CN110343742A - 一种用于高通量测序文库制备的微量贝类dna提取方法 - Google Patents

一种用于高通量测序文库制备的微量贝类dna提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法。选取微量贝类鳃丝组织，仅需细胞裂解液和蛋白酶K，进行细胞裂解、蛋白质消化，稀释上清，由此得到的基因组DNA，可以直接用来制备高通量测序文库。DNA提取所需的组织量低至5mg，操作简便快速，尤其适用于微量组织的高通量测序文库制备；利用该DNA样品制备的文库进行测序获得基因分型数据，分型准确性达99.94％。本发明DNA提取操作时间不超过30分钟，提取的DNA适用于大批量贝类微量样品的高通量测序文库的制备及后续全基因组分型分析。

Description

一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法
技术领域
本发明涉及脱氧核糖核酸提取与分子标记分型技术领域，更具体的说是涉及一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法。
背景技术
目前，贝类占我国海产养殖总量近80％，是我国海水养殖的支柱性产业。近年来随着生物高新技术的迅猛发展，如何高效利用基因组学与遗传信息学应用于贝类优良种质创制，已成为贝类遗传育种领域的前沿焦点问题。另外，开展全基因组范围的SNP标记分型能够为砗磲等珍贵的贝类资源的种质资源分析和遗传资源的开发和保护等方面提供丰富的数据信息。
随着测序成本的降低和文库构建流程的标准稳定化，GBS、RAD、2b-RAD等简化基因组测序技术作为一种高效标记开发技术已然成为贝类等非模式生物大规模群体的SNP位点基因型筛查和分析的主流技术，推动了群体遗传学、遗传图谱构建及数量性状位点定位等方面的研究进展。简化基因组技术对于贝类的分子育种和多样性保护等方面具有重要的科研价值和产业价值。
但是，在相关领域的应用仍存在一定挑战。究其原因，这类技术大都是通过酶切的方式获得代表性的标签序列，从而实现降低基因组的复杂度。测序文库制备的首要步骤是对基因组DNA进行酶切处理，文库制备对于DNA的起始量和质量的要求较高。通常分子育种所涉及的选育亲本和濒危保护贝类的研究获取组织的方式都以不影响生物体存活状态为前提，通过这类方式获取的组织微量，提取的DNA量少，一般不能直接用来制备高通量测序文库。目前尚未有文献报道可用于高通量测序文库制备的微量组织基因组DNA的快速、简便、有效的提取方法。
针对海洋软体动物的的DNA提取方法主要分为两种：一种是以传统酚-氯仿抽提法和试剂盒为代表的，该方法可以得到主带完整、纯净的基因组DNA，需要大量样品材料，可能会导致贝类死亡或造成畸形伤害，并且成本较高，因而不适用于分子标记辅助育种等需要维持研究对象良好生长状况的研究领域；另一种是以贝类DNA快提法为代表的一类技术可以在不影响活体扇贝生存情况下，短时快速获得基因组DNA用于普通PCR检测，但该方法获得的DNA均有不同程度的降解，并且含有较多SDS、蛋白酶K等酶抑制剂，容易影响内切酶的活性，无法保证高通量测序文库的制备质量，所以通过该方法获取DNA的方式并不能直接转化到制备高通量测序文库的应用中。
因此，如何从离体的微量贝类组织提取DNA并适用于高通量测序文库制备是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法
(1)配制细胞裂解液和蛋白酶K混合液；
(2)选取5.0mg贝类离体鳃丝，浸泡在步骤(1)所述细胞裂解液和蛋白酶K混合液中；
(3)步骤(2)得到的反应体系放置于37-65℃水浴锅中消化，直至澄清；
(4)待消化完毕后，吸取上清液，稀释，得到可用于高通量测序文库制备的基因组DNA样品；
(5)用步骤(4)获得的基因组DNA样品构建Miso-RAD测序文库；
(6)利用双端测序平台对步骤(5)构建的Miso-RAD文库进行高通量测序；
(7)对步骤(6)获得的测序数据进行处理与分析。
优选的：步骤(1)中细胞裂解液pH＝8.0，组分为100mM NaCl、10mM Tris-HCl和1mMEDTA；蛋白酶K终浓度为0.1μg/μl。
优选的：贝类为瓣鳃纲。
优选的：步骤(3)中水浴温度为56℃，水浴消化时间为1.0小时；每30min将所述鳃丝、所述细胞裂解液和所述蛋白酶K混匀。
优选的：步骤(4)中稀释为向上清液中加入灭菌三蒸水，上清液与灭菌三蒸水的体积比例是1:49。
优选的：步骤(5)用于制备Miso-RAD测序文库的起始入口量为2-5ul的稀释液。
优选的：步骤(5)构建Miso-RAD测序文库，步骤包括：BsaXI酶切与检测、灭活内切酶、T4DNA连接酶连接、一轮PCR富集、样品检测与回收纯化、再次扩增、LguI酶酶切、T4DNA连接酶连接、加barcode标记进行PCR扩增。
