CN106866555A

CN106866555A - 1‑二苯甲基‑4‑甲基哌嗪类化合物其制备方法和应用

Info

Publication number: CN106866555A
Application number: CN201710068356.2A
Authority: CN
Inventors: 姚红红; 张惠斌; 吴芳芳; 韩丽; 张晓田
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2017-02-08
Filing date: 2017-02-08
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2037-02-08
Also published as: CN106866555B

Abstract

本发明公开了一种式Ⅰ结构的化合物其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自H、F、Cl、Br、CN、CF₃、OH、NO₂、NH₂、取代或未取代的C₁‑C₆烷基、取代或未取代的C₁‑C₆烷氧基、取代或未取代的C₁‑C₆烷酰基或取代或未取代的C₁‑C₆烷酰胺基，本发明还公开了式Ⅰ结构的化合物其药学上可接受的盐或溶剂化物的制备方法及其在制备预防和治疗缺血性脑卒中药物中的应用。

Description

1-二苯甲基-4-甲基哌嗪类化合物其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体而言，涉及1-二苯甲基-4-甲基哌嗪类化合物其制备方法和应用。

背景技术

脑卒中是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，是目前全球第二大致死性疾病，具有“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高、并发症多”的特点，其病因主要是各种因素引起脑内动脉狭窄、闭塞或破裂，从而导致急性脑血液循环障碍，临床上表现为一过性或永久性神经功能障碍的症状和体征。脑卒中主要包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中发病率约占脑卒中病人总数的60％～70％，控制脑卒中病死率并提高生存质量是当前医学研究函待解决的难题。

目前临床常用治疗策略首选以溶栓为主，迅速复流再通是缺血性脑卒中急性期治疗成功的前提，但是在临床应用中存在着诱发脑出血等并发症以及溶栓治疗的时间窗的限制。实验动物研究发现，由缺血缺氧诱导的一系列瀑布样延迟性生化级联反应是导致脑卒中组织损伤及长期行为学障碍的关键原因。缺血性脑损伤涉及非常复杂的病理生理过程，目前研究揭示的影响脑卒中发生、发展的主要病理机制包括兴奋性毒性损伤、能量代谢障碍、离子稳态失衡、神经元过度去极化、氧化应激、炎症反应、血脑屏障破坏、凋亡和再生障碍等。基于该疾病的病理特点，深入研究脑卒中神经损伤及神经保护机制，寻找具有神经保护作用的药物具有非常重要的意义。

过去针对脑缺血诱发的级联反应中的不同环节而研发一些药物及小分子化合物，尽管临床前的基础研究结果有效，但是进入到临床实验时却没有显示预期效果。部分神经保护剂的临床药效结果并不强，而且兼具较大毒副作用从而限制了临床应用。因此，通过新的途径寻找新型神经保护剂已成为目前的研究重点。

近年研究者提出脑血管保护应该予以足够重视，提出了神经-血管单元的概念。血脑屏障包括血管内皮细胞、星型胶质细胞、周细胞、胞外间隙及基底膜，血脑屏障作为构成神经-血管单元的核心结构，其损害直接影响神经系统内环境的稳定，血脑屏障参与了脑缺血后的凋亡、炎症反应、神经及血管新生等病理进程，血脑屏障的开放和破坏是缺血性脑卒中发生、发展中重要的病理现象。周细胞，又称Rouget细胞或壁细胞，其环绕在脑微血管及毛细血管的表面，与内皮细胞、星形胶质细胞及神经元在神经血管单元中相互联系，周细胞和内皮细胞一起构成了微血管和组织间隙的屏障，周细胞在维持血脑屏障功能中具有重要意义。研究表明周细胞能通过肌动蛋白应力纤维的收缩控制毛细血管直径从而调节脑微血管血流量，周细胞数量越多，被覆率越高，则微血管的屏障功能越好。研究发现，周细胞的缺失能导致微血管血流量的减少及血脑屏障的破坏。因此，研究周细胞和血脑屏障功能的调节对脑卒中的治疗至关重要。

Sigma-1受体广泛分布于中枢神经系统，作为受体型分子伴侣调节离子通道和下游受体，从而调节线粒体功能、神经递质释放等。近年来国内外研究发现，Sigma-1受体激动剂对缺血性脑卒中治疗起到非常积极的作用。在动物和离体实验中，甚至部分临床研究中，激活Sigma-1受体被证明对神经功能损伤有明显的保护和治疗作用。Esteve公司Ⅱ期临床试验结果表明Sigma-1受体激动剂SA4503可提高急性缺血性脑卒中患者的功能恢复。以Sigma-1受体为靶点，设计小分子Sigma-1受体调节剂，并将其发展为缺血性脑卒中治疗药物具有极高的潜在价值与社会意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是设计合成了全新结构母核的Sigma-1受体调节剂，并将其发展为缺血性脑卒中治疗药物。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：

