫和/或病害。

以与任何其它活性成分处理种子的方式相同的方式，可以贮藏、处理、播种和耕作所述经处理的种子。

在某些方面，本发明提供一种防治植物中的长喙壳属种的方法。所述长喙壳属种可为多脂长喙壳、天蓝色长喙壳(Ceratocystis coerulescens、Ceratocystisfagacearum、甘薯长喙壳、奇异长喙壳菌、毛长喙壳菌、Ceratocystis platani、Ceratocystis pluriannulata或其结合物。在一个实施方案中，所述长喙壳属种为奇异长喙壳菌。奇异长喙壳菌还称为Chalara paradoxa和奇异根串珠霉(Thielaviopsisparadoxa)[无性型]。在本发明的上下文中，术语“奇异长喙壳菌”和“奇异根串珠霉”可互换使用。

长喙壳属是一个重要的植物病原体属且其引起主要的树木病害。奇异长喙壳菌引起甘蔗的凤梨病，以及凤梨、香蕉、可可、椰子和油棕榈的病害。凤梨病在经济上是重要的且出现在几乎所有生长甘蔗的国家。其是一种芽段(sett)的病害并在种植后引起种块腐烂。腐烂的种块闻起来像成熟的凤梨，这是因为由真菌产生了乙酸乙酯。病原体通过芽段的切割端进入，并摧毁节间的薄壁组织。这减缓了出芽和苗发育，因此影响早期苗活力。受感染的芽段因为产生了真菌孢子而由红色变成褐黑色。这些孢子在种块腐烂时被释放到土壤中并作为下一批作物的接种物。病害有时出现在直立的作物中，因为病原体通过由先前的病害侵袭所产生的受伤的茎杆进入。病害主要是通过土壤传播，并且通过主要存在于土壤顶部25厘米的真菌孢子传播。深植、湿润或干燥的土壤条件、低温、短期或长期热水处理(用于防治其他病害)增加了易感性。

在一些实施方案中，根据种子的大小，将本发明的菌株和组合物以约1×10²至约1×10⁷cfu/种子的施用率施用。在一些实施方案中，施用率为约1×10³至约1×10⁶cfu/种子。

当用作土壤处理时，可将本发明的组合物以土壤表面浸透、插柄、注入和/或犁沟施用或通过与灌溉水混合的形式进行施用。可在种植时、播种过程中或播种后、在移植后和在植物生长的任何阶段施用的浸透土壤处理的施用率通常为约4×10¹¹至约1×10¹³cfu/英亩。在一些实施方案中，施用率为约4×10¹¹至约8×10¹²cfu/英亩。在一些实施方案中，施用率为约4×10¹¹至约1×10¹²cfu/英亩。在种植时施用的犁沟处理的施用率为约1×10¹⁰至约1×10¹²cfu/1000排英尺(row feet)。在一些实施方案中，施用率为约5×10¹⁰至约7.5×10¹¹cfu/1000排英尺。在其他实施方案中，施用率为约1×10¹⁰cfu/1000排英尺至约5×10¹¹cfu/1000排英尺。

在某些方面，在与土壤接触之前，将本发明的组合物作为经由多个喷嘴喷出的喷雾施用于切割的种段(即，播种用芽段或甘蔗繁殖材料)，以确保覆盖整个种段块(billetpiece)(特别是病原体进入的切割端)。这可在种植机的抛出种段时进行，因为此时正在供给切割的种段。在一个实施方案中，水体积足以充分润湿植物材料的全部表面(约500-800L/ha，这取决于每公顷种植的种段的量)。

以下实施例仅用于阐述本发明而不意图限制本发明。

实施例

实施例1.采用枯草芽孢杆菌QST713防治凤梨病

进行田间试验，以测定作为固定喷雾施用的 ASO(最少1×10⁹CFU/g的枯草芽孢杆菌QST713)是否与化学杀真菌剂(甲氧乙氯汞)相似，可防治甘蔗的凤梨病，并评估在种植时施用于甘蔗的 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)的任何植物毒性。

经处理的甘蔗地块为两排，约130米。未处理的甘蔗地块为单排，用于对比。将 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)在种植时在犁沟中以最大限度覆盖切割的芽段的方式施用。将机动的背包喷雾器固定在种植机上并设定在100kPa下排出7.9L/100m-排的在水中稀释的 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)浓缩物。浓缩物的施用率为135mL/100m-排。按照常规操作，在种植时采用PTO泵将标准(甲氧乙氯汞)施用于切割的甘蔗芽段。(甲氧乙氯汞)的施用率为125mL/100L水。

