CN106913601A - 孔雀草总黄酮提取物、制备方法及应用 - Google Patents

孔雀草总黄酮提取物、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种孔雀草总黄酮提取物在抗帕金森药物制备中的应用。所述制备方法包括：(1)用乙醇水溶液对孔雀草进行提取至少一次得提取液；所述提取液经浓缩得到浓缩液；(2)所述浓缩液经脱脂溶剂进行脱脂后得到脱脂浓缩液；(3)所述脱脂浓缩液经分离纯化即得所述孔雀草总黄酮提取物。本发明提供的孔雀草总黄酮提取物，按照比色法测定的总黄酮的重量含量高于30％。药理试验证明，该孔雀草总黄酮提取物具有较强的抗帕金森活性，可单独或与其它药物组合应用于抗帕金森药物的制剂中。本发明提供的方法制备的孔雀草总黄酮提取物中的总黄酮的纯度高且制备方法简便，适合工业化生产；本发明提供的孔雀草总黄酮提取物可用于制备抗帕金森药物。

Description

孔雀草总黄酮提取物、制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种植物药及其应用，具体是以孔雀草总黄酮为活性成分的药物提取物及其在制备抗帕金森药物中的用途。
背景技术
孔雀草(Tagetes patula L.)又名红黄草、藤菊、法国万寿菊、小万寿菊，为菊科万寿菊属植物，为一年生草本，花期为7月～9月。我国各地均有栽培，是一种常见的观赏花卉。孔雀草有药用和保健作用，花叶可以入药，有清热化痰、补血通经的功效。能治疗百日咳、气管炎、感冒等。
从20世纪80年代开始，人们即开始对孔雀草的化学成分进行研究，分离得到万寿菊素(patuletin)，槲皮万寿菊素(quercetagetin)，槲皮万寿菊甙(quercetagitrin)等黄酮类化合物(国家中医药管理局《中华本草》编委会；中华本草[M]；上海科学技术出版社，1999年版)。目前人们多对孔雀草花卉进行研究，药用价值研究较少。
帕金森病(PD)是以中脑黑质多巴胺能神经元渐进性死亡为病理特征的中枢神经系统退行性疾病。目前治疗手段主要以西药为主，但只改善症状，不能控制其进程，长期应用疗效减弱且毒性增大。而中药治疗具有毒副作用小、协同作用强等优势而更具有开发前景。
我们在对抗帕金森病中药有效成分筛选过程中惊喜地发现孔雀草总黄酮具有良好的抗帕金森病的药理活性。孔雀草中总黄酮含量约30％以上(迟玉新，窦德强.楮实子与构树叶中总黄酮含量测定.中国现代中药，2008年第10卷第11期)，经过醇提取，大孔树脂的方法可以对孔雀草总黄酮进行纯化制备，使其适合开发成为抗帕金森病的药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种孔雀草总黄酮提取物用于制备抗帕金森病药物中的新用途。
为实现上述目的而采用的技术方案如下：
1.建立制备孔雀草总黄酮提取物的方法
(1)用80％乙醇水(体积比)溶液对孔雀草全草(包括根及地上部分，粉碎成10目粉末)进行浸渍提取，每次溶剂用量为药材质量的10倍量，40℃温浸12小时，浸提2次。合并提取液后经浓缩得到浓缩液(约为药材质量的1倍量)；
(2)上述浓缩液用1/2浓缩液体积的石油醚萃取三次脱脂，得到脱脂浓缩液；
(3)上述脱脂浓缩液进一步经大孔吸附树脂HPD100分离(树脂用量为孔雀草用量的1/2倍)，先用水洗(5倍树脂体积)，再用60％乙醇水溶液洗脱，得到60％乙醇水洗脱液，经减压回收乙醇，干燥得孔雀草总黄酮提取物。
2.孔雀草总黄酮用于抗帕金森病的研究
上述孔雀草总黄酮提取物用于抗帕金森药物的药理试验研究。
附图说明
图1是槲皮素的化学结构图。
具体实施方式
本发明中，采用下述文献报道的比色法对总黄酮含量进行测定：迟玉新，窦德强.楮实子与构树叶中总黄酮的含量测定.中国现代中药2008，10(11)：16-17。该方法的简要操作过程如下：精密称取一定量的总黄酮提取物，制备样品溶液。加Al(NO3)3/NaNO2试液显色，以式I所示槲皮素为对照品，于505nm处进行比色测定。根据测定的吸光度值，即可计算得到孔雀草中总黄酮的含量。
实施例1制备孔雀草总黄酮
溶剂提取法和树脂吸附法制备孔雀草总黄酮：
