CN106957912B - 预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的荧光探针组和检测试剂 - Google Patents
预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的荧光探针组和检测试剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106957912B CN106957912B CN201710182878.5A CN201710182878A CN106957912B CN 106957912 B CN106957912 B CN 106957912B CN 201710182878 A CN201710182878 A CN 201710182878A CN 106957912 B CN106957912 B CN 106957912B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- probe
- curative effect
- gene
- primer
- atic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的探针组和检测试剂,探针组包括:毒性基因探针组包括识别SLC19A1‑rs1131596、GGH‑rs1800909、ATIC‑rs2372536的探针;增强疗效基因探针组包括识别ABCB1 rs1045642、TYMS‑rs2853542、ATIC‑rs4673993的探针;降低疗效基因探针组包括识别FPGS‑rs1054774、DHFR‑rs408626、MTHFR‑rs1801131的探针。本发明的探针组和试剂盒可在用药前通过基因检测,判断出病人大致的MTX用药类型,在临床中根据检测结果调整剂量或更换药物,在提高疗效的同时尽可能地降低药物的毒性损伤。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于预测治疗效果的引物组和检测试剂,特别涉及预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的探针组和检测试剂。
背景技术
风湿关节炎(RA)是一种以慢性破坏性关节病变为特征的系统性自身免疫性疾病。2006年进行的第二次全国残疾人抽样调查中,关节病在导致肢体残疾的21类病因中排第2位(20.1%),仅次于脑血管病(20.6%),而远高于外伤、交通事故等原因造成的残疾。而且,在女性致残者,关节病是首要的致残疾病,占总人数的27%。在这些致残性关节病中,79.4%为RA致残。因此,RA是我国的临床主要致残性疾病之一,并由此造成了严重的家庭及社会负担。提高RA诊治水平,最大限度降低病人致残率是国家亟待解决的重大健康问题。
RA的发病过程可以分为三个阶段:(1)自身免疫启动环节,即在遗传背景下自身抗原对病人致病性免疫反应的驱动;(2)异常免疫应答阶段,即自身反应性T、B细胞及一系列免疫细胞在抗原刺激下活化,引起致病性免疫反应的过程;炎症及组织破坏阶段,即免疫细胞活化后通过一系列炎性细胞因子、自身抗体及炎症介质等致炎因子的作用,导致关节滑膜炎症、软骨和骨破坏的过程。尽管国内外学者针对这一发病过程已经进行了大量研究,但目前仍有一系列与本病的发病机制及干预策略相关的重要问题未得到解决,因此,RA的治疗尚缺乏特异性的治疗方法,免疫抑制剂和生物制剂为主的慢作用药物(DMARDs)仍然是目前治疗RA的主要药物。而近二十年的临床实践表明,在这些DMARDs中,甲氨蝶呤(MTX)是治疗RA的最有效药物,被认为是RA的基本治疗药物,MTX通过抑制叶酸、腺苷和从头生成的核苷酸合成途径而产生疗效。不论是单用或与其它DMARDs药联合使用,即使新的生物制剂治疗的出现,MTX仍以它的低价、广泛使用和联合用药而发挥着中心作用。然而,仅有约45%-65%的病人有良好的临床反应,约30%的病人因不良反应而中断了治疗。MTX的副作用临床上主要表现为胃肠道反应、骨髓抑制、药物性肝炎、肾脏损害、脱发及皮炎等,不良反应只能在相关的症状出现后或者通过相关的血液尿液检查才能得出结论,指标包括白细胞下降、ALT升高、蛋白尿等,但阳性结果也意味着病人机体因用药而造成了不可逆损伤。因此,如何更加精准地使用MTX,以获得更好的疗效和更小的不良反应,是目前风湿病学界亟需解决的紧迫课题。
个体基因遗传差异是药物疗效和不良反应的重要原因,基因多态性会对药物代谢产生很明显的影响,与药物效应及个体易感性紧密联系。通过对病人的基因位点进行检测,能进一步确定对特定药物具有很强敏感性或抵抗性的患病人群,从而指导临床针对不同个体实施个性化方案,使病人既能获得最佳治疗效果,又能避免药物的不良反应,达到个体化用药的目的。近十多年来的大量研究发现,位于MTX细胞内作用途径的基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)可用于预测MTX的疗效和副作用。目前已发现近20种与MTX疗效和不良反应相关的SNP,如SLC19A1、RFC180A、ABCB1、SLCO1B1 、COMTval158met 、GGH、AMPD1 34C、FPGS、SLC46A1 、DHFR、ATIC T675C 、MTHFR、TYMS1494、TYMS、FPGS rs10106 、ATIC、ABCB1、IL-6、FCGR3A等均与MTX的毒性与疗效相关。因此,通过检测相关基因的SNP对临床上更合理地使用MTX具有重要的临床价值和意义。
