CN109652441A

CN109652441A - 一种双元表达载体的构建及应用

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Publication number: CN109652441A
Application number: CN201811652736.1A
Authority: CN
Inventors: 张国栋; 刘佳音; 米铁柱; 吴洁芳; 李继明; 万吉丽
Original assignee: Qingdao Yuance Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Yuance Group Co Ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2019-04-19

Abstract

本申请公开了一种双元表达载体的构建方法，包括以下步骤：(1)获取启动子DNA片段；(2)获取编码DNA片段；(3)将所述步骤1获取得到的启动子DNA片段和所述步骤2获取得到的编码DNA片段转入载体质粒，得到表达载体。本申请双元表达载体的构建方法中，启动子EXP B具有在水稻根系特异启动下游基因表达的特性，通过所述双元表达载体中的启动子EXP B，使得双元表达载体中编码OsHMA3的核苷酸序列在水稻根系中超量表达。

Description

一种双元表达载体的构建及应用

技术领域

本发明属于现代分子生物学植物基因工程技术领域，更具体涉及一种双元表达载体的构建及应用。

背景技术

一般植物表达载体是成套使用的，一套中有两个，一个是带有可以供插入外源表达基因的MCS和筛选标签的融合蛋白(通常是GFP或Gus)的普通载体。

另一个载体就是双元载体(binary-vector)了。通常是先将外源基因插入带有筛选标记的载体，然后将此载体上的35S promoter-expression gene-gfp这段全部切下，然后构建亚克隆，其过程就是将上述的片断插入双元载体的LB和RB之间，其插入方向是可以任意的。

然后将带有35S promoter-expression gene-gfp的双元载体转化农杆菌，再通过农杆菌转染植物，最后可以通过农杆菌特有的ti-DNA转染机制，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。

双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T-DNA区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因编码表达Vir蛋白的功能，VIR基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌转运DNA(T-DNA)两端24bp序列，进而将T-DNA以单链的形式切割下来。

同时，VIR基因编码的virE2能够与单链T-DNA结合，形成T-复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质。之后便是宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的T-DNA的转移。

另一部分则是含有T-DNA的微型质粒，它带有目的基因和大肠杆菌及农杆菌复制的起始位点，实际上是一种分子质量较小的大肠杆菌和农杆菌的穿梭载体。

双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T-DNA的转移。

重金属元素中有的是生物生长发育所必需的矿物元素，如Cu、Zn等是多种转录因子以及酶的辅助因子，但大多数重金属元素并非是生物生长发育所必需的矿物元素，如Hg、Cd，而且所有的重金属元素在超过一定浓度时在生物体内都会产生一定的伤害，这些伤害主要表现在细胞膜损伤、参与光合作用以及呼吸代谢的大分子结构被破坏、核酸分子降解等。

镉(cadmium，Cd)是一种对动植物均具有很强毒性的重金属元素，随着我国工业化、城镇化的快速发展，农田镉污染问题日益突出。国内外大量的研究表明，重金属镉对人体毒性较强，被国际卫生组织列为生物毒性最强的重金属元素之一。

镉的积累可生产具有高生物活性的氧化镉，通过呼吸道进入人体，对人体的肾脏、骨骼、免疫系统、神经系统、心血管系统和生殖系统均可产生毒性。重金属镉比较容易从土壤被植物吸收进入食物链，是影响农产品安全最重要的重金属污染元素。

国内外研究表明，不同水稻品种籽粒镉的积累能力差异很大，籽粒镉浓度的差异高达10倍以上，而且这些性状的遗传性强。通常籼稻品种镉积累能力较粳稻高，但是也有一些粳稻品种具有较强的镉积累能力。

不同水稻品种间，参与重金属镉吸收或运输的关键基因的表达水平、以及所编码的转运蛋白对镉跨膜运输活性的不同，是导致品种间镉积累能力的差异的主要原因。

研究表明，镉是通过铁、锌、锰等植物必需元素的吸收途径进入植物体内。水稻OsHMA3是一个P-1B型重金属ATP酶，主要在根系表达，定位于液泡膜上，具有运输镉的能力。水稻中OsHMA3转运蛋白的主要功能是将镉运输进入液泡中储存，从而限制镉由根系向地上部的运输。

