CN107096003A - 一种治疗前列腺癌的中药组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种治疗前列腺癌的中药组合物，包括下述重量份数的中药原料：黄芪9～30份、人参6～15份、枸杞子6～15份、淫羊藿6～15份、姜黄3～10份、丹参9～20份、重楼9～20份、全蝎3～10份、灵芝6～15份。本发明一种治疗前列腺癌的中药组合物适用于中医辨证为本虚标实的前列腺癌患者，对去势抵抗性前列腺癌细胞PC3和DU145有抑制增殖和促进凋亡的作用。本发明还公开了一种包括该治疗前列腺癌的中药组合物的药物及该药物的制备方法。

Description

一种治疗前列腺癌的中药组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及中医药技术领域，具体涉及一种治疗前列腺癌的中药组合物；本发明还涉及包括该治疗前列腺癌的中药组合物的药物及该药物的制备方法。

背景技术

前列腺癌是最常见的老年男性恶性肿瘤之一，随着我国从1999年起进入老年社会，其发病率不断上升，有关研究显示我国的前列腺癌发病率已逐渐上升为泌尿系肿瘤的第一位。前列腺癌也被列为我国“十二五”攻关重大疾病。但是由于前列腺癌的临床早期症状少，导致大约50～80％前列腺癌患者确诊时已属晚期，发生骨转移。前列腺癌的诊断大体可分为早期和晚期两大类。早期前列腺癌主要指癌肿仍然局限于前列腺内，而晚期前列腺癌是指癌肿已经发生转移扩散者。根治性前列腺切除术(简称根治术)是治愈早期前列腺癌(T1-2N0M0)最有效的方法之一。根治性外放射治疗具有疗效好、适应症广、并发症少等优点，也适用于局限性前列腺癌患者。以雄激素剥夺治疗(ADT)为代表的内分泌治疗是目前公认针对已经发生转移的晚期前列腺癌患者的主要治疗方法，其优点在于可以延缓肿瘤进展，但有效期不长，后期几乎都发展为雄激素非依赖性前列腺癌(去势抵抗性前列腺癌)，而其中位转化时间约为14～30个月。同时内分泌治疗通常发生以下副作用(包括潮热、并发脊髓压迫、乳房疼痛、肥胖及发生心血管疾病、骨质疏松、性欲缺失、勃起功能障碍、免疫能力下降等)。所以，目前治疗的难点是一旦发展为去势抵抗性前列腺癌(包括雄激素非依赖性前列腺癌和激素难治性前列腺癌)时难以再有更为有效的治疗方法，包括化疗、放疗、靶向治疗等等，均难以有效减缓病情进展。而一旦发展为激素难治性前列腺癌，中位生存期仅有12～20个月。

传统中医学并无前列腺癌的明确诊断，根据该病的临床症状与表现，推论属于“癃闭”、“血尿”、“癥瘕”等病症的辨证论治范畴。近年来，有学者开展了一些采用中医药治疗前列腺癌的临床研究，上述报道提示中医药对前列腺癌患者有着一定的疗效，但是既往使用中药主要以经验总结为主，缺乏严格的科学论证依据，无法广泛应用于临床治疗，也很难推动有关中药组合物作用机理的研究。现阶段，亟待开发出既有良好疗效、又能方便患者服用的前列腺癌中药新药以提供临床使用。

发明内容

本发明以前列腺癌的中医药治疗为切入点，近年来开展了大量的研究工作。通过开展证候调查研究和临床经验总结，分析前列腺癌的中西医诊疗进展，提出前列腺癌分期论治的策略，总的病因病机特点为本虚标实、以虚为主，分期辩证的规律特点为：早期前列腺癌以邪实为主，主要以湿、痰、瘀、毒为多见；晚期本虚标实，虚实夹杂，以虚为主，虚证以气阴两虚或脾肾两虚为多见。因此，确立了应用扶正抑瘤法治疗前列腺癌的总体原则，通过10多年的临床实践，创建了治疗前列腺癌的中药组合物(本发明中药组合物的另一名称为：“仙灵方”)，并对其抑制前列腺癌细胞生长的作用机制进行了研究。