在种植后21天(DAP)、35天(DAP)和92天(DAP)评估甘蔗的出芽。在地块中以10米的长度计算出芽数，报告每个地块的五次或六次单独的评估。对于每个处理组，每10米的出芽平均数示于表1中。

表1.在21DAP、35DAP和92DAP评估每10米的甘蔗出芽。

存在与地块中的病害通过实验室分析确定为由奇异长喙壳菌引起的凤梨病。向甘蔗施用 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)没有对植物产生任何显著的植物毒性。如表1所示，采用 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)所实现的凤梨病的防治效果与采用标准化学杀真菌剂(甲氧乙氯汞)所观察到的防治效果类似。当进行评估时， ASO(枯草芽孢杆菌QST713)促进出芽和保护甘蔗免受凤梨病的功效在三个时间点中都是一致的。

实施例2.采用较低施用率的枯草芽孢杆菌QST713防治凤梨病

进行另一田间试验，以确定在低于实施例1中所用施用率的施用率下作为固定喷雾而施用的 ASO(最少1×10⁹CFU/g的枯草芽孢杆菌QST713)对甘蔗凤梨病的防治是否与化学杀真菌剂(甲氧乙氯汞)相似。

田间试验的设置类似于实施例1的描述，不同之处在于，用水稀释的 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)浓缩物以30mL/100m-排和65mL/100m-排的量施用。

在种植四周后，以20m或30m的区域对甘蔗出芽进行计数，并将三次独立重复的每米平均出芽数报告于表2中。

表2.在种植4周后评估每米的平均甘蔗出芽

在最低施用率为30mL/100m-排下采用 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)所实现的凤梨病的防治效果与采用标准化学杀真菌剂(甲氧乙氯汞)所观察到的防治效果类似。

实施例3.采用枯草芽孢杆菌QST713结合杀虫剂处理后的甘蔗出芽

进行类似于实施例1和2的另一田间试验，其在30mL/100m-排(3.33L/ha)、65mL/100m-排(7.22L/ha)、100mL/100m-排(11.1L/ha)或135mL/100m-排(15.00L/ha)下施用 ASO(最少1×10⁹CFU/g的枯草芽孢杆菌QST713)。以125mL/100L水的施用率施用(甲氧乙氯汞)。在种植时，将500 EC(毒死蜱)与 ASO或一起以4L/100L水的施用率施用。在进行该试验的田间存在相对高的凤梨病压力。

在施用后27天(DAA)、39天(DAA)、49天(DAA)和67天(DAA)，评估每米出芽的平均数，并将结果示于图1中。 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)以及化学标准在各测试的施用率下的性能始终一致。

实施例4.枯草芽孢杆菌QST713和短小芽孢杆菌QST2808对奇异长喙壳菌菌丝生长的抑制的评估

为了评估枯草芽孢杆菌QST713或短小芽孢杆菌QST2808对奇异长喙壳菌菌丝生长的抑制，设计了这样的研究，其测量了采用奇异长喙壳菌和各芽孢杆菌菌株的混合培养物在培养皿上抑制的区域。将直径为0.5cm的含有各芽孢杆菌菌落的圆盘置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)板的一端。在将这些板在25℃下孵育2天后，将含有奇异长喙壳菌病原体的圆盘置于相对的一端。对照PDA板仅含有奇异长喙壳病原体。实验设计完全随机地重复七次。在将病原体圆盘置于PDA板上4天后评估抑制区域。

枯草芽孢杆菌QST713和短小芽孢杆菌QST2808均显示出对奇异长喙壳菌菌丝生长的抑制效果，这通过在含有各芽孢杆菌菌株的圆盘周围形成抑制真菌生长的区域而得到证明(参见图2和表3)。仅含有奇异长喙壳菌病原体的对照PDA板被菌丝生长完全覆盖。

表3.在4天后，在芽孢杆菌菌株和奇异长喙壳菌病原体之间的抑制区域(cm)。

实施例5.通过 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)和(短小芽孢杆菌QST2808)中的化合物对病原体生长的抑制

将配制的 ASO(1.34％的含有最少1×10⁹CFU/g的枯草芽孢杆菌QST713)和(1.38％的含有最少1×10⁹CFU/g的短小芽孢杆菌QST2808)进行加热灭菌以消除活菌的作用并仅评估存在于各产品中的热稳定化合物的直接作用。将 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)或(短小芽孢杆菌QST2808)加入至PDA培养基中，最终浓度为0％、0.001％、0.01％、0.1％、1％或10％。然后将PDA培养基在120℃下高压灭菌20分钟。在灭菌后，将含有 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)或(短小芽孢杆菌QST2808)的PDA培养基倒入至培养皿中并在室温下固化。然后将含有奇异长喙壳菌的圆盘置于各板的中央并在25℃下孵育。在将圆盘置于板上4天后，测量病原体生长的直径。将实验设计完全随机重复7次。