国际上已经有通过遗传改良来组控作物重金属积累的成功例子，如加拿大科学家已培育并注册了5种低镉的硬粒小麦新品种，美国培育了低镉的向日葵品种。这些为我们培育低镉水稻指明了方向，也充分说明了通过遗传改良培育重金属低积累的品种是完全可行的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，克服现有技术中的不足和缺陷，提供一种双元表达载体的构建及应用，能有效降低水稻籽粒中镉累积，以解决现有水稻籽粒中镉过量积累而导致人体吸入过量重金属的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种双元表达载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)获取启动子DNA片段；

(2)获取编码DNA片段；

(3)将所述步骤1获取得到的启动子DNA片段和所述步骤2获取得到的编码DNA片段转入载体质粒，得到表达载体。

优选地，所述启动子为EXP B。

优选地，所述编码DNA片段为编码OsHMA3的DNA片段。

优选地，所述步骤2进一步包括：获取水稻的全基因组，根据水稻的全基因组获得编码OsHMA3的DNA片段。

优选地，所述步骤3进一步包括：对所述步骤1获取的启动子EXP B的DNA片段，添加EcoRI和SacI酶切位点片段。

优选地，所述步骤3进一步包括：对所述步骤2获取的编码OsHMA3的DNA片段，添加BamHI和HindIII酶切位点片段。

优选地，所述步骤1获取得到的启动子DNA片段中，启动子DNA片段的获得，使用如下引物序列：

EXP B-F：GAATTCTTTATTTTATTCATTTATTCAC；

EXP B-R：GAGCTCCCTGCGTACACGGCCACATGAA。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种双元表达载体构建中获取启动子DNA片使用的引物，所述引物序列包括：

EXP B-F：GAATTCTTTATTTTATTCATTTATTCAC；

EXP B-R：GAGCTCCCTGCGTACACGGCCACATGAA。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种如前述任一项方法获得的双元表达载体。

为解决上述技术问题，本发明又提供了一种如前述任一项所述方法在降低水稻籽粒镉积累中的应用。

优选地，所述步骤3具体包括：

通过酶切将所述步骤1获取得到的启动子EXP B的DNA片段和所述步骤2获取得到的编码OsHMA3的DNA片段连入载体质粒，得到双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHMA3。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：所述双元表达载体用于降低水稻籽粒中镉的积累，所述双元表达载体包括启动子EXP B的核苷酸序列和编码OsHMA3的核苷酸序列，所述启动子EXP B是水稻根系特异表达基因的启动子。

优选地，所述启动子EXP B的核苷酸序列与SEQ ID NO.1的核苷酸序列具有至少90％的同源性。

优选地，所述编码OsHMA3的核苷酸序列与SEQ ID NO.2的核苷酸序列具有至少90％的同源性。

优选地，所述启动子EXP B的核苷酸序列和所述编码OsHMA3的核苷酸序列克隆至pCAMBIA1300载体上形成所述双元表达载体。

优选地，所述启动子EXP B的核苷酸序列和所述编码OsHMA3的核苷酸序列克隆至pCAMBIA1300载体上的酶切位点分别为EcoRI、SacI和BamHI、HindIII。

本发明还提供一种如上所述的双元表达载体在降低水稻籽粒中镉积累的应用。

与现有技术相比，本发明的有益的技术效果包括：

1、启动子EXP B具有在水稻根系特异启动下游基因表达的特性，通过所述双元表达载体中的启动子EXP B，使得双元表达载体中编码OsHMA3的核苷酸序列在水稻根系中超量表达；

2、通过所述双元表达载体中设置编码OsHMA3的核苷酸序列，使得水稻根系中超量表达OsHMA3，从而可将水稻从外界环境中吸收的重金属镉运输至水稻根系细胞的液泡中储存，限制镉由根系向地上部的运输，达到降低水稻籽粒中镉积累的效果；