根据本发明的一个方面，提供了一种治疗前列腺癌的中药组合物，包括以下重量份数的原料药：

黄芪9～30份、人参6～15份、枸杞子6～15份、淫羊藿6～15份、姜黄3～10份、丹参9～20份、重楼9～20份、全蝎3～10份、灵芝6～15份。

本发明的中药组合物方中黄芪、人参和灵芝大补元气，淫羊藿和枸杞子补肾生精，共奏扶正培元之功，同为主药；丹参、重楼、全蝎功能解毒活血，姜黄祛寒散结，帮助消逐余邪，共为辅佐。以上诸药以规定的配比合用，共奏益气补肾、固本培元、活血攻毒、消肿散结之功效。

优选的，本发明的中药组合物包括下述用量的原料药(用量为重量份)：

黄芪12～18份、人参8～12份、枸杞子8～12份、淫羊藿8～12份、姜黄5～7份、丹参12～17份、重楼12～17份、全蝎4～7份、灵芝8～12份。

优选的，本发明的中药组合物的原料药的最佳用量为(用量为重量份)：

黄芪15份、人参9份、枸杞子12份、淫羊藿9份、姜黄6份、丹参15份、重楼15份、全蝎5份、灵芝12份。

本发明上述中药组合物适用于中医辨证为本虚标实的前列腺癌患者，特别适用于治疗晚期前列腺癌。

根据本发明的另一个方面，提供了一种治疗前列腺癌的药物，治疗前列腺癌的药物包括含有上述中药原料的水提物和药学上可接受的载体。

优选的，本发明上述治疗前列腺癌的药物，由上述中药原料的水提物和药学上可接受的载体组成。

优选的，每克治疗前列腺癌的药物含有从0.1～100g中药组合物中得到的水提物，即中药活性成分。

优选的，药学上可接受的载体包括粘合剂、填充剂、稀释剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、湿润剂、悬浮剂、乳化剂和防腐剂中的至少一种。

优选的，粘合剂可以为蜂蜜、糖浆、米糊和面糊中的至少一种。优选的，填充剂可以为淀粉、糊精、纤维素、甘露糖醇和乳糖中的至少一种。优选的，稀释剂可以为淀粉、糖粉、乳糖和硫酸钙二水化合物中的至少一种。优选的，润滑剂可以为硬脂酸镁、硬脂酸锌和硬脂酸钙中的至少一种。优选的，崩解剂可以为淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物中的至少一种。优选的，着色剂可以为主要是天然色素，例如做药丸时用的红曲红。优选的，调味剂可以为糖。优选的湿润剂可以为十二烷基硫酸钠。优选的，悬浮剂可以为山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝和氢化食用脂肪中的至少一种。优选的，乳化剂可以为卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯和阿拉伯胶中的至少一种。优选的，防腐剂可以为对羟基苯甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和山梨酸中的至少一种。

根据本发明的另一个方面，还提供了该治疗前列腺癌的药物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将上述中药原料与纯净水按重量份配比1:5～1:15进行混合，浸泡30～90min，回流提取2次，每次30～90min；

(2)合并步骤(1)所得的提取液，离心、过滤后，滤液再经旋转蒸干、浓缩得到浓缩液，将浓缩液与上述药学上可接受的载体混匀、加工成型，得到制剂。

优选的，步骤(1)的中药原料与纯净水的重量份配比为1:10。

优选的，步骤(2)的制剂为水剂、片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、注射剂、霜剂、喷雾剂、滴剂和贴剂中的任一种。

基于具体实施方式中的试验结果，仙灵方对前列腺癌细胞PC3和DU145有抑制增殖和促进凋亡的作用，本发明的中药组合物以及包括该中药组合物的药物可用于治疗前列腺癌。

附图说明

图1为仙灵方对前列腺癌细胞PC3(图1A)和DU145(图1B)的抑制生长作用(3次独立试验数据以平均数±标准差表示，*表示为与非治疗对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05))；