目前国外有不同的实验室通过文献报道以上单一基因与MTX疗效或毒性显著相关,检测方法为传统的PCR-RFLP及第一代测序,每次只能检测一个基因的一个多态位点,国内尚无此类MTX疗效或毒性文献报道,更无相关商品试剂盒面世。
现有检测SNP效果最佳的方法为基因测序法,经典的DNA测序平台目前主要为Sanger测序,原理是双脱氧链终止法,它可以把一段长约1000bp的基因序列的每个碱基都测定出来,被公认为检测SNP或突变的金标准,方法准确,但缺点是效率比较低、耗时,一次只能检测一个基因位点,检测时间需12小时左右。
发明内容
本发明的目的在于提供预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的探针组和检测试剂。
本发明所采取的技术方案是:
用于预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的探针组,包括毒性基因探针组、增强疗效基因探针组和降低疗效基因探针组,其中:
毒性基因探针组包括识别SLC19A1-rs1131596、GGH-rs1800909、ATIC-rs2372536的探针;
增强疗效基因探针组包括识别ABCB1 rs1045642、TYMS- rs2853542、ATIC-rs4673993的探针;
降低疗效基因探针组包括识别FPGS-rs1054774、DHFR-rs408626、MTHFR-rs1801131的探针。
作为上述探针组的进一步改进,识别SLC19A1-rs1131596、GGH-rs1800909、ATIC-rs2372536的探针序列分别为:
SLC19A1-rs1131596:CTTCCAGGCACAGTGTCACCTTCGTCCC(SEQ ID NO:1);
GGH-rs1800909:CCAGTCCGGGCTGCCTGCTGTGCGT(SEQ ID NO:2);
ATIC-rs2372536:TCCAGGTGTAAGTGTTGAGGAGGC(SEQ ID NO:3)。
作为上述探针组的进一步改进,识别ABCB1、TYMS-rs16430、ATIC-rs4673993的探针序列分别为:
ABCB1 rs1045642:CACAGGAAGAGATTGTGAGGGCAGC(SEQ ID NO:4);
TYMS- rs2853542:GCGCCACTTGGCCTGCCTCCGTC(SEQ ID NO:5);
ATIC-rs4673993:CTCAGTTTTTTATTCAGGAGCAGG(SEQ ID NO:6);
作为上述探针组的进一步改进,识别FPGS-rs1054774、DHFR-rs408626、MTHFR-rs1801131的探针序列分别为:
FPGS-rs1054774:TTGAGCATATTTATTAGGTGTGTC(SEQ ID NO:7);
DHFR-rs408626:ATCAGTAAGACTCTTCGACCACC(SEQ ID NO:8);
MTHFR-rs1801131:AGCTGACCAGTGAAGCAAGTGTCTTTG(SEQ ID NO:9)。
作为上述探针组的进一步改进,内标基因为GAPDH,对应的探针序列为GAPDH:TTCCTAGATTATTCTCTGGTAAATCA(SEQ ID NO:10)。
一种用于预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的试剂盒,包括质控品、针对相同基因的核酸扩增剂和多色荧光检测剂,多色荧光检测剂使用的荧光探针如上所述。
作为上述试剂盒的进一步改进,核酸扩增剂的引物对分别为:
1)SLC19A1-rs1131596:
上游引物:GGGGTAGGGAGGCCTGCAGACCAT(SEQ ID NO:11);
下游引物:GGGCACCATCCTGCTCAGGCCA(SEQ ID NO:12);
2)GGH-rs1800909:
上游引物:TTGAAAGGCGGCGGGAGGCGG(SEQ ID NO:13);
下游引物:GTCTAGACAGCTCGAGGCTC(SEQ ID NO:14);
3)ATIC-rs2372536:
上游引物:CAATCTCTATCCCTTTGTAAAG(SEQ ID NO:15);
下游引物:TTCTGACTTACCAATGTCAA(SEQ ID NO:16);
4)ABCB1 rs1045642:
上游引物:ACATTGCCTATGGAGACAAC(SEQ ID NO:17);
下游引物:TCGATGAAGGCATGTATGTTG(SEQ ID NO:18);
5)TYMS- rs2853542:
上游引物:ACCGCGCCACTTGGCCTGCC(SEQ ID NO:19);
下游引物:GGACGGAGGCAGGCGAAGT(SEQ ID NO:20);
6)ATIC-rs4673993:
上游引物:ATACTAGATGGTCTTCTGAAG(SEQ ID NO:21);
下游:GCCTCACTCTTCAATGACAC(SEQ ID NO:22);
7)FPGS-rs1054774:
上游引物:CACTGCAATTTCGATGGTCT(SEQ ID NO:23);
下游引物:CAGCTGTATTAAGTCCCGAA(SEQ ID NO:24);
8)DHFR-rs408626:
上游引物:TCTTCTAGTCACCCAATCCAG(SEQ ID NO:25);
