CN113293220A - 分析绵羊耳部大小的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用 - Google Patents

分析绵羊耳部大小的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种分析绵羊耳部性状的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用，涉及生物技术领域，本发明提供了能够分析绵羊耳部性状特征的1920个SNP位点组合，其物理位置信息基于绵羊v4.0基因组序列比对确定，利用1920个SNP位点组合制成的分子探针组合、基因芯片、试剂盒能够对绵羊个体进行遗传评估，对早期难以度量的耳部性状进行个体选择，缩短世代间隔，加速育种进程，从而节约大量的育种成本。

Description

分析绵羊耳部大小的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及生物检测技术领域，更具体的涉及分析绵羊耳部大小的基因芯片、分子探针组合、试剂盒及应用。
背景技术
耳朵类型是现在家畜品种的一个重要性状，耳朵大小是其重要的表型之一。而绵羊耳朵不仅是绵羊重要性状之一，还是广受欢迎的食材；此外，有研究表明绵羊和人类耳朵在结构上较为相似，因此其还能作为人类耳朵相关医学研究中的模型；而且，绵羊耳部性状在绵羊品种溯源及种质资源的保护、开发利用也具有重要意义。为了更好的开展绵羊耳朵大小的研究，已经有越来越多的科研工作者利用基因分析研究绵羊耳部面积性状，目前，分子标记技术由于其准确度高、可操作性强等优点越来越受到重视，其中基于单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms,SNP）的分子标记技术应用得越来越广泛。SNP作为生物基因组中的一种遗传分子标记，在动植物遗传进化分析、重要经济形状筛选、分子育种等方面起着越来越重要的作用。基于SNP的SNP芯片是进行现代遗传育种便捷高效的工具，由于其容易实现SNP高通量、自动化检测，可以检测出基因组 DNA上每个碱基对的变化，包括插入、缺失、颠倒、转换等，已经成为非常理想的SNP检测技术，在绵羊育种领域中的运用也越来越多。
尽管绵羊现有的商业化SNP芯片有Illumina Ovine SNP50 Beadchip（50K）、Illumina Sheep HD Genotyping Beadchip（680K）和Illumina Ovine LD（5K），能够覆盖绵羊全基因组的超过 54K 个 SNP 位点，可用于遗传育种、全基因组关联分析、数量性状基因座定位、基因优选及比较基因组学等研究。但是现有的绵羊SNP芯片主要依据西方品种绵羊的数据，缺乏中国绵羊品种与国外绵羊品种结合的 SNP 数据，存在位点均匀性不足、对功能性位点和区域的体现不足、超过10%的位点在中国绵羊群体为极低频位点等诸多问题，设计一款适用于中国绵羊群体且能对耳部面积性状进行快速有效检测SNP芯片，有着十分重要的意义。
发明内容
为满足我国当前绵羊品种研究以及农业生产上对绵羊耳部面积检测的需求，本发明提供了一种分析绵羊耳部性状的分子探针组合、基因芯片、试剂盒及应用，利用本发明提供的位点信息，能够快速准确的实现绵羊耳部大小沉积评价、品种筛选、品种鉴定、品种溯源、绵羊育种，有利于种质资源保护以及种质资源改良，耗时短、成本低、市场效益广阔。
为实现本发明的技术目的，本发明提供以下技术方案：
第一方面、1920个SNP位点组合在分析绵羊耳部大小的应用，所述1920个SNP位点组合的物理位置如表1所示：
表1 1920个位点组合的位置信息
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其物理位置基于绵羊 v4.0基因组序列比对确定。
第二方面、分析绵羊耳部大小的方法，将待测绵羊的基因组DNA的1920个SNP位点基因型与对照绵羊基因组DNA的所述1920个SNP位点基因型进行比较；
其中，所述1920个SNP位点为表1所述的1920个SNP位点。
第三方面、分析绵羊耳部大小的分子探针组合，所述分子探针组合检测待测样品中如表1所示的SNP位点组合，所述表1中的位点组合的物理位置信息基于绵羊 v4.0基因组序列比对确定。
第四方面、分析绵羊耳部大小的基因芯片，所述基因芯片负载有第三方面所述的分子探针组合。
第五方面、分析绵羊耳部大小的试剂盒，其具有第三方面所述的分子探针组合或第四方面所述的基因芯片。
第六方面、分析绵羊耳部大小的方法，应用第三方面所述的分子探针组合或第四方面所述的基因芯片或第五方面所述的试剂盒对待测样品进行检测。