3、通过本发明的提供的降低水稻籽粒中镉积累的方法，使得制得的具有双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHMA3的水稻籽粒中镉积累明显降低10％，有利于减少水稻籽粒中的重金属镉含量，避免消费者食用大米而导致的重金属积累问题。

附图说明

图1为本发明实施例所述pCAMBIA1300载体的空载体结构示意图；

图2为实施例所述双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHMA3的载体结构示意图；

图3为实施例所述具有双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHMA3的水稻的PCR电泳图；

图4为实施例所述具有双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHMA3水稻根系与野生型水稻根系中镉含量检测图；

图5为实施例所述具有双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHMA3水稻与野生型水稻地上部镉含量检测图；

图6为本发明实施例所述具有双元表达载体pCAMBIA1300-EXPB-OsHMA3水稻籽粒与野生型水稻籽粒中镉含量检测图。

具体实施方式

下面结合实施例详述本发明。为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明，但本发明并不局限于这些实施例。

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较好实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

除另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者通过现有方法制备得到。

除非另有特别说明，以下实施例中用到的DNA提取试剂盒购、RNA提取试剂盒均购置于天根公司，pBlunt-T克隆载体购置于全式金公司，引物由上海生工公司合成，反转录试剂盒购置于Promega公司。

本发明提供了一种双元表达载体，所述双元表达载体可用于降低水稻籽粒中镉的积累，所述双元表达载体包括启动子EXP B(来源水稻及大麦，编码细胞壁解离蛋白，在根毛处特异表达)的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)和编码OsHMA3的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)，所述启动子EXP B为根特异表达启动子。本发明提供的双元表达载体能使水稻籽粒中镉的积累明显降低10％，有利于减少大米中重金属镉的含量，避免消费者因食用大米而导致重金属积累的问题。

实施例一：双元表达载体的构建

1、启动子EXP B的DNA片段的获得：

具体地，包括以下步骤：

步骤①，根据已知水稻根特异表达启动子核苷酸序列，设计特异性扩增引物，该引物序列如下：

EXP B-F：GAATTCTTTATTTTATTCATTTATTCAC(SEQ ID NO.3)

EXP B-R：GAGCTCCCTGCGTACACGGCCACATGAA(SEQ ID NO.4)

步骤②，提取水稻基因组DNA：

在本实施例中采用水稻叶片为材料提取基因组DNA。可以理解的是，水稻品种众多，本领域技术人员可根据实际情况采用不同品种的水稻提取水稻基因组DNA，在本申请方案中并不限制具体采用那一品种的烟草，获得启动子EXP B的DNA片段。另外，已报道的DNA提取方法众多，本领域技术人员可根据实际情况进行选择，在本实施例中具体采用如下的水稻DNA提取方法：

1)从水稻幼苗上剪取叶片并剪成碎片，放入离心管中；

2)加入小钢珠和DNA提取液，在Tissuelyser-192组织研磨仪上震荡研磨；

3)加入氯仿颠倒混匀，静置后，离心至清晰分相，吸取上清液转入新的离心管中，弃枪头；

4)加入在-20℃冰箱预冷的无水乙醇，颠倒混匀；

5)离心至沉淀附于离心管底部，弃上清液，用乙醇洗涤沉淀，将离心管倒置，自然干燥；

6)加入1/10×TE缓冲液溶解沉淀，样品置于-20℃冰箱中保存备用。

进一步，所述的震荡研磨具体为：在25Hz下震荡研磨60s。

进一步，所述的步骤(4)中冰箱的温度条件为-20℃。

进一步，所述的离心条件均为11000rpm。

进一步，所述的洗涤沉淀用的乙醇浓度为70％。

进一步，所述的DNA提取液为：10mL浓度为1M的Tris-HCl(pH8.0)、10mL浓度为0.5M的EDTA(pH8.0)、10mL浓度为5M的NaCl，最后利用dd H₂O定容至100mL，配置新鲜溶液待用。

步骤③，对步骤②提取得到的水稻基因组DNA进行PCR扩增：

在0.2mL的PCR扩增管中，采用以下体系对②得到的水稻基因组DNA进行特异性扩增，并对扩增的PCR产物进行回收测序，得到启动子EXP B的DNA片段。

以下表1为50μL水稻基因组DNA扩增PCR反应体系。具体的，在本实施例中PCR反应体系应采用50μL体系，在其他实施例中，本领域技术人员也可以根据表1提供的配比进行等比例的更改或微调。