下游引物:TGCGTCTTTTAACCTCCATCC(SEQ ID NO:26);
9)MTHFR-rs1801131:
上游引物:AAGGAGGAGCTGCTGAAGATG(SEQ ID NO:27);
下游引物:GTTCTCCCGAGAGGTAAAGA(SEQ ID NO:28);
10)GAPDH:
上游引物: GCTAGCTGGCCCGATTTCTC(SEQ ID NO:29);
下游引物: CACAGCCACCACACCTCTG(SEQ ID NO:30)。
作为上述试剂盒的进一步改进,不同的探针上标记有不同的荧光基团。
作为上述试剂盒的进一步改进,多色荧光检测剂由毒性基因检测池、增强疗效基因检测池和降低疗效基因检测池组成。
作为上述试剂盒的进一步改进,毒性基因检测池、增强疗效基因检测池和降低疗效基因检测池中探针的荧光标记组合分别为如下组合中的一个:
A:FAM 、VIC、TET、ROX、BHQ-1五种荧光,BHQ-1标记在探针的3’端,其余的分别标记在探针的5’端;;
B:REC、HEX、Texas Red、Cy5、BHQ-2五种荧光,BHQ-2标记在探针的3’端,其余的分别标记在探针的5’端;
C:FAM 、REC、HEX、ROX、BHQ-1五种荧光,BHQ-1标记在探针的3’端,其余的分别标记在探针的5’端。
本发明的有益效果是:
本发明的探针组和试剂盒可在用药前通过基因检测,判断出病人大致的MTX用药类型,在临床中根据基因检测结果调整剂量或更换药物,在提高疗效的同时尽可能地降低药物的毒性损伤。
发明人选择了50个类风湿关节炎病人,其中预测毒性基因与增强疗效基因均出现SNP阳性的病人为8例,在用药过程中剂量减少30%至50%不等,用药三个月后证明疗效明显且只有1例出现少量蛋白尿,有效地规避了不良反应;其中预测毒性基因SNP阴性但降低疗效基因阳性的病人11例,在用药过程中剂量增加30%至50%不等,用药三个月后证明疗效明显且只有2例出现轻度的腹泻和恶心、1例出现白细胞下降。说明本发明的探针组可以有效地指导临床用药,对病人进行个性化用药,减少毒副作用。
本发明通过精心选择三大类与MTX治疗关系明确的基因类型,每种基因类型包含三个基因,根据基因序列设计特异性引物及探针,探针通过多色荧光标记,组成三组基因检测池,共包含九个基因位点,检测在1个半小时内结束,通过荧光扩增曲线完成精确测定。
本发明创新性设计三个检测池,可在1个半小时内得到9个基因SNP结果,精确度和准确度都完全能满足临床要求,同时成本较低,每个临床样品检测的试剂成本可控制在30元以内。
具体实施方式
用于预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的探针组,包括毒性基因探针组、增强疗效基因探针组和降低疗效基因探针组,其中:
毒性基因探针组包括识别SLC19A1-rs1131596、GGH-rs1800909、ATIC-rs2372536的探针;
增强疗效基因探针组包括识别ABCB1 rs1045642、TYMS- rs2853542、ATIC-rs4673993的探针;
降低疗效基因探针组包括识别FPGS-rs1054774、DHFR-rs408626、MTHFR-rs1801131的探针。
发明人通过对大量的临床数据分析,对种类繁多的SNP位点进行筛选,最终得到上述9个SNP位点组合,从毒性基因、增强疗效基因和降低疗效基因3个方面全面入手,在尽可能减少SNP使用量的同时,很好地保证了甲氨蝶呤疗效及不良反应的效果。通过对上述SNP位点进行荧光实时分析,可以很好地指导甲氨蝶呤治疗RA时的用药。
根据荧光实时监测结果中三类基因(毒性基因、增强疗效基因和降低疗效基因)出现的阳性结果百分比(如毒性基因三个指标均为阳性,则阳性结果百分比表述为100%;如毒性基因两个指标为阳性,一个指标为阴性,则阳性结果百分比表述为67%,依次类推),作为药物剂量增减的依据,药物增减的剂量控制在30%至50%,在临床用药过程中定期检测毒副作用指标,同时做好疗效观察。
发明人选择了50个类风湿关节炎病人,其中:
预测毒性基因与增强疗效基因均出现SNP阳性的病人为8例,在用药过程中剂量减少30%至50%不等,用药三个月后显示疗效明显,且只有1例出现少量蛋白尿,有效地规避了不良反应;
预测毒性基因SNP阴性但降低疗效基因阳性的病人11例,在用药过程中剂量增加30%至50%不等,用药三个月后证明疗效明显且只有2例出现轻度的腹泻和恶心、1例出现白细胞下降。
说明本发明的探针组可以有效地指导临床用药,对病人进行个性化用药,减少毒副作用。
作为上述探针组的进一步改进,识别SLC19A1-rs1131596、GGH-rs1800909、ATIC-rs2372536的探针序列分别为:
SLC19A1-rs1131596:CTTCCAGGCACAGTGTCACCTTCGTCCC
GGH-rs1800909:CCAGTCCGGGCTGCCTGCTGTGCGT
ATIC-rs2372536:TCCAGGTGTAAGTGTTGAGGAGGC。
作为上述探针组的进一步改进,识别ABCB1、TYMS-rs16430、ATIC-rs4673993的探针序列分别为:
ABCB1 rs1045642:CACAGGAAGAGATTGTGAGGGCAGC
TYMS- rs2853542:GCGCCACTTGGCCTGCCTCCGTC
ATIC-rs4673993:CTCAGTTTTTTATTCAGGAGCAGG。
