CN106822168B - 含硒有机化合物的组合物和其使用方法 - Google Patents

含硒有机化合物的组合物和其使用方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及包含硒化合物的组合物和使用所述组合物调节受试者的葡萄糖代谢的方法，所述化合物例如5’‑甲基硒代腺苷、Se‑腺苷‑L‑高半胱氨酸、γ‑谷氨酰基‑甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物或式(III)的化合物和其组合。

Description

含硒有机化合物的组合物和其使用方法
相关申请的交叉引用
本专利申请是2014年3月14日提交的国际专利申请系列号PCT/US2014/029542的部分继续，所述申请通过引用结合到本文中。
发明领域
本申请涉及含硒有机成分和化合物的组合物和它们用于代替胰岛素、提高胰岛素活性、抑制葡萄糖产生或调节各种生物途径中的葡萄糖代谢的方法。
发明背景
硒(Se)是在许多生物过程中起关键作用的必需微量元素，所述生物过程例如生殖、甲状腺激素新陈代谢、DNA合成和保护免于氧化损伤和感染。硒在各种硒依赖性酶的催化位点处掺入，所述酶例如谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、硫氧还蛋白还原酶和一种蛋氨酸亚砜还原酶。这些含硒酶促进代谢活性的调节、免疫功能、抗氧化防御、胞内氧化还原调节和线粒体功能。
此外，文献中的结果显示，不同化学形式的硒具有不同的生物活性。例如，selenozolidine在减少肺肿瘤数量方面比硒代甲硫氨酸更加有效。(Poerschke等，JBiochem Molecular Toxicology 2012 26:344)。Barger等表明，饲喂不同来源的硒例如硒甲硫氨酸、亚硒酸钠和硒化酵母的小鼠对基因表达和对线粒体结构和功能的特定功能途径具有不同的影响。(Barger等，Genes and Nutrition 2012 7:155)。硒化酵母包含许多硒和硫化合物，但硒化酵母中并非所有的硒化合物影响生物过程。此外，已经表明硒化酵母中硒和硫化合物的混合物彼此抑制，负面影响生物过程或对细胞有毒。
非胰岛素依赖性(II型)糖尿病(DM)是特征为在骨骼肌、肝和脂肪中胰岛素抗性结合由胰脏β-细胞功能导致的胰岛素分泌缺乏的疾病。胰岛素抗性是II型糖尿病的重要特征。在肝中，Forkhead Box Class O (FOXO)基因转录因子家族的成员以非磷酸化状态被活化，并且它们位于细胞核中。在核中，FOXO转录因子结合基因例如葡萄糖6-磷酸酶(G6PC)的启动子区。与其它转录因子例如PGC-1α一起，发生G6PC转录增加，从而增加葡萄糖产生速率。葡萄糖6-磷酸酶还催化糖原异生和糖原分解的最后一步，导致从肝释放葡萄糖。因此，G6PC在控制葡萄糖稳态中，特别在糖尿病受试者中，是重要的。
不同化学形式的硒的生物活性和利用度的明显不同要求鉴定正面影响生物过程的含硒化合物。具体而言，需要表征硒在胰岛素代替、提高胰岛素活性、抑制葡萄糖产生或调节各种生物途径中的葡萄糖代谢中的作用。此外，对于患有I型或II型糖尿病的个体，需要确定硒化合物的作用和它们作为胰岛素代替疗法的功效。
发明简述
本公开内容提供在受试者中代替胰岛素的方法。代替胰岛素的方法包括给予受试者组合物，所述组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。该方法的组合物还可包含载体。
本公开内容还提供在受试者中提高胰岛素活性的方法。提高胰岛素活性的方法包括给予受试者组合物，所述组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。该方法的组合物还可包含载体。提高胰岛素活性的方法可进一步包括给予胰岛素或其类似物或衍生物。
本公开内容进一步提供在受试者中抑制葡萄糖产生的方法。抑制葡萄糖产生的方法包括给予受试者组合物，所述组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。该方法的组合物还可包含载体。
本公开内容进一步提供在受试者中调节葡萄糖代谢的方法。调节葡萄糖代谢的方法包括：给予受试者组合物，所述组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。该方法的组合物还可包含载体。
在受试者中代替胰岛素、提高胰岛素活性、抑制葡萄糖产生或调节葡萄糖代谢的任何一种方法中，所述组合物可包含5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸和γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸。在受试者中代替胰岛素、提高胰岛素活性、抑制葡萄糖产生或调节葡萄糖代谢的任何一种方法中，所述组合物可包含至少0.1% (w/v)的5’-甲基硒代腺苷。在受试者中代替胰岛素、提高胰岛素活性、抑制葡萄糖产生或调节葡萄糖代谢的任何一种方法中，所述组合物可呈干燥或胶囊形式。
在受试者中代替胰岛素、提高胰岛素活性或抑制葡萄糖产生或调节葡萄糖代谢的任何一种方法中，所述组合物可进一步包含胰岛素或其类似物或衍生物。在受试者中代替胰岛素、提高胰岛素活性、抑制葡萄糖产生或调节葡萄糖代谢的任何一种方法中，所述组合物可进一步包含胰岛素敏化剂、胰岛素促分泌剂或肠降血糖素模拟物。在受试者中代替胰岛素、提高胰岛素活性、抑制葡萄糖产生或调节葡萄糖代谢的任何一种方法中，所述组合物可排除5’-甲基硫代腺苷、S-腺苷-L-高半胱氨酸或γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸中的一种或多种。
在受试者中代替胰岛素、提高胰岛素活性、抑制葡萄糖产生或调节葡萄糖代谢的任何一种方法中，所述组合物可口服给予。在受试者中代替胰岛素、提高胰岛素活性、抑制葡萄糖产生或调节葡萄糖代谢的任何一种方法中，5’-甲基硒代腺苷或式(I)的化合物是硒代糖苷。在受试者中代替胰岛素、提高胰岛素活性、抑制葡萄糖产生或调节葡萄糖代谢的任何一种方法中，所述组合物可给予至受试者的肝细胞。
本公开内容提供包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物和式(III)的化合物和其组合的至少两种不同的化合物的组合物。所述组合物还可包含载体。
本公开内容进一步提供包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸和γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸的至少三种不同的化合物的组合物。所述组合物还可包含载体。
本公开内容提供组合物，其包含至少0.1% (w/v)的式(I)化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
或其药学上可接受的盐、水合物或前药。
R1是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R2是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R3是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、环烷基、羧基或C-酰胺基；或R3与R4和它们所连接的原子一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R4是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、环烷基、羧基或C-酰胺基；或R3与R4和它们所连接的原子一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R5是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基。
R6是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基。
R7是C3-C16烷基，其中C3-C16烷基不是具有羧基和氨基两者的取代的烷基；烯基、炔基、酮、氨基醇；氨基酸，其选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；OR’、Se-R’、S- R’，其中OR’的R’选自H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基，其中Se-R’的R’选自H、C3-C16烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基，其中S-R’的R’选自H、C3-C16烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基。
R8是氢、叠氮基、烷基、烯基、炔基。式(I)组合物还可包含载体。此外，组合物的5’-甲基硒代腺苷或式(I)的化合物可以是硒代糖苷。式(I)组合物还可给予至受试者的肝细胞。
本公开内容还提供组合物，其包含至少0.1% (w/v)的式(II)化合物：
Figure 167233DEST_PATH_IMAGE002
或其药学上可接受的盐、水合物或前药。
R1是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R2是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R3是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、环烷基、羧基或C-酰胺基；或R3与R4和它们所连接的原子一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R4是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、环烷基、羧基或C-酰胺基；或R3与R4和它们所连接的原子一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R5是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基。
R6是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基。
R8是氢、叠氮基、烷基、烯基、炔基。
R9是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R9与R10一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R10是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R9与R10一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R11是OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或药学上可接受的盐或内盐。
式(II)组合物可包含载体。式(II)组合物还可给予至受试者的肝细胞。
最后，本公开内容提供组合物，其包含至少0.1% (w/v)的式(III)化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
或其药学上可接受的盐、水合物或前药。
R1是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R2是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R3是OH、OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或药学上可接受的盐或内盐。
R4是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或药学上可接受的盐或内盐。
R5是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基。
R6是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基。
R7是C3-C16烷基，其中C3-C16烷基不是具有羧基和氨基两者的取代的烷基；烯基、炔基、酮、氨基醇；氨基酸，其选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；OR’、Se-R’、S- R’，其中OR’的R’选自H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基，其中Se-R’的R’选自H、C3-C16烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基，其中S-R’的R’选自H、C3-C16烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基。
式(III)组合物可包含载体。式(III)组合物还可给予至受试者的肝细胞。
本文所述的组合物可包含组合物的至少约0.033% (w/v)的两种化合物的每一种，或组合物的至少约0.033%(w/v)的三种化合物的每一种。
附图简述
附图简述如下。当表明硒化合物的混合物时，以ppb为单位的量表示在混合物的各硒化合物中硒的ppb的量。当表明硫化合物的混合物时，以ppb为单位的量表示在混合物的各硫化合物中硫的ppb的量。例如，150 ppb的化合物CDE组合包含150 ppb的在化合物C中的硒、150 ppb的在化合物D中的硒和150 ppb的在化合物E中的硒，总硒浓度为450 ppb。例如，150 ppb的化合物HIJ组合包含150 ppb的在化合物H中的硫、150 ppb的在化合物I中的硫和150 ppb的在化合物J中的硫，总硫浓度为450 ppb。
图1是显示150 ppb的各单独的化合物和化合物C、化合物D、化合物E、化合物H、化合物I和化合物J的各种组合对通过OD490表示的AML-12肝细胞的细胞成活力的作用的图。
图2A-2B显示化合物C、化合物D、化合物E、化合物H、化合物I和化合物J的各种组合和单独化合物对AML-12肝细胞中的G6pc基因的mRNA表达水平的作用。
图2A是柱状图，显示用对照和150 ppb化合物CDE和化合物HIJ处理48小时的AML-12细胞中的相对G6pc mRNA水平。
图2B是柱状图，显示用单独化合物C、化合物D、化合物E、化合物H、化合物I和化合物J处理48小时的AML-12细胞中的相对G6pc mRNA表达。
图3是柱状图，显示胰岛素、化合物CDE和胰岛素和化合物CDE两者的组合对AML-12细胞中的相对G6pc mRNA表达水平的影响。当与对照组(无胰岛素和化合物CDE处理组)相比时，*P < 0.05，** P < 0.01。
图4是柱状图，显示胰岛素、化合物CDE和胰岛素和化合物CDE两者的组合对用8-CPT/Dex共处理的AML-12细胞中相对G6pc mRNA表达水平的影响。插图是具有高放大倍数的柱状图，其显示用单独的水(对照)、8-CPT/Dex和胰岛素的组合和8-CPT/Dex、胰岛素和化合物CDE的组合处理的AML-12细胞中的相对G6pc mRNA表达水平。
图5A-5D显示化合物CDE和化合物HIJ对AML-12肝细胞中Insr和Igf1r基因的相对mRNA表达水平的影响。
图5A是柱状图，其显示用150 ppb的化合物CDE和150 ppb的化合物HIJ处理24小时的AML-12细胞中的相对Insr mRNA表达水平。当与对照(水溶媒处理)组相比时，** P <0.01。
图5B是柱状图，其显示用150 ppb的化合物CDE和150 ppb的化合物HIJ处理24小时的AML-12细胞中的相对Igf1r mRNA表达水平。当与对照(水溶媒处理)组相比时，** P <0.01。
图5C是柱状图，其显示用对照、10或100 nM胰岛素、150 ppb或300 ppb化合物CDE处理或用8-CPT/Dex、胰岛素和化合物CDE共处理的AML-12细胞中的相对Insr mRNA表达水平。但与对照(无8-CPT/Dex/胰岛素/化合物CDE处理)组相比时，*P < 0.05、** P < 0.01。
图5D是柱状图，其显示用对照、10或100 nM胰岛素、150 ppb或300 ppb化合物CDE处理或用8-CPT/Dex、胰岛素和化合物CDE共处理的AML-12细胞中的相对Igfr1 mRNA表达水平。当与对照(无8-CPT/Dex/胰岛素/化合物CDE处理)组相比时，*P < 0.05、** P < 0.01。