第七方面、第三方面所述的分子探针组合或第四方面所述的基因芯片或第五方面所述的试剂盒具有如下任一所述的用途：（1）在绵羊耳部大小评价中的应用；（2）在绵羊品种筛选的应用；（3）在绵羊品种鉴定中的应用；（4）在绵羊品种溯源中的应用；（5）在绵羊育种中的应用；（6）在种质资源保护中的应用；（7）在种质资源改良中的应用；（8）在绵羊系谱重构中的应用。
有益效果：
1、 本发明基于对国内外众多绵羊的遗传资源研究，提供一种仅由1920个SNP位点组成的分析绵羊耳部大小的SNP位点组合，本发明提供的SNP位点组合不仅具有国内外通用性好，还能快速从基因水平上对早期不能显现的绵羊耳部大小性状进行评价，获取更准确的育种评估信息，控制育种进程，利用上述位点组合还能对绵羊品种进行筛选、鉴定和溯源，为种质资源保护和种质资源的改良提供技术支持。
2、本发明提供的分析绵羊耳部大小的探针组合、基因芯片、试剂盒还具有通量小、成本低，分析更容易的特点，普适性广，市场前景广阔。
附图说明
图1是瓦格吉尔羊Vs 设德兰羊（WGR versus SHE）组的曼哈顿图；
图2是多浪羊Vs 设德兰羊（DLS versus SHE）组的曼哈顿图；
图3是本申请对群体阈值分析的判定结果进行了显著性检验的结果图。
具体实施方式
下面参考具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《生物信息学与功能基因组学》原著第三版或者相关书籍进行，所采用的生物信息软件和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用材料来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
此外，还需要说明的是，本发明提供的位点组合及应用均是发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才得以完成。
在本文前述的位点组合部分中所描述的特征和优点，同样适用于基于位点组合所形成的分子探针组合、基因芯片、试剂盒以及其应用，在此不再赘述。
需要说明的是，本发明所称的绵羊耳部大小是根据耳部面积的大小划分，常规面积的耳朵面积为大耳朵，发生变异的小耳畸形为小耳朵。
本发明的所称的SNP是指单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，所述单个核苷酸的变异包括由单个碱基的转换、颠换、插入或缺失所导致的变异。
需要说明的是，本发明所称的分子标记为一切可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，包括但不限于基于分子杂交的分子标记，如RFLP、MinisatelliteDNA；基于PCR技术的分子标记，如RAPD、STS、SSR和SCAR；基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记；基于DNA芯片技术的分子标记，如SNP；基于EST数据库发展的分析标记技术等。本发明提供的分子标记可以用于基因组作图、和基因定位研究、基于图谱的基因克隆、物种亲缘关系和系统分类等。
需要说明的是，本发明所称的探针是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)，例如Taqman-MGB探针。
需要说明的是，本发明所称的试剂盒为本领域常规使用的任意一种包含检测或实验所用试剂，便于操作人员能够摆脱繁重的试剂配制及优化过程的盒子。在本发明的一个实施例中，其中包含有扩增本发明提供的位点信息的引物、检测本发明提供的位点信息的分子标记或探针或基因芯片，还包括扩增所用的酶和缓冲液，或者还检测用的荧光标记。
实施例1 耳部性状SNP位点组合的获得
1、绵羊个体的选择
为了实现国内外绵羊品种的更加全面的覆盖，本发明对遍布于亚洲、欧洲、非洲和中东的248个绵羊个体进行遗传信息采集，其中包括16个野羊亚洲摩弗伦品种、172个地方品种和60个培育品种，具体涉及到中国山东的小尾寒羊、泗水裘皮羊、大尾寒羊、洼地绵羊，中国江苏的湖羊，中国宁夏的滩羊，中国新疆的阿勒泰羊、巴什拜羊、杜泊绵羊、中国美利奴羊（细毛羊）、中国美利奴羊（超细毛羊）、萨福克羊、策勒黑羊、多浪羊、Waggir Sheep羊，芬兰的芬兰羊（Finnsheep）、荷兰的威桑岛羊（Ouessant）、设德兰羊（Shetland）、索洛格诺羊（Solognote）、哥特兰岛羊（Gotland）、德伦特希思羊（Drente