优选的：步骤(6)处理与分析为：按照序列不含N、序列80％以上碱基的质量值>20原则对原始reads进行质量过滤，再用RADtyping软件对基因组范围内SNP位点实现基因分型。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法，有益效果为：优化提取样品组织的量，使样品组织自身释放的溶解酶和体系中的酶量达到最佳配比，无需煮沸灭活，在短时间内得到了完整度较高的基因组DNA，通过舍弃SDS的使用、优化入口组织量和稀释倍数，使体系内酶的抑制作用降到最低，保证了建库首要步骤酶切体系的高效稳定，确保了高质量的文库制备，可以快速准确地获得基因分型数据。该DNA提取方法舍弃了传统DNA抽提方法中繁琐的去蛋白、沉淀DNA等步骤，具有操作简便快速，试剂成本低，实验安全性高等特点，特别是不影响待分析生物体存活状态，适用于大批量贝类样品的高通量测序文库的制备及后续全基因组分型分析，将在贝类的分子育种研究和濒危贝类遗传多样性保护等方面具有重要的应用前景。
具体的，本发明只需5.0mg离体贝类鳃丝，通过细胞裂解、消化蛋白与稀释上清便可提出高质量的基因组DNA，实验流程简便，DNA提取时间大大缩短，所需试剂耗材成本也仅为常规酚-氯仿抽提法的50-60％，且杜绝了酚、氯仿等有害物质的使用，提高了实验安全性，十分适用于贝类大批量或珍贵样本的处理。用该DNA样品成功构建了基于酶切技术的Miso-RAD文库，通过二代高通量测序技术，实现了一次性对贝类全基因组范围内230多万个单核苷酸多态性位点的分型，与常规提取法提得的DNA构建的测序文库相比，标签种类一致性达95.76％，基因分型准确性高达99.94％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为虾夷扇贝基因组DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所述贝类为双壳贝类，包括扇贝、牡蛎、贻贝和蛤仔等。
实施例1以虾夷扇贝为例，详述本发明。
实施例1
一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法，具体包含以下步骤：
(1)在1.5ml EP管中加入99.5μl细胞裂解液(成分有100mM NaCl、10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH＝8.0)，再向裂解液中加入0.5μl浓度为20mg/ml的蛋白酶K，调节使最终混合液的蛋白酶K酶终浓度达0.1μg/μl，制得混合液。
(2)向EP管中放入离体虾夷扇贝的鳃丝5.0mg。
(3)将上述EP管放入37-65℃水浴锅中消化1.0h，本例为56℃水浴锅，为促进细胞裂解和蛋白消化，每隔30min将EP管取出颠倒混匀一次。
(4)消化结束，吸取上清液，与三蒸灭菌水按照1:49的比例稀释。稀释液即为本发明提取得到的扇贝基因组DNA。
(5)DNA质量检测：用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品质量，用Nano Drop测其浓度、OD260/OD280、OD260/OD230等值，检测可知该样品DNA完整度较高，无蛋白质残留，放于-20℃保存备用。
(6)构建Miso-RAD测序文库：建库流程参照Shi Wang等人的Serial sequencingof isolength RAD tags for cost-efficient genome-wide profiling of genetic andepigenetic variations(doi:10.1038/nprot.2016.133)，步骤包括BsaXI酶切与检测、灭活内切酶、T4DNA连接酶连接、一轮PCR富集、样品检测与回收纯化、再次扩增、LguI酶酶切、T4DNA连接酶连接、加barcode标记进行PCR扩增等步骤。
(7)利用双端测序平台PE150对该文库进行高通量测序。
(8)利用生物信息学方法对文库测序数据进行处理与分析：首先剔除含N的序列，保留80％以上碱基的质量值>20的序列，然后运用RAD-typing软件进行基因分型。
对比试验1
采用不同方法提取离体虾夷扇贝组织基因组DNA，比较琼脂糖凝胶电泳检测结果(参见附图图1)，1组采用的是本发明的方法，泳道1、2为该方法提取的DNA；2组采用如下步骤，具体为剪取扇贝鳃丝，浸泡于200ul裂解液中(裂解液成分100mMNaCl、10mM Tris-HCl和1mM EDTA；蛋白酶K浓度0.3mg/ml；SDS的质量体积比为0.50％)，置于56℃水浴锅内消化30min，然后100℃水浴煮沸10min，吸取上清，稀释100倍后用于后续实验，泳道3、4为该方法提取的DNA，3组采用传统酚氯仿抽提法，泳道5、6为该方法提取的DNA。