图6A-6C显示化合物CDE和化合物HIJ对在含血清培养基中培养的AML-12细胞的在苏氨酸32处磷酸化的Foxo3 (pFoxo3T32)和在苏氨酸28处磷酸化的Foxo4 (pFoxo4T28)的蛋白水平的影响。
图6A是蛋白质印迹，其显示在响应用水对照或150 ppb的化合物CDE和150 ppb的化合物HIJ处理AML-12细胞6小时时各种信号转导分子包括pFoxo3T32和pFoxo4T28的蛋白表达。
图6B是柱状图，其显示图6A的凝胶中的pFoxo3T32蛋白水平的定量分析。
图6C是柱状图，其显示图6A的凝胶中的pFoxo4T28蛋白水平的定量分析。
图7A-7C显示化合物CDE、化合物CE和化合物DE对在无血清培养基中培养的AML-12细胞中的pFoxo3T32和pFoxo4T28的蛋白水平的影响。
图7A是蛋白质印迹，其显示在响应用水对照或150 ppb的化合物CDE、150 ppb的化合物CE和150 ppb的化合物DE处理AML-12细胞6小时时各种信号转导分子包括pFoxo3T32和pFoxo4T28的蛋白表达。
图7B是柱状图，其显示图7A的凝胶中的pFoxo3T32蛋白水平的定量分析。
图7C是显示图7A的凝胶中的pFoxo4T28蛋白水平的定量分析的图。
图8是蛋白质印迹，其显示对照或150 ppb的化合物CDE和150 ppb的化合物HIJ对人IMR-32神经元细胞的pFOXO4T28、pFOXO4S193和其它信号转导分子的蛋白水平的影响。
图9A-9C显示化合物CDE对在原代小鼠肝细胞中的葡萄糖产生、G6pc mRNA表达和胞外乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响。
图9A是柱状图，其显示在用对照、8-CPT/Dex、10或100 nM胰岛素、150 ppb或300ppb化合物CDE和胰岛素和化合物CDE的组合处理的小鼠肝细胞的培养基中的相对葡萄糖水平。与溶媒处理组(图中第一个柱)相比，* P < 0.05。
图9B是柱状图，其显示用对照、10或100 nM胰岛素、150 ppb或300 ppb化合物CDE和胰岛素和化合物CDE的组合处理的小鼠肝细胞中的相对G6pc mRNA水平。与溶媒处理组(图中第一个柱)相比，* P < 0.05。
图9C是柱状图，其显示在用对照、10或100 nM胰岛素、150 ppb或300 ppb化合物CDE和胰岛素和化合物CDE的组合处理的小鼠肝细胞的培养基中的相对LDH水平。
图10A-10C显示化合物CDE对用8-CPT/Dex刺激的原代小鼠肝细胞中的葡萄糖产生、G6pc mRNA表达和胞外LDH活性的影响。
图10A是柱状图，其显示在用对照、8-CPT/Dex、8-CPT/Dex和胰岛素或化合物CDE的组合和8-CPT/Dex、胰岛素和化合物CDE的组合处理的小鼠肝细胞的培养基中的相对葡萄糖水平。
图10B是柱状图，其显示在用对照、8-CPT/Dex、8-CPT/Dex和胰岛素或化合物CDE的组合和8-CPT/Dex、胰岛素和化合物CDE的组合处理的小鼠肝细胞中的相对G6pc mRNA水平。
图10C是柱状图，其显示在用对照、8-CPT/Dex、8-CPT/Dex和胰岛素或化合物CDE的组合和8-CPT/Dex、胰岛素和化合物CDE的组合处理的小鼠肝细胞的培养基中的相对LDH水平。与溶媒处理组(图中第一个柱)相比，* P < 0.05。
图11A-11B显示化合物CDE对在无血清培养基中培养的原代小鼠肝细胞中的葡萄糖产生和胞外LDH活性的影响。
图11A是柱状图，其显示在8-CPT/Dex的存在或不存在下用基础对照(水溶媒)、10或100 nM胰岛素(Ins)、150 ppb或300 ppb化合物CDE和胰岛素和化合物CDE的组合处理6小时的小鼠肝细胞的培养基中的相对葡萄糖水平。与基础对照组(图中第一个柱)相比，# P <0.05。与8-CPT/Dex处理组(图中第一个填充柱)相比，* P < 0.05。
图11B是柱状图，其显示在8-CPT/Dex的存在或不存在下用基础对照(水溶媒)、10或100 nM胰岛素(Ins)、150 ppb或300 ppb化合物CDE和胰岛素和化合物CDE的组合处理6小时的小鼠肝细胞的培养基中的相对LDH水平。
图12A-12F显示化合物CDE对原代小鼠肝细胞中磷酸化的Pdk1 (pPdk1)、在丝氨酸473处磷酸化的Akt (pAktS473)、在苏氨酸24处磷酸化的FOXO1 (pFoxo1T24)、在苏氨酸32处磷酸化的Foxo3 (pFoxo3T32)、在苏氨酸28处磷酸化的Foxo4 (pFoxo4T28)和在丝氨酸9处磷酸化的Gsk3b (pGsk3bS9)的蛋白表达水平的影响。
图12A是蛋白质印迹，其显示对照、胰岛素或150 ppb或300 ppb化合物CDE对原代小鼠肝细胞中的pPdk1、pAktS473、pFoxo1T24、pFoxo3T32、pFoxo4T28和pGsk3bS9的蛋白水平的影响。
图12B是柱状图，其显示用对照、100 nM的胰岛素或150 ppb或300 ppb化合物CDE处理的小鼠肝细胞中的相对pPdk1蛋白水平。
图12C是柱状图，其显示用对照、100 nM的胰岛素或150 ppb或300 ppb化合物CDE处理的小鼠肝细胞中的相对pAktS473蛋白水平。
图12D是柱状图，其显示用对照、100 nM的胰岛素或150 ppb或300 ppb化合物CDE处理的小鼠肝细胞中的相对pFoxo1T24蛋白水平。
图12E是柱状图，其显示用对照、100 nM的胰岛素或150 ppb或300 ppb化合物CDE处理的小鼠肝细胞中的相对pFoxo3T32蛋白水平。
图12F是柱状图，其显示用对照、100 nM的胰岛素或150 ppb或300 ppb化合物CDE处理的小鼠肝细胞中的相对pGsk3bS9蛋白水平。
图13A-13D显示化合物CDE处理对在无血清条件下培养的原代小鼠肝细胞中的磷酸化Pdk1、Akt、Foxo1和Foxo3的蛋白表达水平的时间影响。
图13A是蛋白质印迹，其显示化合物CDE处理0分钟、5分钟、30分钟、1小时、2小时和3小时对原代小鼠肝细胞中的pPdk1、pAktT308、pFoxo1T24、pFoxo3T32、Akt和Actb的蛋白水平的影响。
图13B是柱状图，其显示用化合物CDE处理小鼠肝细胞0分钟、5分钟、30分钟、1小时、2小时和3小时后的相对pPdk1蛋白水平。当与无化合物CDE处理(0分钟组)相比时，* P至少< 0.05。
图13C是柱状图，其显示用化合物CDE处理小鼠肝细胞0分钟、5分钟、30分钟、1小时、2小时和3小时后的相对pAktT308蛋白水平。当与无化合物CDE处理(0分钟组)相比时，#P< 0.15，* P至少< 0.05。
图13D是柱状图，其显示用化合物CDE处理小鼠肝细胞0分钟、5分钟、30分钟、1小时、2小时和3小时后的合并的pFoxo1T24和pFoxo3T32蛋白水平。与无化合物CDE处理(0分钟组)相比，#P < 0.15，* P至少< 0.05。
图14A-14B显示化合物CDE对在Lepr db/db 小鼠中血糖水平的影响。
图14A是柱状图，其显示每两天经腹膜内注射生理盐水或化合物CDE后，在小鼠年龄为27天至3.5个月的Lepr db/db 小鼠中的血糖水平。
图14B是柱状图，其显示每日经腹膜内注射生理盐水或化合物CDE后，在小鼠年龄为38天至66天的Lepr db/db 小鼠中的血糖水平。
图15A-15B显示每两天经腹膜内注射生理盐水或化合物CDE后，化合物CDE对小鼠年龄为27天至3.5个月的Lepr db/db 小鼠中的葡萄糖耐受的影响。
图15A是显示在零时间点(注射葡萄糖之前立即测定)和葡萄糖注射后的各个时间点(0.25小时、0.5小时、1小时和2小时)，化合物CDE对盐水-和化合物CDE-处理的Lepr db/db 小鼠中的血糖水平的影响的图。* P是指在相同时间点与盐水处理组相比至少< 0.05。
图15B是显示图15A中的图的曲线下面积(AUC)的定量分析的图。
发明详述
定义
本文使用的术语"给药"和"给予"是指提供药物、前药或其它剂或治疗性处理(例如本申请的组合物)给受试者体内、体外或给离体细胞、组织和器官的行为。本公开内容的化合物和组合物可通过本领域已知的任何给药途径提供给受试者。对人体的示例性的给药途径可通过眼(经眼)、口(经口)、皮肤(局部或透皮)、鼻(经鼻)、肺(吸入)、口腔粘膜(含服)、脑、耳、直肠、阴道或通过注射。注射途径可经静脉内、皮下、瘤内、腹膜内等给予。
术语"烷基"是指具有1-24个碳原子和优选至少3个碳原子的支链或非支链的饱和的烃基。在一些实施方案中，"烷基"包含1-16个碳原子(即，C1-16烷基)，特别在其它实施方案中，烷基包含3-16个原子(即，C3-16烷基)。烷基可任选被酰基、氨基、酰胺基、叠氮基、羧基、烷基、芳基、卤代、胍基、氧代、硫烷基、亚氧硫基、磺酰基、杂环基或羟基取代。烷基的其它实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、3-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、新己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基和十六烷基。
在C3-C16烷基的一个实施方案中，烷基不是取代的烷基。在其它实施方案中，取代的烷基不具有羧基和氨基两者。在进一步的实施方案中，C3-C16烷基不是具有羧基和氨基两者的取代的烷基。
术语“碱金属”是指包括但不限于适当的碱金属盐(例如IA族)盐、碱土金属盐(例如IIA族)和其它生理上可接受的金属的金属盐。金属盐可从铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌或其组合制备。
术语"烯基"是指含有至少一个碳-碳双键的直链或支链碳链。在一些实施方案中，"烯基"是指含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的烃(即，C1-10烯基)。烯基的实例包括但不限于乙烯、丙烯、丁烯、戊烯、己烯、庚烯、辛烯、壬烯和癸烯。烯基可任选被氨基、烷基、卤代或羟基取代。
术语"酰胺基"是指C-酰胺基，例如--CONR'R''部分；或N酰胺基，例如--NR'COR''部分，其中R'和R''可独立为氢、烷基、烯基、炔基、烷氧基、碳环、杂环、芳基或芳烷基。"磺酰胺基"包括--NR'--SO2--R''部分，其中R'和R''可以是氢、烷基、芳基或芳烷基。
术语"炔基"是指包含至少一个碳-碳三键的直链或支链碳链。在示例性的实施方案中，"炔基"是指含有2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的烃(即，C2-10炔基)。炔基的实例包括但不限于乙炔、丙炔、丁炔、戊炔、己炔、庚炔、辛炔、壬炔和癸炔。炔基可任选被氨基、烷基、卤代或羟基取代。
术语"芳基"是指包含1、2或3个环的碳环芳族系统。所述环可以侧接的方式（in apendant manner）连接在一起，或可稠合在一起。术语"芳基"包括芳族基团，例如苯基、萘基、四氢萘基、1,2,3,4-四氢化萘、2,3-二氢化茚、茚和联苯基。芳基可任选地被氨基、烷基、卤代、羟基、碳环、杂环或另一芳基取代。
本文使用的“组合”是指多个组分。组合可包含原子、化合物、组合物、组分、成分、元件、部分、分子或混合物，基本上由它们组成或由它们组成。组合包括但不限于混合物。
术语"稠合"意指第二个环通过与第一个环具有两个共同(即，共享)的相邻原子而存在(即，连接或形成)。术语"稠合"等同于术语"缩合”、“连接”和“结合”，它们可互换使用。
术语"环烷基"是指包含许多个环原子的单环饱和的或部分地饱和的碳环。在一些实施方案中，"环烷基"是指含有3-12个环原子的碳环(即，C3-12环烷基)。如本文使用的，环烷基包括单环、桥接、螺(spiro)、稠合、二环和三环的环结构。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基、降冰片基(norbornyl)、十氢化萘、金刚烷基和环辛基。环烷基可任选被氨基、烷基、卤代或羟基取代。
术语"芳烷基"是指芳基-取代的烷基部分。芳烷基可以是"低级芳烷基"，其中芳基与具有1-6个碳原子的烷基连接。芳烷基的实例包括苄基、二苯甲基、三苯甲基、苯基乙基和二苯乙基。术语“苄基”和“苯基甲基”可互换使用。在一些实施方案中，烷基是C3-C16烷基。在其它实施方案中，烷基不是具有羧基和氨基两者的取代的烷基。
术语"芳基氧基"是指与氧原子连接的芳基。芳基氧基可任选地被卤代、羟基或烷基取代。所述基团的实例包括但不限于苯氧基、4-氯-3-乙基苯氧基、4-氯-3-甲基苯氧基、3-氯-4-乙基苯氧基、3,4-二氯苯氧基、4-甲基苯氧基、3-三氟甲氧基苯氧基、3-三氟甲基苯氧基、4-氟苯氧基、3,4-二甲基苯氧基、5-溴-2-氟苯氧基、4-溴-3-氟苯氧基、4-氟-3-甲基苯氧基、5,6,7,8-四氢萘基氧基、3-异丙基苯氧基、3-环丙基苯氧基、3-乙基苯氧基、4-叔丁基苯氧基、3-五氟乙基苯氧基和3-(1,1,2,2-四氟乙氧基)苯氧基。
术语"烷氧基"是指被烷基或环烷基取代的含有氧基的基团。烷氧基的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、叔丁氧基和环己基氧基。"低级烷氧基"具有1-6个碳原子和包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、异丙氧基和叔丁氧基。
术语"芳烷氧基"是指通过氧原子与其它基团连接的含有氧基的芳烷基。"低级芳烷氧基"是与低级烷氧基连接的苯基。低级芳烷氧基的实例包括但不限于苄基氧基、1-苯基乙氧基、3-三氟甲氧基苄基氧基、3-三氟甲基苄基氧基、3,5-二氟苄基氧基、3-溴苄基氧基、4-丙基苄基氧基、2-氟-3-三氟甲基苄基氧基和2-苯基乙氧基。
术语"酰基"是指–C (=O)R部分，其中R是氢、烷基、烯基、炔基、碳环、杂环、芳基或芳烷基。优选R是氢、烷基、芳基或芳烷基。
术语"羧基"是指--R'C(=O)OR''部分，其中R'和R''独立为氢、烷基、烯基、炔基、碳环、杂环、杂环烷基、芳基、醚或芳烷基。另外，R'可以是共价键。"羧基"包括羧酸和羧酸酯两者。
术语"羧酸"是指其中R''是氢或盐的羧基。羧酸包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、2-甲基丙酸、环氧乙烷-甲酸和环丙烷甲酸。
术语"羧酸酯"或"酯"是指其中R''是烷基、烯基、炔基、碳环、杂环、芳基或芳烷基的羧基。羧酸的实例包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、环丙烷甲酸、环丁烷甲酸、环戊烷甲酸、环己烷甲酸、环庚烷甲酸、环辛烷甲酸或环壬烷甲酸。
术语“羰基”是指是指C=O部分，亦称为“氧代”基团。
术语"杂环"或"杂环基"或“杂环状环”是指具有3-12个碳原子的芳族或非-芳族环状烃。在示例性的实施方案中，"杂环基"是指含有3、4、5或6个环原子的环状烃(即，C3-6杂环基)。杂环可任选是取代的、饱和的或不饱和的。通常，至少一个环原子是氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)或硒(Se)。例如，在一些实施方案中，来自杂环基的环N原子是与-C(O)部分成键形成酰胺、氨基甲酸酯或脲的原子。杂环基团的实例包括但不限于氮丙啶、环氧乙烷、硫杂环丙烷、氮杂环丁烷、环氧丁烷（oxetane）、硫杂环丁烷(thietane)、吡咯烷、咪唑、四氢呋喃、吡喃、噻喃、硫代吗啉、硫代吗啉S-氧化物、噁唑啉、四氢噻吩、哌啶、四氢吡喃、硫杂环己烷、咪唑烷（imidazolidine）、氧代二氧杂环戊烯基(oxodioxolenyl)、噁唑烷、噻唑烷、二氧杂环戊烷、二硫杂环戊烷、哌嗪、噁嗪、对二硫杂环己烷、二噁烷、吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、吡咯基、噻吩基、1,2,3-三唑基、1,2,4-三唑基、吲哚基、咪唑基、噻唑基、噻二唑基、嘧啶基、噁唑基、三嗪基和tetrastyla。示例性的杂环包括苯并咪唑、二氢噻吩、二噁英(dioxin)、二噁烷、二氧杂环戊烷、对二硫杂环己烷、二噻嗪、二噻唑、二硫杂环戊烷、呋喃、吲哚、3-H吲唑、3-H-吲哚、吲嗪、异吲哚、异噻唑、异噁唑、吗啉、噁唑、噁二唑、噁噻唑、噁噻唑烷、噁嗪、噁二嗪、哌嗪、哌啶、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、吡啶、嘧啶、嘧啶、哒嗪、吡咯、吡咯烷、四氢呋喃、四嗪、噻二嗪、噻二唑、噻三唑、噻嗪、噻唑、噻吩、三嗪和三唑。杂环可任选被氨基、烷基、烯基、炔基、卤代、羟基、碳环、硫代、其它杂环或芳基取代。