Heathen），埃塞俄比亚的邦加羊（Bonga Sheep）、阿法尔羊（Afar Sheep），尼日尔的姆博罗罗羊（Mbororo Sheep），尼日利亚的扬卡羊（Yankasa Sheep），非洲乍得的西非矮羊（West African Dwarf Sheep）、乌达羊（Uda Sheep），非洲布基纳法索的贾隆凯羊（Djallonké Sheep）、摩西羊（Mossi Sheep）、萨赫勒羊（Sahelian Sheep），西非喀麦隆的喀麦隆羊（Cameroon Sheep），伊拉克的阿华西绵羊（Awassi Sheep）、哈姆达尼羊（Hamdani Sheep），阿塞拜疆的马泽克羊（Mazekh Sheep），伊朗的灰设拉子羊（Grey-Shiraz Sheep）、盖泽尔羊（Ghezel Sheep）、阿夫沙里羊（AfshariSheep）、沙尔羊（Shal Sheep）、马奎羊（Makui Sheep）、莫哈尼羊（Moghani Sheep），巴基斯坦的卡拉库尔羊（Karakul Sheep），伊朗舍赫尔科德的亚洲摩弗伦（Asiatic mouflon）。
2、绵羊全基因的总SNP集合的获得
采用本领域常规方法采集步骤1中绵羊个体中载有遗传信息的样本，该样本包括但不限于血液、细胞、组织、皮肤、毛发、排泄物等。提取样本中的遗传信息（例如DNA）进行高深度测序，利用SAMtools和GATK两种方式与2015 年发布的绵羊4.0 参考基因组（从NCBI获得）进行对比，并将两种方式获得共同结果形成一个SNP集合，共计2836万个SNP位点，作为绵羊全基因的总SNP集合。
需要说明的是，本发明所称的遗传信息（genetic information） 是指生物为复制与自己相同的东西、由亲代传递给子代、或各细胞每次分裂时由细胞传递给细胞的信息。
需要说明的是，提取样本中的遗传信息（例如DNA）进行高深度测序可以由生物公司完成，例如华大基因公司，illumina公司等，高深度测序方法采用本领域常规方法或生物公司的方法，在本发明的一个实施例中，采用平均测序深度为~25.7×，应用重测序分析流程进行高深度测序。
3、候选基因及所在功能区域的筛选
3.1 对不同耳部大小的绵羊遗传信息样本处理
筛选不同耳部大小的绵羊品种，对相应的遗传信息样本进行分组，在本发明的一个实施例中，本发明将瓦格吉尔羊Vs 设德兰羊（WGR versus SHE）为一组、将多浪羊Vs 设德兰羊（DLS versus SHE）为一组。
3.2 对分组后不同耳部大小的绵羊遗传信息的处理
应用XP-CLR扫荡每个绵羊组之间的多基因座等位基因频率差异，扫描出与耳部性状相关的功能区域（扫描得到的曼哈顿图如图1-2所示，同时利用π ratio（即π值）挖掘每组中的绵羊品种中与耳部性状相关的功能区域，然后取两种结果的交集，筛选出耳部性状相关的功能区域。
参照已公开的基因研究成果对区域内的基因进行筛选，最终确定8个与耳部性状相关的、功能十分确定的候选基因LEMD3、MSRB3、SEC24D、TSHR、SMPX、DICER1、SLC26A4、TCF3，进而通过perl脚本确定上述候选基因对应的功能区域。
4、耳部大小的SNP位点组合的获得
利用bedtools在总的SNP集合中寻找步骤3中确定的候选基因所在功能区域对应的SNP位点，得到与LEMD3、MSRB3、SEC24D、TSHR、SMPX、DICER1、SLC26A4、TCF3共8个耳部性状相关的功能基因相关联，且仅包含1920个snp位点的耳部性状位点组合。
实施例2 将耳部性状SNP位点组合用于制备引物组合及探针组合
本领域技术人员根据本发明提供的耳部性状SNP位点组合中的每一个位点的序列信息设计引物，并将设计得到的引物利进行二级结构评估和Tm值评估，最终获得特异性好、灵敏度高，并且可以在同一反应条件下实现检测目的的引物。
其中，二级结构评估及Tm值评估可以采用本领域常用的任一一种方式进行，例如采用DNA folding form评估其二级结构，具体参见
Figure 762108DEST_PATH_IMAGE009
，然后采用软件RaW-Probe评估其Tm值。
上述方法均为常规方法，根据本申请提供的耳部大小的SNP位点组合中的位点信息，不再需要付出创造性劳动的情况下就能获得，因此，根据本发明提供的SNP位点组合获得的引物也属于本发明的保护范围。
同样的，利用本发明提供的SNP位点组合制备探针，例如tanqman探针也属于本发明的保护范围。
实施例3 将分析耳部大小的SNP位点组合用于制备基因芯片