一种式Ⅰ结构的化合物其药学上可接受的盐或溶剂化物，

其中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自H、F、Cl、Br、CN、CF₃、OH、NO₂、NH₂、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的C₁-C₆烷氧基、取代或未取代的C₁-C₆烷酰基或取代或未取代的C₁-C₆烷酰胺基。

优选的，所述R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自H、CH₃、F、Cl、Br、CN、CF₃、OH、NO₂、NH₂或OCH₃；

更优选的，选自以下任一化合物：

所述的化合物其药学上可接受的盐或溶剂化物，所述盐选自硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、醋酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、马来酸盐、锂盐、钠盐、钾盐、钙盐。

一种药物组合物，包含上述化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

一种药物制剂，包含治疗有效量的所述化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或所述药物组合物在药学上可接受的赋形剂。

所述药物制剂的制剂的形式可选自片剂、丸剂、颗粒剂、膜剂、滴丸、胶囊剂、注射剂、软胶囊、乳剂、脂质体、冻干粉、高分子微球或者聚乙二醇衍生物。

所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物所述的药物组合物在制备预防或治疗缺血性脑卒中的药物中的应用。

所述缺血性脑卒中的对应症包括脑缺血、缺糖、缺氧诱发的脑损伤或神经功能异常或认知功能障碍，特别是脑卒中、脑血栓、短暂性脑缺血发作、基底节腔梗、动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞、腔隙性脑梗塞、脑栓塞、脑外伤和脑血管性痴呆。

所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的制备方法，包括以下步骤：化合物Ⅲ和化合物Ⅴ在抗坏血酸钠和硫酸铜条件下经1,3-偶极环加成反应(Huisgen环加成)制备即可；

其中，R¹、R²、R³和R⁴定义如前所述。

所述化合物Ⅲ、化合物Ⅴ、抗坏血酸钠和硫酸铜的摩尔比为3:1:1:1～3:3:1:1，优选为3:2.4:1:1～3:3:1:1；所述反应的温度为15℃～30℃，所述反应的溶剂选自甲醇、乙醇、水、三氯甲烷中的一种或多种；优选的，所述反应溶剂为的甲醇和水的混合溶剂，所述甲醇和水的体积比3:1～6:1，优选为3:1～4:1；所述化合物Ⅲ的反应浓度为0.01～1mol/L，优选为0.08～0.1mol/L，所述反应的时间为至反应结束为止。所述硫酸铜可以为硫酸铜五水合物或无水硫酸铜。

所述化合物Ⅲ通过化合物Ⅱ在酸性条件下先和亚硝酸钠反应再和叠氮钠反应制备即可；

其中R¹和R⁴的定义如前所述；

所述酸性条件为4～8mol/L的盐酸水溶液，优选为4～6mol/L的盐酸水溶液；所述化合物Ⅱ、亚硝酸钠和叠氮钠的摩尔比为1:1:1～1:2:3，优选为1:1:1～1:1:1.2；所述反应溶剂为水；所述化合物Ⅱ的反应浓度为0.5～1.1mol/L，优选为0.5～0.9mol/L；所述和亚硝酸钠反应的温度为-10℃以下，反应的时间为1～3小时；所述和叠氮钠反应的温度为-10℃至室温，反应的时间为至反应结束为止。

所述化合物Ⅴ通过化合物Ⅵ在碳酸钾和溴丙炔作用下经亲核取代反应制备即可；

其中，R²和R³定义如前所述；

所述化合物Ⅵ和3-溴丙炔、碳酸钾的摩尔比为1:1:1～1:2:4，优选为1:1:1～1:1.2:2；所述反应的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，所述反应的温度为15℃～30℃，所述化合物Ⅵ的浓度为0.1～1mol/L，优选为0.1～0.4mol/L，所述反应的时间为至反应结束为止。

为实施本发明的方法，所述化合物可通过口服、肠胃外、皮下、静脉注射、吸入式喷雾或通过植入式贮存器等给药。

本发明所述的缺血性脑卒中损伤涉及以下病症脑血栓、短暂性脑缺血发作、基底节腔梗、动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞、腔隙性脑梗塞、脑栓塞和脑血管性痴呆,以及上述疾病引起的头痛、眩晕、耳鸣、半身不遂,吞咽困难,说话不清,恶心、呕吐、昏迷等多种情况。