术语"杂芳基"是指其中多个环原子中的至少一个是O、N、S、P或Se的环状烃。杂芳基的环的特征为环成员间共享的不定域[pi]电子(芳族性)。本文定义的杂芳基部分可具有碳(C)、N、S、P或Se成键侧基（bonding hands）。例如，在一些实施方案中，来自杂芳基的环N原子是与-C(O)部分成键形成酰胺、氨基甲酸酯或脲的原子。在示例性的实施方案中，"杂芳基"是指包含5或6个环原子的环(即，C5-6杂芳基)。杂芳基的实例包括但不限于吡咯、呋喃、噻吩(thiene)、噁唑、噻唑、异噁唑、异噻唑、咪唑、吡唑、噁二唑、噻二唑、三唑、四唑、吡啶、嘧啶、吡嗪、哒嗪和三嗪。
术语"羟基"是指取代基-OH。
术语"氧代"是指取代基 =O。
术语"硝基"是指NO2。
术语“叠氮基”是指N3。
术语“硫类似物”是指化合物的类似物，其中一个或多个硒原子被一个或多个硫原子置换的。
术语"硫烷基"是指--SR'部分，其中R'是氢、烷基、烯基、炔基、碳环、杂环、芳基或芳烷基。
术语"亚氧硫基"是指--SOR'部分，其中R'是氢、烷基、烯基、炔基、碳环、杂环、芳基或芳烷基。
术语"磺酰基"是指--SOR'部分，其中R'是指氢、烷基、烯基、炔基、碳环、杂环、芳基或芳烷基。
术语"酮"是指含有至少一个羰基的部分，其中羰基碳与两个其它碳原子结合。在示例性的实施方案中，"酮"是指含有3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的含有羰基的部分(即，C3-10 酮)。酮基的实例包括但不限于丙酮、丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛酮、壬酮、癸酮、环丁酮、环戊酮、环己酮、环庚酮、环辛酮、环壬酮和环癸酮。
术语"氨基"是指具有式--NR'R''的伯、仲或叔基团，其中R'和R''独立为氢、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、羧基、环烷基、杂环或另一氨基(如在酰肼的情况下)。R'和R''与它们所连接的氮原子一起形成具有4-8个原子的环。因此，术语"氨基"包括未取代的、单取代的(例如一烷基氨基或一芳基氨基)和二取代的(例如二烷基氨基或芳烷基氨基)氨基。氨基包括--NH2部分、甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、甲基-乙基氨基、吡咯烷-1-基或哌啶子基、吗啉代等。形成环的其它示例性的"氨基"包括吡咯基、咪唑基、吡唑基、异噻唑基、异噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲嗪基、咪唑基、异吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、喹嗪基。含有氨基的环可任选被另一氨基、烷基、烯基、炔基、卤代或羟基取代。
术语“胺”是指式--NR'R''的伯、仲或叔氨基，其中该定义中使用的R'和R''独立为氢、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、芳基、羧基、环烷基、杂环或其它氨基(在酰肼的情况下)或R'和R''与它们所连接的氮原子一起形成具有4-8个原子的环。因此，本文使用的术语"氨基"包括未取代的、单取代的(例如一烷基氨基或一芳基氨基)和二取代的(例如二烷基氨基或芳烷基氨基)氨基。氨基包括--NH2、甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、甲基-乙基氨基、吡咯烷-1-基或哌啶子基（piperidino）、吗啉代等。形成环的其它示例性的"氨基"包括但不限于吡咯基、咪唑基、吡唑基、异噻唑基、异噁唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲嗪基、咪唑基、异吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、喹嗪基。含有氨基的环可任选被另一氨基、烷基、烯基、炔基、卤代或羟基取代。
术语“醇”是指"羟基"或包含–OH部分的任何取代基。
术语"氨基醇"是指含有醇和胺基团两者的官能团。"氨基醇"亦指具有与代替羧酸基团的醇结合的碳的氨基酸。在示例性的实施方案中，"氨基醇"包含与邻近带醇的碳的碳结合的胺。在示例性的实施方案中，"氨基醇"是指含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子的含有胺和醇的部分(即，C1-12氨基醇)。氨基醇的实例包括但不限于乙醇胺、庚胺醇、乙基异丙肾上腺素、去甲肾上腺素、丙醇胺、鞘氨醇、甲醇胺、2-氨基-4-巯基丁-1-醇、2-氨基-4-(甲基硫代)丁-1-醇、半胱氨醇、苯基甘氨醇、脯氨醇、2-氨基-3-苯基-1-丙醇、2-氨基-l-丙醇、环己基甘氨醇、4-羟基-脯氨醇、亮氨醇、叔-亮氨醇、苯基丙氨醇、a-苯基甘氨醇、2-吡咯烷甲醇、酪氨醇、缬氨醇、丝氨醇、2-二甲基氨基乙醇、组氨醇、异亮氨醇、亮氨醇、甲硫氨醇、l-甲基-2-吡咯烷甲醇、苏氨醇、色氨醇、丙氨醇、精氨醇、甘氨醇、谷氨醇、4-氨基-5-羟基戊酰胺、4-氨基-5-羟基戊酸、3-氨基-4-羟基丁酸、赖氨醇、3-氨基-4-羟基丁酰胺和4-羟基-脯氨醇。
术语"氨基酸"是指含有羧酸和与紧邻羧酸基团的碳原子结合的胺的基团，并包括天然和合成氨基酸两者。氨基酸的实例包括但不限于精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。在一些实施方案中，羧基被H、盐、酯、烷基或芳烷基取代。氨基还可被H、酰基、烷基、烯基、炔基、羧基、环烷基、芳烷基或杂环基取代。
术语"醚"是指--R'--O--R''部分，其中R'和R''独立为氢、烷基、烯基、炔基、碳环、杂环、芳基或芳烷基。另外，R'可以是与碳连接的共价键。
术语"卤素"是指氟、氯、溴或碘原子。
术语"卤化物"是指含有与氟、氯、溴或碘原子结合的原子的官能团。本文公开的示例性的实施方案可包括"烷基卤化物"、"烯基卤化物"、"炔基卤化物"、"环烷基卤化物"、"杂环基卤化物"或"杂芳基卤化物"基团。在示例性的实施方案中，"烷基卤化物"是指含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的含有碳-卤素键的部分(即，C1-10烷基卤化物)。烷基卤化物基团的实例包括但不限于氟甲基、氟乙基、氯甲基、氯乙基、溴甲基、溴乙基、碘甲基和碘乙基。除非另外说明，否则本文涉及的任何含碳基团可包含一个或多个碳-卤素键。通过非限制性实例的方式，C1烷基可以是，但不限于甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基、溴甲基、二溴甲基、三溴甲基、碘甲基、二碘甲基、三碘甲基、氯氟甲基、二氯氟甲基和二氟氯甲基。
在本文所述的化合物中，杂原子能够带有多个不同的价位。通过非限制性实例的方式，S、Se和N可以是中性的，或带有正电荷。此外，O可以是中性的，或带有正电荷或负电荷。
本公开内容的化合物和组合物的示例性的实施方案包括式(I)、(II)和(III)，其可包括例举的化合物的非对映体和对映体。对映体定义为互为镜像和不可叠印的一对分子实体之一。非对映体或非对映异构体定义为并非对映体的立体异构体。非对映体或非对映异构体是并非作为镜像相关的立体异构体。非对映异构体通过物理性质的差异来表征。
本公开内容的实施方案可包含式(I)化合物：
Figure 881111DEST_PATH_IMAGE004
或其药学上可接受的盐、水合物或前药。R1是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R2是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R3是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、环烷基、羧基或C-酰胺基；或R3与R4和它们所连接的原子一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R4是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、环烷基、羧基或C-酰胺基；或R3与R4和它们所连接的原子一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R5是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基。
R6是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基。
R7是C3-C16烷基，其中C3-C16烷基不是具有羧基和氨基两者的取代的烷基；烯基、炔基、酮、氨基醇；氨基酸，其选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；OR’、Se-R’、S-R’，其中OR’的R’选自H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基，其中Se-R’的R’选自H、C3-C16烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基，其中S-R’的R’选自H、C3-C16烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基；和
R8是氢、叠氮基、烷基、烯基、炔基。
术语“化合物C”是指5'-甲基硒代腺苷，亦称为(2R,4S,5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((甲基硒烷基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇((2R,4S,5S)-2-(6-amino-9H-purin-9-yl)-5-((methylselanyl)methyl)tetrahydrofuran-3,4-diol)(CAS登记号5135-40-0)和包括其任何药学上可接受的盐。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
本公开内容的另一实施方案可包括式(II)化合物：
Figure 723165DEST_PATH_IMAGE006
或其药学上可接受的盐、水合物或前药，其中
R1是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；
R2是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；
R3是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、环烷基、羧基或C-酰胺基；或R3与R4和它们所连接的原子一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；
R4是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、环烷基、羧基或C-酰胺基；或R3与R4和它们所连接的原子一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；
R5是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基；
R6是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基；
R8是氢、叠氮基、烷基、烯基、炔基；
R9是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R9与R10一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；
R10是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R9与R10一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；和
R11是OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或药学上可接受的盐或内盐。
术语“化合物D”是指5'-硒代腺苷高半胱氨酸；(2R)-2-氨基-4-((((2S,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)硒烷基)丁酸((2R)-2-amino-4-((((2S,3S,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl)selanyl)butanoic acid)(CAS登记号4053-91-2)，和包括其任何药学上可接受的盐。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
本公开内容的进一步实施方案可包括式(III)化合物：
Figure 676296DEST_PATH_IMAGE008
或其药学上可接受的盐、水合物或前药，其中
R1是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；
R2是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；
R3是OH、OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或药学上可接受的盐或内盐；
R4是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或药学上可接受的盐或内盐；
R5是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基；
R6是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基；和
R7是C3-C16烷基，其中C3-C16烷基不是具有羧基和氨基两者的取代的烷基；烯基、炔基、酮、氨基醇；氨基酸，其选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；OR’、Se-R’、S-R’，其中OR’的R’选自H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基，其中Se-R’的R’选自H、C3-C16烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基，其中S-R’的R’选自H、C3-C16烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基。
术语“化合物E”是指γ-L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸；亦称为N5-(1-羧基-2-(甲基硒烷基)乙基)-L-谷氨酰胺（N5-(1-carboxy-2-(methylselanyl)ethyl)-L-glutamine）或其任何药学上可接受的盐。
Figure DEST_PATH_IMAGE009
术语“化合物CDE”、“化合物CDE”、“化合物CDE组合”或“组合的化合物CDE”是指化合物C、化合物D和化合物E或其药学上可接受的盐的组合或混合物。
术语“化合物H”是指5’-甲基硫代腺苷；5'-S-甲基-5'-硫代腺苷(CAS登记号2457-80-9)或其药学上可接受的盐。
Figure 552986DEST_PATH_IMAGE010
术语“化合物I”是指S-腺苷-L-高半胱氨酸，亦称为(S)-5'-(S)-(3-氨基-3-羧基丙基)-5'-硫代腺苷(CAS登记号979-92-0)或其药学上可接受的盐。
Figure DEST_PATH_IMAGE011
术语“化合物J”是指γ-L-谷氨酰基-甲基-L-半胱氨酸，亦称为γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸或其药学上可接受的盐。
Figure 437765DEST_PATH_IMAGE012
术语“化合物HIJ”是指化合物H、化合物I和化合物J或其药学上可接受的盐的混合物。
术语"类似物"和"衍生物"可互换使用，是指给定分子的至少一个位置的天然或非天然修饰。例如，给定化合物或分子的衍生物可通过添加官能团或原子、除去官能团或原子或改变官能团或原子为不同的官能团或原子(包括但不限于同位素)被修饰。
