CN106868016B

CN106868016B - 一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点及其应用

Info

Publication number: CN106868016B
Application number: CN201510923087.4A
Authority: CN
Inventors: 赵方杰; 黄朝锋; 唐仲; 闫佳莉; 王佩同
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2015-12-14
Publication date: 2020-06-09
Anticipated expiration: 2035-12-14
Also published as: CN106868016A

Abstract

本发明公开了一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点及其应用。一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点，所述突变位点位于水稻OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸，且存在A/C多态性，所述突变位点与水稻籽粒镉含量显著相关，该位点具有AA基因型的水稻籽粒镉含量显著低于具有CC基因型的水稻籽粒镉含量。由于所述突变位点存在于水稻粳稻品种中，采用简易分子标记检测该突变位点对于规避高镉积累品种的使用风险及辅助选育低镉积累新品系都具有重要经济和社会效益。

Description

一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点及其应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，涉及一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点及其应用。

背景技术

镉是一种对动植物均具有很强毒性的重金属元素，随着我国工业化、城镇化的快速发展，农田镉污染问题日益突出。水稻是我国主要的粮食作物，水稻镉污染日趋严重，已成为不容忽视的食品安全问题。近年来关于水稻吸收、运输及解毒镉的机理已经开展了大量的研究工作，并取得了一些重要进展，为遗传改良阻控水稻重金属镉积累提供了理论基础和技术途径。

国内外研究表明，不同水稻品种籽粒镉的积累能力差异很大，籽粒镉浓度的差异高达10倍以上，而且这些性状的遗传性强。通常籼稻品种镉积累能力较粳稻高，但是也有一些粳稻品种具有较强的镉积累能力。不同水稻品种间，参与重金属镉吸收或运输的关键基因的表达水平、以及所编码的转运蛋白对镉跨膜运输活性的不同，是导致品种间镉积累能力的差异的主要原因。研究表明，镉是通过铁、锌、锰等植物必需元素的吸收途径进入植物体内。水稻OsHMA3是一个P‐1B型重金属ATP酶，主要在根系表达，定位于液泡膜上，具有运输镉的能力。水稻中OsHMA3转运蛋白的主要功能是将镉运输进入液泡中储存，从而限制镉由根系向地上部的运输。

国际上已经有通过遗传改良阻控作物重金属积累的成功例子，如加拿大科学家已培育并注册了5种低镉的硬粒小麦新品种，美国培育了低镉的向日葵品种。最近，日本科学家采用放射性诱变，筛选出低镉水稻突变株，其根系镉的吸收及籽粒镉浓度比对照降低90％以上，种植在镉污染的土壤上稻米镉浓度也没有超标，而且生长及产量均不受影响，分析表明突变的基因为编码镉和锰的运转蛋白Nramp5，目前日本正在应用这一突变株开展低镉水稻品种的培育。这些例子充分说明通过遗传改良培育重金属低积累的品种是完全可行的。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点。

本发明的另一目的是提供检测该突变位点的引物对。

本发明的又一目的是提供该突变位点和引物对的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一个控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点，所述突变位点位于水稻OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸，且存在A/C多态性，所述突变位点与水稻籽粒镉含量显著相关，该位点具有AA基因型的水稻籽粒镉含量显著低于具有CC基因型的水稻籽粒镉含量。