本发明的另一方面涉及通式I所述的化合物或其可药用盐在制备Sigma受体调节剂中的用途。

本发明的所述的式I化合物对Sigma-1受体有不同程度的亲和力。

本发明所述的式I化合物在制备预防缺血性脑卒中的药物中的应用，可以在防治对象出现缺血性脑卒的症状之前施用，也可以在防治对象出现缺血性脑卒的症状之后施用。

本发明所述的式I化合物对氧糖剥夺(OGD)诱导的周细胞损伤有较强的保护作用。动物药效实验表明，所述的式I化合物能够呈剂量依赖性地改善脑缺血动物的神经缺陷症状，缩小脑梗死面积，降低血脑屏障破坏程度，减少脑组织细胞凋亡。

本发明中，上标表示取代基的编号，例如，R¹表示第一取代基，、R²表示第二取代基；下标表示原子的个数，例如C₁-C₆烷基表示含一个碳原子～含六个碳原子的烷基，其中，“C₁-C₆烷基”可以是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基等。

有益效果：本发明公开了所述化合物在治疗脑缺血损伤诱发的神经功能异常的药物中的用途。通过动物实验手段首次证明，所述化合物能显著减少脑缺血诱发的脑梗死范围，同时能明显改善神经行为学功能，增加血脑屏障完整性。本发明的化合物有望开发为治疗脑缺血等引发的脑卒中疾病的潜在药物。

附图说明

图1：噻唑蓝(MTT)测定的C3H细胞存活率的统计图：在化合物I-1(10μM)存在或不存在下，经过氧糖剥夺12小时后，将细胞存活计算为相对正常对照的百分比；Sigma-1受体激动剂PRE084作为阳性对照药物。***p<0.001，相比于正常对照组；##p<0.01，相比于氧糖剥夺组。

图2：预给药I-1对缺血小鼠脑梗死的保护作用以及神经功能的影响：图2A是小鼠神经运动功能评分的结果统计图；图2B是2,3,5一三苯基氯化四氮唑(TTC)染色后的脑组织冠状切片图；**p<0.01，***p<0.001相比于溶剂对照组；结果表明缺血能造成小鼠神经功能损伤严重，脑部出现明显的大区域死亡，而预防性给予目标化合物I-1后，神经功能呈剂量依赖性地显著修复，脑部死亡区域显著减少。

图3：预给药I-1对缺血小鼠的血脑屏障完整性的影响：图3A是6,6'-[[3,3'-二甲基(1,1'-二苯基)-4,4'-二基]双(偶氮基)]双(4-氨基-5-羟基-1,3-萘二磺酸)四钠盐(Evans blue)渗漏实验的脑组织冠状切片图；图3B是缺血侧脑组织的Evans blue定量结果统计图；*p<0.05，相比于伪手术组；#p<0.05，相比于脑卒中模型组；Evans blue渗漏实验结果表明缺血能造成小鼠的血脑屏障破坏严重，而预防给予目标化合物I-1(0.6mg/kg)后，血脑屏障显著修复。

图4：预给药I-1对缺血小鼠的缺血侧脑组织中紧密连接相关蛋白闭锁蛋白(Occludin)、封闭蛋白5(Claudin 5)及胞质紧密粘连蛋白1(ZO-1)以及凋亡相关蛋白的影响。图4A和4B是缺血侧脑组织中紧密连接相关蛋白表达及结果统计图；图4C和4D是缺血侧脑组织中凋亡相关蛋白表达及结果统计图；**p<0.01，***p<0.001，相比于伪手术组；#p<0.05，##p<0.01相比于模型组。

图5：缺血后不同时间点给予I-1治疗对缺血小鼠神经运动功能和脑梗死的影响：图5A是神经运动功能评分的结果统计图；图5B是TTC染色后的脑组织冠状切片图；*p<0.05，**p<0.01，相比于模型组；结果表明缺血3小时内给予目标化合物I-1，可显著改善神经功能缺陷，明显减少脑梗死区域。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：制备1-二苯甲基-4-((1-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪(I-1)，其结构式如下：

步骤1)1-二苯甲基-4-(丙-2-炔-1-基)哌嗪

于50mL的茄形瓶中投入0.50g(2.0mmol)1-二苯甲基哌嗪、0.55(4.0mmol)碳酸钾和5mL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，水浴条件下缓慢滴加0.28g(2.4mmol)溴丙炔，搅拌0.5h，移至室温反应12h，反应液加水淬灭，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，以饱和氯化钠溶液洗2次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残余物经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝5∶1)，得白色固体，重0.31g，收率：54％。

1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.43–7.41(m,4H),7.31–7.26(m,4H),7.19–7.15(m,2H),4.24(s,1H),3.25(s,2H),3.17(s,1H),2.50–2.40(m,4H),2.31–2.10(s,4H).