表1，50μL启动子EXP B的PCR扩增反应体系

PCR扩增条件为：

2、编码OsHMA3的DNA片段的获得：

具体地，包括以下步骤：

步骤①，根据已知水稻中编码OsHMA3的核苷酸序列分析，设计特异性扩增引物：

具体地，对多个已知水稻中编码OsHMA3的开放阅读框的核苷酸序列进行分析，在编码OsHMA3基因起始密码子ATG下游+1和2014位处，设计一对水稻OsHMA3的PCR引物，该引物序列如下：

OsHMA3-F：5’-GGATCCATGGCCGGAAAGGATGAGGCG-3’(SEQ ID NO.5)

OsHMA3-R：5’-AAGCTTCATCCTTTCACTTCACCGGAG-3’(SEQ ID NO.6)

步骤②，提取水稻总RNA，发转录得到水稻cDNA：

将水稻种子置于铺有纱布的培养皿中，加入20mL无菌水，黑暗下培养至出芽，然后置于光照培养箱中培养至两叶一心后取水稻根部，以水稻根部为材料提取水稻总RNA，反转录得到水稻cDNA。

步骤③，对步骤②提取得到的水稻cDNA进行PCR扩增：

在0.2mL的PCR扩增管中，采用以下体系对②得到的水稻cDNA进行特异性扩增，并对扩增的PCR产物进行回收测序，得到OsHMA3的DNA片段。其中，编码OsHMA3的DNA片段为能编码OsHMA3蛋白的核苷酸序列，即OsHMA3蛋白对应的开放阅读框。

以下表2为50μL水稻基因组DNA扩增PCR反应体系。具体的，在本实施例中PCR反应体系应采用50μL体系，在其他实施例中，本领域技术人员也可以根据表2提供的配比进行等比例的更改或微调。

表2，50μL OsHMA3的PCR扩增反应体系

PCR扩增条件为：

3、pCAMBIA1300-EXP B-OsHMA3表达载体的构建：

具体地，包括以下步骤：

步骤①，将步骤1中②得到的测序正确的pBlunt-EXP B载体用EcoRI和SacI双酶切后与用EcoRI和SacI双酶切后的pCAMBIA1300载体连接，得到pCAMBIA1300-EXP B载体；

具体地，验证成功转入含有EcoRI和SacI酶切位点的启动子EXP B片段的pBlunt-T载体，采用EcoRI和SacI双酶切得到含特定酶切位点的基因片段。将目的基因片段连入pCAMBIA1300载体，得到表达载体pCAMBIA1300-EXP B，经测序验证正确后备用。

步骤②，将步骤1中③得到的测序正确的pBlunt-OsHAM3载体用BamHI和HindIII双酶切后与用BamHI和HindII双酶切后的pCAMBIA1300-EXP B载体连接，得到pCAMBIA1300-EXP B-OsHAM3载体；

具体地，验证成功转入含有BamHI和HindII酶切位点的OsHAM3片段的pBlunt-T载体，采用BamHI和HindII双酶切得到含特定酶切位点的基因片段。将目的基因片段连入pCAMBIA1300-EXP B载体，得到表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHAM3，经测序验证正确后备用。

实施例二：水稻转基因阳性植株的获得

1、将所述步骤3得到的双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHAM3转入农杆菌中。

2、将上述1中制得的含有双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHAM3的农杆菌侵染水稻日本晴的愈伤组织，共培养2天后经选择培养基培养、分化、生根、炼苗得到T0转基因植株。

具体地，包括以下步骤：

①挑取单菌落，接种至25mL新鲜制备的农杆菌培养基(添加抗生素)，28℃250-300rpm摇培过夜，扩培农杆菌至0.3＜OD550＜1.0，将菌液以6000g离心5分钟(4℃)，轻柔重悬农杆菌至OD550＝0.1(添加100μMAS，AS溶于DMSO的母液浓度为100mmol/L)；

