CN106967767B - 一种β-胸苷的合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种β‑胸苷的合成方法，采用酶工程逆向合成胸苷，使用葡萄糖脱氢酶、尿苷激酶、乌贼酸激酶、核糖核苷二磷酸还原酶、胸苷酸激酶以及胸苷激酶，以5‑甲基尿苷为原料，经过两个磷酸化步骤产生核苷酸，然后转化为脱氧核苷酸，再经两步脱磷酸化产生胸苷。本发明公开了一种β‑胸苷的合成方法，成本大大降低，缩短生产周期，减少工业废物，无毒环保。

Description

一种β-胸苷的合成方法
技术领域
本发明涉及化学合成技术领域，尤其涉及一种β-胸苷的合成方法。
背景技术
β-胸苷(β-Thymidine)在抗病毒药物的生产和生物医学的应用中有着重要的作用，β-胸苷是合成抗爱滋病药(AIDS)齐多夫定(Zidovudine)和司它夫定(Stavudine)的主要原料，无天然产物存在，其结构如下式所示：
目前β-胸苷的合成方法主要采用化学合成法，通过溴代反应、还原反应以及皂化反应制得，合成工艺如下：
该化学合成方法的成本较高，会产生较多的工业废品，废品中的溴和镍废物难以处理。
除了化学合成法以外，还可以通过酵母发酵法生产，发酵法生产β-胸苷虽然原辅料成本下降很多，但必须大批量连续生产，而产生的发酵液废水处理成本也居高不下。据预测，到2019年全球胸苷市场总值将达到1.9亿美元，因此提供一种制备成本低，适用于工业化生产的β-胸苷的制备方法，具有重大的经济意义。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种β-胸苷的合成方法，通过胸苷专用酶催化剂的构建和酶工程逆向合成胸苷路线的设计，能有效缩短化学反应步骤，去除高压氢化等危险工艺，减少使用溶剂5种以上。其方法步骤如下：
S1：5-甲基尿苷在尿苷激酶的作用下生成5-甲基尿苷单磷酸；
S2：5-甲基尿苷单磷酸在乌贼酸激酶的作用下，生成5-甲基尿苷二磷酸；
S3：5-甲基尿苷二磷酸在核糖核苷二磷酸还原酶的作用下生成胸苷二磷酸；
S4：胸苷二磷酸在胸苷酸激酶的作用下生成胸苷单磷酸；
S5：胸苷单磷酸在胸苷激酶的作用下生成β-胸苷。
本发明提供的一种β-胸苷的合成方法，在一个反应内使用5种酶，促进5-甲基尿苷转化为胸苷，研究利用两个磷酸化步骤产生核苷酸，然后使用核糖核苷酸还原酶(RNR)催化核苷酸转化为脱氧核苷酸，再经两步脱磷酸化产生胸苷。反应流程如下：
(1)5-甲基尿苷生成5-甲基尿苷单磷酸：
(2)5-甲基尿苷单磷酸生成5-甲基尿苷二磷酸：
(3)5-甲基尿苷二磷酸生成胸苷二磷酸：
(4)胸苷二磷酸化生成胸苷单磷酸：
(5)胸苷单磷酸化生成胸苷：
工作原理：
本发明采用酶工程增加稳定性和活动性逆向合成胸苷，反应的推动力是从葡萄糖氧化成葡萄糖酸内酯和消耗ADP。两个ATP消耗步骤(S1&S2)与两个ATP产生步骤(S4&S5)相结合。总体反应是ATP中性---不消耗ATP，由于ATP/ADP步骤是循环再生的，并且葡萄糖脱氢酶(GDH)催化循环NADH。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果在于：
1、本发明提供的一种β-胸苷的合成方法，在同一反应器中一锅端完成全部反应，操作简单；所需大部分成本是酶、葡萄糖和5-甲基尿苷；另外杂质是磷酸化合物，分离容易，大大降低成本，缩短生产步骤，减少工业废物，无毒和环保。
2、通过胸苷专用酶催化剂的构建和酶工程逆向合成胸苷路线的设计，能有效缩短化学反应步骤，去除高压氢化等危险工艺，减少使用溶剂5种以上，反应过程产生的废水减少30％以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
原料来源：5-甲基尿苷，连云港笃翔化工有限公司；80-90％纯度三磷酸腺苷(ATP)、80-90％纯度黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、MgSO4、葡萄糖(Glucose)、HCl、NaOH、NaCl、磷酸盐缓冲液，来自任何商业来源。
实施例1