步骤2)叠氮苯

于50mL的三颈瓶中加入1.0g(11mmol)苯胺和10mL的6mol/L盐酸，冰盐浴冷却至-10℃，滴加0.74g(11mmol)亚硝酸钠水溶液，滴加过程中保持温度低于0℃，保持温度搅拌1h，滴加0.84g(13mmol)叠氮钠水溶液，滴加过程中仍保持温度低于0℃，搅拌3h(0℃-r.t.)，反应液用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用饱和氯化钠溶液洗2次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得深棕色液体，重1.2g，收率：90％。

1H-NMR(300MHz,CDCl3):δ7.28–7.26(m,2H),7.08-7.05(m,1H),6.99–6.97(m,2H).

步骤3)1-二苯甲基-4-((1-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪

于50mL的茄形瓶中加入0.10g(0.34mmol)1-二苯甲基-4-(丙-2-炔-1-基)哌嗪、50mg(0.41mmol)叠氮苯、4mL甲醇和1mL水，室温搅拌0.5h，逐滴加入37mg(0.14mmol)五水硫酸铜水溶液，继续搅拌0.5h，再逐滴加入24mg(0.14mmol)抗坏血酸钠水溶液，反应12h，反应液以二氯甲烷萃取3次，合并有机相，用饱和碳酸氢钠溶液洗2次，饱和氯化钠溶液洗2次，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，残余物薄层层析分离(二氯甲烷：甲醇＝50：1)，乙酸乙酯重结晶，得白色固体，重45mg，收率：32％。

MS(ESI)m/z:calculated for C26H27N5[M+H]+:409.2,found:410.2

1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.68(s,1H),7.90–7.88(m,2H),7.61–7.54(m,2H),7.48–7.45(m,1H),7.40–7.38(m,4H),7.28–7.23(m,4H),7.17–7.12(m,2H),4.24(s,1H),3.63(s,2H),2.47–2.40(m,4H),2.35–2.20(m,4H)；

实施例2：制备1-二苯甲基-4-((1-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪(I-1).

步骤1)中，1-二苯甲基哌嗪和3-溴丙炔、碳酸钾的摩尔比为1:1:1；1-二苯甲基哌嗪的浓度为0.1mol/L。

步骤2)中，苯胺亚硝酸钠和叠氮钠的摩尔比为1:1:1，述化合物Ⅲ的反应浓度为0.5mol/L；使用4mol/L的盐酸水溶液。

步骤3)中，化合物Ⅲ、化合物Ⅴ、抗坏血酸钠和硫酸铜的摩尔比为3:3:1:1，0.1mol/L；反应溶剂为体积比3:1的甲醇和水。

实施例3：制备1-二苯甲基-4-((1-(3-甲基苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪(I-2)，其结构式如下：

合成步骤参考实施例1，所不同的是反应物取代基根据目标化合物的取代基需要而改变；

MS(ESI)m/z:calculated for C27H29N5[M+H]+:423.2,found:424.2

1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.65(s,1H),7.76–7.72(m,1H),7.68–7.66(m,1H),7.46–7.37(m,6H),7.28–7.23(m,5H),7.19–7.12(m,3H),4.24(s,1H),3.65(s,2H),2.48–2.41(m,4H),2.38(s,3H),2.32–2.18(m,4H)；

实施例4：制备1-二苯甲基-4-((1-(3-三氟甲基苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪(I-3)，其结构式如下：

MS(ESI)m/z:calculated for C27H26F3N5[M+H]+:477.2,found:478.2

1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.88(s,1H),8.34–8.21(m,2H),7.92–7.76(m,2H),7.42–7.39(m,4H),7.30–7.25(m,4H),7.19–7.14(m,2H),4.27(s,1H),3.70(s,2H),2.61–2.54(m,4H),2.38–2.21(m,4H)；

实施例5：制备1-二苯甲基-4-((1-(2-三氟甲基苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪(I-4)，其结构式如下：

MS(ESI)m/z:calculated for C27H26F3N5[M+H]+:477.2,found:478.2

1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.37(s,1H),8.03–8.00(m,1H),7.92–7.84(m,2H),7.73–7.70(m,1H),7.42–7.39(m,4H),7.30–7.25(m,4H),7.21–7.14(m,2H),4.27(s,1H),3.68(s,2H),2.50–2.44(m,4H),2.37–2.22(m,4H)；

实施例6：制备1-二苯甲基-4-((1-(4-三氟甲基苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪(I-5)，其结构式如下：

MS(ESI)m/z:calculated for C27H26F3N5[M+H]+:477.2,found:478.2

1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.85(s,1H),8.16(d,J＝8.4Hz,2H),7.96(d,J＝8.4Hz,2H),7.38(d,J＝7.5Hz,4H),7.25(t,J＝7.5Hz,4H),7.14(t,J＝7.5Hz,2H),4.25(s,1H),3.68(s,2H),2.61–2.48(m,4H),2.38–2.20(m,4H)；

