CN106987585B - 一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法，包括如下步骤：1)cfDNA提取；2)去磷酸化；3)变性为单链cfDNA；4)和3’端单链DNA接头进行分子间的单链连接；5)延伸：所得的单链连接产物为模板，3’端接头已知序列设计引物进行延伸；6)获得的双链DNA产物和5’端双链DNA接头进行分子间的双链连接；7)PCR扩增：以获得的完整双链DNA接头连接产物为模板，以3’端和5’端两端接头已知序列为正反向引物，进行PCR扩增；8)用磁珠法进行PCR产物纯化，回收文库。本发明原cfDNA富集效率高，可有效的检测双链、单链和受损伤的DNA。

Description

一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法

技术领域

本发明涉及二代基因测序文库构建领域，具体涉及一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法。

背景技术

cfDNA(cell-free circulating DNA)一般指存在于血浆、尿液等体液中的DNA碎片，由双链DNA、单链DNA和受损伤的DNA组成，它们在肿瘤监控、无创产前和器官移植等领域有广泛的应用。

现在的cfDNA二代测序技术，绝大部分用常规的双链DNA文库构建的方法，只能够检测没有受损伤的双链DNA，并且为了除去接头二聚体污染，一般还需要用磁珠法进行片段选择的步骤，这导致一些小片段的双链DNA、受损伤的双链DNA和单链DNA的信息丢失。特别在一些转录活跃的基因组区域，因为缺乏核小体的有效保护，这部分的cfDNA一般是一些小片段DNA，无法有效的通过现有的DNA双链建库进行检测，而这些基因组区域往往发挥着重要的功能，是我们重点的研究对象和关注部分^[1]。

对于某些低丰度的DNA的检测，以这些额外单链DNA作为模板的话可以显著增加目标DNA的模板量，有利于最终目的DNA捕获。

Marie-Theres Gansauge and Matthias Meyer为了检测古生物DNA，发明了一种单链DNA建库。该方法在单链模板和单链接头的连接步骤，使用的为CircLigase II。该酶的连接效率为较低，需要较长的连接时间，并且需要生物素标记的磁珠，成本高，且步骤复杂，模板DNA损失也大，造成原DNA的富集效率低^[2]。

参考文献：

[1]Snyder MW,Kircher M,Hill AJ,Daza RM,Shendure J.Cell-free DNAcomprises an in vivo nucleosome footprint that informs its tissues-of-originCell.2016；164:57–68.doi:10.1016/j.cell.2015.11.05.

[2]GansaugeM.-T.&Meyer M.Single-stranded DNA library preparation forthe sequencing of ancient or damaged DNA.Nat.Protoc.8,737–748(2013).

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提出一种针对血浆游离DNA进行独特的单链建库的二代测序文库构建方法,即一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法,该方法可以在单管中完成整个建库过程，简单、高效，防止样品间的污染；并且原cfDNA富集效率高，能够同时有效检测双链、单链和受损伤的cfDNA。

所采用的技术方案为：

一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法，包括如下步骤：

1)cfDNA提取；

2)提取的cfDNA在磷酸酶的作用下去磷酸化；

3)变性处理：95±2℃高温处理，将原来双链的cfDNA变性为单链cfDNA；

4)3’端接头连接：在步骤3)所得的单链cfDNA产物和3’端单链DNA接头进行分子间的单链连接；

5)延伸：在步骤4)所得的单链连接产物为模板，3’端接头已知序列设计引物进行延伸，获得双链DNA产物；

6)5’端接头连接：在步骤5)获得的双链DNA产物和5’端双链DNA接头进行分子间的双链连接；

7)PCR扩增：以步骤6)获得的完整双链DNA接头连接产物为模板，以3’端和5’端两端接头已知序列为正反向引物，进行PCR扩增；

8)用磁珠法进行PCR产物纯化，回收文库。

优选地，步骤2)中，去磷酸化反应体系包括：SAP 1μl；SAP缓冲液2μl；cfDNA xμl，0＜x＜20；ddH2O加至总20μl；反应条件为37℃反应30-60min，然后65℃反应15-30min进行磷酸酶的灭活。

