CN106856998A - 一种利用盐芥与拟南芥的嫁接体系研究植物耐逆分子机理的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用盐芥与拟南芥的嫁接体系研究植物耐逆分子机理的方法，本发明首先构建了盐芥与拟南芥的嫁接体系；然后进行ICP‑OES检测，以观察嫁接前后耐盐性的改变；再提取RNA进行转录组表达谱检测，以观察盐处理前后的基因的变化及基因交流情况。本发明经过大量的试验摸索，成功构建了盐芥/拟南芥、盐芥/盐芥、拟南芥/盐芥、拟南芥/拟南芥嫁接体系，然后通过对嫁接体系盐处理前后的Na⁺、K⁺、Mg²⁺等离子组含量检测，以观察嫁接前后耐盐性的改变；通过提取RNA进行转录组表达谱检测，以观察盐处理前后的基因的变化及基因交流情况。本发明构建的盐芥与拟南芥的嫁接体系为植物耐逆机理的研究提供了一种新的方向和思路。

Description

一种利用盐芥与拟南芥的嫁接体系研究植物耐逆分子机理的 方法

技术领域

本发明涉及植物嫁接及耐逆分子生物学技术领域，特别是涉及一种利用盐芥与拟南芥的嫁接体系研究植物耐逆分子机理的方法。

背景技术

植物之间的嫁接是源于我国的一种古老的农艺技术，时至今日，在园艺生产上，嫁接仍旧是园艺领域常用的技艺。其作为一种农业生产技术，已广泛用于农业、林业和园艺植物的栽培及科研开发。尽管嫁接技术历史悠久，但真正大量的研究始于上世纪七八十年代，特别是近十年来，随着生物技术的迅速发展，嫁接的研究逐渐从过去传统农艺性状的研究过渡到分子机理的研究。在国内外掀起一次空前的研究热潮。但是远缘嫁接不亲和严重限制了该技术的推广与应用，若能针对不同的情况找出不亲和的具体原因，并通过一些巧妙的手段克服或减弱不亲和现象，这在植物嫁接研究中具有特别重要的意义。

目前为止，嫁接杂交、嫁接育种发展较迅速，相应的对此分子机制研究也在逐渐兴起，国内外均有关于嫁接引起的基因转移的报道。水平基因的转移，主要发生在微生物中，常常是由质粒介导，是仅次于基因垂直传递重要的基因交流。由于此现象的存在，使生物早期的演化关系更为复杂。目前为止，已发现基因的转移不仅仅是发生在细菌之间，而且也发生在细菌与高等生物之间，甚至是高等生物之间。而植物的嫁接引起的水平基因转移有些是可以遗传的，但有些是不可以遗传的，这就使得本来就不明朗的这种植物嫁接引起的水平基因转移更加扑朔迷离。而且大部分的研究材料局限于同一物种之间进行。

远缘杂交在育种上能提供丰富的遗传材料，拓展育种范围，创造突变优势更强的新品种，具有重要的意义，而且远缘杂交的成功对研究植物嫁接分子机理的机制提供有利的基础保障。然而大部分植物远缘杂交是不亲和的。

盐芥和拟南芥为十字花科中两个不同属的小型植株，其中，盐芥为耐盐的模式植物，具有对高盐、干旱和低温等非生物胁迫极高的耐受能力，使得盐芥成为研究植物耐受非生物胁迫逆境机理的理想材料；而拟南芥为研究双子叶植物的模式植物，且为不耐盐的甜土植物。而且盐芥和拟南芥的基因组测序已经完成，因此，通过构建盐芥和拟南芥的嫁接体系对于植物嫁接的分子机制及嫁接的耐逆分子机理研究具有重要的意义。但是，拟南芥和盐芥作为同科不同属的两种植物，这两种植物之间的嫁接属于属间的远缘嫁接，远缘嫁接不亲和的特点使得拟南芥和盐芥嫁接体系的构建极为困难。目前还未见有通过构建盐芥与拟南芥的嫁接体系来研究植物耐逆分子机理的报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用盐芥与拟南芥的嫁接体系研究植物耐逆分子机理的方法。本发明首先构建了盐芥与拟南芥的嫁接体系；然后进行ICP-OES检测，以观察嫁接前后耐盐性的改变；再提取RNA进行转录组表达谱检测，以观察盐处理前后的基因的变化及基因交流情况。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用盐芥与拟南芥的嫁接体系研究植物耐逆分子机理的方法，步骤如下：