术语“包含”是指包括并不排除另外的要素或方法步骤的组合物、化合物、制剂或方法。术语“包含”还指包括并不排除另外的要素或方法步骤的本公开内容的组合物、化合物、制剂或方法实施方案。
术语“由……组成”是指排除任何其它组分或方法步骤的存在的化合物、组合物、制剂或方法。术语“由……组成”还指排除任何其它组分或方法步骤的存在的本公开内容的化合物、组合物、制剂或方法。
术语“基本上由……组成”是指包括另外的要素或方法步骤的组合物、化合物、制剂或方法，所述另外的要素或方法步骤在实质上不影响组合物、化合物、制剂或方法的特征。术语“基本上由……组成”还指包括另外的要素或方法步骤的本公开内容的组合物、化合物、制剂或方法，所述另外的要素或方法步骤在实质上不影响组合物、化合物、制剂或方法的特征。
术语"化合物"是指可用于治疗、诊断或预防身体机能的疾病、患病、不适或病症的任何一个或多个化学实体、部分、药剂、药物等。通过使用本申请的筛选方法可确定化合物是治疗性的。
术语“组合物"是指一种或多种化合物与或不与另一种剂(例如但不限于载体剂)的组合(例如，一种或多种含硒化合物与惰性或活性的载体，使得组合物特别适合于体外、体内或离体诊断或治疗用途)。
术语“组分”是指化合物或组合物的组成部分。例如，组合物的组分可包括化合物、载体和组合物中存在的任何其它剂。
术语"有效量"是指足以实现有益或需要的结果的组合物或化合物的量。有效量可在一次或多次施用或剂量中给予，和不意欲限制于特定的制剂或给药途径。
术语"水合物"是指以分子形式与水缔合的化合物(即，其中H- OH键不裂解)，其可表示为例如式R x H2O，其中R是本文公开的化合物。给定的化合物可形成超过一种水合物，包括例如一水合物(R x H2O)、二水合物(R2 x H2O)、三水合物(R3 x H2O)等。
术语“抑制性的”或“拮抗性的”是指降低、限制、抑制或阻断另一化合物的活动或功能的化合物的性质。
术语“分离的”是指将一种材料与在混合物中的至少一种其它材料或天然伴随该材料的材料分离。例如，经合成合成的化合物与起始材料或中间体分离。
"已知的治疗性化合物"是指已经表明(例如通过动物试验或之前给予人的经验)在治疗中有效的治疗性化合物。换句话说，已知的治疗性化合物不限于已知或表明在治疗疾病(例如神经变性疾病)中有效的化合物。
术语“线粒体电位”是指跨越内部线粒体膜的电压差，其通过跨膜的净正电荷移动维持。
术语“调节葡萄糖代谢”是指在细胞或活的生物体中从形成、转化或分解葡萄糖或其组分的生物化学途径的已知或确定状态的状态(例如，活性或量)改变。
"任选的"或"任选地"是指其中随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生的情况，和该描述包括其中所述事件或情况发生的实例和其中所述事件或情况不发生的实例。"任选地"包括其中描述的条件存在的实施方案和其中描述的条件不存在的实施方案。例如，"任选取代的苯基"意指苯基可以被取代或可以不被取代，和该描述包括未取代的苯基和其中存在取代的苯基。
术语"有机硒"或“含硒有机化合物”是指其中硒代替硫的任何有机化合物。因此，有机硒可以指通过酵母生物合成的任何这样的化合物，或指化学合成的游离有机硒-化合物，例如游离硒代甲硫氨酸。
术语"患者"或"受试者"可互换使用和是指动物界的任何成员。受试者可以是哺乳动物，例如人、驯化的哺乳动物(例如狗或猫)或家畜哺乳动物(例如牛(cow/cattle)或猪(pig/swine))。
本文使用的术语“ppb”是指基于含硒化合物的硒或基于含硫化合物的硫的十亿之份数。含硒化合物的实例是化合物C、化合物D和化合物E。含硫化合物的实例是化合物H、化合物I和化合物J。为了转化基于硒的ppb为含有硒的化合物的ppb，将指示的ppb乘以以下倍数：对于化合物C为4.35，对于化合物D为5.46，和对于化合物E为3.94。为了转化基于硫的ppb为含有硫的化合物的ppb，将指示的ppb乘以以下倍数：对于化合物H为9.28，对于化合物I为12.00，和对于化合物J为8.25。
短语"药学上可接受的"是指在合理的医学判断范围内适合用于与人和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的收益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂量形式。
术语“载体”是指药学上可接受的载体。短语"药学上可接受的载体"是指药学上可接受的材料、组合物或对照，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包胶材料，其涉及从身体的一个器官或部分携带或运输含硒化合物、类似物或衍生物至身体的另一个器官或部分。在与制剂的其它成分相容和对患者或受试者无害的意义上，载体必须是可接受的。
可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括但不限于：(1) 糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2) 淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3) 纤维素和其衍生物，例如羧基甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4) 西黄蓍胶粉；(5) 麦芽；(6) 明胶；(7) 滑石粉；(8) 赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9) 油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10) 二醇，例如丙二醇；(11) 多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12) 酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13) 琼脂；(14) 缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15) 藻酸；(16) 无热原水；(17) 等渗盐水；(18) 林格溶液；(19) 乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21) 药物制剂中使用的其它无毒相容物质。
术语“前药”是指药理学活性化合物。更通常，“前药”是指无活性化合物，其通过代谢转化而转化成药理学活性剂。本文所述的化合物或组合物的前药通过修饰任一上式的化合物中存在的官能团来制备，其方式为所述修饰可在体内裂解以释放母体化合物。前药可容易地在生理条件下经历体内化学改变(例如水解或酶催化)，导致药理学活性剂的释放。前药包括本文所述的任一式的化合物，其中羟基、氨基或羧基与可经体内裂解以分别再生游离羟基、氨基或羧基的任何基团结合。前药的实例包括但不限于任何上式的化合物的酯(例如乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物)，或任何其它衍生物，其在达到生理pH或通过酶作用时转化成活性母体药物。本领域中描述了选择和制备合适的前药衍生物的常规程序(参见例如Bundgaard. Design of Prodrugs. Elsevier，1985)。
术语"纯化的"或“基本上纯化的”是指从组合物中除去无活性或抑制性的组分(例如污染物)至包含无活性组分、化合物或药学上可接受的载体的组合物的10%或更少(例如10%或更少、9%或更少、8%或更少、7%或更少、6%或更少、5%或更少、4%或更少、3%或更少、2%或更少或1%或更少)的程度。
术语“盐”可包括药学上可接受的酸加成盐或游离碱的加成盐。可用于形成药学上可接受的酸加成盐的酸的实例包括但不限于源自无毒无机酸例如硝酸、磷酸、硫酸或氢溴酸、氢碘酸、氢氟酸、亚磷酸的盐，以及源自无毒有机酸例如脂肪族一和二羧酸、苯基-取代的链烷酸、羟基链烷酸、链烷二酸、芳族酸、脂肪族和芳族磺酸和乙酸、马来酸、琥珀酸或柠檬酸的盐。这样的盐的非限制性实例包括萘二磺酸盐、苯磺酸盐、硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、一氢磷酸盐、二氢磷酸盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、三氟乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯基乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。还预期氨基酸的盐例如但不限于精氨酸盐，葡萄糖酸盐、半乳糖醛酸盐和其它盐，例如但不限于公开于Berge等(“PharmaceuticalSalts”, J. Pharma. Sci. 1977; 66:1-19)中的那些。
短语"药学上可接受的盐"包括但不限于本领域技术人员众所周知的盐。例如，本发明的一元盐(例如碱金属和铵盐)和多元盐(例如二盐或三盐)。本公开内容的化合物的药学上可接受的盐例如当可交换基团例如--OH、--NH--或--P(=O)(OH)--部分中的氢被替换为药学上可接受的阳离子(例如钠、钾或铵离子)而制备，和可自本文公开的相应的化合物通过例如与合适的碱反应合宜地制备。
在化合物足够碱性或酸性以形成稳定的无毒酸或碱盐的情况下，化合物作为盐给予可能是合适的。药学上可接受的盐的实例是与形成生理学上可接受的阴离子的酸形成的有机酸加成盐，例如甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸盐。也可形成合适的无机盐，包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐和碳酸盐。药学上可接受的盐可使用本领域众所周知的标准程序获得，例如通过使足够碱性的化合物例如胺与合适的酸反应，得到生理上可接受的阴离子。也可制备羧酸的碱金属盐(例如钠、钾或锂)或碱土金属盐(例如钙)。
术语"富硒酵母"和"硒化酵母"是指任何酵母(例如酿酒酵母)，其在含有硒来源例如无机硒盐的培养基中培养。最终产物中残留的无机硒盐的量通常非常低(例如低于2%)。
与一个部分有关的术语"取代的"是指在该部分的任何可接受的位置上连接的另外的取代基。除非另外说明，部分可通过碳、氮、氧、硫或任何其它可接受的原子键合。取代基的实例包括但不限于胺、醇、硫醇、醚、烯、炔、环氧化物、氮丙啶、环氧乙烷、氮杂环丁烷、二氢呋喃、吡咯烷、吡喃、哌啶、醛、酮、酯、羧酸、羧酸酯、亚胺、酰亚胺、叠氮化物、偶氮基、烯胺、烷基卤化物、烯基卤化物、炔基卤化物、芳基卤化物、膦、氧化膦、次膦酸酯、亚膦酸酯（phosphonites）、亚磷酸酯、膦酸酯、磷酸酯、硫酸酯、硫氧化物、磺酰基、次硫酰基(sulfoxyl)、磺酸酯、硝酸酯、亚硝酸酯、腈、硝基、亚硝基、氰酸酯、硫代氰酸酯、异硫代氰酸酯、碳酸酯、酰基卤化物、过氧化物、氢过氧化物、半缩醛、半缩酮、缩醛、缩酮、原酸酯、原碳酸酯、硫化物、二硫化物、磺酸、磺酸、硫酮、硫醛、磷酸二酯、硼酸、硼酸酯、硼酸和硼酸酯。
术语“治疗”或“处理”是指治疗性处理，其中目标是减慢(例如减轻或延迟)不需要的生理病况的发作，减少现有病症或疾病的症状，或获得有益或需要的结果，例如已经或将变得异常的参数、值、功能、计量或结果的下降的部分或完全恢复或抑制。有益或需要的结果包括但不限于症状减轻；病况、病症或疾病的发展的程度或活力或速率的降低；病况、病症或疾病的状态的稳定(即，不恶化)；病况、病症或疾病的发作延迟或进展减慢；病况、病症或疾病状态的改善；和病况、病症或疾病的减轻(无论是部分还是全部，无论是否其转变为实际临床症状的立即减轻)或促进或改善。
术语"能够特异性检测基因表达的试剂"是指能够或足以检测本文所述的各种基因的表达的试剂。合适的试剂的实例包括但不限于能够与mRNA或cDNA特异性杂交的核酸引物或探针，和抗体(例如单克隆或多克隆抗体)。
术语"毒性的"是指与给予有毒物之前的相同的细胞或组织相比，对受试者、细胞或组织的任何有害效果。
化合物和组合物
本公开内容涉及含硒有机化合物、组合物和使用所述化合物和组合物的方法。本文公开的化合物和组合物可代替胰岛素、提高胰岛素活性、抑制葡萄糖产生或调节各种生物途径中的葡萄糖代谢。本公开内容的组合物、化合物和方法并不显示不利地影响肝细胞中的葡萄糖代谢，因此它们还可用于治疗或预防非胰岛素依赖性(II型)糖尿病。
本公开内容的一个实施方案涉及包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药、基本上由其组成或由其组成的组合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
。
R1是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R2是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R3是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、环烷基、羧基或C-酰胺基；或R3与R4和它们所连接的原子一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R4是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、环烷基、羧基或C-酰胺基；或R3与R4和它们所连接的原子一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环。
R5是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基。
R6是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基。
R7是C3-C16烷基，其中C3-C16烷基不是具有羧基和氨基两者的取代的烷基；烯基、炔基、酮、氨基醇；氨基酸，其选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；OR’、Se-R’、S-R’，其中OR’的R’选自H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基，其中Se-R’的R’选自H、C3-C16烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基，其中S-R’的R’选自H、C3-C16烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基；和
R8是氢、叠氮基、烷基、烯基、炔基。
本文所述的组合物的另外的实施方案可包含5’-甲基硒代腺苷(“化合物C”)和其任何类似物、衍生物和/或药学上可接受的盐，基本上由其组成或由其组成。化合物C是(2R,4S,5S)-2-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-5-((甲基硒烷基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇(CAS登记号5135-40-0)和包括其任何类似物、衍生物和/或药学上可接受的盐。
Figure 767115DEST_PATH_IMAGE014
本公开内容的组合物可包含式(I)的化合物、化合物C和其组合，基本上由其组成或由其组成。例如，本申请的一个方面提供包含选自5’-甲基硒代腺苷、式(I)的化合物和其组合的化合物的组合物。在进一步的实施方案中，这些化合物的一种或多种可以是合成的、分离的和/或纯化的。
在一些实施方案中，组合物包含至少5’-甲基硒代腺苷和一种其它化合物，基本上由其组成或由其组成。在其它实施方案中，所述其它化合物是含硒化合物。在进一步的实施方案中，组合物包含比率为至少1:1至100:1、1:1至50:1、1:1至10:1、1:1至6:1或1:1至3:1的5’-甲基硒代腺苷和所述其它化合物(例如含硒化合物)。
在一些实施方案中，提供包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药，基本上由其组成或由其组成的组合物，其中R1、R3、R4和R8各自为H；R2是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’或C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；R5和R6各自不存在；和R7是C3-C16烷基，其中C3-C16烷基不是具有羧基和氨基两者的取代的烷基；烯基、炔基、酮、氨基醇；氨基酸，其选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；OR’、Se-R’、S-R’，其中OR’的R’选自H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基，其中Se-R’的R’选自H、C3-C16烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基，其中S-R’的R’选自H、C3-C16烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基。