实施例7：制备1-二苯甲基-4-((1-(3-氯苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪(I-6)，其结构式如下：

MS(ESI)m/z:calculated for C26H26ClN5[M+H]+:443.2,found:444.2

1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.76(s,1H),8.04(s,1H),7.93–7.90(m,1H),7.66–7.49(m,3H),7.40–7.37(m,4H),7.28–7.23(m,4H),7.17–7.12(m,2H),4.24(s,1H),3.65(s,2H),2.60–2.52(m,4H),2.36–2.22(m,4H)；

实施例8：制备1-二苯甲基-4-((1-(2-氯苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪(I-7)，其结构式如下：

MS(ESI)m/z:calculated for C26H26ClN5[M+H]+:443.2,found:444.1

1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.42(s,1H),7.78–7.75(m,1H),7.70–7.68(m,1H),7.63–7.56(m,2H),7.44–7.40(m,4H),7.31–7.26(m,4H),7.20–7.15(m,2H),4.27(s,1H),3.67(s,2H),2.50–2.41(m,4H),2.41–2.21(m,4H)；

实施例9：制备1-二苯甲基-4-((1-(4-氟苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪(I-8)，其结构式如下：

MS(ESI)m/z:calculated for C26H26FN5[M+H]+:427.2,found:428.2

1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.66(s,1H),7.95–7.91(m,2H),7.45–7.37(m,6H),7.27–7.22(m,4H),7.17–7.10(m,2H),4.23(s,1H),3.64(s,2H),2.48–2.38(m,4H),2.38–2.14(m,4H)；

实施例10：制备1-二苯甲基-4-((1-(4-甲氧基苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪(I-9)，其结构式如下：

合成步骤同实施例1

MS(ESI)m/z:calculated for C27H29N5O[M+H]+:439.2,found:440.2

1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.56(s,1H),7.80–7.77(m,2H),7.39–7.37(m,4H),7.27–7.23(m,4H),7.16–7.08(m,4H),4.23(s,1H),3.80(s,3H),3.62(s,2H),2.48–2.36(m,4H),2.39–2.05(m,4H)；

实施例11：制备1-二苯甲基-4-((1-(5-氯-2-甲基苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪(I-10)，其结构式如下：

MS(ESI)m/z:calculated for C27H28ClN5[M+H]+:457.2,found:458.1

1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.37(s,1H),7.61(s,1H),7.57–7.48(m,2H),7.44–7.40(m,4H),7.30–7.26(m,4H),7.20–7.15(m,2H),4.27(s,1H),3.67(s,2H),2.52–2.43(m,4H),2.37–2.24(m,4H),2.13(s,3H)；

实施例12：制备1-二苯甲基-4-((1-(5-氯-2-甲基苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪(I-11)，其结构式如下：

MS(ESI)m/z:calculated for C27H28FN5[M+H]+:441.2,found:442.2

1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.31(s,1H),7.51–7.47(m,1H),7.42–7.35(m,5H),7.31–7.25(m,5H),7.20–7.17(m,2H),4.27(s,1H),3.66(s,2H),2.41–2.41(m,4H),2.40–2.24(m,4H),2.12(s,3H)；

实施例13：制备1-二苯甲基-4-((1-(2，4-二氟苯基)-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪(I-12)，其结构式如下：

MS(ESI)m/z:calculated for C26H25F3N5[M+H]+:445.2,found:446.2

1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.42(s,1H),7.91–7.83(m,1H),7.69–7.63(m,1H),7.39–7.37(m,4H),7.33–7.31(m,1H),7.28–7.23(m,4H),7.17–7.12(m,2H),4.24(s,1H),3.65(s,2H),2.49–2.38(m,4H),2.38–2.03(m,4H)；

实施例14：通式(I)化合物对Sigma-1受体的亲和力检测

本实验中使用3H(+)-喷他佐辛作为放射性标记配基，浓度远高于3H(+)-喷他佐辛的BD1047和氟哌啶醇作为测定非特异性结合量的非标记配基。所有化合物亲和力测试实验做两复管，进行两次单独实验，实验数据表示为平均值。

抑制率的计算公式：

抑制率的意义在于，当抑制率大于100％时，就说明检测化合物与受体的亲和力大于放射性配基。

材料：C57BL/6N小鼠脑细胞膜受体样品，2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠(BCA)试剂盒定量配成1mg/ml。

Sigma-1受体结合实验：

饱和曲线的测定：设计8组3H(+)-喷他佐辛浓度，用脑细胞膜反应液稀释，分别为85.7nM、65.9nM、50.7nM、39nM、30nM、15nM、7.5nM和0nM。向每支反应管内加入100μl的脑细胞膜蛋白溶液，50μl的3H(+)-喷他佐辛溶液，总反应体系为200μl。反应管在37℃水浴中，反应3小时。用玻璃纤维滤纸(提前1小时浸泡0.3％聚乙烯亚胺)过滤后，每片滤纸用10ml反应终止液终止反应。滤纸置于烘箱内烘干后，液体闪烁计数器计数。

