CN107079815B - 一种诱导迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种愈伤组织的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明一种诱导迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种愈伤组织的方法，包括：1)以迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种的花苞、茎段、芽、根分别作为外植体，先在自来水下冲洗4h，将杜鹃花苞的外层萼片剥掉，取幼小的花苞作为外植体，之后转入蒸馏水中浸泡5h,将茎段、根剪成1‑2厘米长的小段，2)将已经预处理好的外植体采用0.1%的升汞浸泡8min，期间不断搅拌，用无菌蒸馏水冲洗4‑5次；3)将已经过灭菌处理的外植体接种于1/2WPM+1.0mg/LZT+2.0mg/LNAA+100mg/L的水解酪蛋白+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉与1/2WPM+0.5mg/L ZT+0.5 mg/L 6‑BA+2.0 mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的培养基上，培养于14h/d光照，22℃的培养室中。本发明为无性繁殖奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于组培育苗技术领域，具体说涉及一种诱导迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种愈伤组织的方法。
背景技术
马缨杜鹃（Rhododendron delavayiFranch）杜鹃花科杜鹃花属常绿灌木或小乔木，高1-7（-12）米，其全株均可入药，用于治疗消化道出血，衄血，咯血，月经不调；其花（马缨花）：苦，凉。有小毒。清热解毒，止血，调经。用于月经不调，衄血，咯血，消化道出血，骨髓炎，其叶、根可治疗流感。疟疾。除此之外，该物种因花朵美丽，颜色鲜艳，人工栽培，具有较高的园艺价值。
迷人杜鹃（Rhododendron agastumBalf. f. et W. W. Smith）杜鹃花科杜鹃花属常绿灌木，高2-3米，杜鹃枝繁叶茂，绮丽多姿，萌发力强，耐修剪，根桩奇特，是优良的盆景材料。园林中最宜在林缘、溪边、池畔及岩石旁成丛成片栽植，也可于疏林下散植，是花篱的良好材料，可经修剪培育成各种形态。在花季中绽放时即使杜鹃总是给人热闹而喧腾的感觉，而不是花季时，深绿色的叶片也很适合栽种在庭园中做为矮墙或屏障。现已有研究证明其是马缨杜鹃与露珠杜鹃的杂交后代。
迷人杜鹃与马缨杜鹃杂交的后代在花色上产生了更多的花色，对园林园艺具有重要的意义，但由于其自然杂交的后代往往性状不稳定，成为了园艺学的一大难题。
目前的文献研究中对于杜鹃花组织培养技术的研究较多，但是对于杂交后代的组培技术的研究尚未见报道，并且对于最佳外植体、灭菌方式、基本培养基目前尚没有定论以及在活性炭的使用上存在很大的争议。
对愈伤组织的诱导，愈伤组织原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽，进而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。从植物器官、组织、细胞离体培养所产生的愈伤组织，在一定条件下可进一步诱导器官再生或胚状体而形成植株。在单倍体育种中，也可由花粉产生的愈伤组织或胚状体分化成单倍体植株。甚至可由原生质体培养诱导植株或器官再生。故愈伤组织的概念已不局限于植物体创伤部分的新生组织了。
愈伤组织的功能用途：
在离体培养中，接受各种因素的作用，细胞都会分裂进入脱分化，经持续分裂增生成细胞团，进一步发展成为不受亲本植株影响的愈伤组织。愈伤组织培养作为一种最常培养形式，除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以外，其他几种培养形式最终都要愈伤组织才能产生再生植株，而且，愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的。因此，愈伤组织培养具有多种用途。一方面可研究植物生长发育及分化的机制、遗传变异规律，对植物遗传育种具有特殊意义；另一方面可用于大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体培养中的原生质体来源等。实践证明，愈伤组织培养不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是植物改良，种质保存和有用化合物生产的理想途径。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导迷人杜鹃和马缨杜鹃的杂交种愈伤组织的方法，为解决其杂交后代性状不稳定以及杂交后代不育的问题奠定基础。