优选地，步骤3)中，连接反应的连接酶是TS2126RNA ligase 1。

该连接酶可优选为从Thermus scotoductus bacteriophage TS2126中分离纯化的热稳定性的RNA ligase 1，具有非常好的单链DNA连接活性，连接效率达50％以上。可参考文献[3]:

[3]Blondal T.,Thorisdottir A.,Unnsteinsdottir U.,Hjorleifsdottir S.,Aevarsson A.,Ernstsson S.,Fridjonsson O.H.,Skirnisdottir S.,Wheat J.O.,Hermannsdottir A.G.,Sigurdsson S.T.,Hreggvidsson G.O.,Smith A.V.,KristjanssonJ.K.(2005)Isolation and characterization of a thermostable RNA ligase 1from aThermus scotoductus bacteriophage TS2126with good single-stranded DNAligation properties.Nucleic Acids Res.33,135–142。

优选地，步骤3)中，连接反应体系包括：单链cfDNA产物，1-5倍摩尔浓度的3’端接头量，5-15Vol％的PEG6000，25mM ATP，2.5mM MnCl₂，RNA ligase 1缓冲液，0.1mg/ml ofTS2126RNA ligase 1；连接反应的反应条件为65℃反应1-2.5h。

优选地，步骤3)中，3’端接头序列为

5'PHO-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC[i7]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'ddC,该接头序列5'端磷酸化修饰，3'端双脱氧修饰。

优选地，步骤6)中，连接反应的连接酶为T4 DNA ligase。

优选地，步骤6)中，5’端接头的上链序列为

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

下链序列则是上链序列的反向互补，上链序列的T是突出末端。

本发明的有益效果在于：

针对血浆游离DNA二代测序文库构建时，有效回收单链和受损伤的模板DNA，进行独特的单链建库的二代测序文库构建：cfDNA是存在于血浆、尿液等体液中的DNA碎片，由双链DNA、单链DNA和受损伤的DNA组成，现在的cfDNA二代测序技术，绝大部分用常规的双链DNA文库构建的方法，只能够检测没有受损伤的双链DNA，本发明的方法通过单链建库的方法成功实现单链和受损伤的cfDNA的捕获富集。

本发明是一种简单有效的单链DNA建库技术，和常规单链建库相比，本发明步骤简单，建库时间短，建库成本低，并且原cfDNA富集效率高，可有效的检测双链、单链和受损伤的DNA。

附图说明

图1为本发明单链建库流程原理和过程示意图。图中denature是变性处理；3’adapter ligaiton是3’端接头连接；extension是延伸；5’adapter ligaiton是5’端接头连接；primer是引物。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。除非特别说明，下面实施例中所使用的仪器、设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。

术语解释：

bufeer为缓冲液；to为加至总含量；SAP为Super Absorbent Polymer，高吸水树脂；x的大小为0<x<20；ligase为连接酶；PEG6000为聚乙二醇6000；ATP为Adenosinetriphosphate，三磷酸腺苷。

参见图1所示，一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法，包括如下步骤：

1.cfDNA去磷酸化处理。反应体系如下：

SAP buffer 2μl

cfDNA xμl

ddH₂O to 20μl

37℃反应30-60min进行去磷酸化反应，然后65℃反应15-30min进行磷酸酶的灭活。

2.上步去磷酸化的cfDNA产物进行高温变性，成为单链:

95℃反应5min。

3. 3’端接头和上步cfDNA单链产物连接。该连接为两个单链DNA分子之间的连接。

3-1 3’端接头序列为

5'PHO-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC[i7]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'ddC,该接头序列5'端磷酸化修饰，3'短双脱氧修饰，防止在连接反应中接头的自连和cfDNA分子的反向连接。