待测药品的sigma-1受体活性测试：在反应管(200μl体系)中，每管加入30nM的3H(+)-喷他佐辛，100μl膜受体溶液。总结合管中加入膜受体反应液补足200μl，其余管中加入10μM各待测药品和1μM氟哌啶醇。非特异性结合管中加入10μM BD1047。反应管在37℃水浴中，反应3小时。用玻璃纤维滤纸(提前1小时浸泡0.3％聚乙烯亚胺)过滤后，每片滤纸用10ml反应终止液终止反应。滤纸置于烘箱内烘干后，液体闪烁计数器计数。

实验结果如表1所示。

表1化合物I对Sigma-1受体的亲和力结果

实施例15：化合物I-1对氧糖剥夺C3H细胞损伤的保护作用

本测定按常规采用噻唑蓝(MTT)比色试验法，周细胞C3H细胞培养于含10％胎牛血清的培养基中(37℃，5％CO₂)，实验前接种于孔板上培养24小时。实验时，预先给药敷育1小时后换含药无糖DMEM培养基，至缺氧罐中(37℃，1％O₂，94％N₂，5％CO₂)。氧糖剥夺12小时后，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，37℃孵育1小时，终止培养，小心吸出培养板中的液体，每孔加入200μL二甲基亚砜(DMSO)，37℃振荡10分钟，使结晶充分溶解，在酶标仪上570nm波长测定各孔OD值，根据下列公式计算给药后对氧糖剥夺诱发的周细胞存活率：

存活率＝(OD_给药组-OD_空白组)/(OD_正常组-OD_空白组)×100％。

实验结果：统计结果显示，氧糖剥夺条件下周细胞C3H的活性显著下降，而给予目标化合物I-1(10μM)后，周细胞活性得到明显恢复而目标化合物I-1不影响正常组C3H细胞的活性。PRE084(3μM,10μM)为阳性对照药品。***p<0.001，相比于正常对照组；##p<0.01，相比于氧糖剥夺组。每组6孔,独立重复实验3次。结果如图1所示。

实施例16：化合物I-1对急性脑缺血诱发神经损伤的保护作用

目的和原理：手术方式暴露右侧近端大脑中动脉，注射玫瑰红染料，激光照射大脑中动脉形成光栓，可阻塞大脑中动脉缺血往大脑供血，造成右侧大脑局部缺血，以模拟缺血型中风患者。应用永久性大脑中动脉栓塞模型小鼠，评价候选化合物对缺血诱发的大脑损伤程度以及短期的神经行为学变化。

实验材料：

受试品为化合物I-1，白色固体粉末，易溶于DMSO。使用前将受试品充分溶解于溶媒DMSO，配置成所需要浓度(2mg/kg、0.6mg/kg、0.2mg/kg)。

对照化合物为SA4503，白色固体粉末，易溶于DMSO。使用前将受试品充分溶解于溶媒DMSO，配置成所需要浓度(0.2mg/kg)。

2,3,5一三苯基氯化四氮唑(TTC)，购自Sigma公司。余均为市售商品。

实验动物：8周龄C57BL/6J雄性小鼠，体重22～25g，购自南京大学模式动物中心。动物生产许可证：SCXK(苏)2015-0001。SPF级环境饲养，光照为12小时/12小时明暗交替，自由饮食。实验前，将动物置于实验环境适应7天。

实验方法:

(1)实验分组：伪手术组(不进行缺血)、模型-溶剂对照组(进行缺血手术)、化合物I-1(2mg/kg、0.6mg/kg、0.2mg/kg)和SA4503(0.2mg/kg)给药组(进行缺血手术)。预给药方案：缺血手术前24小时和手术前1小时，尾静脉注射分别给予空白溶剂和化合物I-1和SA4503。

(2)大脑中动脉栓塞所致局灶性脑缺血模型：本实验采用光栓法模型，操作方法如下，小鼠用1％戊巴比妥钠麻醉，右侧卧位固定，右眼眶和右耳道之间剪口，暴露头皮和颞肌，剪断颧弓暴露右侧近端大脑中动脉。尾静脉注射50μl玫瑰红后，立即用连接532nm激光器的直径100μm光纤头照射已暴露的大脑中动脉，照射时长2min，可观察到大脑中动脉供血消失。缝合伤口，消毒，动物放入护理饲养笼，加热板维持温度在37℃左右，待动物苏醒后放回饲养笼。以上实验操作均在25℃～28℃环境中进行。假手术组给予同样的操作，但不进行激光照射。

