CN107012191B - 一种分子量范围可控的多肽的制备方法及装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分子量范围可控的多肽的制备方法及装置,所述方法包括如下步骤:(1)酶固定化:将蛋白酶共价偶联在多孔微球上;(2)装膜:将负载固定化酶的多孔微球装入管式陶瓷膜内,所述管式陶瓷膜的截留分子量范围为1‑800kDa;(3)同步酶解‑超滤:配制蛋白液,调节pH,调节蛋白液的温度并导入步骤(2)的管式陶瓷膜内,收集管式陶瓷膜透过液;(4)浓缩和干燥:将步骤(3)收集的管式陶瓷膜透过液浓缩并干燥。本发明制备方法可以制备质量均一的多肽,且多肽的分子量可以进行精准的控制,且本发明方法工艺简单,步骤少,容易操作,制备的多肽的分子量可大于蛋白酶的分子量,不含有蛋白酶等杂质,便于后续的运用,能进行工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种多肽的制备方法,具体地,涉及一种分子量范围可控的多肽的制备方法及装置。
背景技术
多肽是氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物,可从动物或植物体内直接提取,也可以蛋白质为原料通过化学法或生物法降解获得。多肽在人体内具有易消化、吸收率快和利用率高等特点,其吸收机制主要基于肽运转载体实现跨膜转运的方式实现,是传统代谢模式认为蛋白质必须水解成游离氨基酸才能被吸收机制的重要补充。多肽吸收过程主要分为三种类型,包括依赖H+浓度或Ca2+浓度的主动转运过程、pH依赖性的非耗能性Na+/H+交换转运系统和谷胱甘肽转运系统。多肽吸收特点主要包括:易消化吸收,该过程与多肽序列长度、氨基酸组成密切相关,部分多肽的吸收不受到人体内的酶催化的二次水解过程影响,以完整肽的形式直接进入人体循环系统并发挥其功能;吸收过程快,进入循环系统的时间短,可快速发挥作用;吸收效率高,部分肽可100%吸收且没有任何废物及排泄物;主动吸收,迫使活性肽吸收入体内;吸收过程能耗极低,不会增加胃肠功能负担;具有一定的载体作用,将部分营养物质运载输送到人体的细胞或组织。此外,多肽作为食品其安全性高,针对营养不良或消化吸收有问题的病人,配方食品中的多肽或蛋白质水解物已经逐渐成为补充氮源的重要原料,提供人体生长发育所需的营养物质。多肽作为一种新兴的功能性蛋白配料近年来在国内外发展迅速,在功能性食品、饮料、化妆品以及药品等领域应用十分广泛。
蛋白质的多样性和复杂性使其降解形成的多肽功能肽及其活性种类十分丰富,目前已被证明的生物活性包括保护胃黏膜及抗溃疡作用、抗过敏、降血压、降胆固醇、抗衰老、抑制肿瘤细胞生长、促进伤口愈合、增强骨强度和预防骨质疏松、预防关节炎、促进角膜上皮损伤的修复和促进角膜上皮细胞的生长等。多肽的活性种类与其来源和分子量范围密切相关,研究表明扇贝酶解产物中存在抗氧化多肽,其中相对分子质量为0.8-1kDa范围内的多肽具有较强的抗氧化损伤作用并能清除超氧负离子和羟自由基,可显著增强免疫细胞的代谢和增殖。鳕鱼酶解产物中存在具有降低血压活性的多肽,随其相对分子质量降低其活性助剂升高,其中在相对分子质量为3K的多肽具有最强的ACE抑制活性;以阿拉斯加狭鳕鱼皮胶原蛋白为原料,酶解产物中存在相对分子质量为0.9-1.9kDa范围内具有较高ACE抑制活性。海洋生物酶解产物中还存在抗菌肽,海洋生物亚洲鲎中发现的抗菌肽分子量为2.3Da,贻贝酶解产物中存在分子量为4.4kDa的防御素,美洲拟鲽的皮肤黏液降解物中存在分子量2.7kDa的线性抗菌肽;牡蛎酶解液经柱层析分离后分子量低于5kDa的多肽混合物中存在降血糖活性多肽;此外,许多蛋白降解物中还存在抗肿瘤和免疫调节等生物活性多肽。可见,多肽的分子量范围对其生物活性影响非常显著,分子量范围控制对于提高多肽的生物活性具有重要意义。
传统的控制多肽分子量的方法是首先将蛋白质进行酶解,在采用膜分离技术对不同分子量的多肽进行分离;一方面酶解过程可将蛋白质降解成为不同分子量的多肽,另一方面膜分离过程可根据选择不同类型的膜制备出低于截留分子量的多肽。201610298693.6公开了一种混合酶解-膜过滤制备中华鳖降压肽的方法,该方法包括原料预处理、混合酶水解、灭酶、离心过滤、膜过滤、冻干等关键步骤;201510676592.3公开了基于二步酶解和酶膜反应制备低致敏性乳清蛋白粉的方法,该方法以乳清为底物,利用二步蛋白酶解技术水解乳清蛋白中的致敏位点,利用膜的选择性透过作用,分离获得分子量低于1kDa的无致敏位点的蛋白水解物;201310004236.8公开了一种连续酶解与二级膜过滤提纯制备大米蛋白活性多肽的方法,该方法以碱性蛋白酶和大米蛋白为主要原料进行酶解反应,通过超滤膜、纳滤膜和喷雾干燥等步骤制备大米蛋白活性多肽。类似的专利还有很多,201010188410.5公开了一种不补料酶解-膜分离耦合制备鱼鳞胶原蛋白抗氧化肽的方法,200310107554.3公开了一种酶解与膜滤集成连续制取酪蛋白生物活性多肽的工艺,200810061920.9公开了一种利用酶解与膜滤耦合技术连续制备窄分子量分布燕窝提取物的方法,201010523747.7公开了一种酶解和膜分离制备免疫活性大豆肽的方法,201310137894.4公开了一种利用酶膜反应器连续制备蚕蛹蛋白抗氧化肽的方法,201110112515.7公开了一种利用酶膜反应器制备燕麦抗氧化肽的方法等。