(1)将盐芥种子经消毒处理后，播种于含有琼脂粉的1/2MS培养基上，层积一周后转入长日照光照条件下培养；待盐芥萌发时，将拟南芥种子进行消毒处理，并播种于含有琼脂粉的1/2MS培养基上，层积或直接置于长日照光照条件下培养；

(2)在无菌条件下进行拟南芥/盐芥的嫁接、拟南芥/拟南芥的自嫁接、盐芥/盐芥的自嫁接和盐芥/拟南芥的嫁接；

(3)将嫁接好的拟南芥/盐芥、拟南芥/拟南芥、盐芥/盐芥和盐芥/拟南芥复合体置于短日照条件下培养，得嫁接苗；

(4)将嫁接苗移栽至水培营养液中继续培养，然后用NaCl进行处理，对嫁接苗盐处理前后离子组含量进行检测，并提取RNA进行转录组表达谱检测。

优选的，步骤(1)中，盐芥种子和拟南芥种子消毒处理的方法为：用浓度为0.5％的NaClO消毒6-8分钟，然后用无菌水清洗4-6次。上述消毒处理的方法避免了先用酒精消毒，再用NaClO进行二次消毒，操作步骤简化，从而减少了二次污染，而且种子不会灭过而影响种子萌发及后期实验。

优选的，步骤(1)中，所述1/2MS培养基中琼脂的质量百分含量为1-1.5％；进一步优选为1.2％。研究发现，选用上述琼脂含量的1/2MS培养基，既保证足够的水分利于种子正常萌发生长，又有利于后续的取材嫁接。

优选的，步骤(1)中，所述长日照培养的条件为：16h光照/8h黑暗，光照条件下的温度为21-23℃，黑暗条件下的温度为18-20℃，光强为8000lux，相对湿度大于70％。

优选的，步骤(2)中，拟南芥/盐芥的嫁接方法为：将萌发后7-10天的盐芥的真叶及生长点切去，只保留两片子叶作为砧木；将萌发后3-5天的拟南芥下胚轴距上端1/4处切下作为接穗，嫁接到盐芥砧木上。

优选的，步骤(2)中，盐芥/拟南芥、盐芥/盐芥、拟南芥/拟南芥的嫁接方法为：将作为砧木拟南芥或盐芥移至另一含有琼脂粉的1/2MS培养基中，并套上长3-6mm，内径/外径为0.3mm/1.5mm的无菌塑料管，在解剖镜下将接穗的下胚轴与砧木在套管内对接形成嫁接体，最后将培养皿迅速封口。

具体的，盐芥/拟南芥的嫁接方法为：以萌发后7-10天的盐芥作为接穗，以萌发后5-7天的拟南芥作为砧木，在砧木上套上长3-6mm，内径/外径为0.3mm/1.5mm的无菌塑料管，在解剖镜下将接穗的下胚轴与砧木在套管内对接形成嫁接体，最后将培养皿迅速封口。

盐芥/盐芥的嫁接方法为：将长势一致的盐芥下胚轴1/2偏上端处切下，然后将作为砧木的部分移至另一含有琼脂粉的1/2MS培养基中，并套上长3-6mm，内径/外径为0.3mm/1.5mm的无菌塑料管，在解剖镜下将接穗的下胚轴与砧木在套管内对接形成嫁接体，最后将培养皿迅速封口。

拟南芥/拟南芥的嫁接方法为：以萌发后3-5天的拟南芥分别作为接穗和砧木，在作为砧木的拟南芥上套上长3-6mm，内径/外径为0.3mm/1.5mm的无菌塑料管，在解剖镜下将接穗的下胚轴与砧木在套管内对接形成嫁接体，最后将培养皿迅速封口。