(3)神经行为评分及脑缺血面积测定：术后24小时进行神经行为评分。改良神经功能评分(mNSS)包括一系列的神经功能障碍测试，具体的评分标准如下：

1)运动功能测试

A.提尾测试：提尾后通过比较对侧肢体瘫痪程度评价：前肢不能伸展1分；后肢不能伸展1分；30秒内头部侧弯与垂直轴角度超过10°1分。

B.动物置于地上，不能直线行走1分；朝对侧旋转运动2分；对侧偏瘫3分。

2)平衡木评分测试：

抓住平衡木的边1分；单肢脱离抱住平衡木2分；两肢脱离抱住平衡木或在平衡木上旋转(﹥30秒)3分；试图保持平衡但仍滑落(﹥20秒)4分；试图保持平衡，但滑落(＞10秒)5分；10秒内从平衡木上滑落，没有试图保持平衡或抓握平衡木6分。

3)反射和异常运动测试：

耳廓反射障碍1分；角膜反射障碍1分。

上述的评价指标综合反映了运动、感觉、平衡以及反射功能，分数范围为1～14，分数越大表明神经行为损伤越明显。

神经行为评分结束后，将小鼠麻醉，0.01M的磷酸盐缓冲液(PBS)灌流5分钟，断头取脑，去掉嗅球、小脑、脑干和低位脑干，然后冠状切5片。脑片组织用1％TTC染色，正常组织为红色,梗死部位为白色，染色完置于4％多聚甲醛固定，24小时后用黑色背景拍照。

实验结果：

(1)大脑中动脉缺血后，模型组小鼠表现出明显的神经行为障碍；预处理给予化合物I-1(2mg/kg、0.6mg/kg、0.2mg/kg)，动物的神经行为症状呈剂量依赖性地明显改善，经统计学分析，高剂量和中剂量I-1给药组动物的行为评分与溶剂对照组动物相比都有显著性差异，分别是**p<0.01，***p<0.001。结果如图2A所示。

(2)TTC染色显示，小鼠脑缺血24小时后，脑组织出现明显缺血区。预处理给予化合物I-1，脑缺血区明显小于溶剂对照组。结果如图2B所示。

实施例17：化合物I-1对急性脑缺血诱发血脑屏障完整性破坏的保护作用

实验材料：

受试品为化合物I-1，白色固体粉末，易溶于DMSO。使用前将受试品充分溶解于溶媒DMSO，配置成所需要浓度(0.6mg/kg)。

6,6'-[[3,3'-二甲基(1,1'-二苯基)-4,4'-二基]双(偶氮基)]双(4-氨基-5-羟基-1,3-萘二磺酸)四钠盐(Evans blue)，购自Sigma公司。余均为市售商品。

实验方法:

(1)实验分组：伪手术组(不进行缺血)、模型-溶剂对照组(进行缺血手术)、化合物I-1(0.6mg/kg)和SA4503(0.2mg/kg)给药组(进行缺血手术)。预给药方案：缺血手术前24小时和手术前1小时，尾静脉注射分别给予空白溶剂、化合物I-1和SA4503。

(2)大脑中动脉栓塞所致局灶性脑缺血模型：手术方案同实施例15所述。在动物缺血21小时尾静脉注射200μL Evans blue(2％)，缺血24小时后，将小鼠麻醉，0.01M的PBS灌流5分钟，断头取脑，去掉嗅球、小脑、脑干和低位脑干，然后冠状切5片，拍照。取缺血侧半球组织，按1:10加入PBS匀浆完全(1mg脑组织/10μLPBS)，取700μL匀浆液与15％三氯乙酸混合(1:1)，1000g 4℃离心10min；取上清500μL移至新的EP管，加入125μL 5M氢氧化钠，充分混匀；将混合液加入200μL待测板中，在波长620nm处读取数值。

实验结果：

大脑中动脉缺血后，模型组小鼠血脑屏障破坏严重，Evans blue渗漏增加；预处理给予化合物I-1(0.6mg/kg)，动物的血脑屏障损伤明显改善，Evans blue定量结果经统计学分析，给药组动物Evans blue含量较模型组小鼠显著性降低。*p<0.05，相比于伪手术组；#p<0.05，相比于模型组。结果如图3所示。

实施例18：化合物I-1对急性脑缺血诱发的血脑屏障紧密连接以及细胞凋亡的影响。

实验材料、实验动物、实验分组和实验模型同实施例16所述。

免疫印迹

(1)组织标本的收集和蛋白提取：

动物行为学检测后，部分小鼠麻醉，0.01M PBS灌流5分钟，断头取脑，分离出梗死区的脑组织和对应部位的伪手术组的脑组织。组织称重后，置于冰上，按1:10加入组织裂解液，用匀浆器充分匀浆，冰上裂解30分钟，4℃，12000rpm离心30分钟，取上清进行蛋白定量。