采用固定化酶耦合膜分离的方法也有文献报道,但主要采用柱式固定化酶反应器串联膜分离技术实现,或将酶直接固定在中空纤维膜上实现。类似的研究或综述报道包括,“化工时刊,2004,18(1):13-17”公开的酶膜反应器及其工业应用研究,“食品安全导刊,2014,11:76-78”公开的酶膜反应器及其应用,“化学与生物工程,2017,34(2):25-32”公开的酶膜耦合法制备均一分子量胶原蛋白多肽,“食品工业科技,2000,21(1):30-31”公开的牛乳蛋白在膜反应器中的酶解,“食品工业科技,2010,31(8):208-212”公开的酶膜反应器连续酶解花生蛋白的工艺研究,“2000,16(4):337-342”公开了动态膜分离式固定化酶反应器操作性能的研究等,其它类似的研究主要是采用酶反应结合膜分离技术在多肽或糖水解产物制备领域的具体应用。这些基于酶解并进一步膜分离的多肽制备过程中,一方面蛋白质酶解过程中释放出的多肽在溶液中会被继续酶解,膜分离后的多肽混合物中存在大量的分子量远远低于膜截留分子量的多肽,导致制备出的多肽分子量分布范围过于宽泛;另一方面传统方法难于制备分子量范围较高的多肽,尤其难于制备平均分子量高于酶的分子量的多肽,且容易导致酶解产物中存在一定的蛋白酶残留。
发明内容
针对传统的基于酶解和膜分离的多肽制备方法可能存在的问题,本发明旨在提供一种分子量范围可控的多肽制备方法及装置,所述方法步骤简单,制备的多肽分子量可控。
为达此目的,本发明采用了以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种分子量范围可控的多肽的制备方法,包括如下步骤:
(1)酶固定化:将蛋白酶共价偶联在多孔微球上;
(2)装膜:将负载固定化酶的多孔微球装入管式陶瓷膜内,所述管式陶瓷膜的截留分子量范围为1-800kDa;
(3)同步酶解-超滤:配制蛋白溶液,调节pH,调节蛋白液的温度并导入步骤(2)的管式陶瓷膜内,收集陶瓷膜透过液;
(4)浓缩和干燥:将步骤(3)收集的管式陶瓷膜透过液浓缩并干燥。
优选地,步骤(1)所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中,通过酶解和超滤两个步骤同时进行协同作用,制备得到了一种分子量范围可控的多肽,通过调节管式陶瓷膜的截留分子量,从而进一步控制多肽的分子量范围,且制备得到的多肽不含有蛋白酶等杂质。
优选地,步骤(1)所述的蛋白酶的载量为0.1-50mg/g,例如可以是0.1mg/g、0.2mg/g、0.3mg/g、0.5mg/g、0.8mg/g、1mg/g、2mg/g、3mg/g、5mg/g、8mg/g、10mg/g、12mg/g、15mg/g、18mg/g、20mg/g、22mg/g、25mg/g、28mg/g、30mg/g、32mg/g、35mg/g、38mg/g、40mg/g、42mg/g、45mg/g、48mg/g或50mg/g,优选为0.5-40mg/g,进一步优选为1-30mg/g。
优选地,步骤(1)所述多孔微球为多孔陶瓷微球、多孔玻璃微球或烧结的多孔不锈钢微球中的任意一种或至少两种的组合。
优选地,步骤(1)所述多孔微球的内部孔道的直径为0.05-50μm,例如可以是0.05μm、0.08μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.5μm、0.8μm、1μm、2μm、3μm、5μm、8μm、10μm、15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm或50μm,优选为0.1-20μm。
优选地,步骤(1)所述多孔微球的直径为0.1-5mm,例如可以是0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.5mm、0.6mm、0.8mm、1mm、1.2mm、1.5mm、1.8mm、2mm、2.2mm、2.5mm、2.8mm、3mm、3.2mm、3.5mm、3.8mm、4mm、4.2mm、4.5mm、4.8mm或5mm,优选为0.1-2mm。
优选地,所述多孔微球的球形度为0.5-1.5,例如可以是0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5,优选为0.7-1.0。
本发明中,通过调节多孔微球的直径和球形度,不仅便于蛋白酶的偶联,同时降低酶解时的空间位阻,提高酶解效率,而在本申请范围的球形度下,提高了管式陶瓷膜的单位装载量,防止了微球泄露。
优选地,步骤(2)所述的管式陶瓷膜的内孔直径为1-30mm,例如可以是1mm、2mm、3mm、5mm、6mm、8mm、10mm、12mm、15mm、16mm、18mm、20mm、21mm、23mm、25mm、26mm、28mm或30mm,优选为3-20mm。