②侵染预培养的愈伤5-10分钟，每隔一定时间轻柔地翻转或摇动培养瓶，去除农杆菌菌液，在滤纸上阴干愈伤组织；

③将愈伤组织放置在铺有滤纸的共培养基平板上，每皿放置量以愈伤之间有缝隙为准，于21-25℃培养箱黑暗培养72h；

④漂洗愈伤组织后，阴干并转移至筛选培养基，于28℃黑暗培养；

⑤挑取共培养2d的愈伤组织于培养皿中，若愈伤组织表面有菌体存在可用无菌水冲洗3-5次，最后一次用含有500mg/LCef无菌水静置1h，静置后置于无菌滤纸上干燥30分钟，直至愈伤组织表面无可见农杆菌存在；

⑥处理完成后将愈伤组织转移至潮霉素浓度200mg/L和400mg/LTimentin的筛选培养基进行筛选抗性愈伤，28℃暗培养，15d筛选一次，共筛选两次；

⑦将筛选两次的愈伤在筛选培养基上长至＞0.2mm时，转移至预分化培养基，黑暗条件下28℃培养7-10天，将愈伤组织转移到分化培养基，2-3周后可见幼芽；

⑧待小苗生长至7-8cm时，转移到生根培养基，7天后炼苗、移栽。

3、对上述步骤2中获得的含有双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHAM3的水稻进行检测。

具体地，可采用PCR扩增潮霉素基因的方法，包括以下步骤：

采用试剂盒法提取上述步骤2中获得的含有双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHAM3水稻的DNA，以所提DNA为模板，进行PCR检测。根据所述双元表达载体设计一对潮霉素引物进行PCR扩增，对扩增得到的产物进行电泳检测及测序验证，在本实施例中预期产物的大小为750bp，

潮霉素的引物为：

HYG-F：5’-ATCTTAGCCAGACGAGCG GG-3’(SEQ ID NO.7)

HYG-R：5’-ACACAGCCATCGGTCCAGAC-3’(SEQ ID NO.8)

本发明还提供一种双元表达载体，所述双元表达载体用于降低水稻籽粒中镉积，所述双元表达载体包括启动子EXP B的核苷酸序列和编码OsHMA3的核苷酸序列，所述启动子EXP B为水稻根系特异表达启动子。

本发明还提供一种如前述的双元表达载体在降低水稻籽粒中镉积累的应用。

实施例三：验证具有双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHAM3的水稻籽粒对Cd的吸收积累，具体实施过程如下：

①将鉴定具有双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHAM3的水稻的T2代转基因材料与野生型水稻分别单独种植在同一生长环境中；

②全生育期均用加0.1μM镉水稻浇灌水稻植株；

③水稻成熟时，分别收集水稻籽粒、根系和地上部，将收集到的水稻籽粒、根系和地上部样品于60℃烘箱烘3d，得干样；

④称取0.25g左右干样于消煮管中，添加5ml混酸(体积比HNO3∶HClO4＝85∶15)进行消煮；

⑤以浓度为2％HNO3将样品消煮液定容至25ml，充分摇匀并使用0.45μm过滤器过滤；

⑥利用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定各样品中Cd含量。

图4为本发明提供的具有双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHAM3的水稻与野生型水稻的根系镉含量检测图，图5为本发明提供的具有双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHAM3的水稻与野生型水稻的地上部镉含量检测图，图6为本发明提供的具有双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHAM3的水稻与野生型水稻的籽粒中镉含量检测图。本实施例结果表明具有双元表达载体pCAMBIA1300-EXP B-OsHAM3的水稻与野生型水稻相比，根系中富集更多的Cd；而与野生型相比，地上部和籽粒中中Cd含量显著降低超过10％。

本发明所用到的遗传转化培养基及其配制方法如下：

(1)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液配制)

将上述试剂逐一溶解，然后室温(20-25℃，下同)下用蒸馏水定容至1000mL。

2)N6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000mL。

3)铁盐贮存液(按100倍浓缩液配制)