将1eq 5-甲基尿苷，0.1eq三磷酸腺苷(ATP)、0.1eq NADPH，酶浓度黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、酶浓度MgSO4，葡萄糖脱氢酶，尿苷激酶，乌贼酸激酶，核糖核苷二磷酸还原酶，胸苷酸激酶和胸苷激酶加入磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含10mMNaCl，使用HCl和Na0H保持pH值为6，反应温度为20℃，反应时间为20h。
与常用化学合成法相比，反应过程产生的废水减少33％。
实施例2
将1eq 5-甲基尿苷，0.1eq三磷酸腺苷(ATP)、0.1eq NADPH，酶浓度黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、酶浓度MgSO4，葡萄糖脱氢酶，尿苷激酶，乌贼酸激酶，核糖核苷二磷酸还原酶，胸苷酸激酶和胸苷激酶加入磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含10mMNaCl，使用HCl和NaOH保持pH值为7，反应温度为45℃，反应时间为30h。
与常用化学合成法相比，反应过程产生的废水减少31％。
实施例3
将1eq 5-甲基尿苷，0.1eq三磷酸腺苷(ATP)、0.1eq NADPH，酶浓度黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、酶浓度MgSO4，葡萄糖脱氢酶，尿苷激酶，乌贼酸激酶，核糖核苷二磷酸还原酶，胸苷酸激酶和胸苷激酶加入磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含10mMNaCl，使用HCl和NaOH保持pH值为8，反应温度为30℃，反应时间为37h。
与常用化学合成法相比，反应过程产生的废水减少38％。
实施例4
将1eq 5-甲基尿苷，0.1eq三磷酸腺苷(ATP)、0.1eq NADPH，酶浓度黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、酶浓度MgSO4，葡萄糖脱氢酶，尿苷激酶，乌贼酸激酶，核糖核苷二磷酸还原酶，胸苷酸激酶和胸苷激酶加入磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含10mMNaCl，使用HCl和NaOH保持pH值为7，反应温度为25℃，反应时间为10h。
与常用化学合成法相比，反应过程产生的废水减少42％。
实施例5
将1eq 5-甲基尿苷，0.1eq三磷酸腺苷(ATP)、0.1eq NADPH，酶浓度黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、酶浓度MgSO4，葡萄糖脱氢酶，尿苷激酶，乌贼酸激酶，核糖核苷二磷酸还原酶，胸苷酸激酶和胸苷激酶加入磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含10mMNaCl，使用HCl和NaOH保持pH值为9，反应温度为35℃，反应时间为40h。
与常用化学合成法相比，反应过程产生的废水减少36％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种β-胸苷的合成方法，其特征在于，方法步骤如下：
S1:5-甲基尿苷在尿苷激酶的作用下生成5-甲基尿苷单磷酸；
S2:5-甲基尿苷单磷酸在乌贼酸激酶的作用下,生成5-甲基尿苷二磷酸；
S3:5-甲基尿苷二磷酸在核糖核苷二磷酸还原酶的作用下生成胸苷二磷酸；使用葡萄糖脱氢酶催化循环；
S4:胸苷二磷酸在胸苷酸激酶的作用下生成胸苷单磷酸；
S5：胸苷单磷酸在胸苷激酶的作用下生成β-胸苷。
2.根据权利要求1所述的一种β-胸苷的合成方法，其特征在于，所述S1-S4中反应温度为25-45℃。
3.根据权利要求1所述的一种β-胸苷的合成方法，其特征在于，所述S1-S4中pH为6-9。
4.根据权利要求1所述的一种β-胸苷的合成方法，其特征在于，所述S1-S4的反应时间为10-40h。
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