本发明根据已公布的水稻日本晴(Nipponbare)序列设计OsHMA3基因的全长PCR引物，对籽粒镉积累存在显著差异的水稻品种(图1；图2)的cDNA进行PCR扩增和测序，同时与日本晴的序列进行了比对，发现了一些单核苷酸多态性(single nucleotidepolymorphism,SNP)。这些SNP会导致OsHMA3所编码氨基酸的变异(图3)。通过酵母异源表达这些不同水稻品种来源的OsHMA3蛋白发现，在OsHMA3蛋白80位和380位氨基酸的变异会导致OsHMA3蛋白功能丧失(图3；图4)。OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位的SNP导致了HMA3蛋白第380位氨基酸的变异。OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸位点存在A/C多态性(SEQ ID NO.4)，所述OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位SNP位点与水稻籽粒镉含量显著相关。水稻OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸位点具有AA基因型的水稻籽粒镉含量显著低于具有CC基因型的水稻籽粒镉含量。利用这个SNP设计了一个dCAPS分子标记，对不同水稻品种的基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物经一个限制性内切酶Hpy188I酶切，在电泳中可检测到两种大小不同条带，籽粒镉含量高的品种的条带大小为189bp(base pair)，籽粒镉含量低的品种条带大小为163bp(图5)，这两种条带在聚丙烯酰胺凝胶电泳中具有很好的多态性(图6)。该dCAPS标记能分析待测水稻品种中OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸的多态性。

一种用于检测水稻基因组中是否存在权利要求1所述的基因突变位点的引物对，正向引物F1：5'‐TGGAAGCTGGCTCTGGTGATGCTTCTG‐3'(SEQ ID NO.1)，反向引物R1：5'‐TCTGGTGATCGTCCCGGTCTT‐3'(SEQ ID NO.2)。

一种检测水稻基因组中是否存在本发明所述的基因突变位点的方法，包括：以待测水稻基因组DNA为模板，用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物进行PCR扩增，扩增得到OsHMA3基因，PCR产物经一个限制性内切酶Hpy188I酶切，电泳结果如果出现189bp的条带，表明待测水稻品种中OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸存在所述的基因突变位点，其基因型为CC，该水稻样品为籽粒镉含量高的品种；如果出现163bp的条带，表明水稻品种中OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸位点未产生突变，基因型为AA，该水稻样品为籽粒镉含量低的品种。

本发明所述的基因突变位点在水稻籽粒低镉积累品种的辅助选择育种中的应用。

本发明所述的引物对在检测本发明所述的基因突变位点中的应用。

本发明所述的引物对在水稻籽粒低镉积累品种的辅助选择育种中的应用。

有益效果：

本发明提供了控制水稻籽粒镉积累基因OsHMA3序列一个新的突变位点及其检测方法，可以用于水稻OsHMA3基因的辅助选择育种。

附图说明

图1为不同品种水稻编号、名称及亚种类型；

图2为不同品种水稻籽粒镉含量差异；

图3为不同品种水稻OsHMA3氨基酸变异位点；

图4为在酵母异源系统中验证不同品种水稻OsHMA3蛋白活性；

图5为本发明检测所述突变位点的dCAPS分子标记的设计图；

图6为籽粒高镉品种与低镉品种水稻dCAPS分子标记的电泳分析图；

图7为通过本发明所述的dCAPS分子标记检测的籽粒高镉品种与低镉品种水稻地上部镉含量差异。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1

本发明所述的检测所述突变位点的方法，包括以下步骤：

1、引物设计：根据对不同水稻品种(图1)OsHMA3基因的测序分析，即序列SEQ IDNO.5，在OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位SNP位点及其周围约200bp处，设计一对dCAPS分子标记的PCR引物，序列为正向引物：5'‐TGGAAGCTGGCTCTGGTGATGCTTCTG‐3'(SEQID NO.1)，反向引物：5'‐TCTGGTGATCGTCCCGGTCTT‐3'(SEQ ID NO.2)。引物可委托金斯瑞公司合成。

2、DNA提取：以水稻叶片为材料提取基因组DNA，已报道的DNA提取方法很多，可任意选择一种。本发明是采用的是陈文岳等(中国水稻科学，2005,19:561‐563)报道的一种水稻DNA简易提取法。

3、PCR扩增：在0.2mL的PCR扩增专用薄壁管中，加入20ng水稻基因组DNA、正反向引物各0.25μM、4种dNTP(dCTP、dGTP、dATP、dTTP)各100μM、10μL 2×GC BufferI、1个酶活力单位的Taq DNA聚合酶，用双蒸水定容到20μL，充分混匀。本发明使用的PCR试剂为TaKaRa公司产品。PCR扩增在热循环仪上进行，扩增条件为：95℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸5分钟。本发明采用的热循环仪为BioRad公司的T100型。