在特定的实施方案中，提供包含至少约0.033% (w/v)至至少约0.1% (w/v)的根据式(I)或5'-甲基硒代腺苷(“化合物C”)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药，基本上由其组成或由其组成的组合物。在另一个实施方案中，组合物排除5’-硒代腺苷高半胱氨酸和/或γ-L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸。在仍进一步实施方案中，组合物排除5’-甲基硫代腺苷、S-腺苷-L-高半胱氨酸和γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸的一种或多种。在一些实施方案中，组合物包含式(I)的化合物或5'-甲基硒代腺苷(“化合物C”)或其药学上可接受的盐、水合物或前药，条件是排除5’-甲基硫代腺苷、γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸或腺苷高半胱氨酸、高半胱氨酸或甲硫氨酸的一种或多种。
在一些实施方案中，提供包含式(I)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药的组合物，其中R1、R3、R4和R8各自是H；R2是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’或C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；R5和R6各自不存在；和R7是选自异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、3-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、新己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基和十六烷基的烷基或氨基酸。
在一些实施方案中，提供包含式(I)的化合物或5'-甲基硒代腺苷(“化合物C”)或其药学上可接受的盐、水合物或前药，基本上由其组成或由其组成的组合物，其中R1、R3、R4和R8各自是H；R2是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；R5和R6各自不存在；和R7是烷基或氨基酸；条件是5'-硒代腺苷甲硫氨酸、脱羟基5'-甲基硒代腺苷、乙基硒代腺苷、硒代(羟基)-硒吩(selenophene)-(3'-脱氧基-腺苷)、烯丙基硒代腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷高半胱氨酸、硒代羟基腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷、硒代腺苷-Se(甲基)-硒亚砜、腺苷-羟基硒亚砜、乙基硒代腺苷、硒代-(羟基)-硒吩(selenophene)-(3'-脱氧基-腺苷)、腺苷-羟基硒亚砜和硒代腺苷-Se(甲基)-硒亚砜可各自从组合物中排除。
在本公开内容的一些实施方案中，提供包含式(I)化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药，基本上由其组成或由其组成的组合物，其中R7为烷基，其选自异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、3-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、新己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基和十六烷基；烯基、炔基、酮、氨基醇；氨基酸，其选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；OR’、Se-R’，其中R’选自烷基，其选自异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、3-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、新己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基和十六烷基；环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；和R8是氢、叠氮基、烷基、烯基、炔基。
在一些实施方案中，本公开内容的组合物包含式(I)化合物、5'-甲基硒代腺苷(“化合物C”)或其药学上可接受的盐、水合物或前药，由其组成或基本上由其组成，条件是5'-硒代腺苷甲硫氨酸、脱羟基5'-甲基硒代腺苷、乙基硒代腺苷、硒代(羟基)-硒吩(selenophene)-(3'-脱氧基-腺苷)、烯丙基硒代腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷高半胱氨酸、硒代羟基腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷、硒代腺苷-Se(甲基)-硒亚砜、腺苷-羟基硒亚砜、乙基硒代腺苷、硒代-(羟基)-硒吩(selenophene)-(3'-脱氧基-腺苷)、腺苷-羟基硒亚砜和硒代腺苷-Se(甲基)-硒亚砜可各自从组合物中排除。
在其它实施方案中，提供包含根据一个或多个式(I)的一种或多种化合物（one ormore compounds according to one or more of Formula (I)）或5'-甲基硒代腺苷(“化合物C”)，基本上由其组成或由其组成的组合物，其中为了使硒毒性最小，除去无活性或抑制性化合物和/或使组合物的治疗指数最大，以下化合物的每一个从组合物中排除，其中排除的化合物是γ -谷氨酰基硒代半胱氨酸-γ-谷氨酰基半胱氨酸、γ -谷氨酰基半胱氨酸-2,3-DHP-硒代半胱氨酸、二-γ -谷氨酰基硒代半胱氨酸、硒代谷胱甘肽-γ-谷氨酰基半胱氨酸、γ -谷氨酰基硒代半胱氨酸-γ-谷氨酰基半胱氨酸、γ-谷氨酰基半胱氨酸-2,3-DHP-硒代半胱氨酸、二-γ -谷氨酰基硒代半胱氨酸、硒代谷胱甘肽-γ-谷氨酰基半胱氨酸、脱羟基5'-甲基硒代腺苷、乙基硒代腺苷、硒代(羟基)-硒吩(selenophene)-(3'-脱氧基-腺苷)、烯丙基硒代腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷高半胱氨酸、硒代羟基腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷、硒代腺苷-Se(甲基)-硒亚砜、腺苷-羟基硒亚砜、乙基硒代腺苷、硒代-(羟基)-硒吩(selenophene)-(3'-脱氧基-腺苷)、腺苷-羟基硒亚砜和硒代腺苷-Se(甲基)-硒亚砜。
本公开内容的组合物的另一实施方案包含式(II)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药，基本上由其组成或由其组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE015
其中
R1是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；
R2是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；
R3是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、环烷基、羧基或C-酰胺基；或R3与R4和它们所连接的原子一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；
R4是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、环烷基、羧基或C-酰胺基；或R3与R4和它们所连接的原子一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；
R5是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基；
R6是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基；
R8是氢、叠氮基、烷基、烯基、炔基；
R9是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R9与R10一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；
R10是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R9与R10一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；和
R11是OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或药学上可接受的盐或内盐。
本文所述的组合物的另外的实施方案包含5'-硒代腺苷高半胱氨酸(“化合物D”)，基本上由其组成或由其组成，并包括其任何类似物、衍生物和/或药学上可接受的盐。化合物D是(2R)-2-氨基-4-((((2S,3S,5R)-5-(6-氨基-9H-嘌呤-9-基)-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲基)硒烷基)丁酸(CAS登记号4053-91-2)和包括其任何类似物、衍生物和/或药学上可接受的盐。
Figure 529797DEST_PATH_IMAGE016
本公开内容的组合物可包含式(II)的化合物、化合物D和其组合，基本上由其组成或由其组成。例如，本申请的一个方面提供包含选自5'-硒代腺苷高半胱氨酸、式(II)的化合物和其组合的化合物的组合物。在进一步的实施方案中，一种或多种这些化合物可以是合成的、分离的和/或纯化的。
在式(II)的一些实施方案，组合物包含至少5'-硒代腺苷高半胱氨酸(“化合物“D”)和一种其它化合物，基本上由其组成或由其组成。在一些实施方案中，组合物包含比率为至少1:1至100:1、1:1至50:1、1:1至10:1、1:1至6:1或1:1至3:1的5’-硒代腺苷高半胱氨酸和一种其它含硒化合物。在实施方案中，所述其它化合物是5'-甲基硒代腺苷。在实施方案中，所述其它化合物是γ-L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸。
在一些实施方案中，提供包含式(II)化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药，基本上由其组成或由其组成的组合物，其中R1、R3、R4、R8和R9各自是H；R2是H、酰基、烷基、羧基、C(O)R’或C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；R5和R6 不存在；R10是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；和R11是OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或药学上可接受的盐或内盐。
在一些实施方案中，提供包含式(II)化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药，基本上由其组成或由其组成的组合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10如上文所定义，和其中R11是OR，其中R选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、仲丁基或叔丁基。
在特定的方面，提供包含式(II)化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药、5'-硒代腺苷高半胱氨酸(“化合物“D”)或其药学上可接受的盐、水合物或前药，基本上由其组成或由其组成的组合物。
在一些实施方案中，组合物包含式(II)化合物、硒代腺苷高半胱氨酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药，基本上由其组成或由其组成；条件是腺苷高半胱氨酸、5'-硒代腺苷甲硫氨酸、烯丙基硒代腺苷高半胱氨酸和硒代羟基腺苷高半胱氨酸的一种或多种可各自从组合物中排除。在实施方案中，组合物排除5’-甲基硫代腺苷、γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸或腺苷高半胱氨酸、高半胱氨酸或甲硫氨酸的一种或多种的一种或多种化合物。
本公开内容的组合物的进一步实施方案可包含式(III)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药，基本上由其组成或由其组成：
Figure DEST_PATH_IMAGE017
其中
R1是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；
R2是H、酰基、烷基、烯基、炔基、芳烷基、羧基、环烷基、C(O)R’、C(O)OR’，其中R’选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂环基；或R1与R2一起形成具有4-8个环成员以及选自氧或氮的至少一个杂原子的杂环；
R3是OH、OR、烷氧基、芳烷氧基或氨基，其中R选自烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或药学上可接受的盐或内盐；
R4是烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基、杂环基或药学上可接受的盐或内盐；
R5是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基；
R6是氧代、羟基、烷基、烯基、炔基、OR’或不存在；其中R’选自烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基或芳烷基；和
R7是C3-C16烷基，其中C3-C16烷基不是具有羧基和氨基两者的取代的烷基；烯基、炔基、酮、氨基醇；氨基酸，其选自精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；OR’、Se-R’、S-R’，其中OR’的R’选自H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基，其中Se-R’的R’选自H、C3-C16烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基，其中S-R’的R’选自H、C3-C16烷基、环烷基、芳基、芳烷基和杂环基。
本文所述的组合物的另外的实施方案可包含Gamma (γ)-L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸(“化合物E”)，基本上由其组成或由其组成，并包括其任何类似物、衍生物和/或药学上可接受的盐。化合物E是N5-(1-羧基-2-(甲基硒烷基)乙基)-L-谷氨酰胺和包括其任何类似物、衍生物和/或药学上可接受的盐。
Figure 526572DEST_PATH_IMAGE018
本公开内容的组合物可包含式(III)的化合物、化合物E和其组合，基本上由其组成或由其组成。例如，本申请的一个方面提供包含选自Gamma (γ)-L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸、式(III)的化合物和其组合的化合物的组合物。在进一步的实施方案中，这些化合物的一种或多种可以是合成的、分离的和/或纯化的。