将3.73g乙二胺四乙酸二钠和2.78g七水合硫酸亚铁分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000mL，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)MS培养基微量元素母液(按照100倍浓缩配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000mL

(2)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900mL，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000mL，分装到50mL三角瓶，封口后灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

加蒸馏水至900mL，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000mL，分装到50mL三角瓶，封口后灭菌。

3)与培养基

加蒸馏水至250mL，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口后灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5mL葡萄糖贮存液和250mLAS贮存液，分装倒入培养皿中。

4)共培养基

加蒸馏水至250mL，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口后灭菌。

5)选择培养基

加蒸馏水至250mL，调节pH值到6.0，封口，灭菌。

使用前溶解培养基，加入250mLHN和400mL分装倒入培养皿中。

6)预分化培养基

加蒸馏水至250mL，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口后灭菌。

使用前加热溶解培养基，加入250mLHN和250mLCN贮存液，分装倒入培养皿中。

7)分化培养基

加蒸馏水至900mL，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000mL，分装到50mL三角瓶，封口，灭菌。

8)生根培养基

加蒸馏水至900mL，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。

以上所述，仅是本发明的几个实施例，并非对本发明做任何形式的限制，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于本发明技术方案保护范围内。

序列表

<110> 青岛袁策集团有限公司

<120> 一种双元表达载体的构建及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2005

<212> DNA

<213> Oryza glaberrima

<400> 1

tttattttat tcatttattc acatttgaca actagaatta taccagtggg taaagaccaa 60

tgatataata gctattagga gctccgataa attgaaacat taggatcgct atatacatca 120

taattgaaaa gttaatgaaa aattcttcct tggttttggg ccaaatacta ttcattcctt 180

cctttctagc cccaacctag tacactacca cccttcgctc ggtctgtctc ttttcgatcc 240

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cgtgtggtgg atcgaatcag aaaaaaaaaa tcagaagcct aaaaaaactg gacggacaga 360

aaaaccccga aaactttatg tatcttttaa ttagttatat tatagatgta agaaatggtt 420

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ttttttttct aaaaaaagtt ttagaaatgg aaatttgcct gcataccttg agatttggga 660

tagcttaagt ccctggcaaa cgcaggaaat ttaaccaaaa aacaatatca tgccaacttc 720

gggagcaacg tactactgta catagatcaa ttctttactt atgaatggta tatataaaat 780

tgaactaggc gagatgcatg gtttcagatt tgactgttct tgaaaccgat cagacttgac 840

tgttagttgt gaagttttcc ctgtgttcca attacaagta gacactagct aatctaatac 900

taacagtagc atccctcttg gttgttctgt agtgtactga aaactaatac aacaatgcta 960

ctagtgcctg ataagttgat cttcgaacaa tgtgcgctta tagcaggtac atactctgag 1020

attgaatttc tcaacttgtg ttatcccaat tgtacttcac caatccactt ccttacaaga 1080

aattcagctc gccttatttt gtaggtactg gatactgatc gaaaatcaac aacagttcgt 1140

ttagcctttt tccctacacc aacttgtcac gttctcacca ataattctcg accggcagaa 1200

tccctaaatt tcttgccacg tacgtctgca tccctccaaa aattccctat aaatacccct 1260

tctcggccac tccctgcaac tcacccaaga acacactcga gctgagcacg tctagctagc 1320

tatatctctc aacatcttcc gagctactac tagtagctag ctagctagag gaagcagcag 1380

caatggcgaa atcttgcacc ttggtactac tacttgtcgc actggtcggg ctctcacttc 1440

ttgtgagccc cattgcttgc tcccgcaagc tcagcaagcc gaaacccaag ccgaagccga 1500

gcatgaagaa gccggtggtc cgggctcaca acaactacac cggtagcccg tcggtgacgg 1560

tcaccaccgg ctgggccgcc gccggcgcca cgtactacgg cgcccccaac ggcgacggca 1620

gcgacggtta gtgctcgctt gctttcgctt tcgagcttac agtacttgca ttgcacggca 1680

ttggtcgagc tggaactgaa attaaaatgg aatcggggga aaacttgcag gcggcgcttg 1740

cggctaccag accgccgtcg ggcagcggcc gttctcgtcg atgatcgccg ccgggagccc 1800

gtcgctgtac aagggaggca aggggtgcgg cgcgtgctat gaggtcagca cacacacacg 1860

acactgacac atgtacacac agcagtgtgt ggtcacacgg gcgagctagc tattactgct 1920

gcgagagctt tcgtgtagct ccattaatgg cggaaagtgg tcggctgatc ccaactcaat 1980

gcgttcatgt ggccgtgtac gcagg 2005

<210> 2

<211> 3014

<212> DNA

<213> Hordeum vulgare L.