3-2该连接反应的连接酶是TS2126 RNA ligase 1，该酶分离自噬菌体TS2126株系，和T4 RNA ligase 1相比，拥有更高的分子间单链DNA连接活性，连接效率可达50％以上。

该连接反应体系包括：单链cfDNA产物，1-5倍摩尔浓度的3’端接头量，5-15Vol％的PEG6000，25mM ATP，2.5mM MnCl₂，RNA ligase 1bufffer，0.1mg/ml of TS2126RNAligase 1。

65℃反应1-2.5h。需要注意的是ATP浓度过高会抑制反应，Mn²⁺对于单链DNA分子间的反应效率非常重要。

4.延伸反应。以单链连接产物为模板，3’端接头已知序列设计引物进行延伸，获得双链DNA产物。

4-1引物序列为：CAAGCAGAAGACGGCATACGA

4-2反应体系包括：上步单链连接产物，引物，DNA聚合酶buffer，DNA聚合酶。

4-3反应条件：65℃反应5-15min。

5. 5’端接头连接。该反应是上步反应双链DNA产物和双链DNA 5’端接头之间进行的dsDNA(double-stranded DNA，双链DNA)分子间连接。

5-1 5’端接头序列为：上链序列为

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

下链序列是上链序列的反向互补，特殊的是，上链序列的最后的T是突出末端。

5-2连接反应体系包括：上步双链DNA产物，5’端接头的摩尔量约是该产物的20倍，T4 DNA Ligase，T4 DNA Ligase buffer。

5-3反应条件：20℃反应20min.

6.PCR扩增。以上步获得的完整双链DNA接头连接产物为模板，以3’端和5’端两端接头已知序列为正反向引物，进行PCR扩增。

6-1两引物序列：

P5 primer：AATGATACGGCGACCACCGA

P7 primer：CAAGCAGAAGACGGCATACGA

6-2反应体系包括：上步反应产物，两PCR引物，高保真DNA聚合酶，DNA聚合酶buffer。

6-3反应条件：98℃变性1min；98℃，15s，60℃，30s，72℃，30s。该过程循环反应8-14cycles。72℃，1min。

7.磁珠法进行PCR产物纯化，得出目的产物，回收文库。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。这些简单推演或替换应当也属于本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)cfDNA提取；

2)提取的cfDNA在磷酸酶的作用下去磷酸化；去磷酸化反应体系包括：SAP1μl；SAP缓冲液2μl；cfDNAxμl，0＜x＜20；ddH₂O加至总20μl；反应条件为37℃反应30-60min，然后65℃反应15-30min进行磷酸酶的灭活；

3)变性处理：95±2℃高温处理，将原来双链的cfDNA变性为单链cfDNA；

4)3’端接头连接：在步骤3)所得的单链cfDNA产物和3’端单链DNA接头进行分子间的单链连接；连接反应的连接酶是TS2126RNA ligase 1；连接反应体系包括：单链cfDNA产物，1-5倍摩尔浓度的3’端接头量，5-15Vol％的PEG6000，25mM ATP，2.5mM MnCl₂，RNA ligase 1缓冲液，0.1mg/ml的TS2126 RNA ligase1；连接反应的反应条件为65℃反应1-2.5h；3’端接头序列5'PHO-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC[i7]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'ddC,该接头序列5'端磷酸化修饰，3'端双脱氧修饰；

5)延伸：在步骤4)所得的单链连接产物为模板，3’端接头已知序列设计引物进行延伸，获得双链DNA产物；

6)5’端接头连接：在步骤5)获得的双链DNA产物和5’端双链DNA接头进行分子间的双链连接；连接反应的连接酶为T4DNA ligase；5’端接头的上链序列为

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

下链序列则是上链序列的反向互补，上链序列的T是突出末端；

7)PCR扩增：以步骤6)获得的完整双链DNA接头连接产物为模板，以3’端和5’端两端接头已知序列为正反向引物，进行PCR扩增；

8)用磁珠法进行PCR产物纯化，回收文库。