本申请的一个方面提供包含选自γ-L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸、式(III)的化合物和其组合的化合物的组合物。在进一步的实施方案中，可分离和/或纯化这些化合物中的一种或多种。在实施方案中，组合物包含至少0.033% (w/v)的一种所述化合物。
在实施方案中，组合物包含至少γ-L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸和一种其它化合物。在一些实施方案中，组合物包含比率为至少1:1至100:1、1:1至50:1、1:1至10:1、1:1至6:1或1:1至3:1的γ-L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸和一种其它含硒化合物。在实施方案中，所述其它化合物是5'-甲基硒代腺苷。在实施方案中，所述其它化合物是Gamma (γ)-L-谷氨酰基-甲基-L-半胱氨酸。
在特定的方面，提供包含与组合物中的一种其它含硒化合物的比率为至少1:1的式(III)的化合物或其药学上可接受的盐、水合物或前药、γ-L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸(“化合物E”)或其药学上可接受的盐、水合物或前药的组合物。
在一些实施方案中，组合物包含式(III)的化合物、γ-L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药，条件是γ-谷氨酰基硒代半胱氨酸- γ-谷氨酰基半胱氨酸、γ-谷氨酰基半胱氨酸-2,3-DHP-硒代半胱氨酸、二-γ-谷氨酰基硒代半胱氨酸、硒代谷胱甘肽-γ-谷氨酰基半胱氨酸、γ-谷氨酰基硒代半胱氨酸-γ-谷氨酰基半胱氨酸、γ-谷氨酰基半胱氨酸-2,3-DHP-硒代半胱氨酸、二-γ-谷氨酰基硒代半胱氨酸和硒代谷胱甘肽-γ-谷氨酰基半胱氨酸的一种或多种可各自从组合物中排除。
在一些实施方案中，组合物包含式(III)的化合物、γ-L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药，条件是5’-甲基硫代腺苷、γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸或腺苷高半胱氨酸、高半胱氨酸或甲硫氨酸的一种或多种被排除。
本申请的另一方面提供本文所述的生物活性含硒化合物(例如式(I)、(II)和(III))的类似物或衍生物。含硒化合物的类似物和/或衍生物可经合成制备。例如，式(I)、(II)和(III)的一个实施方案包含其任何类似物、衍生物或药学上可接受的盐。本发明的组合物的另一实施方案包含式(I)、(II)和(III)的化合物和其组合。
本公开内容的组合物的另外的实施方案可包含本文所述的化合物的混合物，基本上由其组成或由其组成。例如，本发明的组合物的一个实施方案是“化合物CDE”。化合物CDE包含化合物C、化合物D和化合物E和其任何类似物、衍生物和/或药学上可接受的盐的混合物。化合物CE包含化合物C和化合物E和其任何类似物、衍生物和/或药学上可接受的盐的混合物。化合物DE包含化合物D和化合物E和其任何类似物、衍生物和/或药学上可接受的盐的混合物。
在一些实施方案中，本申请的组合物包含至少约0.033% (w/v)至至少约0.1% (w/v)的以下化合物之一，基本上由其组成或由其组成：化合物C、化合物D、化合物E、化合物CDE、式(I)、式(II)、式(III)或其混合物。例如，组合物可包含至少0.033% (w/v)、至少0.05% (w/v)、至少0.1% (w/v)、至少约0.033% (w/v)、至少约0.05% (w/v)、至少约0.1%(w/v)、至少约0.033% (w/v)至至少约0.1% (w/v)或至少约0.05% (w/v)至至少约0.1% (w/v)的化合物C、化合物D、化合物E、式(I)、式(II)、式(III)的化合物、化合物CDE或其混合物。
例如，在一些实施方案中，组合物包含至少约0.033% (w/v)至至少约0.035% (w/v)、至少约0.033%至至少约0.040% (w/v)、至少约0.033%至至少约0.045% (w/v)、至少约0.033%至至少约0.050% (w/v)、至少约0.033%至至少约0.055% (w/v)、至少约0.033%至至少约0.060% (w/v)、至少约0.033%至至少约0.065% (w/v)、至少约0.033%至至少约0.070%(w/v)、至少约0.033%至至少约0.075% (w/v)、至少约0.033%至至少约0.080% (w/v)、至少约0.033%至至少约0.085% (w/v)、至少约0.033%至至少约0.090% (w/v)、至少约0.033%至至少约0.095% (w/v)或至少约0.033%至至少约0.1% (w/v)的式(I)、式(II)、式(III)的化合物、化合物C、化合物D、化合物E、化合物CDE或其混合物，以及其间的所有百分比范围值。
例如，在一些实施方案中，组合物包含至少约0.05%至至少约0.060% (w/v)、至少约0.05%至至少约0.065% (w/v)、至少约0.05%至至少约0.070% (w/v)、至少约0.05%至至少约0.075% (w/v)、至少约0.05%至至少约0.080% (w/v)、至少约0.05%至至少约0.085% (w/v)、至少约0.05%至至少约0.090% (w/v)、至少约0.05%至至少约0.095% (w/v)或至少约0.05%至至少约0.1% (w/v)的式(I)、式(II)、式(III)的化合物、化合物C、化合物D、化合物E、化合物CDE或其混合物，以及其间的所有百分比范围值。
在其它实施方案中，组合物包含约0.033% (w/v)至约99.9% (w/v)、约0.033%至约90% (w/v)、约0.033%至约80% (w/v)、约0.033%至约70% (w/v)、约0.033%至约60% (w/v)、约0.033%至约50% (w/v)、约0.033%至约40% (w/v)、约0.033%至约30% (w/v)、约0.033%至约20% (w/v)、约0.033%至约10% (w/v)、约0.033%至约5% (w/v)或约0.033%至约1% (w/v)的式(I)、式(II)、式(III)的化合物、化合物C、化合物D、化合物E、化合物CDE或其混合物，以及其间的所有百分比范围值。
在其它实施方案中，组合物包含约0.05% (w/v)至约99.9% (w/v)、约0.05%至约90% (w/v)、约0.05%至约80% (w/v)、约0.05%至约70% (w/v)、约0.05%至约60% (w/v)、约0.05%至约50% (w/v)、约0.05%至约40% (w/v)、约0.05%至约30% (w/v)、约0.05%至约20%(w/v)、约0.05%至约10% (w/v)、约0.05%至约5% (w/v)或约0.05%至约1% (w/v)的式(I)、式(II)、式(III)的化合物、化合物C、化合物D、化合物E、化合物CDE或其混合物，以及其间的所有百分比范围值。
在进一步的实施方案中，组合物包含约0.1% (w/v)至约99.9% (w/v)、约0.1%至约90% (w/v)、约0.1%至约80% (w/v)、约0.1%至约70% (w/v)、约0.1%至约60% (w/v)、约0.1%至约50% (w/v)、约0.1%至约40% (w/v)、约0.1%至约30% (w/v)、约0.1%至约20% (w/v)、约0.1%至约10% (w/v)、约0.1%至约5% (w/v)或约0.1%至约1% (w/v)的式(I)、式(II)、式(III)的化合物、化合物C、化合物D、化合物E、化合物CDE或其混合物，以及其间的所有百分比范围值。
在其它实施方案中，组合物包含至少约0.033% (w/v)至至少约0.1% (w/v)或至少约0.05% (w/v)至至少约0.1% (w/v)的式(I)、式(II)、式(III)的化合物、化合物C、化合物D、化合物E、化合物CDE或其混合物。
在实施方案中，组合物包含至少5’-甲基硒代腺苷和一种其它化合物。在一些实施方案中，组合物包含比率为至少1:1至100:1、1:1至50:1、1:1至10:1、1:1至6:1或1:1至3:1的5’-甲基硒代腺苷和一种其它含硒化合物。在实施方案中，所述其它化合物是5'-硒代腺苷高半胱氨酸。在其它实施方案中，所述其它化合物是L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸。
在其它实施方案中，组合物可排除5’-甲基硫代腺苷(“化合物H”)、S-腺苷-L-高半胱氨酸(“化合物I”)、γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸(“化合物J”)、γ-L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸、Se-腺苷高半胱氨酸或谷氨酰基硒代半胱氨酸中的一种或多种，因为一种或多种这些化合物可能是组合物不需要的，或对组合物中的其它化合物是抑制性的。
本申请的一个方面提供包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少两种化合物的组合物。在进一步的实施方案中，一种或多种这些化合物可以是合成的、分离的和/或纯化的。
本申请的一个方面涉及5’-甲基硒代腺苷(“化合物C”)、Se-腺苷-L-高半胱氨酸(“化合物D”)、L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸(“化合物E”)和其类似物。一些实施方案包括包含式(I)、式(II)和/或式(III)的化合物和其混合物和载体的组合物。
在其它实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物和式(III)的化合物和其混合物的至少三种不同的化合物。在仍进一步实施方案中，组合物包含至少约0.033%(w/v)的至少一种这些化合物。在其它实施方案中，组合物包含至少约0.05% (w/v)的这些化合物的两种的每一种。在又一实施方案中，组合物包含至少约0.033% (w/v)的这些化合物的三种的每一种。
在进一步的实施方案中，式(I)、式(II)和式(III)的这些化合物的一种或多种可以是合成的、分离的和/或纯化的。在实施方案中，包含式(I)、式(II)和式(III)的化合物的组合物进一步包含载体，例如水、生理盐水、生理缓冲液，其包括表面活性剂和稳定氨基酸。
在一些实施方案中，提供包含根据式(I)、式(II)、式(III)、化合物C、化合物D、化合物E、化合物CDE或其混合物的一种或多种的一种或多种化合物的组合物，其中为了使硒毒性最小、除去无活性或抑制性化合物和/或使组合物的治疗指数最大，以下化合物的一种或多种各自从组合物中排除，其中排除的化合物是γ -谷氨酰基硒代半胱氨酸-γ-谷氨酰基半胱氨酸、γ -谷氨酰基半胱氨酸-2,3-DHP-硒代半胱氨酸、二-γ -谷氨酰基硒代半胱氨酸、硒代谷胱甘肽-γ-谷氨酰基半胱氨酸、γ -谷氨酰基硒代半胱氨酸-γ-谷氨酰基半胱氨酸、γ-谷氨酰基半胱氨酸-2,3-DHP-硒代半胱氨酸、二-γ -谷氨酰基硒代半胱氨酸、硒代谷胱甘肽-γ-谷氨酰基半胱氨酸、脱羟基5'-甲基硒代腺苷、乙基硒代腺苷、硒代(羟基)-硒吩(selenophene)-(3'-脱氧基-腺苷)、烯丙基硒代腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷高半胱氨酸、硒代羟基腺苷高半胱氨酸、硒代腺苷、硒代腺苷-Se(甲基)-硒亚砜、腺苷-羟基硒亚砜、乙基硒代腺苷、硒代-(羟基)-硒吩(selenophene)-(3'-脱氧基-腺苷)、腺苷-羟基硒亚砜和硒代腺苷-Se(甲基)-硒亚砜。
在一些实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物和式(III)的化合物和其混合物的至少两种不同的化合物；和载体。在其它实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸的至少两种不同的化合物；和载体。在实施方案中，组合物包含5’-甲基硒代腺苷和γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸。在实施方案中，两种化合物的每一种以至少约0.033% (w/v)存在于组合物中。
在其它实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物和式(III)的化合物和其混合物的至少三种不同的化合物；和载体。在其它实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸的至少三种不同的化合物；和载体。在实施方案中，三种化合物的每一种以至少约0.033% (w/v)存在于组合物中。
在一些实施方案中，本文所述的本申请的任何化合物可用前药修饰以延长半寿期。前药还可有助于保护化合物免于氧化，使化合物靶向组织或允许化合物通过血脑屏障。
在一些实施方案中，前药包含硒代糖苷。糖苷包括单糖、二糖和寡糖。糖可包括核糖、葡萄糖、半乳糖或甘露糖。例如，与硒部分缀合的半乳糖可使化合物靶向肝。
在其它实施方案中，前药包含selenazolidine。这些化合物提供化合物的缓慢释放。
在又一实施方案中，前药包含含硒有机化合物与维生素、例如维生素C或维生素E的缀合。这些前药缀合物具有改进的保护作用。
在仍其它的实施方案中，前药可以是细胞色素P450活化的前药，例如环状的磷酸酯或膦酸酯。细胞色素P450活化的前药的其它实施方案改进生物利用度。特别是，核苷被这些分子修饰和提供至肝的分子靶向。示例性的前药包括HepDirect前药。细胞色素P450活化的前药的其它实施方案改进生物利用度和描述于Huttunen等，Current MedicinalChemistry 2008 15:2346。
在实施方案中，式(I)、式(II)、式(III)的化合物、化合物C、化合物D、化合物E或化合物CDE中的任一种可经修饰以减少硒的氧化。在实施方案中，化合物可通过硒原子之间的键合形成二聚体。
在实施方案中，式(I)、式(II)、式(III)的化合物、化合物C、化合物D、化合物E或化合物CDE中的任一种可通过连接至组织靶向剂或用于增加化合物的半寿期的其它剂而修饰。组织靶向剂可包括本领域已知的任何试剂，包括但不限于对结合组织特异性抗原有特异性的抗体、转铁蛋白受体或如本文所述的前药。
在一些实施方案中，本发明的组合物经配制以穿过血脑屏障。本发明的组合物可与适合于递送至脑的植入材料组合，所述材料例如聚合的可生物降解的植入物或载体。这样的聚合载体包括但不限于聚乙二醇、聚丙交酯、聚乙交酯、聚原酸酯、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇和乙烯乙酸乙烯酯共聚物。
在其它实施方案中，化合物可与纳米粒载体连接或组合，以递送组合物至脑，和提供其它组织的靶向。其它纳米粒包括磷脂、壳聚糖、乳酸和葡聚糖。
微球和脂质体是可用于本公开内容的另外的载体。例如，微球和脂质体可包括但不限于聚乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA载体。在其它实施方案中，载体递送组合物至脑或其它身体组织可通过使用包含抗体、转铁蛋白受体或前药作为靶向剂的脂质体或微球来靶向。组织靶向还可包括受体介导的运输，例如用胰岛素受体或转铁蛋白受体。这些受体可整合至脂质体或微球，其还包括如本文所述的组合物。
脂质前药也可适合与本发明的化合物一起使用。通过非限制性实例，某些脂质前药描述于Hostetler等(1997 Biochem. Pharm. 53:1815-1822)和Hostetler等(1996Antiviral Research 31:59-67)，这两篇文献通过引用以其整体结合到本文中。合适的前药技术的其它实例描述于WO 90/00555; WO 96/39831; WO 03/095665A2; 美国专利号5,411,947; 5,463,092; 6,312,662; 6,716,825;和美国专利申请公开号2003/0229225和2003/0225277，其各自通过引用以其整体结合到本文中。这样的前药还可具有将药物化合物靶向患者内的特定组织例如肝的能力，如描述于Erion等(2004 J. Am. Chem. Soc.126:5154-5163; Erion等，Am. Soc. Pharm. & Exper. Ther. DOI:10.1124/jept.104.75903 (2004); WO 01/18013 A1; 美国专利号6,752,981)，其各自通过引用以其整体结合到本文中。