本发明的目的及解决其主要技术问题是采用以下技术方案来实现的：一种诱导迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种愈伤组织的方法，包括以下操作步骤：
1)、外植体的选择及预处理：以迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种的花苞、茎段、芽、根分别作为外植体，先在自来水下冲洗4h，将杜鹃花苞的外层萼片剥掉，取幼小的花苞作为外植体，之后转入蒸馏水中浸泡5h,将茎段、根剪成1-2厘米长的小段，备用；
2)、灭菌：将已经预处理好的外植体采用0.1%的升汞浸泡8min，期间不断搅拌的方式对外植体进行灭菌处理，之后用无菌蒸馏水冲洗4-5次，倒尽无菌蒸馏水，备用；
3)、接种：将已经过灭菌处理的外植体接种于1/2WPM+1.0mg/LZT+2.0mg/LNAA+100mg/L的水解酪蛋白+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉与1/2WPM+0.5mg/L ZT+0.5 mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的培养基上，培养于14h/d光照，22℃的培养室中。
上述的步骤1）采用迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种的花苞为最佳外植体。
上述的步骤3）用经过高温高压灭菌的镊子夹取已经过灭菌处理的外植体。
上述的步骤3）培养基PH为5.0。
杂交现象在自然界中普遍存在，植物学家认为杂交能够增强现存的物种适应变化的能力，甚至是新物种形成的来源。其在园艺学方面的意义远大于给分类学带来的困难，从园艺学的角度出发，杂交可以选育新品种，特别是突变现象的发生便于从自然界去选育园艺新品种，并将大大缩短育种周期。由于杂交后代具有性状不稳定性，因此本发明通过诱导迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种愈伤组织的方法为无性繁殖奠定了基础，故具有一定的现实意义。
具体实施方式
以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种诱导迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种愈伤组织的方法具体实施方式、特征及其功效，详细说明如后。
一种诱导迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种愈伤组织的方法，包括以下操作步骤：
1)、外植体的选择及预处理：以迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种的花苞、茎段、芽、根分别作为外植体，先在自来水下冲洗4h，将杜鹃花苞的外层萼片剥掉，取幼小的花苞作为外植体，之后转入蒸馏水中浸泡5h,将茎段、根剪成1-2厘米长的小段，备用；
2)、灭菌：将已经预处理好的外植体采用0.1%的升汞浸泡8min，期间不断搅拌的方式对外植体进行灭菌处理，之后用无菌蒸馏水冲洗4-5次，倒尽无菌蒸馏水，备用；
3)、接种：将已经过灭菌处理的外植体接种于1/2WPM+1.0mg/LZT+2.0mg/LNAA+100mg/L的水解酪蛋白+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉与1/2WPM+0.5mg/L ZT+0.5 mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的培养基上，培养于14h/d光照，22℃的培养室中。
上述的步骤1）采用迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种的花苞为最佳外植体。
上述的步骤3）用经过高温高压灭菌的镊子夹取已经过灭菌处理的外植体。
上述的步骤3）培养基PH为5.0。
上述方法和参数是通过以下实验优选最佳方案得出的：
1.1.实验材料
从贵州百里杜鹃采集迷人杜鹃与马缨杜鹃杂交种的杜鹃幼苗、花苞、芽、茎段、根等外植体。
1.2.材料的预处理
以迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种的幼苗、花苞、茎段、芽、根分别作为外植体，先在自来水下冲洗4h，将杜鹃花苞的外层萼片剥掉，取幼小的花苞作为外植体，之后转入蒸馏水中浸泡5h,将茎段、根剪成1-2厘米长的小段，备用。
1.3.外植体的消毒
在本次发明中选择0.1%升汞、10%NaClO以及70%酒精三种灭菌剂，分别设定不同的灭菌时间，以便筛选迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种外植体最适宜的灭菌方式，具体实验方案见表1。
迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种外植体分别采用以上12种方式进行灭菌处理，其他因素皆相同。