图2为仙灵方对前列腺癌细胞PC3和DU145的促凋亡作用(3次独立试验数据以平均数±标准差表示，*表示为与非治疗对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05))，其中图2A为仙灵方对前列腺癌细胞PC3和DU145早期凋亡因子Annexin V的表达的影响；图2B为仙灵方对前列腺癌细胞PC3和DU145的凋亡率的影响；

图3为仙灵方对前列腺癌细胞PC3和DU145关键蛋白激酶的影响；

图4为仙灵方对前列腺癌细胞PC3和DU145的核转录因子NF-κB/p65和肿瘤蛋白MUC1表达的影响(其中β-actin为内参)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。

下述列举了本发明实施例1～5的组分和比例，按下述配比称取原料药(克)：

实施例1：黄芪9、人参15、枸杞子6、淫羊藿6、姜黄10、丹参20、重楼9、全蝎3和灵芝15。

实施例2：黄芪12、人参8、枸杞子12、淫羊藿12、姜黄5、丹参12、重楼17、全蝎7和灵芝12。

实施例3：黄芪15、人参9、枸杞子12、淫羊藿9、姜黄6、丹参15、重楼15、全蝎5和灵芝12。

实施例4：黄芪18、人参12、枸杞子8、淫羊藿8、姜黄7、丹参17、重楼12、全蝎4和灵芝8。

实施例5：黄芪30、人参6、枸杞子15、淫羊藿15、姜黄3、丹参9、重楼20、全蝎10和灵芝6。

按上述实施例1～5称取各中药原料组分配制成中药组合物并粉碎成细颗粒状，用相当于中药组合物5～15倍重量的纯净水浸泡该中药组合物30～90min，加热回流提取该中药组合物活性成分30～90min。第一次提取完成后，再向该中药组合物药渣中加入5～15倍体积的纯净水，浸泡该中药组合物药渣30min，继续加热回流提取该中药组合物活性成分30～90min。完成提取过程后，提取液离心过滤，经旋转蒸干定容至100g/mL(即中药组合物初始重量与最后的溶液的体积的比值)获得中药组合物水提物浓缩液，-80°保存备用。

进一步，向上述制备得到的本发明中药组合物水提物浓缩液中加入药学上可接受的载体(药物可接受的载体包括：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等)，制成各种制剂(制剂包括水剂、片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、注射剂、霜剂、喷雾剂、滴剂和贴剂中的任一种)。

(1)固体口服制剂的制备过程：

固体口服制剂的制备过程中常加入各种赋形剂，包括：上述发明内容中的粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂。将上述制备得到的本发明中药组合物水提物浓缩液与上述常用的赋形剂混合得混合物，浓缩液占混合物总重量的0.1％～100％，填充、压片等常用的方法制得固体口服制剂(即每克固体口服制剂对应的中药原料总重量为0.1～100g)。反复的混合过程可使活性物质均匀分布于整个使用了大量填充剂的组合物中。

(2)液体口服制剂的制备过程：

将上述制备得到的本发明中药组合物水提物浓缩液与液体口服制剂常用的添加剂(即上述发明内容中的悬浮剂、乳化剂和防腐剂，还可以是非水性载体，如食用油，例如杏仁油、分馏椰子油、油性酯、丙二醇和乙醇)混合，制得液体口服制剂，浓缩液占液体口服制剂总重量的0.1％～100％，制得液体口服制剂(即每克液体口服制剂对应的中药原料总重量为0.1～100g)。根据需要，还可以添加常规的香味剂或着色剂。

本发明的制剂在使用时根据病人的病情确定用法用量。例如，对于0.1g中药组合物/每片的片剂，早期前列腺癌患者适宜：早晚各口服该片剂1次，每次口服2～3片；晚期前列腺癌患者适宜：早中晚各口服该片剂1次，每次口服8～10片。

本发明中药组合物煎液(以下简称仙灵方)对前列腺癌细胞生长的影响及其作用机制通过以下试验进行验证。

1材料和方法

1.1药物：本发明中药组合物：黄芪15g，人参9g，枸杞子12g，淫羊藿9g，姜黄6g，丹参15g，重楼15g，全蝎5g，灵芝12g(实施例3)。上药共98g，用1L纯净水浸泡30分钟后回流提取2次，每次1h。提取液离心过滤后旋转蒸干定容至1g/mL(原料药的重量/总提取液体积)，制得浓缩提取液，-80°保存备用。后续试验中提及的处理方法均为将制备的浓缩提取液(中药复方)直接加入到细胞培养液中，其浓度(或者剂量)均表示为将上述浓缩提取液对应的原料药的重量/细胞培养液体积。