本发明的SNP基因芯片是采用常规方法将实施例2获得的引物或探针固定在聚合物基片上，例如尼龙膜、硝酸纤维膜、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等，或将探针固定在玻璃板上，或在玻璃等硬质表面上直接合成实施例2获得的引物或探针，本申请的SNP基因芯片的使用方法与常规方法相同。
需要说明的是，本领域技术人员可以采用任一一种方式制备检测绵羊耳部大小的SNP基因芯片，同样也可以委托生物公司制备，但是基于本申请提供的耳部大小分析的SNP位点组合制备的SNP基因芯片均属于本发明的保护范围。
实施例4 绵羊耳部性状的分析试剂盒
本申请的提供的耳部大小分析的SNP检测试剂盒包括基于实施例1获得的SNP位点组合获得的引物或探针或基因芯片。根据使用类型的不同，还包括相应的检测试剂，例如当基于实施例1获得的SNP位点组合获得的为Taqman探针时，还包括荧光定量PCR反应常规使用的缓冲液、连接酶、AceQUniversal U+ Probe Master Mix V2，TaqMan Probe等。
本领域技术人员根据使用方式的不同配置不同的绵羊耳部性状检测的SNP试剂盒，但是基于本申请提供的耳部性状SNP位点组合配置的绵羊耳部性状SNP检测试剂盒均属于本发明的保护范围。
实施例5 绵羊耳部性状的检测
基于本申请的实施例1提供的分析绵羊耳部大小的SNP位点组合对已知耳朵大小的绵羊进行耳部大小的检测，根据检测结果，并结合已知的耳朵大小，判断检测的准确性，具体为：
采用常规方法采集绵羊的外周血，并提取其中的全基因组DNA，获得全基因组DNA样本；
采用常规方法根据本发明提供的SNP位点组合中的位点信息设计基因芯片，对绵羊的全基因组DNA样本进行检测，获得绵羊中每个位点的分型结果（即每个位点是否为纯合子、杂合子、突变型纯合子或碱基缺失的结果），计算每个位点的分型结果的频率值，并与群体阈值进行比较，比较结果显示，基因检测结果与相应的绵羊耳部表型一致。
需要说明的是，本申请的所述群体阈值是通过对肥臀尾群体，长耳部性状群体、短耳部性状群体以及瘦尾群体进行分析获得，方法同上。
本申请对大耳绵羊群体，小耳绵羊群体进行分析的判定结果进行了显著性检验（独立样本曼惠特尼U检验），结果如图3所示，根据图中结果可以看出，P<0.01，差异极显著，可见采用本发明方法进行判定的结果具有准确性和有效性。
工业应用
本领域技术人员基于本申请提供的仅由1920个SNP位点组成的分析绵羊耳部大小的SNP位点组合可以制成的分析绵羊耳部大小的SNP探针组合及基因芯片、试剂盒，能够从基因组水平上对绵羊个体的耳部大小进行分析，遗传信息评估、品种筛选、品种鉴定，控制育种进程，还能应用于绵羊品种溯源、绵羊系谱重构、种质资源保护和种质资源改良。
以上所述仅为帮助理解本发明的优选实例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，在不违背本发明的思想下，本领域技术人员在此基础上对本发明作出的各种改动或者修改，同样应属于本发明的范围。

Claims (7)

1.1920个SNP位点组合在分析绵羊耳部大小的应用，所述1920个SNP位点组合的物理位置如表1所示，其物理位置基于绵羊 v4.0基因组序列比对确定。
2.分析绵羊耳部大小的方法，将待测绵羊的基因组DNA的1920个SNP位点基因型与对照绵羊基因组DNA的所述1920个SNP位点基因型进行比较；
其中，所述1920个SNP位点为权利要求1所述的1920个SNP位点。
3.分析绵羊耳部大小的分子探针组合，所述分子探针组合检测待测样品中如表1所示的SNP位点组合，所述表1中的位点组合的物理位置信息基于绵羊 v4.0基因组序列比对确定。
4.分析绵羊耳部大小的基因芯片，所述基因芯片负载有权利要求3所述的分子探针组合。
5.分析绵羊耳部大小的试剂盒，其具有权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片。
6.分析绵羊耳部大小的方法，应用权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片或权利要求5所述的试剂盒对待测样品进行检测。
7.权利要求3所述的分子探针组合或权利要求4所述的基因芯片或权利要求5所述的试剂盒具有如下任一所述的用途：
（1）在绵羊耳部大小评价中的应用；
（2）在绵羊品种筛选的应用；
（3）在绵羊品种鉴定中的应用；
（4）在绵羊品种溯源中的应用；
（5）在绵羊育种中的应用；
（6）在种质资源保护中的应用；
（7）在种质资源改良中的应用；
（8）在绵羊系谱重构中的应用。
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