作为上述探针组的进一步改进,识别FPGS-rs1054774、DHFR-rs408626、MTHFR-rs1801131的探针序列分别为:
FPGS-rs1054774:TTGAGCATATTTATTAGGTGTGTC
DHFR-rs408626:ATCAGTAAGACTCTTCGACCACC
MTHFR-rs1801131:AGCTGACCAGTGAAGCAAGTGTCTTTG。
作为上述探针组的进一步改进,内标基因为GAPDH,对应的探针序列为GAPDH:TTCCTAGATTATTCTCTGGTAAATCA。
一种用于预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的试剂盒,包括质控品、针对相同基因的核酸扩增剂和多色荧光检测剂,多色荧光检测剂使用的荧光探针如上所述。
作为上述试剂盒的进一步改进,核酸扩增剂的引物对分别为:
1)SLC19A1-rs1131596:
上游引物:GGGGTAGGGAGGCCTGCAGACCAT
下游引物:GGGCACCATCCTGCTCAGGCCA
2)GGH-rs1800909:
上游引物:TTGAAAGGCGGCGGGAGGCGG
下游引物:GTCTAGACAGCTCGAGGCTC
3)ATIC-rs2372536:
上游引物:CAATCTCTATCCCTTTGTAAAG
下游引物:TTCTGACTTACCAATGTCAA
4)ABCB1 rs1045642:
上游引物:ACATTGCCTATGGAGACAAC
下游引物:TCGATGAAGGCATGTATGTTG
5)TYMS- rs2853542:
上游引物:ACCGCGCCACTTGGCCTGCC
下游引物:GGACGGAGGCAGGCGAAGT
6)ATIC-rs4673993:
上游引物:ATACTAGATGGTCTTCTGAAG
下游:GCCTCACTCTTCAATGACAC
7)FPGS-rs1054774:
上游引物:CACTGCAATTTCGATGGTCT
下游引物:CAGCTGTATTAAGTCCCGAA
8)DHFR-rs408626:
上游引物:TCTTCTAGTCACCCAATCCAG
下游引物:TGCGTCTTTTAACCTCCATCC
9)MTHFR-rs1801131:
上游引物:AAGGAGGAGCTGCTGAAGATG
下游引物:GTTCTCCCGAGAGGTAAAGA
10)GAPDH:
上游引物: GCTAGCTGGCCCGATTTCTC
下游引物: CACAGCCACCACACCTCTG。
作为上述试剂盒的进一步改进,不同的探针上标记有不同的荧光基团。
作为上述试剂盒的进一步改进,多色荧光检测剂由毒性基因检测池、增强疗效基因检测池和降低疗效基因检测池组成。
作为上述试剂盒的进一步改进,毒性基因检测池、增强疗效基因检测池和降低疗效基因检测池中探针的荧光标记组合分别为如下组合中的一个:
A:FAM 、VIC、TET、ROX、BHQ-1五种荧光,BHQ-1标记在探针的3’端,其余的分别标记在探针的5’端;;
B:REC、HEX、Texas Red、Cy5、BHQ-2五种荧光,BHQ-2标记在探针的3’端,其余的分别标记在探针的5’端;
C:FAM 、REC、HEX、ROX、BHQ-1五种荧光,BHQ-1标记在探针的3’端,其余的分别标记在探针的5’端。
上述荧光组合具有如下优点:
1)不同荧光基团均有自己特定的激发波长光谱,在设计时充分考虑到每种荧光基团的光谱范围,按照光谱错峰不重叠的原则,使每个检测池中四种荧光基团的光谱峰之间都有最佳的间隔,相互基团完全不影响各自的荧光激发;
2)影响荧光基团发光的另一个因素是缓冲体系中的各种离子会引起荧光基团最大吸收波长的位移及相应荧光峰的改变,这会导致仪器收集四种不同颜色的信号时不能得到稳定的信号源甚至引起荧光淬灭,从而造成结果的波动和改变。通过测试发现在离子强度达到正常配置10倍浓度时对荧光信号强度的干扰仅在5%以内,完全不影响信号采集及分析;
3)传统的荧光淬灭基团主要为TAMRA,本发明中荧光淬灭基团均选用BHQ系列,因为BHQ基团本身不产生荧光,吸收光谱覆盖范围非常广,从430nm一直到近红外,可淬灭的报告基团种类包括了绝大多数的荧光报告基团,在反应过程中无噪声干扰,背景干净,大大提高了反应的灵敏度和特异性。
下面结合实施例,进一步说明本发明的技术方案。
荧光检测试剂盒:包括阴性质控品、阳性质控品、荧光探针、反应缓冲液,其中:
荧光探针的具体序列如下:
SLC19A1-rs1131596:CTTCCAGGCACAGTGTCACCTTCGTCCC
GGH-rs1800909:CCAGTCCGGGCTGCCTGCTGTGCGT
ATIC-rs2372536:TCCAGGTGTAAGTGTTGAGGAGGC
ABCB1 rs1045642:CACAGGAAGAGATTGTGAGGGCAGC
TYMS- rs2853542:GCGCCACTTGGCCTGCCTCCGTC
ATIC-rs4673993:CTCAGTTTTTTATTCAGGAGCAGG
FPGS-rs1054774:TTGAGCATATTTATTAGGTGTGTC
DHFR-rs408626:ATCAGTAAGACTCTTCGACCACC
MTHFR-rs1801131:AGCTGACCAGTGAAGCAAGTGTCTTTG
GAPDH:TTCCTAGATTATTCTCTGGTAAATCA。
扩增引物如下:
1)SLC19A1-rs1131596:
上游引物:GGGGTAGGGAGGCCTGCAGACCAT
下游引物:GGGCACCATCCTGCTCAGGCCA
2)GGH-rs1800909:
上游引物:TTGAAAGGCGGCGGGAGGCGG
下游引物:GTCTAGACAGCTCGAGGCTC
3)ATIC-rs2372536:
上游引物:CAATCTCTATCCCTTTGTAAAG
下游引物:TTCTGACTTACCAATGTCAA
4)ABCB1 rs1045642:
上游引物:ACATTGCCTATGGAGACAAC
下游引物:TCGATGAAGGCATGTATGTTG
5)TYMS- rs2853542:
上游引物:ACCGCGCCACTTGGCCTGCC
下游引物:GGACGGAGGCAGGCGAAGT
6)ATIC-rs4673993:
上游引物:ATACTAGATGGTCTTCTGAAG
下游:GCCTCACTCTTCAATGACAC
7)FPGS-rs1054774:
上游引物:CACTGCAATTTCGATGGTCT
下游引物:CAGCTGTATTAAGTCCCGAA
8)DHFR-rs408626:
上游引物:TCTTCTAGTCACCCAATCCAG
下游引物:TGCGTCTTTTAACCTCCATCC
9)MTHFR-rs1801131:
上游引物:AAGGAGGAGCTGCTGAAGATG
下游引物:GTTCTCCCGAGAGGTAAAGA
10)GAPDH:
上游引物: GCTAGCTGGCCCGATTTCTC
下游引物: CACAGCCACCACACCTCTG。
在单一反应管内快速准确的同时进行临床4色多基因SNP检测,检测探针采用荧光标记物进行标记,每种探针均有一个荧光报告基团和荧光淬灭基团,分别标记在探针序列的5’端和3’端,试剂共分三个检测池,每个检测池有四种探针(对应于三种待检基因和一种内参基因),共包含五种荧光标记物(前四种为荧光报告基团,后一种为荧光淬灭基团),其组合情况如下:
A:检测池一包括FAM 、VIC、TET、ROX、BHQ-1五种荧光,BHQ-1标记在探针的3’端,其余的分别标记在探针的5’端。
B:检测池二包括REC、HEX、Texas Red、Cy5、BHQ-2五种荧光,BHQ-2标记在探针的3’端,其余的分别标记在探针的5’端。
C:检测池三包括FAM 、REC、HEX、ROX、BHQ-1五种荧光,BHQ-1标记在探针的3’端,其余的分别标记在探针的5’端。
检测结果:
采集中山大学附属第一医院风湿科一病人EDTA抗凝全血0.5ml,提取得到浓度为160ng/ul的总DNA溶液,OD测定260/280纯度数值为1.82;
取5ul DNA提取溶液作为每个检测池的反应模板,分别加入3个检测池的反应管内,进行实时荧光扩增;扩增程序如下:
95℃预变性15分钟,然后95℃45秒、60℃55秒共40个循环。
分析结果显示,SLC19A1-rs1131596、GGH-rs1800909 、FPGS-rs1054774 、MTHFR-rs1801131 、ATIC-rs4673993五个位点的SNP检测结果为阳性改变,扩增同阳性质控品,荧光扩增曲线的CT检测值均位于24~31区间,荧光信号强度值RFU大于1000;ABCB1-rs1045642 、DHFR- rs408626 、TYMS- rs2853542、ATIC-rs2372536四个位点的SNP检测结果为正常型别,荧光扩增曲线形态为阴性扩增,扩增同阴性质控品。重复三次实验,结果均一致。说明本发明的扩增引物和荧光探针具有很好的灵敏度和特异性,可以满足临床的需要。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州之远生物技术有限公司
<120> 预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的荧光探针组和检测试剂
<130> MTX
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
cttccaggca cagtgtcacc ttcgtccc 28
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 2
ccagtccggg ctgcctgctg tgcgt 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
tccaggtgta agtgttgagg aggc 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
cacaggaaga gattgtgagg gcagc 25
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 5
gcgccacttg gcctgcctcc gtc 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 6
ctcagttttt tattcaggag cagg 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 7
ttgagcatat ttattaggtg tgtc 24
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 8
atcagtaaga ctcttcgacc acc 23