优选的，步骤(3)中，嫁接好的拟南芥/盐芥、拟南芥/拟南芥、盐芥/盐芥和盐芥/拟南芥复合体在短日照条件下的培养时间分别为：6-8天、6-8天、10-12天和10-12天。

优选的，步骤(3)中，短日照培养的条件为：8h光照/16h黑暗，光照条件下的温度为21-23℃，黑暗条件下的温度为18-20℃，光强为8000lux，相对湿度大于70％。

优选的，步骤(4)中，所述水培营养液为1/2Hogland营养液。

本发明的有益效果：

(1)本发明系首次通过构建盐芥与拟南芥的嫁接体系来研究植物耐逆分子机理，由于拟南芥和盐芥属于同科不同属的两种植物，这两种植物之间的嫁接属于属间的远缘嫁接，远缘嫁接不亲和的特点使得拟南芥和盐芥嫁接体系的构建极为困难，本发明经过大量的试验摸索，成功构建了盐芥/拟南芥、盐芥/盐芥、拟南芥/盐芥、拟南芥/拟南芥嫁接体系，然后通过对嫁接体系盐处理前后的Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等离子组含量检测，以观察嫁接前后耐盐性的改变；通过提取RNA进行转录组表达谱检测，以观察盐处理前后的基因的变化及基因交流情况。因此，本发明构建的盐芥与拟南芥的嫁接体系为植物耐逆机理的研究提供了一种新的方向和思路。

(2)在本发明的盐芥、拟南芥的嫁接体系构建过程中，选择以萌发生长到特定时期的盐芥或拟南芥分别作为砧木和接穗，通过直接用NaClO单一灭菌减少污染，有利于种子正常萌发；通过选用1.2％的琼脂和双面刀片的使用，有利于得到切口平整，光滑且伤害最小的切面；通过在解剖镜下操作嫁接，有利于砧木与接穗形成层的更好的吻合，提高嫁接成功率，克服实现了远缘杂交不亲和的难题。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：嫁接成功的盐芥/拟南芥(E/A)嫁接苗；图中，B为A的嫁接部位放大图。

图2A-图2F：嫁接苗盐处理前后的Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等离子组含量；图中，A为拟南芥缩写；E为盐芥缩写；S为地上茎叶部分；R为地下根部分；CK为对照；NaCl为100mmol/LNaCl盐处理。

图3A：拟南芥/拟南芥自嫁接RNA-Seq测序结果；At为拟南芥缩写。

图3B：拟南芥/盐芥嫁接RNA-Seq测序二者水平基因交流结果；At为拟南芥；Es为盐芥。

图3C：盐芥/盐芥自嫁接RNA-Seq测序结果；Es为盐芥。

图3D：盐芥/拟南芥嫁接RNA-Seq测序二者水平基因交流结果；Es为盐芥；At为拟南芥。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

术语说明：

1/2MS培养基：指将MS培养基中的大量元素成分减半后的MS培养基。MS培养基为现有技术中常规的培养基，该培养基的配方组成是现有技术中已知的(如专利CN104604539A中公开的MS培养基)，该培养基可以购买得到，也可以自行配制。

本申请中所采用培养基是以1/2MS培养基为基础，并对1/2MS培养基中的琼脂粉的含量进行了优化，培养基中琼脂的质量百分含量为1-1.5％；更优选为1.2％。

1/2Hogland营养液：指将Hogland营养液中的全部成分减半后的营养液。Hogland营养液为现有技术中常规的营养液，该营养液的配方是现有技术中已知的。

正如背景技术所介绍的，现有技术中还未见有通过构建盐芥与拟南芥的嫁接体系来研究植物耐逆分子机理的报道，基于此，本申请首先构建了盐芥与拟南芥的嫁接体系，然后利用构建的嫁接体系来研究植物耐逆分子机理。