分析可知用本发明DNA提取方法得到的DNA主带完整清晰，只有小部分降解，蛋白残留少，其浓度均在100ng/ul以上，对于微量组织的DNA提取得率高，并且后续可以成功建库，并获得较好的测序结果；2组方法提取获得的DNA降解严重，无完整的主带，泳道中的DNA呈弥散状，并且浓度均在10ng/ul以下，体系中仍存有内切酶抑制成分，后续无法完成高通量测序文库的制备。用传统酚氯法提取的DNA有完整清晰的主带，并且浓度较高，但是该方法步骤繁琐，需要接触有机试剂，实验安全性低。
对比实验2
与实施例1的区别仅在于，用传统酚氯仿抽提法提取同一只虾夷扇贝鳃丝基因组DNA，以此为对照，用上述两种DNA样品构建Miso-RAD测序文库，并做2个平行重复。
虾夷扇贝基因组已公布，从NCBI下载获得其参考基因组，从中提取含有BsaXI酶切识别位点的标签作为分型的参考序列。
分析共获得21.3M过滤后的高质量reads，占总数据量的98.84％；不同文库测序数据统计情况如表1所示，其中对照组酚氯仿抽提法DNA构建的两个平行文库的标准标签分别覆盖了基因组91.44％、90.47％的位点，本发明构建的两个平行文库的标签种类一致性为95.46％，与对照组相比，标签种类一致性达到95.76％。SNP分型结果如表2所示，本发明中快速提取法构建的文库共检测到2310317个与酚氯仿抽提法文库共有的纯合位点和13147个共有的杂合位点，分型一致性为99.94％。
表1
表2：
纯合位点数 杂合位点数 总数
能分型位点数 2,310,317 13,147 2,323,464
分型一致位点数 2,309,994 12,146 2,322,140
分型不一致位点数 323 1,001 1,324
分型一致性 99.986％ 92.386％ 99.943％
本发明具有易操作、成本低、效率高、通量高、分型准确率高等优点，适用于大规模、高通量活体贝类遗传学研究。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)配制细胞裂解液和蛋白酶K混合液；
(2)选取5.0mg贝类离体鳃丝，浸泡在步骤(1)所述细胞裂解液和蛋白酶K混合液中；
(3)步骤(2)得到的反应体系放置于37-65℃水浴锅中消化，直至澄清；
(4)待消化完毕后，吸取上清液，稀释，得到可用于高通量测序文库制备的基因组DNA样品；
(5)用步骤(4)获得的基因组DNA样品构建Miso-RAD测序文库；
(6)利用双端测序平台对步骤(5)构建的Miso-RAD文库进行高通量测序；
(7)对步骤(6)获得的测序数据进行处理与分析。
2.根据权利要求1所述的一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中细胞裂解液pH＝8.0，组分为100mM NaCl、10mM Tris-HCl和1mMEDTA；最终混合液中蛋白酶K终浓度为0.1μg/μl。
3.根据权利要求1所述的一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法，其特征在于：所述贝类为瓣鳃纲。
4.根据权利要求1所述的一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法，其特征在于：所述步骤(3)中水浴温度为56℃，水浴消化时间为1.0小时；每30min将所述鳃丝、所述细胞裂解液和所述蛋白酶K混匀。
5.根据权利要求1所述的一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法，其特征在于：所述步骤(4)稀释为向上清液中加入灭菌三蒸水，上清液与灭菌三蒸水的体积比例是1:49。
6.根据权利要求1所述的一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法，其特征在于：所述步骤(5)用于制备Miso-RAD测序文库的起始入口量为2-5ul的稀释液。
7.根据权利要求1所述的一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法，其特征在于：所述步骤(5)构建Miso-RAD测序文库，步骤包括：BsaXI酶切与检测、灭活内切酶、T4DNA连接酶连接、一轮PCR富集、样品检测与回收纯化、再次扩增、LguI酶酶切、T4 DNA连接酶连接、加barcode标记进行PCR扩增。
8.根据权利要求1所述的一种用于高通量测序文库制备的微量贝类DNA提取方法，其特征在于，所述步骤(6)处理与分析为：按照序列不含N、序列80％以上碱基的质量值>20原则对原始reads进行质量过滤，再用RADtyping软件对基因组范围内SNP位点实现基因分型。
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