4、PCR产物的酶切：取步骤3所得PCR产物的10μL，加入2μL CutSmart Buffer、1个酶活力单位的限制性内切酶Hpy188I，用双蒸水定容到20μL，充分混匀，37℃保温1个小时。本发明使用的内切酶及其Buffer是NEB公司产品。

5、酶切产物的电泳：用1×TBE电泳液制备浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶，将步骤4所得的20μL酶切产物与2μL 10×Loading Buffer混合，加到凝胶的点样孔中，以DNAMarker2000bp DNALadder(TaKaRa公司)作为分子量对照，在200V～300V电泳1h。用0.1％硝酸银对凝胶进行染色，显示DNA条带，染色方法按照《分子克隆实验指南》(科学出版社，第三版)。

6、电泳图谱分析：在凝胶成像仪(BioRad公司)上观察凝胶上的电泳条带，通过比对DNAmarker判断电泳条带的大小，电泳条带为189bp(SEQ ID NO.3)的水稻品种OsHMA3基因1138位核苷酸位点为CC型，对应籽粒镉含量相对较高，电泳条带为163bp(SEQ ID NO.4)的水稻品种OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸位点为AA型，对应籽粒镉含量相对较低。

为了证明本发明的正确性，发明人设置了实施例2的试验。

实施例2

利用本发明所述dCAPS分子标记对进行过基因组重测序的533份水稻品种OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位SNP进行检测，最终结果如下：

检测到4份水稻品种OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位A/C位点均为CC型，与测序结果吻合。所述4份水稻品种编号分别是NO.17、NO.23、NO.35和NO.221(图1)。

对上述4份水稻品种镉含量分析表明这4份水稻品种地上部镉含量显著高于其他对照品种(图6)。由此可见，在水稻遗传育种中，继代选育OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位A/C位点的AA型均可降低水稻籽粒镉积累，达到水稻籽粒低镉积累品种育种的目的。

Claims

1.一种用于检测水稻基因组中是否存在控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点的引物对，其特征在于正向引物如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示；所述的控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点位于水稻OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸，且存在A/C多态性，所述突变位点与水稻籽粒镉含量显著相关，该位点具有AA基因型的水稻籽粒镉含量显著低于具有CC基因型的水稻籽粒镉含量。

2.一种检测水稻基因组中是否存在权利要求1中所述的控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点的方法，其特征在于包括：以待测水稻基因组DNA为模板，用SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示引物进行 PCR 扩增，扩增得到OsHMA3基因片段，PCR产物经一个限制性内切酶Hpy188I酶切，电泳结果如果出现189bp的条带，表明待测水稻品种中OsHMA3基因起始密码子ATG下游 +1138位核苷酸存在所述的基因突变位点，其基因型为CC，该水稻样品为籽粒镉含量高的品种；如果出现163bp的条带，表明水稻品种中OsHMA3基因起始密码子ATG下游 +1138位核苷酸位点未产生突变，基因型为AA，该水稻样品为籽粒镉含量低的品种。

3.控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点在水稻籽粒低镉积累品种的辅助选择育种中的应用；所述的控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点位于水稻OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸，且存在A/C多态性，所述突变位点与水稻籽粒镉含量显著相关，该位点具有AA基因型的水稻籽粒镉含量显著低于具有CC基因型的水稻籽粒镉含量。

4.权利要求1所述的引物对在检测控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点中的应用；所述的控制水稻籽粒高镉积累的基因突变位点位于水稻OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1138位核苷酸，且存在A/C多态性，所述突变位点与水稻籽粒镉含量显著相关，该位点具有AA基因型的水稻籽粒镉含量显著低于具有CC基因型的水稻籽粒镉含量。

5.权利要求1所述的引物对在水稻籽粒低镉积累品种的辅助选择育种中的应用。