将目数为10目的孔雀草粉末1kg，乙醇的体积百分含量为80％的乙醇水溶液浸渍提取2次，每次溶剂用量为药材质量的10倍量，每次40℃温浸12小时。合并提取液，回收乙醇溶液，浓缩至约为药材质量的1倍量(约1升)，经每次500毫升石油醚萃取3次后，得脱脂溶液。脱脂溶液经已预先处理过的HPD100大孔吸附树脂柱(约500毫升)，依次用水(2500毫升)、60％的乙醇水溶液进行洗脱(2000毫升)，60％的乙醇洗脱液减压回收乙醇，减压干燥得总黄酮提取物105g，测得总黄酮为34.5g，占所述干燥后的总黄酮提取物的重量百分比为32.8％，占孔雀草原料药材总重的百分比即收率为3.45％。
实验例2孔雀草总黄酮的抗帕金森作用研究
1.实验材料
C57BL/6小鼠购自大连医科大学动物实验中心，所用孔雀草总黄酮为采用上述工艺自制。
2.动物分组
将50只C57BL/6小鼠随机分为5组：空白组、模型组、阳性药组(多巴丝肼片(美多芭)，上海罗氏制药有限公司，批号：SH1346)和孔雀草总黄酮高、低剂量组，每组10只。
3.造模及给药方法
模型组和高、低剂量组皮下注射MPTP(购于Sigma公司，批号：1001054803)25mg/kg，每天一次，连续3d。第四天开始灌胃给予孔雀草总黄酮提取物，孔雀草总黄酮高、低剂量组分别给药60mg/kg、30mg/kg，每天给药一次，连续给药9天。空白组以腹腔注射等量生理盐水代替MPTP，每天一次。同时每天进行动物行为学实验考查。
4.行为学考查
4.1悬挂实验(Traction test)
目的是检测C57BL/6小鼠肢体运动协调情况。将受试小鼠悬挂于一水平电线上，电线直径约为0.2mm。从小鼠双前爪抓住电线开始计时，小鼠掉落则计时结束。25秒以上的记6分；20-25秒记5分；15-20秒记4分；10-15秒记3分；5-10s记2分；0-5s记1分。最后计算得分情况，并作统计学分析。分值越高，小鼠抓住电线越牢固；说明小鼠肢体运动协调情况越好，反之，则说明小鼠震颤、肌强直等情况严重。结果见表1。
表1 悬挂实验得分结果()
注：△与空白组比较，有差异(p＜0.05)；△△与空白组比较，差异显著(p＜0.01)；▲与模型组比较，有差异(p＜0.05)，▲▲与模型组比较，有显著差异(p＜0.01)。
4.2爬杆实验(Pole test)
目的是检测C57BL/6小鼠肢体运动协调情况。将一直径为2.5cm的软木球固定于一根长50cm，直径1cm的木杆顶端，木杆上缠上纱布以防打滑，然后将被测小鼠放到小球上，并记录小鼠爬完杆子所需要的时间。然后按以下标准记分：0-3秒内完成上述动作的记6分；3-6秒内完成的记5分；6-9秒内完成的记4分；9-12秒内完成的记3分；12-15秒内完成的记2分；15秒以上的记1分。最后计算得分情况，并作统计学分析。分值越高，小鼠爬完杆子的全程所用的时间越少，说明小鼠肢体运动协调情况越好，也说明小鼠对爬杆实验越来越熟练，结果见表2。
表2 爬杆实验得分结果()
注：△与空白组比较，有差异(p＜0.05)；△△与空白组比较，差异显著(p＜0.01)；▲与模型组比较，有差异(p＜0.05)。
实施例3孔雀草总黄酮抗帕金森病的血清药理学研究
1.实验材料
方法采用SD大鼠，雌雄各半，体重200±20g，购自大连医科大学。所用孔雀草总黄酮为采用上述工艺自制。称取孔雀草总黄酮适量，配制成5mg/mL的溶液，待用。
2.方法
2.1药物血清的制备
大鼠适应性饲养3天，自由饮水进食。随机分为空白组和孔雀草总黄酮高、低剂量组。高、低剂量组分别给药60mg/kg、30mg/kg，每天灌胃给药2次，连续给药7天；空白组给予等量生理盐水。于末次给药后0.5h摘眼球取血，静置0.5h后，3000rpm/min离心10min，分离血清，然后56℃灭活30min以除去可能存在的生物活性物质，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，密封后置于-20℃冰箱保存备用。
2.2细胞分组与处理