<400> 2

atggccggaa aggatgaggc ggaagggctc gaggcgaggc tgctgctgct gccgcctgag 60

gcggcggcgg aggagccgac gaggtgtggc ggcggcgacg gcggcggcgg cgggaggaag 120

cggaagaaga cgtaccttga tgtccttggc gtgtgctgct ccgcggaggt cgcgctggtg 180

gagcggctgc tcgcgccgct cgacggcgtc cgcgtggtgt ccgtcgtcgt ggcgtcccgc 240

accgtcgtcg tcgagcacga ccccgccgcc gccccggagt ccgccatcgt gaaggcgctg 300

aacaaggccg gcctcgaggc gtcggtgcga gcctacggca gcagcggcgt ggtcagccgg 360

tggccgagcc cgtacatcgt cgcctccggc gtcctcctca cggcgtcctt cttcgagtgg 420

ctcttccctc ccctgcagtg cctggccgtg gcggccgtcg tcgccggcgc gccgccgatg 480

gtgcgccgtg ggttcgccgc ggcgagccgg ctgtcgctcg acatcaacgt cctcatgctc 540

atcgccgtcg ccggcgcgct ctgcctcggc gactacacgg aggccggcgc catcgtcttc 600

ctcttcacca ccgcagaatg gctcgagacg ctggcctgca caaaggcgag cgccgggatg 660

tcgtcgttga tgggcatgct gccggtgaag gcggtcatcg cgacgacggg cgaggttgtc 720

agcgtgcgcg acgtccgcgt gggcgacgtc gtcgcggtca gggccggcga gatcgtcccc 780

gtcgacggcg tggtggtcga cggccagagc gaggtcgacg agaggagcct caccggcgag 840

tccttcccgg tgccgaagca gccgcactcc gaggtctggg ccggcacaat gaactttgac 900

ggttacattg ctgtgagaac tacggctctc gccgagaact cgacggtggc gaagatggag 960

aggctggtgg aggcggcgca gaacagcagg tcgaagacgc agcggctgat cgattcgtgc 1020

gcaaagtact acacgccggc cgtggtggtt gttgcagcag gagtggccct gatcccggct 1080

ctgctcggag cagatggcct tgagcaatgg tggaagctgg ctctggtgat gcttgtgagc 1140

gcgtgcccct gcgcattagt gctgtcgaca ccggtggcat ccttctgcgc aatgctgcgc 1200

gctgcgagga tggggatctt catcaagggt ggagatgttc ttgaatcact tggggagatc 1260

agggccgtcg cgttcgacaa gaccgggacg atcaccagag gagagttcag catcgactcg 1320

ttccatctgg ttggggatca caaggttgag atggatcatc ttctttactg gattgcaagc 1380

attgagagca agtcaagcca cccaatggca gctgcacttg tggagtatgc tcaatccaaa 1440

tccatccaac caaacccgga aaatgtgggc gattttcgga tatatcccgg ggaggggatc 1500

tatggagaga tccatggaaa gcacatctac attgggaaca gaaggacatt ggcaagagcg 1560

tcatcacctc agtcaactca agaaatgggt gagatgatca agggcgtgtc gatcggctac 1620

gtgatctgcg acggcgagct cgccggcgtc ttctcgctct ccgacgactg ccggaccggc 1680

gcggcggagg cgatccggga gcttggatcg ctgggcatca agtcggttat gctgaccggg 1740

gacagcagcg cggcggcgac gcacgcgcag ggccagctcg gcggcgtcat ggaggagctc 1800

cactccgagc tcctcccgga ggacaaggtc cggctcgtca gcggcctcaa ggcgaggttc 1860