在 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)或(短小芽孢杆菌QST2808)的各浓度下对病原体生长的平均抑制示于表4中。 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)在PDA培养基中的浓度为10％和1％时完全抑制病原体的菌丝生长。采用较低浓度的 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)观察到了剂量响应。(短小芽孢杆菌QST2808)仅在10％和1％的浓度下抑制菌丝生长。奇异长喙壳菌病原体对 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)中的热稳定化合物比对(短小芽孢杆菌QST2808)中的热稳定化合物更加敏感。

表4.奇异长喙壳菌在含有不同浓度的热灭菌的 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)或(短小芽孢杆菌QST2808)的PDA培养基中生长的平均直径

＊为了进行方差分析，将数据转化成√X+0.5。相同字母前的平均值通过图基(Tukey)检验在5％的概率下没有差异。

实施例6. ASO(枯草芽孢杆菌QST713)和(短小芽孢杆菌QST2808)在自然病原体压力下的产量效果

进行田间试验，其中奇异长喙壳菌和镰刀菌属(Fusarium)均天然存在于土壤中。单独使用 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)或(短小芽孢杆菌QST2808)或与(嘧菌酯+环唑醇)结合处理甘蔗，如表5所示。

使用机械种植机以1.5m犁沟的间隔种植甘蔗的RB92579品种。在苗圃中准备长40cm且各含有三至四个芽的幼苗并用于田间试验。将幼苗种植在犁沟中，18至20个芽/米沟槽。实验设计为随机区组设计，重复四次。使用背包喷雾器对幼苗和周围的土壤进行处理。

在收获时间，使用机械收割机收获各地块的所有品系，并将甘蔗段称重。将重量测量转换成每公顷可磨碎的甘蔗(茎杆)的吨数(TMH)。取出来自各地块的甘蔗段的样品，置于塑料袋中，并送入实验室来测量以千克/吨表示的总的可回收的糖(TRS)，其对应于原料中可利用的糖的量减去工业处理中的损失。然后通过以下公式将这两个参数用于计算每公顷糖的吨数(TSH)：TSH＝TMH×TRS/1000。来自各处理组的甘蔗的TMH和TSH值报告于表6中。

表5.配制的 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)、(短小芽孢杆菌QST2808)，和(嘧菌酯+环唑醇)用于在田间试验的施用率

＊SC：悬浮浓缩剂

表6.在单独使用 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)或(短小芽孢杆菌QST2808)或与(嘧菌酯+环唑醇)结合处理的甘蔗中，每公顷可磨碎的甘蔗(茎杆)的吨数(TMH)、每公顷糖的吨数(TSH)，以及与未处理的对照的TSH的百分比差异(Δ％-TSH)。

＊与未处理对照的统计学差异；ns：与未处理对照无统计学差异。通过Scott-Knott检验确定统计学差异。

在天然存在的病原体压力的条件下，如TMH和TSH所示，除了处理8之外的各处理均导致统计学上显著的产量增加。(短小芽孢杆菌QST2808)单独以2.0L/ha施用时特别有效并产生了类似于使用化学标准(即，嘧菌酯+环唑醇)所观察到的产量增加。

实施例7. ASO(枯草芽孢杆菌QST713)与(枯草芽孢杆菌rm303)相比的抗真菌活性

进行田间试验，其中奇异长喙壳菌(茎腐病或凤梨病)天然存在于土壤中。在与土壤接触前的种植时，采用在水中稀释的以下市售产品之一对各组糖甘蔗播种芽段进行充分喷雾： ASO(枯草芽孢杆菌QST713)、(枯草芽孢杆菌rm303)或250 EC(丙环唑)。将 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)以15、30、60或135毫升产品/100米的排(mL/100排-米)进行施用，(枯草芽孢杆菌rm303)以150mL/100排-米进行施用。将250 EC(丙环唑)以20毫升产品/100升混合物(mL/100L)进行施用，且包括采用合成杀真菌剂的对照处理。

在施用后第15天(DAA)、21天(DAA)、35天(DAA)、84天(DAA)和140天(DAA)测定每米的平均出芽(参见表7)。随着 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)的施用率的增加，出芽数也增加，在60mL/100排-米和135mL/100排-米的施用率下观察到最大的效果。在该田间试验和其他相关试验中，证明了 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)比(枯草芽孢杆菌rm303)更加一致地防治奇异长喙壳菌(茎腐病或凤梨病)。