优选地,步骤(2)所述的管式陶瓷膜包括进口和出口,所述进口和出口均设置有筛网。
优选地,所述筛网的直径为小于0.1mm,例如可以是0.001mm、0.002mm、0.003mm、0.004mm、0.005mm、0.006mm、0.007mm、0.008mm、0.009mm、0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm或0.1mm,优选为0.005-0.8mm。
优选地,所述负载固定化酶的多孔微球装入管式陶瓷膜内的装填体积为管式陶瓷膜内孔体积的60-100%,例如可以是60%、61%、62%、63%、65%、66%、68%、70%、72%、73%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、90%、92%、95%、98%或100%,优选为70-90%。
优选地,步骤(2)所述管式陶瓷膜的截留分子量范围为1-800kDa,例如可以是1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、6kDa、8kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、120kDa、150kDa、180kDa、200kDa、230kDa、250kDa、280kDa、300kDa、320kDa、350kDa、380kDa、400kDa、450kDa、500kDa、550kDa、600kDa、650kDa、700kDa、750kDa或800kDa,优选为3-500kDa,进一步优选为5-300kDa。
优选地,步骤(3)所述的蛋白溶液的浓度为0.1-10%,例如可以是0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.8%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%。
优选地,步骤(3)所述的调节pH为2.5-10,例如可以是2.5、2.6、2.8、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10,优选为3-8。
优选地,步骤(3)所述的调节蛋白液的温度为15-60℃,例如可以是15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、35℃、36℃、38℃、40℃、41℃、42℃、43℃、45℃、46℃、48℃、50℃、51℃、53℃、55℃、56℃、58℃或60℃,优选为30-50℃,优选为35-45℃。
优选地,步骤(3)所述的管式陶瓷膜的截留液出口的压力为0.05-0.2MPa,例如可以是0.05MPa、0.06MPa、0.07MPa、0.08MPa、0.09MPa、0.1MPa、0.12MPa、0.13MPa、0.15MPa、0.16MPa、0.18MPa或0.2MPa,优选为0.1-0.15MPa。
本发明中,控制温度和压力是为了保证酶解的效果,在本申请的温度和压力范围内,酶解更完全,本申请特定分子量范围的多肽才能进行分离。
优选地,步骤(4)所述的浓缩为浓缩至原体积的5-30%,例如可以是5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%或30%,优选为8-25%。
优选地,所述分子量范围可控的多肽的制备方法,包括如下步骤:
(1)酶固定化:将蛋白酶共价偶联在直径为0.1-5mm、球形度为0.5-1.5、内部孔道的直径为0.05-50μm的多孔微球上,所述的蛋白酶的载量为0.1-50mg/g;
(2)装膜:将负载固定化酶的多孔微球装入内孔直径为1-30mm的管式陶瓷膜内,所述的管式陶瓷膜的进口和出口均设置有筛网,所述筛网的直径为小于0.1mm,所述管式陶瓷膜的截留分子量范围为1-800kDa,所述负载固定化酶的多孔微球装入管式陶瓷膜内的装填体积为管式陶瓷膜内孔体积的60-100%;
(3)同步酶解-超滤:配制浓度为0.1-10%蛋白溶液,调节pH为2.5-10,调节蛋白液的温度为15-60℃并导入步骤(2)的管式陶瓷膜内,所述的管式陶瓷膜的截留液出口的压力为0.05-0.2MPa,收集管式陶瓷膜透过液;
(4)浓缩和干燥:将步骤(3)收集的管式陶瓷膜透过液浓缩至原体积的5-30%,干燥;
其中,步骤(1)所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶中的任意一种或至少两种的组合,步骤(1)所述多孔微球为多孔陶瓷微球、多孔玻璃微球或烧结的多孔不锈钢微球中的任意一种或至少两种的组合。
作为优选技术方案,所述分子量范围可控的多肽的制备方法,包括如下步骤:
(1)酶固定化:将蛋白酶共价偶联在直径为0.1-2mm、球形度为0.7-1、内部孔道的直径为0.05-20μm的多孔微球上,所述的蛋白酶的载量为3-30mg/g;
(2)装膜:将负载固定化酶的多孔微球装入内孔直径为3-20mm的管式陶瓷膜内,所述的管式陶瓷膜的进口和出口均设置有筛网,所述筛网的直径为0.005-0.8mm,所述管式陶瓷膜的截留分子量范围为5-300kDa,所述负载固定化酶的多孔微球装入管式陶瓷膜内的装填体积为管式陶瓷膜内孔体积的70-90%;
(3)同步酶解-超滤:配制浓度为0.1-10%蛋白溶液,调节pH为3-8,调节蛋白液的温度为35-45℃并导入步骤(2)的管式陶瓷膜内,所述的管式陶瓷膜的截留液出口的压力为0.1-0.15MPa,收集管式陶瓷膜透过液;
(4)浓缩和干燥:将步骤(3)收集的管式陶瓷膜透过液浓缩至原体积的8-25%,干燥;
其中,步骤(1)所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶中的任意一种或至少两种的组合,步骤(1)所述多孔微球为多孔陶瓷微球、多孔玻璃微球或烧结的多孔不锈钢微球中的任意一种或至少两种的组合。
另一方面,本发明提供一种分子量范围可控的多肽的制备装置,所述装置包括依次连接的蛋白质溶液储液瓶1、流体输送泵2、换热器3和管式陶瓷膜6。
优选地,所述换热器3的出口与管式陶瓷膜6进口连接;
优选地,所述管式陶瓷膜6中装填负载了固定化酶的多孔微球7;
优选地,所述负载了固定化酶的多孔微球7的装填体积为管式陶瓷膜6内孔体积的60-100%,优选为70-90%;
优选地,所述的管式陶瓷膜6的内孔直径为1-30mm,例如可以是1mm、2mm、3mm、5mm、6mm、8mm、10mm、12mm、15mm、16mm、18mm、20mm、21mm、23mm、25mm、26mm、28mm或30mm,优选为3-20mm;
优选地,所述管式陶瓷膜6的截留分子量范围为1-800kDa,例如可以是1kDa、2kDa、3kDa、5kDa、6kDa、8kDa、10kDa、15kDa、20kDa、25kDa、30kDa、35kDa、40kDa、45kDa、50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、120kDa、150kDa、180kDa、200kDa、230kDa、250kDa、280kDa、300kDa、320kDa、350kDa、380kDa、400kDa、450kDa、500kDa、550kDa、600kDa、650kDa、700kDa、750kDa或800kDa,优选为3-500kDa,进一步优选为5-300kDa;
优选地,所述管式陶瓷膜6的进口和出口均设置有筛网;
优选地,所述筛网的直径为小于0.1mm,优选为0.005-0.8mm。
优选地,所述换热器3与管式陶瓷膜6之间设置有温度计4,用于监控换热器出口的温度;
优选地,所述管式陶瓷膜6的截留液出口与蛋白质溶液储液瓶1相连,所述蛋白质溶液储液瓶1用于收集通过管式陶瓷膜6的截留液;
优选地,所述蛋白质溶液储液瓶1与蛋白质溶液储液瓶1之间设置有压力计8,用于监测管式陶瓷膜截留液出口的压力。
本发明所述管式陶瓷膜6的透过液出口用于收集透过液,所述透过液用于浓缩干燥制备所述多肽。
本发明所述一种分子量范围可控的多肽的制备装置的工作过程如下:
所述配制的蛋白溶液从蛋白质溶液储液瓶1的出口流出,通过流体输送泵2导入换热器内,所述蛋白质溶液从换热器的出口流出,通过温度计测量换热器出口的蛋白质溶液的温度,保证蛋白质溶液的温度在15-60℃,从换热器的出口流出蛋白质溶液从管式陶瓷膜6的进口流入,将通过陶瓷膜后的截留液返回至蛋白质溶液储液瓶1内,通过管式陶瓷膜透过液出口5收集管式陶瓷膜透过液,所述收集的管式陶瓷膜透过液用于后续的浓缩和干燥。
与现有技术相比,本发明至少具有以下有益效果:
(1)本发明制备方法可以制备质量均一的多肽,且多肽的分子量可以进行精准的控制,控制在一定范围内的多肽的比例达到了70%以上;
(2)本发明方法工艺简单,步骤少,容易操作,制备的多肽的分子量可大于蛋白酶的分子量,不含有蛋白酶等杂质,便于后续的运用,能进行工业化大规模生产。
附图说明
图1为一种分子量范围可控的多肽制备方法的流程图,其中,1-蛋白质溶液储液瓶,2-流体输送泵,3-换热器,4-温度计,5-透过液出口,6-管式陶瓷膜,7-固定化酶的多孔微球,8-压力表。
具体实施方式
为便于理解本发明,本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例1一种分子量范围可控的多肽的制备装置
一种分子量范围可控的多肽的制备装置,如图1所示,所述装置包括依次连接的蛋白质溶液储液瓶1、流体输送泵2、换热器3和管式陶瓷膜6;
所述管式陶瓷膜6中装填负载了固定化酶的多孔微球7;
所述负载了固定化酶的多孔微球7的装填体积为管式陶瓷膜6内孔体积的60-100%,优选为70-90%;
所述的管式陶瓷膜6的内孔直径为1-30mm,优选为3-20mm;
所述管式陶瓷膜6的截留分子量范围为1-800kDa,优选为3-500kDa,进一步优选为5-300kDa;
所述管式陶瓷膜6的进口和出口均设置有筛网;
所述筛网的直径为小于0.1mm,0.005-0.8mm。
所述换热器3与管式陶瓷膜6之间设置有温度计4,用于监控换热器出口的温度;
所述管式陶瓷膜6的截留液出口与蛋白质溶液储液瓶1相连,所述蛋白质溶液储液瓶1用于收集通过管式陶瓷膜6的截留液;
所述蛋白质溶液储液瓶1与蛋白质溶液储液瓶1之间设置有压力计8,用于监测管式陶瓷膜截留液出口的压力;
所述管式陶瓷膜6的透过液出口用于收集透过液,所述透过液用于浓缩干燥制备所述多肽。
所述一种分子量范围可控的多肽的制备装置的工作过程如下:
所述配制的蛋白溶液从蛋白质溶液储液瓶1的出口流出,通过流体输送泵2导入换热器内,所述蛋白质溶液从换热器的出口流出,通过温度计测量换热器出口的蛋白质溶液的温度,保证蛋白质溶液的温度在15-60℃,从换热器的出口流出蛋白质溶液从管式陶瓷膜6的进口流入,将通过陶瓷膜后的截留液返回至蛋白质溶液储液瓶1内,通过管式陶瓷膜透过液出口5收集管式陶瓷膜透过液,所述收集的管式陶瓷膜透过液用于后续的浓缩和干燥。
实施例2
原料为平均分子量大于23kDa的大豆分离蛋白,蛋白质含量超过93%(干基),称取5kg大豆分离蛋白配置成浓度为6.25%的溶液80L:
(1)酶固定化:将胃蛋白酶共价偶联在直径为0.5mm的多孔陶瓷微球上,所述胃蛋白酶的载量为10mg/g,陶瓷微球的球形度0.85,微球内部孔道直径的范围为100nm-20μm;
(2)装膜:将担载胃蛋白酶的陶瓷微球装入内孔直径5mm的管式陶瓷膜内,陶瓷膜截留分子量为5kDa,陶瓷膜进口和出口使用孔径为0.06mm的筛网将陶瓷微球封装,陶瓷膜内担载胃蛋白酶的多孔陶瓷微球装填体积为陶瓷膜内孔道总体积的80%;
(3)同步酶解-超滤过程:将80L浓度为5%的大豆分离蛋白溶液至于100L不锈钢桶,调节蛋白溶液的pH至3.0,将蛋白溶液通过泵导入换热器,换热器出口连接至陶瓷膜入口,控制换热器出口蛋白溶液的温度为37℃,控制陶瓷膜截留液出口的压力在0.1MPa,将通过陶瓷膜后的截留液返回至100L不锈钢桶内,自动补料使100L不锈钢桶内溶液pH稳定在3.0;反复运行,收集陶瓷膜透过液50L;
(4)浓缩和干燥:将步骤(3)收集的陶瓷膜透过液50L浓缩至浓度为10%,使用NaOH溶液将浓缩液pH调至6.8-7.1,然后将浓缩液干燥,获得的粉末为超滤截留分子量5kDa的多肽。
凝胶过滤色谱分析结果表明制备的多肽分子量在3.0kDa~6.5kDa,其中分子量为4.5kDa~5.5kDa的多肽含量为85%。
实施例3
原料为平均分子量大于80kDa的明胶,蛋白质含量超过96%(干基),称取10kg该明胶配置成浓度为10%的溶液100L:
(1)酶固定化:将胰蛋白酶共价偶联在直径为1mm的多孔玻璃微球上,所述胰蛋白酶的载量为15mg/g,玻璃微球的球形度0.9,多孔玻璃微球内部孔道直径的范围为200nm-10μm;
(2)装膜:将担载胰蛋白酶的玻璃微球装入内孔直径10mm的管式陶瓷膜内,陶瓷膜截留分子量为30kDa,陶瓷膜进口和出口均设置孔径为0.02mm的筛网,陶瓷膜内担载胰蛋白酶的多孔玻璃微球装填体积为陶瓷膜内孔道总体积的75%;
(3)同步酶解-超滤过程:将100L浓度为10%的明胶溶液至于200L不锈钢桶,调节蛋白溶液的pH至8.0,将蛋白溶液通过泵导入换热器,换热器出口连接至陶瓷膜入口,控制换热器出口蛋白溶液的温度为37℃,控制陶瓷膜截留液出口的压力在0.12MPa,将通过陶瓷膜后的截留液返回至200L不锈钢桶内,自动补料法使200L不锈钢桶内溶液pH稳定在8.0;反复运行,收集陶瓷膜透过液70L;
(4)浓缩和干燥:将步骤(3)收集的陶瓷膜透过液70L浓缩至浓度为20%,使用HCl溶液将浓缩液pH调至约7.0,然后将浓缩液干燥,干燥后的粉末为超滤截留分子量30kDa的多肽。
凝胶过滤色谱分析结果表明制备的多肽分子量在20kDa~34kDa,其中分子量为28kDa~31kDa的多肽含量为81%。
实施例4
原料为平均分子量大于80kDa的明胶,蛋白质含量超过96%(干基),称取0.1kg该明胶配置成浓度为0.1%的溶液100L:
(1)酶固定化:将糜蛋白酶共价偶联在直径为0.1mm的烧结的多孔不锈钢微球上,所述糜蛋白酶的载量为50mg/g,玻璃微球的球形度0.5,多孔玻璃微球内部孔道直径的范围为50nm-2μm;
(2)装膜:将担载糜蛋白酶的多孔不锈钢微球装入内孔直径1mm的管式陶瓷膜内,陶瓷膜截留分子量为1kDa,陶瓷膜进口和出口均设置孔径为0.005mm的筛网,陶瓷膜内担载糜蛋白酶的多孔不锈钢微球装填体积为陶瓷膜内孔道总体积的60%;
(3)同步酶解-超滤过程:将100L浓度为0.1%的明胶溶液至于200L不锈钢桶,调节蛋白溶液的pH至2.5,将蛋白溶液通过泵导入换热器,换热器出口连接至陶瓷膜入口,控制换热器出口蛋白溶液的温度为15℃,控制陶瓷膜截留液出口的压力在0.05MPa,将通过陶瓷膜后的截留液返回至200L不锈钢桶内,自动补料法使200L不锈钢桶内溶液pH稳定在2.5;反复运行,收集陶瓷膜透过液50L;
(4)浓缩和干燥:将步骤(3)收集的陶瓷膜透过液50L浓缩至浓度为5%,使用HCl溶液将浓缩液pH调至约7.0,然后将浓缩液干燥,干燥后的粉末为超滤截留分子量1kDa的多肽。
凝胶过滤色谱分析结果表明制备的多肽分子量在0.5kDa~3kDa,其中分子量为0.8kDa~2kDa的多肽含量为75%。
实施例5
原料为平均分子量大于80kDa的明胶,蛋白质含量超过96%(干基),称取10kg该明胶配置成浓度为10%的溶液100L:
(1)酶固定化:将木瓜蛋白酶共价偶联在直径为5mm的多孔玻璃微球上,所述木瓜蛋白酶的载量为0.1mg/g,玻璃微球的球形度1.5,多孔玻璃微球内部孔道直径的范围为45-50μm;
(2)装膜:将担载木瓜蛋白酶的玻璃微球装入内孔直径30mm的管式陶瓷膜内,陶瓷膜截留分子量为800kDa,陶瓷膜进口和出口均设置孔径为0.08mm的筛网,陶瓷膜内担载木瓜蛋白酶的多孔玻璃微球装填体积为陶瓷膜内孔道总体积的100%;
(3)同步酶解-超滤过程:将100L浓度为10%的明胶溶液至于200L不锈钢桶,调节蛋白溶液的pH至10.0,将蛋白溶液通过泵导入换热器,换热器出口连接至陶瓷膜入口,控制换热器出口蛋白溶液的温度为60℃,控制陶瓷膜截留液出口的压力在0.2MPa,将通过陶瓷膜后的截留液返回至200L不锈钢桶内,自动补料法使200L不锈钢桶内溶液pH稳定在10.0;反复运行,收集陶瓷膜透过液45L;
(4)浓缩和干燥:将步骤(3)收集的陶瓷膜透过液45L浓缩至浓度为5%,使用HCl溶液将浓缩液pH调至约7.0,然后将浓缩液干燥,干燥后的粉末为超滤截留分子量800kDa的多肽。
凝胶过滤色谱分析结果表明制备的多肽分子量在780kDa~810kDa,其中分子量为790kDa~805kDa的多肽含量为72%。
实施例6
原料为平均分子量大于80kDa的明胶,蛋白质含量超过96%(干基),称取8kg该明胶配置成浓度为8%的溶液100L:
(1)酶固定化:将菠萝蛋白酶共价偶联在直径为2mm的多孔玻璃微球上,所述菠萝蛋白酶的载量为0.5mg/g,玻璃微球的球形度1,多孔玻璃微球内部孔道直径的范围为5-20μm;
(2)装膜:将担载菠萝蛋白酶的玻璃微球装入内孔直径30mm的管式陶瓷膜内,陶瓷膜截留分子量为300kDa,陶瓷膜进口和出口均设置孔径为0.01mm的筛网,陶瓷膜内担载菠萝蛋白酶的多孔玻璃微球装填体积为陶瓷膜内孔道总体积的90%;
(3)同步酶解-超滤过程:将100L浓度为8%的明胶溶液至于200L不锈钢桶,调节蛋白溶液的pH至8.0,将蛋白溶液通过泵导入换热器,换热器出口连接至陶瓷膜入口,控制换热器出口蛋白溶液的温度为50℃,控制陶瓷膜截留液出口的压力在0.15MPa,将通过陶瓷膜后的截留液返回至200L不锈钢桶内,自动补料法使200L不锈钢桶内溶液pH稳定在8.0;反复运行,收集陶瓷膜透过液60L;
(4)浓缩和干燥:将步骤(3)收集的陶瓷膜透过液60L浓缩至浓度为25%,使用HCl溶液将浓缩液pH调至约7.0,然后将浓缩液干燥,干燥后的粉末为超滤截留分子量300kDa的多肽。
凝胶过滤色谱分析结果表明制备的多肽分子量在280kDa~310kDa,其中分子量为292kDa~305kDa的多肽含量为77%。
实施例7
原料为平均分子量大于80kDa的明胶,蛋白质含量超过96%(干基),称取3kg该明胶配置成浓度为3%的溶液100L:
(1)酶固定化:将枯草杆菌蛋白酶共价偶联在直径为2mm的多孔玻璃微球上,所述枯草杆菌蛋白酶的载量为40mg/g,玻璃微球的球形度0.7,多孔玻璃微球内部孔道直径的范围为100nm-3μm;
(2)装膜:将担载枯草杆菌蛋白酶的玻璃微球装入内孔直径3mm的管式陶瓷膜内,陶瓷膜截留分子量为5kDa,陶瓷膜进口和出口均设置孔径为0.04mm的筛网,陶瓷膜内担载枯草杆菌蛋白酶的多孔玻璃微球装填体积为陶瓷膜内孔道总体积的70%;
(3)同步酶解-超滤过程:将100L浓度为3%的明胶溶液至于200L不锈钢桶,调节蛋白溶液的pH至6.0,将蛋白溶液通过泵导入换热器,换热器出口连接至陶瓷膜入口,控制换热器出口蛋白溶液的温度为35℃,控制陶瓷膜截留液出口的压力在0.1MPa,将通过陶瓷膜后的截留液返回至200L不锈钢桶内,自动补料法使200L不锈钢桶内溶液pH稳定在6.0;反复运行,收集陶瓷膜透过液67L;
(4)浓缩和干燥:将步骤(3)收集的陶瓷膜透过液67L浓缩至浓度为8%,使用HCl溶液将浓缩液pH调至约7.0,然后将浓缩液干燥,干燥后的粉末为超滤截留分子量5kDa的多肽。
凝胶过滤色谱分析结果表明制备的多肽分子量在2kDa~10kDa,其中分子量为3kDa~7kDa的多肽含量为78%。
从实施例1-7可以看出,通过酶解和超滤同时进行,本发明精准的控制了多肽的分子量,控制在一定范围内的比例达到了70%以上,多肽分子量均一,不含有蛋白酶等杂质。
对比例1
与实施例3相比,除酶解和超滤步骤分开进行之外,其它与实施例3相同。
凝胶过滤色谱分析结果表明制备的多肽分子量在15kDa~50kDa,其中分子量为28kDa~31kDa的多肽含量为35%。
对比例2
与实施例3相比,除管式陶瓷膜的截留分子量范围为900kDa之外,其它与实施例3相同。
凝胶过滤色谱分析结果表明制备的多肽分子量在900kDa以上,其中还含有蛋白酶,分子量不均衡。
从对比例1-2和实施例2对比可以看出,本发明方法可以精准的控制多肽的分子量范围,制备得到的多肽质量均一。
综上所述,本发明制备方法可以制备质量均一的多肽,且多肽的分子量可以进行控制,控制在一定范围内的多肽的比例达到了70%以上,不含有蛋白酶等杂质,不仅如此,从对比例可以看出,如果将酶解和过滤的步骤分开,其效果明显不如本发明。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程,但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程,即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (43)
1.一种分子量范围可控的多肽的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)酶固定化:将蛋白酶共价偶联在多孔微球上;
(2)装膜:将负载固定化酶的多孔微球装入管式陶瓷膜内,所述管式陶瓷膜的截留分子量范围为1-800kDa;
(3)同步酶解-超滤:配制蛋白溶液,调节pH,调节蛋白液的温度并导入步骤(2)的管式陶瓷膜内,收集管式陶瓷膜透过液;
(4)浓缩和干燥:将步骤(3)收集的管式陶瓷膜透过液浓缩并干燥。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述的蛋白酶的载量为0.1-50mg/g。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述的蛋白酶的载量为0.5-40mg/g。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述的蛋白酶的载量为1-30mg/g。
6.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述多孔微球为多孔陶瓷微球、多孔玻璃微球或烧结的多孔不锈钢微球中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述多孔微球的内部孔道的直径为0.05-50μm。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述多孔微球的内部孔道的直径为0.1-20μm。
9.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述多孔微球的直径为0.1-5mm。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述多孔微球的直径为0.1-2mm。
11.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述多孔微球的球形度为0.5-1.5。
12.根据权利要求11所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述多孔微球的球形度为0.7-1.0。
13.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述的管式陶瓷膜的内孔直径为1-30mm。
14.根据权利要求13所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述的管式陶瓷膜的内孔直径为3-20mm。
15.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述的管式陶瓷膜包括进口和出口,所述进口和出口均设置有筛网。
16.根据权利要求15所述的制备方法,其特征在于,所述筛网的直径为小于0.1mm。
17.根据权利要求16所述的制备方法,其特征在于,所述筛网的直径为0.005-0.8mm。
18.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述负载固定化酶的多孔微球装入管式陶瓷膜内的装填体积为管式陶瓷膜内孔体积的60-100%。
19.根据权利要求18所述的制备方法,其特征在于,所述负载固定化酶的多孔微球装入管式陶瓷膜内的装填体积为管式陶瓷膜内孔体积的70-90%。
20.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述管式陶瓷膜的截留分子量范围为3-500kDa。
21.根据权利要求20所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述管式陶瓷膜的截留分子量范围为5-300kDa。
22.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述的蛋白溶液的浓度为0.1-10%。
23.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述的调节pH为2.5-10。
24.根据权利要求23所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述的调节pH为3-8。
25.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述的调节蛋白液的温度为15-60℃。
26.根据权利要求25所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述的调节蛋白液的温度为30-50℃。
27.根据权利要求26所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述的调节蛋白液的温度为35-45℃。
28.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述的管式陶瓷膜的截留液出口的压力为0.05-0.2MPa。
29.根据权利要求28所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述的管式陶瓷膜的截留液出口的压力为0.1-0.15MPa。
30.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)所述的浓缩为浓缩至原体积的5-30%。
31.根据权利要求30所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)所述的浓缩为浓缩至原体积的8-25%。
32.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)酶固定化:将蛋白酶共价偶联在直径为0.1-5mm、球形度为0.5-1.5、内部孔道的直径为0.05-50μm的多孔微球上,所述的蛋白酶的载量为0.1-50mg/g;
(2)装膜:将负载固定化酶的多孔微球装入内孔直径为1-30mm的管式陶瓷膜内,所述的管式陶瓷膜包括进口和出口,所述进口和出口均设置有筛网,所述筛网的直径为小于0.1mm,所述管式陶瓷膜的截留分子量范围为1-800kDa,所述负载固定化酶的多孔微球装入管式陶瓷膜内的装填体积为管式陶瓷膜内孔体积的60-100%;
(3)同步酶解-超滤:配制浓度为0.1-10%蛋白溶液,调节pH为2.5-10,调节蛋白液的温度为15-60℃并导入步骤(2)的管式陶瓷膜内,所述的管式陶瓷膜的截留液出口的压力为0.05-0.2MPa,收集陶瓷膜透过液;
(4)浓缩和干燥:将步骤(3)收集的陶瓷膜透过液浓缩至原体积的5-30%,干燥;
其中,步骤(1)所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶中的任意一种或至少两种的组合,步骤(1)所述多孔微球为多孔陶瓷微球、多孔玻璃微球或烧结的多孔不锈钢微球中的任意一种或至少两种的组合。
33.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法使用的制备装置包括依次连接的蛋白质溶液储液瓶(1)、流体输送泵(2)、换热器(3)和管式陶瓷膜(6);
所述管式陶瓷膜(6)中装填负载了固定化酶的多孔微球(7);
所述管式陶瓷膜(6)的截留分子量范围为1-800kDa;
所述换热器(3)与管式陶瓷膜(6)之间设置有温度计(4),用于监控换热器出口的温度;
所述管式陶瓷膜(6)的截留液出口与蛋白质溶液储液瓶(1)相连,所述蛋白质溶液储液瓶(1)用于收集通过管式陶瓷膜(6)的截留液。
34.根据权利要求33所述的制备方法,其特征在于,所述负载了固定化酶的多孔微球(7)的装填体积为管式陶瓷膜(6)内孔体积的60-100%。
35.根据权利要求34所述的制备方法,其特征在于,所述负载了固定化酶的多孔微球(7)的装填体积为管式陶瓷膜(6)内孔体积的70-90%。
36.根据权利要求33所述的制备方法,其特征在于,所述的管式陶瓷膜(6)的内孔直径为1-30mm。
37.根据权利要求36所述的制备方法,其特征在于,所述的管式陶瓷膜(6)的内孔直径为3-20mm。
38.根据权利要求33所述的制备方法,其特征在于,所述管式陶瓷膜(6)的截留分子量范围为3-500kDa。
39.根据权利要求38所述的制备方法,其特征在于,所述管式陶瓷膜(6)的截留分子量范围为5-300kDa。
40.根据权利要求33所述的制备方法,其特征在于,所述管式陶瓷膜(6)的进口和出口均设置有筛网。
41.根据权利要求40所述的制备方法,其特征在于,所述筛网的直径为小于0.1mm。
42.根据权利要求41所述的制备方法,其特征在于,所述筛网的直径为0.005-0.8mm。
43.根据权利要求33所述的制备方法,其特征在于,所述蛋白质溶液储液瓶(1)与蛋白质溶液储液瓶(1)之间设置有压力计(8),用于监测管式陶瓷膜截留液出口的压力。
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