这样的前药还可具有将药物化合物靶向患者内的特定组织例如肝的能力，如描述于Erion等(2004 J. Am. Chem. Soc. 126:5154-5163; Erion等，Am. Soc. Pharm. &Exper. Ther. DOI:10.1124/jept.104.75903 (2004); WO 01/18013 A1; 美国专利号6,752,981)，其各自通过引用以其整体结合到本文中。通过非限制性实例的方式，适合用于本发明的化合物的其它前药描述于WO 03/090690; 美国专利号6,903,081; 美国专利申请号2005/0171060A1; 美国专利申请号2002/0004594A1;和Harris等(2002 Antiviral Chem &Chemo. 12: 293-300; Knaggs等(2000 Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 2075-2078)，其各自通过引用以其整体结合到本文中。
在一些实施方案中，提供包含各自按照式(I)的一种或多种化合物的组合物。在一些方面，组合物包含5'-甲基硒代腺苷或其药学上可接受的盐、水合物或前药；和5'-硒代腺苷高半胱氨酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药。
在一些实施方案中，提供包含各自按照式(I)和式(III)的一种或多种化合物的组合物。在一些方面，组合物包含5'-甲基硒代腺苷或其药学上可接受的盐、水合物或前药；5'-硒代腺苷高半胱氨酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药；和γ-L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药。
在一些实施方案中，组合物包含5'-甲基硒代腺苷或其药学上可接受的盐、水合物或前药；和γ-L-谷氨酰基-Se-甲基-L-硒代半胱氨酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药。
在一些实施方案中，提供包含各自按照式(I)和式(II)的一种或多种化合物的组合物。在一些实施方案中，提供包含各自按照式(II)和(III)的一种或多种化合物的组合物。
在实施方案中，任何本文所述的组合物可进一步包含用于调节葡萄糖代谢或治疗糖尿病的不同的治疗剂。
在一些实施方案中，所述不同的治疗剂是胰岛素或其类似物。胰岛素类似物包括速效胰岛素类似物和长效胰岛素类似物。胰岛素类似物可具有一个或多个氨基酸改变。速效胰岛素类似物包括Aspart、Glulisine和LisPro。长效胰岛素包括NPH胰岛素、胰岛素detemir、Degludec胰岛素或胰岛素glargine。
在一个实施方案中，组合物进一步包含用于调节葡萄糖代谢或治疗糖尿病的不同的治疗剂。在一些实施方案中，所述不同的治疗剂是胰岛素或其类似物。在一些实施方案中，所述不同的治疗剂是胰岛素敏化剂、胰岛素促分泌剂或肠降血糖素模拟物。在本发明的组合物中可有效用于治疗糖尿病的其它示例性的治疗剂包括二甲双胍类、磺酰脲类、氯茴苯酸类、D-苯丙氨酸衍生物、噻唑烷二酮类、DPP-4抑制剂、α糖苷酶抑制剂、胆酸螯合剂和其组合。
根据本发明的另一方面，药物组合物包含治疗有效量的本发明的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐、酯或前药，以及药学上可接受的稀释剂或载体。本发明的示例性的稀释剂和载体详细描述于本申请的定义部分。例如，在一些实施方案中，载体可包括水、生理盐水和含有表面活性剂或稳定氨基酸(例如组氨酸或甘氨酸)的水性缓冲溶液。在本申请的一个实施方案中，药学上可接受的载体是药学上惰性的。
在本申请的一些实施方案中，包含硒的组合物和/或制剂可单独或与其它形式的硒、药物、小分子组合或在药物组合物中给予受试者，在所述药物组合物中其与赋形剂或其它药学上可接受的载体混合。在其它实施方案中，本申请的组合物可使用本领域众所周知的药学上可接受的载体以适合于口服给予的剂量配制。载体使药物组合物能够配制为片剂、丸剂、胶囊剂、液体、凝胶、糖浆剂、膏剂、混悬剂等，由待治疗的患者口服或经鼻摄取。此外，包含一种或多种化合物(包括但不限于5’-甲基硒代腺苷、式(I)的化合物和其组合)的组合物可在药学上可接受的载体例如生理盐水中静脉内给予受试者(例如患者)。
组合物可经配制用于任何给药途径，具体而言用于口服、直肠、透皮、皮下、静脉内、肌内或鼻内给药。组合物可配制为任何常规的形式，例如片剂、胶囊剂、囊片（caplets）、溶液、混悬剂、分散剂、糖浆剂、喷雾剂、凝胶、栓剂、贴剂和乳剂。
如医学领域众所周知的，对于任何一个受试者的剂量可取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、待给予的特定化合物、性别、给药次数（time）和途径、一般健康和与同时给予的其它药物的相互作用。根据通过治疗寻求改变的目标，药物组合物可经配制和系统或局部给予。
本领域已知的用于制剂和给予治疗性化合物的技术足以给予本发明的化合物和组合物，和可见于最新版本的"雷明顿药物科学（Remington’s PharmaceuticalSciences）" (Mack Publishing Co，Easton Pa.)。本公开内容的组合物可配制用于任何给药途径，具体而言用于口服、直肠、透皮、皮下、静脉内、肌内或鼻内给药。合适的给药途径可包括例如口服或透粘膜给药；以及胃肠外递送，包括肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内或鼻内给药。
对于注射，本申请的组合物(例如含硒组合物)可在水溶液中配制，例如在生理上相容的缓冲液例如Hanks’溶液、林格溶液或生理缓冲盐水。对于组织、器官或细胞给药，在制剂中使用适合于待渗透的特定屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的。
适合用于本申请的药物组合物包括其中包含有效实现预期目的的量的活性成分(例如5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其混合物)的组合物。例如，在优选的实施方案中，药物组合物的有效量包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其混合物的化合物的量。有效量的测定完全在本领域技术人员的能力范围内，特别是根据本文提供的公开内容。
一些含硒化合物已被合成制备、纯化和在生物活性测定法中筛选。硒化酵母或其水提取物中并非所有的组分和化合物当获自所述酵母时具有生物活性，并且事实上可能对细胞有毒性。
本公开内容的组合物可配制用于任何给药途径，具体而言用于口服、直肠、透皮、皮下、静脉内、肌内或鼻内给药。合适的给药途径可包括例如口服或透粘膜给药；以及胃肠外递送，其包括肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内或鼻内给药。
对于注射，本申请的组合物(例如含硒组合物)可在水溶液中配制，例如在生理上相容的缓冲液例如Hanks’溶液、林格溶液或生理缓冲盐水。对于组织或细胞给药，在制剂中使用适合于待渗透的特定屏障的渗透剂。所述渗透剂通常是本领域已知的。
在实施方案中，包含或合成配制的化合物的组合物可包含相等量的各含硒组分，例如比率为至少1:1:1的γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸和5’-甲基硒代腺苷和Se-腺苷-L-高半胱氨酸。在其它实施方案中，组合物可包含比率为1:1至100:1、1:1至50:1、1:1至10:1、1:1至6:1或1:1至3:1的至少两种组分。
包含一种或多种化合物(包括5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合)的组合物可在药学上可接受的载体例如生理盐水中静脉内给予受试者(例如患者)。可使用胞内递送化合物的标准方法(例如通过脂质体递送)。这样的方法是本领域普通技术人员众所周知的。
包含硒的组合物可用于静脉内给药以及胃肠外给药，例如静脉内、皮下、肌内和腹膜内。对于注射，本申请的包含硒的组合物(例如药物组合物)可在水溶液中配制，优选生理上相容的缓冲液例如Hanks’溶液、林格溶液或生理缓冲盐水。对于组织或细胞给药，在制剂中使用适合于待渗透的特定屏障的渗透剂。这样的渗透剂通常是本领域已知的。
在一些实施方案中，药用制剂可包含崩解剂、胶化淀粉和包衣。在实施方案中，崩解剂包括交联聚乙烯吡咯烷酮、树胶、淀粉包括胶化淀粉和纤维素产品。在实施方案中，包衣包括聚乙烯醇、纤维素衍生物和甲基丙烯酸衍生物。
在本申请的一些实施方案，包含硒的组合物和/或制剂可单独或与其它形式的硒、药物、小分子组合或在药物组合物中给予受试者，所述药物组合物中其与赋形剂或其它药学上可接受的载体混合。在实施方案中，组合物可包括一种或多种氨基酸或硒代氨基酸，例如甲硫氨酸、半胱氨酸或硒代半胱氨酸，以使毒性最小。在本申请的一个实施方案中，药学上可接受的载体是药学上惰性的。在本申请的另一实施方案中，包含硒的组合物可单独给予遭受、有风险发生或患有与葡萄糖代谢有关的疾病或病况的个体。
组合物还可配制为任何常规形式，例如片剂、胶囊剂、囊片、溶液、混悬剂、分散剂、糖浆剂、喷雾剂、凝胶、栓剂、贴剂和乳剂。本申请的组合物，特别是包含5’-甲基硒代腺苷、式(I)的化合物和其组合的组合物，还可添加至营养饮料或食物产品(例如ENSURE、POWERBAR等)、多维生素、营养产品等，以辅助每日消耗。
使用化合物和组合物的方法
关于与生物过程和转录活化/失活有关的基因的基因表达，本公开内容的化合物和组合物显示组织特异性。例如，本申请涉及使用本文所述的化合物和组合物代替胰岛素、提高胰岛素活性、提高葡萄糖敏感性、抑制葡萄糖产生或调节受试者的各种生物途径中的葡萄糖代谢的方法。因此，包含硒的组合物和化合物可单独或组合给予遭受、有风险发生或患有与本文所述的基因的畸变有关的疾病或病况的个体。例如，本申请的方法可用于诊断或治疗(例如预防性或治疗性)患有与非胰岛素依赖性(II型)糖尿病(DM)有关的病况的受试者。
在本公开内容的一个实施方案中，在受试者中代替胰岛素的方法包括给予受试者组合物，所述组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。在另一个实施方案中，与未用组合物治疗的受试者的肝细胞相比，有效量的组合物在受试者的肝细胞中代替胰岛素。在一些实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。在实施方案中，组合物包含至少0.05% (w/v)的两种化合物的每一种。在其它实施方案中，组合物包含至少0.033% (w/v)的三种化合物的每一种。
在另一个实施方案中，在受试者中提高胰岛素活性的方法包括给予受试者组合物，所述组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。在另一个实施方案中，与未用组合物治疗的受试者的肝细胞相比，有效量的组合物在受试者的肝细胞中提高胰岛素活性。在一些实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。在实施方案中，组合物包含至少0.05% (w/v)的两种化合物的每一种。在其它实施方案中，组合物包含至少0.033% (w/v)的三种化合物的每一种。在受试者中提高胰岛素活性的方法的另外的实施方案进一步包括给予胰岛素或其类似物或衍生物。
在又一实施方案中，在受试者中抑制葡萄糖产生的方法包括给予受试者组合物，所述组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。在另一个实施方案中，与未用组合物治疗的受试者的肝细胞相比，有效量的组合物在受试者的肝细胞中抑制葡萄糖产生。在一些实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。在实施方案中，组合物包含至少0.05% (w/v)的两种化合物的每一种。在其它实施方案中，组合物包含至少0.033% (w/v)的三种化合物的每一种。
在另一个实施方案中，在受试者中增加FOXO3和/或FOXO4磷酸化的方法包括给予受试者组合物，所述组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少两种化合物。在另一个实施方案中，与未用组合物治疗的受试者的肝细胞相比，有效量的组合物在受试者的肝细胞中增加FOXO3和FOXO4磷酸化。在一些实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。在实施方案中，组合物包含至少0.05% (w/v)的两种化合物的每一种。在其它实施方案中，组合物包含至少0.033% (w/v)的三种化合物的每一种。
在实施方案中，在受试者中调节葡萄糖代谢的方法包括给予受试者有效量的组合物，所述组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物的至少两种不同的化合物。在另一个实施方案中，与未用组合物治疗的受试者的肝细胞相比，有效量的组合物在受试者的肝细胞中调节葡萄糖代谢。在一些实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。在实施方案中，组合物包含至少0.05% (w/v)的两种化合物的每一种。在其它实施方案中，组合物包含至少0.033% (w/v)的三种化合物的每一种。
在实施方案中，在受试者中增加葡萄糖敏感性的方法包括给予受试者组合物，所述组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少两种不同的化合物。在另一个实施方案中，与未用组合物治疗的受试者的肝细胞相比，有效量的组合物在受试者的肝细胞中增加葡萄糖敏感性。在一些实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。在实施方案中，组合物包含至少0.05%(w/v)的两种化合物的每一种。在其它实施方案中，组合物包含至少0.033% (w/v)的三种化合物的每一种。
在实施方案中，在受试者中治疗糖尿病的方法包括给予受试者组合物，所述组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少两种不同的化合物。在另一个实施方案中，与未用组合物治疗的受试者的肝细胞相比，有效量的组合物在受试者的肝细胞中治疗糖尿病。在一些实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。在实施方案中，组合物包含至少0.05%(w/v)的两种化合物的每一种。在其它实施方案中，组合物包含至少0.033% (w/v)的三种化合物的每一种。
在一些实施方案中，提供用于在受试者中抑制G6PC的表达的方法或用途，包括给予受试者组合物，所述组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少两种化合物。在另一个实施方案中，与未用组合物治疗的受试者的肝细胞相比，有效量的组合物抑制受试者的肝细胞中的G6PC基因表达。在一些实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。在实施方案中，组合物包含至少0.05% (w/v)的两种化合物的每一种。在其它实施方案中，组合物包含至少0.033% (w/v)的三种化合物的每一种。
在一些方法实施方案中，与未用化合物治疗的相同类型的细胞相比，G6PC减少的范围为大约50%增加或减少至500%增加或减少。G6PC反应的幅度取决于细胞类型、特定的化合物和与细胞接触的时间。
在其它实施方案中，提供用于在受试者中增加胰岛素受体(INSR)的表达的方法或用途，包括给予受试者组合物，所述组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少两种化合物。在另一个实施方案中，与未用组合物治疗的受试者的肝细胞相比，有效量的组合物在受试者的肝细胞中增加胰岛素受体的表达。在一些实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。在实施方案中，组合物包含至少0.05% (w/v)的两种化合物的每一种。在其它实施方案中，组合物包含至少0.033% (w/v)的三种化合物的每一种。