人母神经细胞瘤系细胞(SH-SY5Y细胞，购于中科院上海细胞库)。用含10％灭活胎牛 血清、青霉素100U·mL-1、链霉素100μg·mL-1的DMEM F-12培养液培养SH-SY5Y细胞，隔天更换培养液，培养至单层细胞约80％汇合时，传代培养，用对数生长期的细胞进行实验。调整细胞密度为1×105接种于96孔板中，每孔100μL，置于37℃、5％CO2的培养箱中，培养16h待细胞贴壁。将细胞随机分为3组：模型组、实验组和空白血清组，每组设3个复孔。模型组不加任何血清；实验组分别加入含体积分数5％、10％和20％含药血清的完全培养基，空白血清组只加相应体积分数的空白血清；于37℃、5％CO2的培养箱中培养24h后，实验组和模型组同时加入1mM的MPP+(购于sigma公司，批号：72111)，继续培养48h。3组细胞每孔加5mg/mL MTT 10μL，培养4h，吸去孔内培养基，每孔加DMSO 100μL，待结晶充分溶解，酶标仪检测492nm处各孔的吸收值(OD值)(参考波长620nm)，计算细胞存活率。
细胞存活率％＝实验组OD值/对照组OD值×100％
统计学处理数据以均数±标准差()表示，用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行统计学处理。
3.结果
与空白血清组相比，模型组细胞存活率分别为(40.23％±1.68％)、(42.50％±1.11％)和(36.01％±0.92％)；预先加入高、低剂量的孔雀草总黄酮含药血清组的存活率显著增加，与模型组有显著统计学意义。结果表明，一定体积分数的孔雀草总黄酮组含药血清对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞有明显的保护作用。
表3 不同体积分数的含药血清对抗MPP+细胞毒性后的SH-SY5Y细胞存活率()
注：*与模型组比较，有差异(p＜0.05)；**与模型组比较，有显著差异(p＜0.01)，***与模型组比较，有极显著差异(p＜0.001)。
上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims (7)

1.一种具有抗帕金森作用的孔雀草总黄酮提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)用乙醇水溶液对孔雀草粗粉进行提取至少一次得提取液；所述提取液经浓缩得到浓缩液；
(2)所述浓缩液经脱脂溶剂进行脱脂后得到脱脂浓缩液；
(3)所述脱脂浓缩液经分离纯化即得所述孔雀草总黄酮提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述孔雀草为全草包括根及地上部分花；所述孔雀草粗粉粒度为2目-60目；步骤(1)中所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分含量为0～100％；所述提取为浸渍、渗漉、回流提取、索氏提取、超声提取或闪式提取；所述提取的次数为1～3次；所述乙醇水溶液的用量为所述药材的质量的6～20倍；每次所述提取的时间为0.5～3小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所述浓缩液与所述孔雀草的重量份数比为(2～1)∶1；步骤(2)中所述脱脂溶剂为石油醚，用量与浓缩液1/2体积。
4.根据权利要求1～3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述分离纯化的方法为大孔吸附树脂吸附法。所述大孔吸附树脂吸附法树脂的用量为所述孔雀草原料的质量的0.5～2倍，所述树脂吸附法的淋洗液依次为水、体积百分含量为30～80％的乙醇水溶液和体积百分含量为95％的乙醇水溶液，收集体积百分含量为30～80％的乙醇水溶液的洗脱液即可，然后减压浓缩干燥即得孔雀草总黄酮提取物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述树脂按照包括如下步骤的方法进行预处理：将所述树脂用体积百分含量为95％的乙醇水溶液依次经浸泡和回流后即可；所述树脂与所述体积百分含量为95％的乙醇水溶液的体积份数比为1∶2。
6.权利要求1-6中任一所述方法制备的孔雀草总黄酮提取物，总黄酮的含量为30％(重量比)以上。
7.权利要求6所述孔雀草总黄酮提取物在制备抗帕金森药物中的应用。
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