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 9
agctgaccag tgaagcaagt gtctttg 27
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 10
ttcctagatt attctctggt aaatca 26
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 11
ggggtaggga ggcctgcaga ccat 24
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 12
gggcaccatc ctgctcaggc ca 22
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 13
ttgaaaggcg gcgggaggcg g 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 14
gtctagacag ctcgaggctc 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 15
caatctctat ccctttgtaa ag 22
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 16
ttctgactta ccaatgtcaa 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 17
acattgccta tggagacaac 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 18
tcgatgaagg catgtatgtt g 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 19
accgcgccac ttggcctgcc 20
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 20
ggacggaggc aggcgaagt 19
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 21
atactagatg gtcttctgaa g 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 22
gcctcactct tcaatgacac 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 23
cactgcaatt tcgatggtct 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 24
cagctgtatt aagtcccgaa 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 25
tcttctagtc acccaatcca g 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 26
tgcgtctttt aacctccatc c 21
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 27
aaggaggagc tgctgaagat g 21
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 28
gttctcccga gaggtaaaga 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 29
gctagctggc ccgatttctc 20
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 30
cacagccacc acacctctg 19
Claims (10)
1.用于预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的探针组,包括毒性基因探针组、增强疗效基因探针组和降低疗效基因探针组,其中:
毒性基因探针组包括识别SLC19A1-rs1131596、GGH-rs1800909、ATIC-rs2372536的探针;
增强疗效基因探针组包括识别ABCB1 rs1045642、TYMS- rs2853542、ATIC-rs4673993的探针;
降低疗效基因探针组包括识别FPGS-rs1054774、DHFR-rs408626、MTHFR-rs1801131的探针。
2.根据权利要求1所述的探针组,其特征在于:识别SLC19A1-rs1131596、GGH-rs1800909、ATIC-rs2372536的探针序列分别为:
SLC19A1-rs1131596:CTTCCAGGCACAGTGTCACCTTCGTCCC
GGH-rs1800909:CCAGTCCGGGCTGCCTGCTGTGCGT
ATIC-rs2372536:TCCAGGTGTAAGTGTTGAGGAGGC。
3.根据权利要求1所述的探针组,其特征在于:识别ABCB1、TYMS-rs16430、ATIC-rs4673993的探针序列分别为:
ABCB1 rs1045642:CACAGGAAGAGATTGTGAGGGCAGC
TYMS- rs2853542:GCGCCACTTGGCCTGCCTCCGTC
ATIC-rs4673993:CTCAGTTTTTTATTCAGGAGCAGG。
4.根据权利要求1所述的探针组,其特征在于:识别FPGS-rs1054774、DHFR-rs408626、MTHFR-rs1801131的探针序列分别为:
FPGS-rs1054774:TTGAGCATATTTATTAGGTGTGTC
DHFR-rs408626:ATCAGTAAGACTCTTCGACCACC
MTHFR-rs1801131:AGCTGACCAGTGAAGCAAGTGTCTTTG。
5.根据权利要求1所述的探针组,其特征在于:内标基因为GAPDH,对应的探针序列为GAPDH:TTCCTAGATTATTCTCTGGTAAATCA。
6.一种用于预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的试剂盒,包括质控品、针对相同基因的核酸扩增剂和多色荧光检测剂,其特征在于:多色荧光检测剂使用的荧光探针如权利要求1~4任意一项所述。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于:核酸扩增剂的引物对分别为:
SLC19A1-rs1131596:
上游引物:GGGGTAGGGAGGCCTGCAGACCAT
下游引物:GGGCACCATCCTGCTCAGGCCA
GGH-rs1800909:
上游引物:TTGAAAGGCGGCGGGAGGCGG
下游引物:GTCTAGACAGCTCGAGGCTC
ATIC-rs2372536:
上游引物:CAATCTCTATCCCTTTGTAAAG
下游引物:TTCTGACTTACCAATGTCAA
ABCB1 rs1045642:
上游引物:ACATTGCCTATGGAGACAAC
下游引物:TCGATGAAGGCATGTATGTTG
TYMS- rs2853542:
上游引物:ACCGCGCCACTTGGCCTGCC
下游引物:GGACGGAGGCAGGCGAAGT
ATIC-rs4673993:
上游引物:ATACTAGATGGTCTTCTGAAG
下游:GCCTCACTCTTCAATGACAC
FPGS-rs1054774:
上游引物:CACTGCAATTTCGATGGTCT
下游引物:CAGCTGTATTAAGTCCCGAA
DHFR-rs408626:
上游引物:TCTTCTAGTCACCCAATCCAG
下游引物:TGCGTCTTTTAACCTCCATCC
9)MTHFR-rs1801131:
上游引物:AAGGAGGAGCTGCTGAAGATG
下游引物:GTTCTCCCGAGAGGTAAAGA
10)GAPDH:
上游引物: GCTAGCTGGCCCGATTTCTC
下游引物: CACAGCCACCACACCTCTG。
8.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于:不同的探针上标记有不同的荧光基团。
9.根据权利要求8所述的试剂盒,其特征在于:多色荧光检测剂由毒性基因检测池、增强疗效基因检测池和降低疗效基因检测池组成。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于:毒性基因检测池、增强疗效基因检测池和降低疗效基因检测池中探针的荧光标记组合分别为如下组合中的一个:
A:FAM 、VIC、TET、ROX、BHQ-1五种荧光,BHQ-1标记在探针的3’端,其余的分别标记在探针的5’端;
B:REC、HEX、Texas Red、Cy5、BHQ-2五种荧光,BHQ-2标记在探针的3’端,其余的分别标记在探针的5’端;
C:FAM 、REC、HEX、ROX、BHQ-1五种荧光,BHQ-1标记在探针的3’端,其余的分别标记在探针的5’端。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710182878.5A CN106957912B (zh) | 2017-03-24 | 2017-03-24 | 预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的荧光探针组和检测试剂 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710182878.5A CN106957912B (zh) | 2017-03-24 | 2017-03-24 | 预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的荧光探针组和检测试剂 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106957912A CN106957912A (zh) | 2017-07-18 |
CN106957912B true CN106957912B (zh) | 2020-05-19 |
Family
ID=59470565