1.2细胞及试剂：去势抵抗性前列腺癌细胞株PC3和DU145由中山大学孙逸仙纪念医院提供，用含10％肽牛血清的F-12K或DMEM(1:1)培养基进行培养。MTT(细胞增殖及细胞毒性)检测试剂盒、V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国Sigma-Aldrich公司。MUC1多克隆抗体购自美国Abcam公司，NF-κB/p65、ERK(细胞外调节蛋白激酶)和JNK(c-Jun氨基末端激酶)及其磷酸化抗体购自美国Cell Signaling公司。

1.3细胞活力实验：取对数生长期的PC3和DU145细胞，制成细胞悬液接种于96孔板，细胞密度为5×10³个/孔，待细胞贴壁加入不同浓度中药复方(0、5、10、15、20、25、40、50mg/mL)，每个浓度设4个平行复孔，继续培养24、48、72h，向每孔加入10μl MTT溶液继续培养4h，测定570nm处吸光度(A)值。细胞活力(Cell viability，％)＝(加药组A值/空白组A值)×100％。

1.4细胞凋亡实验：细胞以3×10⁵个/孔的密度接种于6孔板，每孔2ml，待细胞贴壁完成，分别加入0、5、15、25mg/mL等不同剂量中药复方，培养48h。每个浓度设3个复孔，重复实验3次。将细胞收集，PBS洗涤2次，每组分别加入400μl的Annexin V结合液、5μl AnnexinV-FITC染色液、5μl PI染色液混匀。避光，室温反应10min。应用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.5Western blot分析：细胞以3×10⁵个/孔的密度接种于96孔板，贴壁后加入25mg/mL的中药复方，分别取培养至0h、0.5h、2h、4h、8h、24h时间点的两种癌细胞，每孔加入40μl裂解液，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，等量蛋白上样，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后半干转1h，5％脱脂牛奶封闭1h，加入一抗孵育过夜。TBST洗膜3次，加入二抗孵育1h，TBST洗膜3次，ECL化学发光法显影。

1.6统计学方法：所有实验数据均采用均数±标准差表示，采用SPSS18.0统计软件分析，多组均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1仙灵方对PC3和DU145细胞生长的影响

参考临床上中药复方用于抗肿瘤研究的试验过程，我们在体外研究仙灵方对前列腺癌细胞生长的影响。我们用制备好的仙灵方中药汤剂处理细胞并培养到72小时。见图1，PC3和DU145细胞加入不同浓度的仙灵方分别培养24h、48h、72h，收集并处理细胞，用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测前列腺癌细胞活力。通过使用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)，我们发现前列腺癌细胞PC3和DU145活力明显下降，呈时间和剂量依赖性，提示仙灵方对PC3和DU145细胞的生长具有抑制作用。

2.2仙灵方对PC3和DU145细胞凋亡的影响

我们也在体外探讨仙灵方对前列腺癌细胞凋亡的影响。我们用制备好的仙灵方中药浓缩液处理细胞并培养到48小时。见图2，前列腺癌细胞使用不同剂量仙灵方处理48h后，使用流式细胞计数仪测定细胞表面Annexin V的表达水平。结果发现仙灵方能够促进前列腺癌细胞早期凋亡因子Annexin V的表达增加，具有剂量依赖性，提示了仙灵方对前列腺癌细胞PC3和DU145具有促进凋亡的作用。