在本发明的一种实施方案中，所提供的利用盐芥与拟南芥的嫁接体系研究植物耐逆分子机理的方法，步骤如下：

(1)砧木和接穗材料的准备：首先是将籽粒饱满的盐芥种子用0.5％的次氯酸钠消毒并种在琼脂粉浓度为1.2％的1/2MS培养基上，4℃层积1周后置于长日照或短日照光照培养箱内竖直培养萌发备用。待盐芥萌发时，用同样的消毒方法将拟南芥种子进行消毒并种于琼脂粉浓度为1.2％的1/2MS培养基上，4℃层积或直接置于长日照光照培养箱中竖直培养，待拟南芥种子萌发后3-5天进行拟南芥/盐芥(A/E)的嫁接、拟南芥/拟南芥(A/A)的自嫁接、盐芥/盐芥(E/E)的自嫁接；待拟南芥种子萌发5-7天进行盐芥/拟南芥(E/A)的嫁接。

(2)无菌条件下嫁接：首先用双面刀片将长势一致的盐芥下胚轴1/2偏上端处切下，然后将作为砧木的拟南芥或盐芥用镊子轻轻夹起移至一新的琼脂粉浓度为1.2％的1/2MS培养基的培养皿中，并套上事先准备好的长约3-6mm，内径/外径为0.3mm/1.5mm的无菌塑料管中，其次在解剖镜下将接穗的下胚轴与砧木在套管内对接形成嫁接体，最后将培养皿迅速封口。拟南芥/拟南芥的自嫁接、盐芥/盐芥的自嫁接及盐芥/拟南芥的嫁接均可用此法。

拟南芥/盐芥的嫁接方法是将长势一致的无菌苗盐芥用镊子移至新的琼脂浓度1.2％的1/2MS培养基上，用刀片将盐芥的的真叶及生长点切去，只保留两片子叶作为砧木备用。将长势一致的在解剖镜下能看到有真叶刚萌发的拟南芥下胚轴距上端1/4左右处切下作为接穗嫁接到事先准备好的盐芥砧木上。

(3)嫁接体的培养：将嫁接好的拟南芥/拟南芥的自嫁接、盐芥/盐芥的自嫁接及盐芥/拟南芥及拟南芥/盐芥复合体置于短日照光照培养箱中竖直培养分别6-8天、10-12天、10-12天和6-8天。然后将嫁接成功的嫁接苗移至1/2Hogland营养液中水培备用。

(4)嫁接苗盐处理前后的Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等离子组含量检测：嫁接苗水培35天后将长势一致的嫁接苗分成两批，一批为对照，一批用100mmol/L的NaCl进行处理一周后取材，进行ICP-OES检测以观察嫁接前后耐盐性的改变。

(5)嫁接苗的RNA-seq检测：嫁接苗水培35天后将长势一致的嫁接苗分成两批，一批为对照，一批用150mmol/L的NaCl进行处理24小时后取材，提取RNA进行转录组表达谱检测，以观察盐处理前后的基因的变化及基因交流情况。

上述方法中，对于种子的消毒方法为：直接用浓度为0.5％的NaClO消毒6-8分钟，然后用无菌水清洗4-6次。此种方法避免了先用酒精消毒，再用NaClO进行二次消毒，操作步骤简化从而减少了二次污染而且种子不会灭过而影响种子萌发及后期实验。

上述方法中，选用琼脂粉浓度为1.2％的1/2MS培养基，既保证足够的水分利于种子正常萌发生长，又有利于后续的取材嫁接。

上述方法中，对于盐芥、拟南芥嫁接体系的构建而言，如何选择砧木和嫁接苗是影响嫁接成活率的关键所在。本发明在拟南芥/盐芥的嫁接中，选用萌发7-10天的略大的盐芥幼苗作为砧木，其侧根已长出，这样可以满足其接穗——拟南芥生长速度快的特点，能大大提高嫁接成活率及保证嫁接苗后期生长旺盛。由于拟南芥生长周期短，用较大苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易导致拟南芥提前开花，嫁接苗长势较差，选用萌发3-5天的较嫩幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，还能进一步保证嫁接苗后期生长的旺盛强壮。

在盐芥/盐芥的嫁接中，选用萌发7-10天的略大的盐芥幼苗，其侧根已长出，且细胞分生能力强，能大大提高嫁接成活率及保证嫁接苗后期生长旺盛。由于盐芥在萌发初期生长缓慢，在营养土中萌发后的前三周为其生长缓慢期，三周后会迅速生长，在培养皿中其生长缓慢期有所缩短，但仍存在，在萌发一周后会迅速生长，因此用较小苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易导致嫁接后的嫁接苗生长缓慢侧根较多且长势较差，选用萌发7-10天的幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，还能进一步保证嫁接苗后期生长的旺盛强壮。