ggcccgacga tgatggtcgg ggacgggatg aacgacgcgg cggcgctggc ggcggcggac 1920

gtgggcgtgt ccatgggcat ctccgggtcg gcggcggcga tggagaccag ccacgcgacg 1980

ctcatgtcga gcgacgtgct cagggtcccc gaggccgtca ggctcggccg gtgcgcccgc 2040

cggaccatcg ccgtcaacgt ggccggctcg gtggccgtga aggccgccgt gctcgcgctg 2100

gccgcggcgt ggcgccccgt gctctgggcc gccgtgctcg ccgacgtcgg gacgtgcctc 2160

tcgtcgtgct caacagcatg acgctgctca gggaggagtg gaagggcggc gccaaggagg 2220

acggcgcgtg ccgcgccacg gcgaggtcgc tggtgatgag gtcccagctc gccgccgact 2280

cccaagcacc caacgccgca gacgctggcg ccgccggccg tgagcaaacg aacggctgcc 2340

gttgctgtcc gaagccgggc atgtcgcccg agcactcggt tgtcatcgac atccgagccg 2400

acggcgagcg tcaagaagag cggccggccg aggcggccgt cgttgccaaa tgttgcggcg 2460

gaggcggcgg cgagggcatc cgctgcggag cctccaagaa gccaactgca acggtcgttg 2520

ttgccaaatg ttgcgggggc ggcggcggcg gcgagggcac caggtgcggc gcgtccaaga 2580

atccggcaac ggcggccgtc gttgccaaat gttgcagcgg aggcggcggc gagggcatcg 2640

gctgcggagc ctccaagaag ccaactgcaa cggccgttgt tgccaaatgt tgcggcggcg 2700

gcggcgaggg caccaggtgc gccgcgtcca agaagccggc aacggcggcc gtcgttgcca 2760

aatgttgcgg tggcgatggc ggcgagggca ccggatgtgg tgcctccaag aggtcgccgc 2820

cggctgaggg aagctgcagc ggcggtgaag gcggtaccaa tggtgttggt cgttgctgca 2880

cgagcgtgaa gaggccaacc tgttgcgaca tgggagcggc ggaggtgtcc gattcttcgc 2940

cggagacggc gaaagactgc agaaatggga ggtgttgcgc gaagacgatg aactccggtg 3000

aagtgaaagg atga 3014

Claims

1.一种双元表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取启动子DNA片段；

(2)获取编码DNA片段；

2.根据权利要求1所述双元表达载体的构建方法，其特征在于，所述启动子为EXP B。

3.根据权利要求1所述双元表达载体的构建方法，其特征在于，所述编码DNA片段为编码OsHMA3的DNA片段。

4.根据权利要求1所述双元表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤2进一步包括：获取水稻的全基因组，根据水稻的全基因组获得编码OsHMA3的DNA片段。

5.根据权利要求1所述双元表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤3进一步包括：对所述步骤1获取的启动子EXP B的DNA片段，添加EcoRI和SacI酶切位点片段。

6.根据权利要求1所述双元表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤3进一步包括：对所述步骤2获取的编码OsHMA3的DNA片段，添加BamHI和HindIII酶切位点片段。

7.根据权利要求1所述双元表达载体的构建方法，其特征在于，所述步骤1获取得到的启动子DNA片段中，启动子DNA片段的获得，使用如下引物序列：

EXP B-F：GAATTCTTTATTTTATTCATTTATTCAC；

EXP B-R：GAGCTCCCTGCGTACACGGCCACATGAA。

8.一种双元表达载体构建中获取启动子DNA片使用的引物，其特征在于，所述引物序列包括：

EXP B-F：GAATTCTTTATTTTATTCATTTATTCAC；

EXP B-R：GAGCTCCCTGCGTACACGGCCACATGAA。

9.如权利要求1-7中任一项所述方法获得的双元表达载体。

10.如权利要求1-7中任一项所述方法在降低水稻籽粒镉积累中的应用。