1.4.迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种培养基的选择
分别以MS、WPM、1/2MS、1/2WPM培养基作为基本培养基，选择ZT、6-BA、α-NAA以及水解酪蛋白四种植物生长调节剂，分别设定6个不同浓度水平进行试验以筛选迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种外植体最适宜诱导无菌苗的培养基，详细实验方案见表2。
迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种外植体分别接种到以上24种培养基上，其他因素皆相同。
1.5接种
接种时，要穿好工作衣，戴好工作帽和口罩，不准说话或对着植物材料或培养容器口呼吸。打开包塞纸和瓶塞、瓶盖时注意不要污染瓶口。在近酒精灯火焰处打开培养瓶瓶口，并使培养瓶倾斜，以免微生物落入瓶内。瓶口可以在拔塞、开盖前灼烧灭菌，接种工作宜在近火焰处进行。手不能接触接种器械的前半部分（即直接切割、触碰植物材料的部分），接种操作时（包括拧开或拧上培养瓶盖时），培养瓶、试管或三角瓶宜水平放置或倾斜一定角度（45度以下），避免直立放置而增大污染机会。手和手臂应避免在培养基、植物材料、接种器械上方经过。已消毒的植物材料接种时不慎掉在超净工作台上，不宜再用。接种期间如遇停电等事件使超净工作台停止运转，重新启动时应对接种器械及暴露的植物材料重新消毒。 将接种好的材料放入培养室中，其中14h/10h光照，22℃培养，每隔三天拍照记录
1.6.实验结果与分析
接种5Day后统计12种灭菌方式的染菌率，具体实验结果见表3。
用0.1%升汞消毒8min，污染率最低，虽然0.1%升汞与酒精混合灭菌效果也很好，但酒精对外植体造成了进一步的损伤，综合考虑，故我们采用0.1%升汞消毒8min的方式对杜鹃外植体进行灭菌。
接种30Day后，统计不同外植体的出现愈伤组织情况，具体实验结果见表4。
以上实验结果证明，迷人杜鹃与马缨杜鹃杂交种最适宜的外植体为花苞。
接种30Day后，统计各种培养基中巴蜀报春的出苗情况，具体实验结果见表5。
通过以上实验结果证明诱导迷人杜鹃与马缨杜鹃杂交种愈伤组织长势最好的培养基为1/2WPM+1.0mg/LZT+2.0mg/LNAA+100mg/L的水解酪蛋白+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，PH为5.0，长势较好的培养基为1/2WPM+0.5mg/L ZT+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉，PH调至5.0。以MS、1/2MS、WPM做为基本培养基不适合迷人杜鹃与马缨杜鹃杂交种生长。
本发明建立了迷人杜鹃与马缨杜鹃杂交种愈伤组织诱导的技术体系，为迷人杜鹃与马缨杜鹃杂交种的无性繁殖奠定了基础，为解决杂交品种后代性状不稳定以及繁殖问题提供了一种行之有效的方法，在园艺学上具有重要的现实意义。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变换材质、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (3)
1.一种诱导迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种愈伤组织的方法，其特征在于：包括以下操作步骤：
1)、外植体的选择及预处理：以迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种的花苞作为外植体，先在自来水下冲洗4h，将杜鹃花苞的外层萼片剥掉，取幼小的花苞作为外植体，之后转入蒸馏水中浸泡5h，备用；
2)、灭菌：将已经预处理好的外植体采用0.1％的升汞浸泡8min，期间不断搅拌的方式对外植体进行灭菌处理，之后用无菌蒸馏水冲洗4-5次，倒尽无菌蒸馏水，备用；
3)、接种：将已经过灭菌处理的外植体接种于1/2WPM+1.0mg/LZT+2.0mg/LNAA+100mg/L的水解酪蛋白+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉或1/2WPM+0.5mg/L ZT+0.5mg/L6-BA+2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+8g/L琼脂粉的培养基上，培养于14h/d光照，22℃的培养室中。
2.如权利要求1所述的一种诱导迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种愈伤组织的方法，其特征在于：所述的步骤3)用经过高温高压灭菌的镊子夹取已经过灭菌处理的外植体。
3.如权利要求1所述的一种诱导迷人杜鹃和马缨杜鹃杂交种愈伤组织的方法，其特征在于：所述的步骤3)培养基pH为5.0。
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