2.3仙灵方对PC3和DU145细胞关键蛋白激酶的影响

为了解仙灵方对前列腺癌关键蛋白激酶的影响以及对可能靶分子的介导作用，我们首先测定ERK、JNK激酶活性和磷酸化。前列腺癌细胞PC3和DU145经仙灵方处理培养，分别取培养至0h、0.5h、2h、4h、8h、24h时间点的两种癌细胞，提取蛋白用Western blot测定ERK、JNK激酶活性和磷酸化。见图3，前列腺癌细胞PC3和DU145经仙灵方(25mg/ml)处理培养到24h，提取蛋白用Western blot测定ERK、JNK激酶活性和磷酸化，GAPDH(甘油醛-3磷酸脱氢酶)用于内对照。我们初步发现，中药复方能够增加ERK激酶活性和磷酸化，同时对JNK的磷酸化也有同样作用，但对JNK激酶蛋白含量影响较小，提示ERK、JNK激酶信号可能参与介导仙灵方对前列腺癌细胞生长的抑制作用。

2.4仙灵方对PC3和DU145细胞核转录因子、肿瘤蛋白的影响

现有研究发现天然药物姜黄素、澳洲茄边碱能通过抑制核转录因子NF-κB/p65和肿瘤蛋白MUC1的表达来抑制前列腺癌细胞的生长，提示NF-κB/p65、MUC1在中药和天然药物杀伤前列腺癌中具有介导作用。见图4，前列腺癌细胞PC3和DU145经仙灵方(25mg/ml)处理，分别取培养至0h、0.5h、2h、4h、8h、24h时间点的两种癌细胞，提取蛋白用Western blot测定NF-κB/p65、MUC1蛋白的表达量，GAPDH用于内对照。结果发现，仙灵方能够抑制定NF-κB/p65、MUC1蛋白的表达，提示NF-κB/p65、MUC1可能是仙灵方作用的潜在靶分子。

综合上述试验结果所述，仙灵方对去势抵抗性前列腺癌细胞PC3和DU145有抑制增殖和促进凋亡的作用，其机制可能是通过ERK、JNK激酶介导的抑制NF-κB/p65、MUC1蛋白的表达来发挥作用。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种治疗前列腺癌的中药组合物，其特征在于，包括下述重量份数的中药原料：

黄芪9～30份、人参6～15份、枸杞子6～15份、淫羊藿6～15份、姜黄3～10份、丹参9～20份、重楼9～20份、全蝎3～10份、灵芝6～15份。

2.根据权利要求1所述的治疗前列腺癌的中药组合物，其特征在于，包括下述重量份数的中药原料：

黄芪12～18份、人参8～12份、枸杞子8～12份、淫羊藿8～12份、姜黄5～7份、丹参12～17份、重楼12～17份、全蝎4～7份、灵芝8～12份。

3.根据权利要求2所述的治疗前列腺癌的中药组合物，其特征在于，包括以下重量份数的中药原料：

黄芪15份、人参9份、枸杞子12份、淫羊藿9份、姜黄6份、丹参15份、重楼15份、全蝎5份、灵芝12份。

4.根据权利要求1～3任一项所述的治疗前列腺癌的中药组合物，其特征在于，所述前列腺癌为晚期前列腺癌。

5.一种治疗前列腺癌的药物，其特征在于，包含有权利要求1～3任一项所述的中药组合物的水提物和药学上可接受的载体。

6.根据权利要求5所述的治疗前列腺癌的药物，其特征在于，每克治疗前列腺癌的药物含有从0.1～100g所述中药组合物中得到的水提物。

7.根据权利要求5所述的治疗前列腺癌的药物，其特征在于，所述药学上可接受的载体包括粘合剂、填充剂、稀释剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、湿润剂、悬浮剂、乳化剂和防腐剂中的至少一种。

8.权利要求5至7任一项所述治疗前列腺癌的药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将中药组合物与纯净水按重量份配比1:5～1:15进行混合，浸泡30～90min，回流提取2次，每次30～90min；

(2)合并步骤(1)所得的提取液，离心、过滤后，滤液再经旋转蒸干、浓缩得到浓缩液，将浓缩液与药学上可接受的载体混匀、加工成型，得到制剂。

9.根据权利要求8所述的治疗前列腺癌的药物的制备方法，其特征在于，所述制剂包括水剂、片剂、胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、注射剂、霜剂、喷雾剂、滴剂和贴剂中的任一种。