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710182878.5A Active CN106957912B (zh) | 2017-03-24 | 2017-03-24 | 预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的荧光探针组和检测试剂 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN106957912B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN112941182B (zh) * | 2021-03-11 | 2021-09-21 | 南京先声医学检验实验室有限公司 | 一种基于核酸质谱的风湿免疫疾病用药的基因检测方法及其应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006230299A (ja) * | 2005-02-25 | 2006-09-07 | Kansai Tlo Kk | 関節リウマチ患者におけるメトトレキセート療法での効果診断遺伝子の塩基多型の検出方法 |
JP6542037B2 (ja) * | 2015-06-04 | 2019-07-10 | シスメックス株式会社 | 関節リウマチ患者におけるメトトレキサートの有効性の診断を補助する方法 |
-
2017
- 2017-03-24 CN CN201710182878.5A patent/CN106957912B/zh active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN106957912A (zh) | 2017-07-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103352080B (zh) | 一种遗传性耳聋基因检测试剂盒 | |
CN104762408B (zh) | 检测egfr基因突变的试剂盒及其检测方法 | |
CN103911452B (zh) | 中国人群耳聋基因筛查试剂盒及其应用 | |
CN102220413B (zh) | 检测表皮生长因子受体基因外显子19缺失突变和外显子21点突变的方法 | |
CN103957705A (zh) | 适用于预测对醋酸格拉替雷的临床反应的单核苷酸多态性 | |
Liu et al. | ANXA7, PPP3CB, DNAJC9, and ZMYND17 genes at chromosome 10q22 associated with the subgroup of schizophrenia with deficits in attention and executive function | |
CN111269978B (zh) | 一种人ApoE基因分型检测试剂盒 | |
CN110699446B (zh) | 一种与非综合征型唇腭裂诊断相关的SNP标志物rs3174298及其应用 | |
CN112708669A (zh) | 用于检测阿达木单抗用药相关基因多态性的引物对及试剂盒 | |
CN106957912B (zh) | 预测甲氨蝶呤疗效及不良反应的荧光探针组和检测试剂 | |
CN116411062A (zh) | 基于78个snp位点评估阿达木单抗治疗银屑病有效性的试剂盒 | |
Hesselbrock et al. | Genetics and alcoholism: the COGA Project | |
CN109897895A (zh) | 一种TaqMan-MGB探针技术检测影响降压药物疗效基因的方法学建立 | |
CN116479116A (zh) | 可排除smn2干扰的smn1基因检测的试剂盒及检测方法 | |
Boguniewicz et al. | Atopy, airway responsiveness, and genes. | |
CN112695083B (zh) | 一种检测高血压用药基因多态性的核酸组合物及试剂盒 | |
CN104293911B (zh) | 一种检测scn11a基因第673位碱基突变的试剂盒 | |
CN112226525B (zh) | 重症肌无力诊断用试剂 | |
CN108486226B (zh) | Hla-b27等位基因的检测试剂盒及其应用 | |
KR100613038B1 (ko) | 염색체 17p11.2-p12 지역의 중복을 제외한 유전자돌연변이를 발병 원인으로 하는 CMT 질환의 진단방법및 진단키트 | |
CN107083429A (zh) | 一种用于房颤易感基因检测的snp分型试剂盒及其应用 | |
CN111363799A (zh) | 一种vps39基因k87r突变检测的试剂盒 | |
Tarbox-Berry et al. | Polymorphisms in the Human Aquaporin 4 Gene Are Associated With Schizophrenia in the Southern Chinese Han Population: A Case–-Control Study | |
WO2014201104A2 (en) | Methods and kits for treating and classifying individuals | |
CN111363797A (zh) | 一种vps11基因a407v突变检测的试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |