CN106987646A - 一种血液游离dna保护剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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丁渭
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Abstract

本发明公开了一种血液游离DNA保护剂及其制备方法，该保护剂是由EDTA‑3K、IDU、glycine、bestain、AEBSF溶解在水中形成的溶液，其中EDTA‑3K、IDU、glycine、bestain、AEBSF在所述溶液中的浓度分别为30g~100g/L、200~600g/L、10~60g/L、0.05~0.3g/L、0.05~0.4g/L。本发明将采集的血液与血液游离DNA保护剂以100:2的比例缓慢充分混合均匀，在常温条件下能够保护血液游离DNA长达14天，可用于血液游离DNA的保护和储存。

Description

一种血液游离DNA保护剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及分子生物学，特别涉及一种血液游离DNA保护剂及其制备方法与应用。
背景技术
游离核酸最早由 Mandel和Metais于1947年发现，但由于缺乏高灵敏性和高特异性的实验方法，导致有关血液中游离DNA与疾病相关性的研究在较长时期内进展缓慢。直到有效分离游离DNA技术、PCR检测技术的出现和应用，使这一领域的研究在最近二十多年得到了较迅速发展。自发现血液中游离DNA可含肿瘤细胞DNA相同基因突变后，应用分子生物学手段对循环游离核酸的研究的兴趣日益增加。但是这些游离的DNA在常温液体形势下很容易就降解消失，因此一种有效可行的延长血液游离DNA保存期限的保护剂是非常需要的。
目前，市面上存在着各种各样的采血管，这些采血管中应用的许多化学试剂和物理方法都只是起到防止血液凝固的作用，而没有起到保护游离核酸的作用。在临床过程中，由于条件或时间的限制，无法在得到血液后第一时间分离血浆，血液中的细胞破裂和长时间的无保护暴露状态会导致血液中游离的DNA降解，造成无法进行后续实验或实验结果的假阴性，从而无法为临床提供有价值的信息。
有鉴于此，本文发明一种可有效防止血液细胞破裂，保护血液游离DNA的血液保护剂，以减少对后续检验检测的干扰。
发明内容
为解决常规采血管中的不能有效地保护游离DNA，延长标本的保存期限的问题，本发明的目的在于提供一种血液游离DNA保护剂，该保护剂不仅能防止血液凝固，而且能够保护其中游离的DNA。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种血液游离DNA保护剂，所述保护剂由EDTA-3K、IDU、glycine、bestain、AEBSF溶解在水中形成的溶液，其中EDTA-3K、IDU、glycine、bestain、AEBSF在所述溶液中的浓度分别为30g~100g/L、200~600g/L、10~60g/L、0.05~0.3g/L、0.05~0.4g/L，采集的血液与血液游离DNA保护剂之间以比值在（80~100）:（1~4）之间的比例混合均匀，室温保存。
本发明所述的制备血液游离DNA保护剂的方法，具体步骤如下：
1）将每一种组分称取适宜的量到容器中；
2）加入适当的双蒸水溶解所有组分，然后全量转移到容量瓶中，多次清洗初次溶解的容器，洗涤液全量转移到容量瓶中，最后使用双蒸水定容。
本发明的有益效果在于：
采集的血液，用本发明的血液游离DNA保护剂保存，可以达到第一时间保护血液中的游离DNA，可以有效防止血液细胞破裂，更好地保证标本DNA的完整性，减少临床使用中对后续检验检测的干扰，同时能延长血液标本的有效保存期限，能够使血液中游离的DNA在常温保存14天之久。
附图说明
图1为全血置于本文所述的游离核酸保护剂中保存0天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β-ACTB基因实时荧光PCR的检测结果。
图2为全血置于本文所述的游离核酸保护剂中保存3天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β-ACTB基因实时荧光PCR的检测结果。
图3为全血置于本文所述的游离核酸保护剂中保存7天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β-ACTB基因实时荧光PCR的检测结果。
图4为全血置于本文所述的游离核酸保护剂中保存14天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β-ACTB基因实时荧光PCR的检测结果。
图5为全血置于EDTA-Na2采血管中保存0天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β-ACTB基因实时荧光PCR的检测结果。