在盐芥/拟南芥的嫁接中，以萌发生长到特定时期——4片真叶，即萌发后7-10天的盐芥为接穗，以萌发后5-7天的拟南芥为砧木，此时作为砧木的拟南芥的主根已有侧根出现，能有利保障嫁接成活率及嫁接苗后期长势。

上述方法中，嫁接后的嫁接体置于短日照下培养，不仅有利于提高嫁接体的成活率，而且还有利于嫁接苗后期生长强壮。这是因为拟南芥生长周期短，在其受到伤害后，其生长周期就更进一步大大缩短，如果在长日照条件下，就会导致嫁接苗弱小而过早的开花结果完成其生活史。而短日照可以延长其营养生长，就弥补长日照下的不足。

上述方法中，种子消毒接种均在无菌超净台中操作，嫁接过程也在无菌超净台中操作，而且嫁接伤口的对接是在解剖镜下操作，更有利于接穗和砧木形成层的对接，可以提高嫁接苗的成功率。

上述方法中，步骤(4)和步骤(5)中，对盐处理前后的嫁接苗的砧木和接穗分别取材，取材过程中均离嫁接部位5mm外取材，避免造成污染以至于实验结果不可靠。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：利用盐芥与拟南芥的嫁接体系研究植物耐逆分子机理的方法

(1)砧木和接穗材料的准备：首先是将籽粒饱满的盐芥种子用0.5％的次氯酸钠消毒并种在琼脂粉浓度为1.2％的1/2MS培养基上，4℃层积1周后置于长日照或短日照光照培养箱内竖直培养萌发备用。待盐芥萌发时，用同样的消毒方法将拟南芥种子进行消毒并种于琼脂粉浓度为1.2％的1/2MS培养基上，4℃层积或直接置于长日照光照培养箱中竖直培养，待拟南芥种子萌发后3-5天进行拟南芥/盐芥(A/E)的嫁接、拟南芥/拟南芥(A/A)的自嫁接、盐芥/盐芥(E/E)的自嫁接。而盐芥/拟南芥(E/A)的嫁接是待拟南芥种子萌发5-7天进行嫁接，此时作为砧木的拟南芥的主根已有侧根出现，能有利保障嫁接成活率及嫁接苗后期长势。

(2)无菌条件下嫁接：

1)拟南芥/盐芥的嫁接方法为：将萌发后7-10天的盐芥的真叶及生长点切去，只保留两片子叶作为砧木；将萌发后3-5天的拟南芥下胚轴距上端1/4处切下作为接穗，嫁接到盐芥砧木上。

2)盐芥/拟南芥的嫁接方法为：以萌发后7-10天的盐芥作为接穗，以萌发后5-7天的拟南芥作为砧木，在砧木上套上长3-6mm，内径/外径为0.3mm/1.5mm的无菌塑料管，在解剖镜下将接穗的下胚轴与砧木在套管内对接形成嫁接体，最后将培养皿迅速封口。

3)盐芥/盐芥的嫁接方法为：将长势一致的盐芥下胚轴1/2偏上端处切下，然后将作为砧木的部分移至另一含有琼脂粉的1/2MS培养基中，并套上长3-6mm，内径/外径为0.3mm/1.5mm的无菌塑料管，在解剖镜下将接穗的下胚轴与砧木在套管内对接形成嫁接体，最后将培养皿迅速封口。

4)拟南芥/拟南芥的嫁接方法为：以萌发后3-5天的拟南芥分别作为接穗和砧木，在作为砧木的拟南芥上套上长3-6mm，内径/外径为0.3mm/1.5mm的无菌塑料管，在解剖镜下将接穗的下胚轴与砧木在套管内对接形成嫁接体，最后将培养皿迅速封口。