(2)十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，按常规步骤进行。

实验结果：

采用免疫印迹法对各组小鼠梗死区组织中紧密连接相关蛋白闭锁蛋白(Occludin)、封闭蛋白5(Claudin 5)和胞质紧密粘连蛋白1(ZO-1)，以及凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病基因xl(Bcl-xl)、Bcl相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)、β-肌动蛋白(β-actin)蛋白水平进行检测。模型组小鼠梗死区组织中紧密连接相关蛋白Occludin、Claudin 5和ZO-1的表达较对照组显著降低，而预处理给予I-1均能显著提高紧密连接蛋白表达。模型组小鼠梗死区组织中抗凋亡蛋白Bcl-xl较对照组显著降低，凋亡蛋白cleaved caspase-3较对照组显著升高；而预处理给予I-1能显著提高Bcl-xl蛋白表达，同时降低caspase-3活化。结果如图4所示。

实施例19：化合物I-1对急性脑缺血的治疗时间窗。

实验材料、实验动物和脑缺血模型手术方案同实施例16所述。

实验分组：伪手术组(不进行缺血)、模型-溶剂对照组(进行缺血手术)、化合物I-1(0.6mg/kg)1小时、3小时、5小时给药组(进行缺血手术)，以及SA4503(0.2mg/kg)2小时给药组(进行缺血手术)。脑缺血手术后治疗给药方案：动物分别在缺血手术后1小时、3小时和5小时尾静脉注射化合物I-1；在缺血手术后2小时尾静脉注射空白溶剂和SA4503。

神经行为评分及脑缺血面积测定实验方法同实施例15所述。

实验结果：

(1)大脑中动脉缺血后，模型组小鼠表现出明显的神经行为障碍；在缺血后不同时间点(1小时、3小时和5小时)开始给予化合物I-1(0.6mg/kg)治疗，急性期脑缺血动物的神经行为症状呈剂量依赖性地明显改善，经统计学分析，缺血1小时和3小时后I-1给药组动物的行为评分与溶剂对照组动物相比都有显著性差异，分别是*p<0.05，**p<0.01。结果如图5A所示。

(2)TTC染色显示，小鼠脑缺血24小时后，脑组织出现明显缺血区。缺血后1小时和3小时给予化合物I-1治疗，脑缺血区明显小于溶剂对照组。结果如图5B所示。

上述结果表明,1-二苯甲基-4-((1-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基)哌嗪能够预防或治疗小鼠脑缺血损伤，改善神经功能缺损，保护神经组织。

Claims

1.一种式Ⅰ结构的化合物其药学上可接受的盐或溶剂化物，

其中，R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自H、F、Cl、Br、CN、CF₃、OH、NO₂、NH₂、取代或未取代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的C₁-C₆烷氧基、取代或未取代的C₁-C₆烷酰基、取代或未取代的C₁-C₆烷酰胺基中的任意一种。

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述R¹、R²、R³和R⁴各自独立地选自H、CH₃、F、Cl、Br、CN、CF₃、OH、NO₂、NH₂或OCH₃。

3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，选自以下任一化合物：

4.根据权利要求1所述的化合物其药学上可接受的盐或溶剂化物，其特征在于，所述盐选自硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、醋酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、马来酸盐、锂盐、钠盐、钾盐或钙盐。

5.一种药物组合物，包含权利要求1～4所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。

6.一种药物制剂，包含治疗有效量的如权利要求1～4所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或权利要求5所述的药物组合物在药学上可接受的赋形剂。

7.根据权利要求6所述药物制剂，其特征在于，所述制剂的形式选自片剂、丸剂、颗粒剂、膜剂、滴丸、胶囊剂、注射剂、软胶囊、乳剂、脂质体、冻干粉、高分子微球或者聚乙二醇衍生物。

8.权利要求1～4中任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物或权利要求5所述的药物组合物在制备预防或治疗缺血性脑卒中的药物中的应用。

9.权利要求1～4中任意一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：化合物Ⅲ和化合物Ⅴ在抗坏血酸钠和无水硫酸铜条件下经1,3-偶极环加成反应制备即可；

其中，R¹、R²、R³和R⁴定义如权利要求1～4所述。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述化合物Ⅲ通过化合物Ⅱ在酸性条件下先和亚硝酸钠反应再和叠氮钠反应制备即可；化合物Ⅴ通过化合物Ⅵ在碳酸钾和溴丙炔作用下经亲核取代反应制备即可；

其中，R¹、R²、R³和R⁴定义如权利要求1～4所述。