图6为全血置于EDTA-Na2采血管中保存3天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β-ACTB基因实时荧光PCR的检测结果。
图7为全血置于EDTA-Na2采血管中保存7天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β-ACTB基因实时荧光PCR的检测结果。
图8为全血置于EDTA-Na2采血管中保存14天后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β-ACTB基因实时荧光PCR的检测结果。
具体实施方式：
以下实施案例仅用于解释本发明，而不用于限制本发明。
本发明所述的血液游离DNA保护剂的制备方法如下：
1） 将每一种组分称取适宜的量到容器中；
本发明所述的血液游离DNA保护剂是由EDTA-3K、IDU、glycine、bestain、AEBSF溶解在水中形成的溶液，其中EDTA-3K、IDU、glycine、bestain、AEBSF在所述溶液中的浓度分别为50g/L、550g/L、30g/L、1mg/L、0.172g/L、0.24g/L。
2） 假设制备1L的血液游离DNA保护剂，先加入500ml的双蒸水溶解所有组分，然后全量转移到1L容量瓶中，多次清洗初次溶解的容器，洗涤液全量转移到容量瓶中，最后使用双蒸水定容至1L。
使用方法:
血液游离DNA保护剂在血液游离DNA保存的应用中，采集的血液与血液游离DNA保护剂以100:2 的比例缓慢充分混合均匀，室温保存。
实施例1：使用本发明的血液游离DNA保护剂与常规的EDTA-Na2采血管的对比试验。
随机抽取8例全血样本，分别按5ml/人份分成8人份，其中4人份为1组，分成2组。其中1组置于常规EDTA-Na2采血管中，另1组置于本发明所述的血液游离DNA保护剂中，分别常温放置0天、3天、7天、14天后进行核酸提取（Qiagen公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit(50)-货号51104试剂盒），以提取的核酸为样本进行人β-ACTB基因的实时荧光PCR检测。
检测结果：
置于常规EDTA-Na2采血管和本发明所述的血液游离DNA保护剂中的全血样本，在常温放置不同时间后，分别进行核酸提取，提取的核酸进行人β-ACTB基因的实时荧光PCR检测，其检测结果的Ct值如表1。
表1
由表1可知，血液游离DNA保护剂能够在14天内有效地保护血液中游离的DNA，只有极其轻微的降解；而常规EDTA-Na2采血管只能维持3天的稳定性且降解情况比较严重。
图1~图8为表1对应的人β-ACTB基因的实时荧光PCR检测结果图，其中图1~图4为全血置于本文所述的游离核酸保护剂中保存不同时间后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β-ACTB基因实时荧光PCR的检测结果图，由图可知，在0~14天的检测时间内，所有检测样本都被正确检出，且稳定性良好，血液中的游离核酸得到了有效的保护；图5~图8为全血置于常规EDTA-Na2采血管中保存不同时间后进行核酸提取，提取得到的核酸进行β-ACTB基因实时荧光PCR的检测结果图，检测结果显示，常规EDTA-Na2采血管中的游离核酸只能保持3天的稳定性，降解情况十分严重。
上述实施例只是对本发明方案的举例说明或解释，而不应理解为对本发明方案的限制，显然，本领域的技术人员可对本发明进行各种修改和变型而不脱离本发明的精神和范围。倘若这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则皆应属本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种血液游离DNA保护剂，是一种作用于采集的血液的溶液，其特征在于，所述保护剂是由EDTA-3K、IDU、glycine、bestain、AEBSF组成。
2.根据权利要求1所述的一种血液游离DNA保护剂，其特征在于，其中EDTA-3K、IDU、glycine、bestain、AEBSF在所述溶液中的浓度分别为30g~100g/L、200~600g/L、10~60g/L、0.05~0.3g/L、0.05~0.4g/L。
3.根据权利要求1所述的一种血液游离DNA保护剂，其特征在于，所述的血液游离DNA保护剂其制备方法的具体步骤如下：
1）将每一种组分称取适宜的量到容器中；
2）加入适当的双蒸水溶解所有组分，然后全量转移容量瓶中，多次清洗初次溶解的容器，洗涤液全量转移到容量瓶中，最后定容。
4.一种血液游离DNA保护剂，其特征在于：在采集的血液与血液游离DNA保护剂的应用中，采集的血液与血液游离DNA保护剂之间以合适的比例缓慢充分混合均匀，室温保存。
5.根据权利要求2所述的一种血液游离DNA保护剂，其特征在于，采集的血液与血液游离DNA保护剂之间以比值在（80~100）:（1~4）之间的比例混合均匀，室温保存。
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