(3)嫁接体的培养：将嫁接好的拟南芥/拟南芥的自嫁接、盐芥/盐芥的自嫁接及盐芥/拟南芥及拟南芥/盐芥复合体置于短日照光照培养箱中竖直培养分别6-8天、10-12天、10-12天和6-8天。然后将嫁接成功的嫁接苗移至1/2Hogland营养液中水培备用。

(4)嫁接苗盐处理前后的Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等离子组含量检测：嫁接苗水培35天后，将长势一致的嫁接苗随机分成两批，一批为空白对照，一批用100mmol/L的NaCl进行处理，一周后取材(对盐处理前后的嫁接苗的砧木和接穗分别取材，取材过程中均离嫁接部位5mm外取材，避免造成污染以至于实验结果不可靠)，进行ICP-OES检测，以观察嫁接前后Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Zn²⁺等离子组含量的变化。

结果如图2A-图2F所示，由图可以看出，嫁接前后Na⁺、K⁺含量差异较明显，说明耐盐性发生明显改变，而其它离子变化不是很明显。

(5)嫁接苗的RNA-seq检测：嫁接苗水培35天后，将长势一致的嫁接苗分成两批，一批为对照，一批用150mmol/L的NaCl进行处理，24小时后取材，提取RNA进行转录组表达谱，以观察盐处理前后的基因的变化及基因交流情况，结果如图3A-图3D所示。

由图可以看出，根据RNA-seq检测发现在盐芥和拟南芥的相互嫁接中均存在水平基因交流现象，这为进一步揭示植物耐逆分子机制奠定基础。

对比例1：

将实施例1的拟南芥/盐芥嫁接中，对于砧木苗的选择分别调整为：萌发后3-5天的盐芥苗和萌发后11-15天的盐芥苗，其他操作同实施例1。

对比例2：

将实施例1中拟南芥/盐芥的嫁接中，对于接穗苗的选择调整为：萌发后6-8天的拟南芥苗；将砧木苗的选择分别调整为：萌发后3-5天的盐芥苗、萌发后7-10天的盐芥苗和萌发后11-15天的盐芥苗，其他操作同实施例1。

考察实施例1、对比例1和对比例2嫁接后嫁接苗的成活率以及后期长势，结果如表1所示。

表1：萌发时间长短对嫁接苗的影响

(注：表1中接穗为拟南芥，砧木为盐芥)

由表1可以看出，在拟南芥/盐芥的嫁接中，作为砧木和接穗的盐芥和拟南芥幼苗，其萌发时间的选择会影响嫁接的成活率以及嫁接苗后期的长势。与对比例1和对比例2相比，本发明实施例1选用萌发7-10天的略大的盐芥幼苗，其侧根已长出，这样可以满足其接穗拟南芥生长速度快的特点，能大大提高嫁接成活率及保证嫁接苗后期生长旺盛。由于拟南芥生长周期短，用较大苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易导致拟南芥提前开花，嫁接苗长势较差，选用萌发3-5天的较嫩幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，还能进一步保证嫁接苗后期生长的旺盛强壮。

对比例3：

将实施例1的盐芥/盐芥的嫁接中，对于砧木苗和接穗苗选择调整为：萌发后3-5天的盐芥苗，其他操作同实施例1。

对比例4：

将实施例1的盐芥/盐芥的嫁接中，对砧木苗和接穗苗选择调整为：萌发后13-17天的盐芥苗；其他操作同实施例1。

考察实施例1、对比例3和对比例4嫁接后嫁接苗的成活率以及后期长势，结果如表2所示。

表2：萌发时间长短对嫁接苗的影响

由表2可以看出，在盐芥/盐芥的嫁接中，作为砧木和接穗的盐芥幼苗，其萌发时间的选择会影响嫁接的成活率以及嫁接苗后期的长势。与对比例1和对比例2相比，本发明实施例1选用萌发7-10天的略大的盐芥幼苗，其侧根已长出，且细胞分生能力强，能大大提高嫁接成活率及保证嫁接苗后期生长旺盛。由于盐芥在萌发初期生长缓慢，在营养土中萌发后的前三周为其生长缓慢期，三周后会迅速生长，在培养皿中其生长缓慢期有所缩短，但仍存在，在萌发一周后会迅速生长，因此用较小苗嫁接一方面不易成活，另一方面很容易导致嫁接后的嫁接苗生长缓慢侧根较多且长势较差，选用萌发7-10天的幼苗既利于提高嫁接苗的成活率，还能进一步保证嫁接苗后期生长的旺盛强壮。