表7.在种植时采用 ASO(枯草芽孢杆菌QST713)、(枯草芽孢杆菌rm303)或250 EC(丙环唑)处理的糖甘蔗中每米的出芽

＊具有相同字母的数字表示没有统计学上的显著差异

除非另有定义，本文中的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。所引用的所有出版物、专利和专利出版物通过引用整体纳入本文用于所有目的。虽然已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，其能够进行进一步的修改，并且本申请旨在覆盖本发明的任何变化、用途或改编，其大体上遵循本发明的原则并且包括偏离本发明的内容，只要该偏离的内容在本发明所属领域中已知的或常规的操作范围内，而且可应用于上文所述的基本特征，并落在所附的权利要求书的范围内。

Claims

1.一种用于防治植物中的长喙壳属种和/或减少采收作物损失的方法，所述方法包括将有效量的至少一种选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、其产生的代谢物及其结合物的生物防治剂施用于植物和/或植物生长位点。

2.权利要求1所述的方法，其中所述长喙壳属种为奇异长喙壳菌。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述枯草芽孢杆菌为保藏于NRRL登录号B-21661下的枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述短小芽孢杆菌为保藏于NRRL登录号B-30087下的短小芽孢杆菌QST2808或其突变体。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在所述施用之前确定所述植物和/或植物生长位点需要处理。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物包括选自幼苗、根茎、苗圃植物、插条和种子的繁殖材料。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物选自甘蔗、凤梨、香蕉、可可、椰子和油棕。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物为甘蔗。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将有效量的枯草芽孢杆菌QST713、短小芽孢杆菌QST2808和/或其突变体在种植前和/或在种植时施用于植物和/或植物生长位点。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将枯草芽孢杆菌QST713、短小芽孢杆菌QST2808和/或其突变体施用于土壤。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述枯草芽孢杆菌QST713、短小芽孢杆菌QST2808和/或其突变体对于土壤浸透处理的施用率为约4×10¹¹至约1×10¹³cfu/英亩，或对于犁沟处理的施用率为1×10¹⁰至约1×10¹²cfu/1000排英尺。

12.根据权利要求11的方法，其中所述施用率为约4×10¹¹至约8×10¹²cfu/英亩或约5×10¹⁰至约7.5×10¹¹cfu/1000排英尺。

13.根据权利要求10所述的方法，其中将枯草芽孢杆菌QST713、短小芽孢杆菌QST2808和/或其突变体施用于与植物根系接触的土壤或植物基部的土壤。

14.根据权利要求13所述的方法，其中枯草芽孢杆菌QST713、短小芽孢杆菌QST2808和/或其突变体在约1×10⁵至约1×10⁷cfu/克土壤的施用率下以单一施用的方式进行施用。

15.根据权利要求10所述的方法，其中对于土壤浸透处理，枯草芽孢杆菌QST713和其突变体在每次施用约5×10¹¹至约6×10¹³cfu/英亩的施用率下以多次施用的方式进行施用。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种生物防治剂为发酵产物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述发酵产物包含枯草芽孢杆菌QST713细胞和/或枯草芽孢杆菌QST713的突变体的细胞、代谢物和残余发酵液。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述发酵产物包含短小芽孢杆菌QST2808细胞和/或短小芽孢杆菌QST2808的突变体的细胞、代谢物和残余发酵液。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中施用至少一种生物防治剂导致植物的作物产量增加。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括将杀虫剂和/或杀真菌剂施用于植物和/或植物生长位点。

21.权利要求20的方法，其中将所述杀虫剂和/或杀真菌剂与枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和/或其代谢物依序或同时施用。

22.权利要求20或21所述的方法，其中所述杀虫剂选自毒死蜱、噻虫胺、氯氰菊酯、乙虫腈、氟虫腈、氟吡菌酰胺、吡虫啉、甲硫威和硫双威。

23.包含至少一种生物防治剂的组合物用于防治植物中的长喙壳属种的用途，其中所述至少一种生物防治剂选自枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、其产生的代谢物和其结合物。

24.根据权利要求23所述的用途，其中所述长喙壳属种为奇异长喙壳菌。

25.根据权利要求23或24所述的用途，其中所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌QST713或其突变体。

26.根据权利要求23至25中任一项所述的用途，其中所述短小芽孢杆菌为短小芽孢杆菌QST2808或其突变体。