对比例5：

将实施例1的盐芥/拟南芥的嫁接中，对于砧木苗的选择分别调整为：萌发后3-4天的拟南芥苗和萌发后15±2天的盐芥苗，其他操作同实施例1。

对比例6：

将实施例1的盐芥/拟南芥的嫁接中，对于接穗苗的选择调整为：萌发后3-5天的盐芥芥苗和萌发后15±2的盐芥苗，其他操作同实施例1。

考察实施例1、对比例5和对比例6嫁接后嫁接苗的成活率以及后期长势，结果如表3所示。

表3：萌发时间长短对嫁接苗的影响

(注：表3中接穗为盐芥，砧木为拟南芥)

由表3可以看出，在盐芥/拟南芥的嫁接中，以萌发生长到特定时期——4片真叶，即萌发后7-10天的盐芥为接穗，以萌发后5-7天的拟南芥为砧木，此时作为砧木的拟南芥的主根已有侧根出现，能有利保障嫁接成活率及嫁接苗后期长势。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用盐芥与拟南芥的嫁接体系研究植物耐逆分子机理的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将盐芥种子经消毒处理后，播种于含有琼脂粉的1/2MS培养基上，层积后转入长日照光照条件下培养；待盐芥萌发时，将拟南芥种子进行消毒处理，并播种于含有琼脂粉的1/2MS培养基上，层积或直接置于长日照光照条件下培养；

(2)在无菌条件下进行拟南芥/盐芥的嫁接、拟南芥/拟南芥的自嫁接、盐芥/盐芥的自嫁接和盐芥/拟南芥的嫁接；

(3)将嫁接好的拟南芥/盐芥、拟南芥/拟南芥、盐芥/盐芥和盐芥/拟南芥复合体置于短日照条件下培养，得嫁接苗；

(4)将嫁接苗移栽至水培营养液中继续培养，然后用NaCl进行处理，对嫁接苗盐处理前后离子组含量进行检测，并提取RNA进行转录组表达谱检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，盐芥种子和拟南芥种子消毒处理的方法为：用浓度为0.5％的NaClO消毒6-8分钟，然后用无菌水清洗4-6次。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述1/2MS培养基中琼脂的质量百分含量为1-1.5％；优选为1.2％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述长日照培养的条件为：16h光照/8h黑暗，光照条件下的温度为21-23℃，黑暗条件下的温度为18-20℃，光强为8000lux，相对湿度大于70％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，拟南芥/盐芥的嫁接方法为：将萌发后7-10天的盐芥的真叶及生长点切去，只保留两片子叶作为砧木；将萌发后3-5天的拟南芥下胚轴距上端1/4处切下作为接穗，嫁接到盐芥砧木上。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，盐芥/拟南芥、盐芥/盐芥、拟南芥/拟南芥的嫁接方法为：将作为砧木拟南芥或盐芥移至另一含有琼脂粉的1/2MS培养基中，并套上长3-6mm，内径/外径为0.3mm/1.5mm的无菌塑料管，在解剖镜下将接穗的下胚轴与砧木在套管内对接形成嫁接体，最后将培养皿迅速封口。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，嫁接好的拟南芥/盐芥、拟南芥/拟南芥、盐芥/盐芥和盐芥/拟南芥复合体在短日照条件下的培养时间分别为：6-8天、6-8天、10-12天和10-12天。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，短日照培养的条件为：8h光照/16h黑暗，光照条件下的温度为21-23℃，黑暗条件下的温度为18-20℃，光强为8000lux，相对湿度大于70％。

9.根据权利要求1所述的无菌嫁接方法，其特征在于，步骤(4)中，所述水培营养液为1/2Hogland营养液。

10.根据权利要求1所述的无菌嫁接方法，其特征在于，所述的种子消毒、播种和嫁接过程均是在无菌超净台中操作。