在实施方案中，提供用于在受试者中增加胰岛素-样生长因子受体(IGF1R)的表达的方法或用途，包括给予受试者组合物，所述组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少两种化合物。在另一个实施方案中，与未用组合物治疗的受试者的肝细胞相比，有效量的组合物在受试者的肝细胞中增加胰岛素-样生长因子受体的表达。在一些实施方案中，组合物包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物。在实施方案中，组合物包含至少0.05% (w/v)的两种化合物的每一种。在其它实施方案中，组合物包含至少0.033% (w/v)的三种化合物的每一种。
在任何一种本文所述的方法中，组合物可包含5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸或其混合物。在任何一种本文所述的方法中，组合物可包含至少约0.1% (w/v)的5’-甲基硒代腺苷。
在任何一种本文所述的方法中，组合物可呈干燥或胶囊形式。在任何一种本文所述的方法中，组合物可进一步包含胰岛素或其类似物或衍生物。在任何一种本文所述的方法中，组合物可进一步包含胰岛素敏化剂、胰岛素促分泌剂或肠降血糖素模拟物。
在任何一种本文所述的方法中，组合物可排除5’-甲基硫代腺苷、S-腺苷-L-高半胱氨酸或γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸的一种或多种。在任何一种本文所述的方法中，组合物可口服给予。
在任何一种本文所述的方法中，组合物可给予至受试者的一种或多种肝细胞。在一些实施方案中，如本文所述的任何一种方法进一步包括给予胰岛素或其类似物，或进一步包括给予用于调节葡萄糖代谢或治疗糖尿病的不同的治疗剂。
在本申请的方法的实施方案中，提供包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物和式(III)的化合物的至少三种不同的化合物的组合物用于在受试者中代替胰岛素或提高胰岛素活性的用途。在实施方案中，用途进一步包括胰岛素或其类似物。在实施方案中，用途进一步包括用于调节葡萄糖代谢或治疗糖尿病的不同的治疗剂。在本申请的其它实施方案，提供包含选自5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸、γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸、式(I)的化合物、式(II)的化合物、式(III)的化合物和其组合的至少三种不同的化合物的组合物用于抑制肝中的G6PC的用途。
含硒化合物在肝细胞和神经元细胞中不同地影响基因表达。与如本文所述的化合物和组合物对肝细胞具有的影响相反，相同或类似的组合物可以相反的方式影响神经元细胞。例如，如本文所述的组合物，降低神经元细胞中的FOXO3和/或FOXO4的磷酸化，而不是增加FOXO3或FOXO4表达，如本公开内容的方法中所说明的。
在本公开内容的方法的另外的实施方案中，如本文所述的化合物和组合物的有效量是有效抑制G6PC的表达、降低肝细胞中的葡萄糖产生或增加肝细胞中的FOXO磷酸化而对细胞无毒的量。选择的化合物的有效量对任何例举的细胞不显示毒性，所述细胞包括小鼠骨骼、人神经元或小鼠肝细胞。此外，包含本文所述的化合物的组合物并不不利地影响肝细胞中的葡萄糖代谢。
测定受试者的细胞中的基因表达的方法是本领域技术人员已知的，和可包括与引物和/或探针杂交(例如在阵列上)，或通过PCR方法。用于测定基因表达的阵列和/或引物是市售可得的。引物和阵列或微阵列可容易地使用本文所述的基因的公众可得的序列设计，所述基因例如G6PC、FOXO3、FOXO4、INSR和IGF1R。例如，G6PC的示例性的序列见于NM_000151.3 、GI:393537030、Gene ID: 2538；FOXO3的示例性的序列见于NM_001455.3、 GI:146260266、Gene ID: 2309；FOXO4的示例性的序列见于NM_001170931.1、GI:283436082、Gene ID: 4303；INSR的示例性的序列见于NM_000208.2、GI:119395735、Gene ID: 3643；和IGF1R的示例性的序列见于XM_011521513.1、GI:767983996、Gene ID: 3480。肝细胞中的基因表达调节可如本文所述的，在获自按照本文所述的组合物治疗的受试者的样品上使用许多测定法进行测定。
医学或研究领域中众所周知的是，对于任何一个受试者的剂量可取决于许多因素，包括但不限于患者的大小（size）、体表面积、年龄、待给予的特定化合物、性别、给药的时限(timing)和途径、一般健康和与同时给予的其它药物的相互作用。在实施方案中，本发明的组合物的剂量可根据在受试者中观察到的功效或明显的硒中毒征兆的存在而调整。硒中毒可通过症状指示，所述症状包括但不限于蒜味呼吸、掉发或薄而易剥落的指甲（flakynails）。
在一些实施方案中，至少一天一次给予本发明的组合物的剂量，持续一段时间以实现血液中元素硒的稳定状态。在仍其它的实施方案中，在受试者正经历疾病或病症的症状时，可给予本发明的组合物的剂量。
实施例
以下实施例提供本公开内容的组合物、化合物和方法的说明性的实施例或实施方案。本公开内容的化合物、组合物和方法的说明性的实施方案通过实施例的方式在本文中提供。尽管本公开内容的概念和技术可接受各种修改和代替形式，其具体的实施方案通过实施例的方式在附图中显示，并将在此处详细描述。然而应理解，不意图限制本公开内容的概念至所公开的具体形式，而是相反，意图涵盖与本公开内容和随附权利要求一致的所有修改、等同物和代替物。
将理解，本文所述的技术具有广泛的应用。选择和描述前述实施方案是为了说明技术原理以及一些实践应用。尽管本文已经描述和/或例举了某些实施方案，但预期其相当大的变化和修改是可能的。
实施例1: 合成和表征5’-甲基硒代腺苷(“化合物C”)
产生化合物C的合成方案和方法为：
Figure DEST_PATH_IMAGE019
将硼氢化钠(227mg，6.0mM，在Aro下)置于装配在磁力搅拌器上和位于冰冷却浴中的含有20mL的无水乙醇的200mL圆底烧瓶中。二甲基二硒化物(190uL，376mg，2.0mM)加入至烧瓶中，同时冷却，搅拌并处于Ar流下。在形成浅黄色溶液后，加入固体5’-氯-5’-脱氧基腺苷(1,143g，4.0mM)。加入100mL的乙醇以溶解沉淀。在之后的四天中室温搅拌混合物。使用质谱法监测到大约75%转化，这在5天后实现。蒸发溶剂和收集3.22g的产物(含大约20%的初始材料(SM))和通过反相(C-8)制备型色谱纯化。收集收率1.1g的纯产物，其分子量通过质谱法证实。
实施例2：合成和表征Se-腺苷-L-高半胱氨酸(“化合物D”)
产生化合物D的合成方案和方法显示在下文步骤1-6中：
Figure 316673DEST_PATH_IMAGE020
5’-氯-5’-脱氧基腺苷(639-62)
将89克(0.366摩尔，1当量)腺苷、59.3mL (58，1.833摩尔，2当量)无水吡啶和1L无水乙腈置于烘箱干燥的2L四颈烧瓶中，其装配有滴液漏斗、搅拌器、气体入口/出口和温度计。将反应装置（reaction set）放置在冰/盐浴中和开始搅拌。当溶液的温度下降到低于3℃时，缓慢加入亚硫酰氯。在亚硫酰氯加入期间将反应混合物的温度保持在低于5℃和持续4h以上(此时溶液是黄色的，底部具有白-黄色沉淀)。在环境温度下将反应放置过夜。
第二天早上，将大的（voluminous）沉淀使用烧结的玻璃滤器滤出和在滤器上用300 ML体积的无水乙腈洗涤。在此期间，沉淀颜色变成白色。然后将湿的沉淀转移回含有800ML的甲醇和160ML的水的混合物的2L反应烧瓶。逐滴加入80毫升（80ML）的浓氢氧化铵溶液至反应烧瓶，同时机械搅拌和用水浴冷却。将混合物在环境温度下搅拌45 min，和形成白色沉淀，其通过真空过滤与液体分离。
使用真空旋转蒸发器将滤液浓缩至干燥，而沉淀从大约560ML热水中结晶。将沉淀在冰水浴中冷却，并将第一批结晶滤出和冷冻干燥。将滤液用作固体结晶中的溶剂，其获自第一滤液的旋转蒸发，以得到第二批产物（The filtrate was used as a solvent in thecrystallization of solids, which resulted from the rotary evaporation of thefirst filtrate to obtain the second crop of the product）。将第二批产物冷冻干燥2天。最终将两批结晶在真空干燥器中经五氧化磷干燥2天。得到84克白色结晶，收率80.5%。MS(286-M+H)，mp.187℃。硒代腺苷高半胱氨酸(655-40)。
将L-硒代甲硫氨酸(9.806克，50mM，1当量)加入配备有温度计、大的冷却指(cooling finger)(在出口具有气泡检查仪)、氨气入口(达到烧瓶底部)和磁力搅拌棒的2L三颈烧瓶，和置于含有CO2-丙酮冷却浴的2.5L的双层容器（duar vessel）中。将Ar°通过烧瓶，然后加入固体CO2至丙酮浴和冷却指。当烧瓶内侧的温度下降至低于-35℃时，无水氨流(气体)开始，和当液体氨水水平达到800ML体积时，气体流停止。
加入小片的金属钠至充分搅拌的溶液中，直到溶液的蓝紫色持续大约30秒。在45min内加入总共2.645克(115mM，2.3当量)的钠。搅拌和冷却持续30min以上。此时所有组分都在溶液中了。单次加入（added in a single portion）无水5’-氯-5’-脱氧基腺苷(14.856克，52mM，1.04当量)和将反应混合物放置，同时搅拌并通入极慢的Aro流过夜。
第二天早上，加入350ML的无水甲醇至烧瓶中存在的白色固体。将烧瓶置于油浴中，安装回流冷凝器，保持Aro气流，并在后续24小时内将油浴加热至50℃。用几滴0.1N HCl将1ML溶液酸化至pH 3.5和使用质谱法分析样品中底物的存在。
如果低于5%，混合物可用1N HCl酸化至pH 3.5，自盐过滤（filtered fromsalts），使用真空旋转蒸发器浓缩至干，并可将粗产物通过从水-乙醇混合物中结晶而纯化。第一批硒代腺苷高半胱氨酸结晶得到15.98克产物，收率74%。然而，大约95%的产物是洁净的，并可用于生物学研究无需进一步纯化。
实施例3：合成和表征γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸(“化合物E”)
产生化合物E的合成方案和方法显示在下文步骤1-4中：
Figure DEST_PATH_IMAGE021
合成N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OSe (655-90)
将N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OH (303mg，1.0Mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(121mg，1.05Mmol)和二环己基碳二亚胺(227mg，1.1Mmol)悬浮/溶于15ML的无水乙醚，和从注射器加入10uL的二甲基乙基苄基胺至反应混合物。在环境温度下(22℃)搅拌持续48h。将混合物过滤，和用10mL的乙醚将沉淀洗涤10次。将滤液浓缩，和在高真空下干燥，得到白色结晶产物(570mg，约90%收率)。MS (M+Na+) = 423.17。
合成N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-MeSe-Cys-OH (655-90)
将N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-OSe(570mg，0.9Mmol)、甲基硒代半胱氨酸(175mg，0.8Mmol)、三乙基胺(152mg，209μL，1.5Mmol)加入至6mL的1,4-二噁烷和2mL的水的混合物。磁力搅拌反应混合物，持续100h。此后加入1.21M HCl (1.65mL)和反应后混合物用三轮(3x) 20mL乙醚萃取。使用真空旋转蒸发器，浓缩萃取物至干燥，得到649 mg的蜡状产物，对其进行制备型HPLC。收集283mg的产物，具有75.6%收率。质谱证实产物的分子量和其中单Se原子的存在。对于C18H32N2O7Se的计算质量=468.42；这些结果得到469.24 m/e (M+H+)和491.24 m/e (M+Na+)。
合成γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸(655-92)
将283mg (0.6Mmol)的N-Boc-(O-tBu)-L-Glu-MeSe-Cys-OH、2mL的苯硫基甲烷（thioanisol）和5mL的三氟乙酸的混合物用磁力搅拌在油浴中加热6小时并处于63℃下。将混合物在环境温度下(22℃)放置过夜。将反应混合物滴加至20 ML的剧烈搅拌的乙醚中。形成的沉淀用两轮(2x) 20ML的乙醚洗涤。产物得到138.3mg的膏状（creamy）沉淀，其然后通过制备型HPLC纯化。
实施例4：
在本文所述的实例中在细胞培养中(体外)测试合成的单独的含硒有机化合物、单独的含硒有机化合物和它们的硫类似物的组合对细胞存活或成活力和基因表达的影响。具体而言，测试的细胞是小鼠AML-12肝细胞。
材料和方法
细胞系和化合物
小鼠肝细胞系AML-12和人成神经细胞IMR-32细胞购自American Type CultureCollection (ATCC，Manassas，Virginia)。AML-12细胞在补充有10%胎牛血清(FBS)、40 ng/ml地塞米松(Dex，Sigma)和1X ITS (含有0.01 mg/ml牛胰岛素、0.0055 mg/ml人转铁蛋白、5 ng/ml钠硒)溶液(Sigma)的Dulbecco改良的Eagle培养基和Ham's F12 (DMEM/F12)培养基中扩增。IMR-32细胞在补充有10% FBS的Eagle最低限度必需培养基(EMEM)中培养。
化合物C (5’-甲基硒代腺苷)、化合物D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和化合物E(γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸)和它们的硫类似物、化合物H (5’-甲基硫代腺苷)、化合物I (S-腺苷-L-高半胱氨酸)和化合物J (γ-谷氨酰基-甲基-半胱氨酸)经合成或获自商业来源(在可得的情况下)。所有测试的化合物的纯度经验证为≥ 99%，如通过质谱法所测定。三个批次的上述合成的化合物用于以下实验。
本文的实施例中显示的ppb值是指含硒化合物中的硒的ppb或含硫化合物中的硫的ppb以确保在实验中测试相同量的硒或硫。
为了将基于硒的ppb转换为化合物的ppb，化合物中的Se的%通过硒的原子量除以化合物的分子量并且将被除数乘以100来计算。为了将基于硫的ppb转换为化合物的ppb，化合物中的S的%通过硫的原子量除以化合物的分子量并且将被除数乘以100来计算。
例如，硒的原子量78.96除以化合物C的分子量344并将结果乘以100，得到化合物C中的硒的%为23%。同样，对于化合物D，硒的原子量78.96除以化合物D的分子量432和结果乘以100，得到化合物D中的硒的%为18%。对于化合物E，硒的原子量78.96除以化合物E的分子量311和结果乘以100，得到化合物E中的硒的%为25%。
这些% Se值用于导出转换硒的ppb为化合物的ppb的系数。这些系数为：对于化合物C，4.35；对于化合物D，5.46；和对于化合物E，3.94。为了将基于硒的ppb转换为化合物的ppb，将标示的硒的ppb乘以如下表中所示的各化合物的系数。例如，下文实验中150 ppb的化合物C是指150 ppb的硒并等同于653 ppb的化合物C。
对于硫化合物，硫的原子量32除以化合物H的分子量297并将结果乘以100，得到化合物H中的硫的%为11%。同样，对于化合物I，硫的原子量32除以化合物I的分子量384并将结果乘以100，得到化合物I中的硫的%为8%。对于化合物J，硫的原子量32除以化合物J的分子量264并将结果乘以100，得到化合物J中的硫的%为12%。
这些% S值用于导出将硫的ppb转换为化合物的ppb的系数。这些系数为：对于化合物H，9.28；对于化合物I，12.00；和对于化合物J，8.25。为了将基于硫的ppb转换为化合物的ppb，将标示的硫的ppb乘以如下表中所示的各化合物的系数。例如，下文实验中所述的150ppb的化合物H是指150 ppb的硫并等同于1392 ppb的化合物H。
Figure 71003DEST_PATH_IMAGE022
细胞成活力测定法
培养的AML-12的细胞成活力使用Promega的CellTiter96® AQueous OneSolution Cell Proliferation Assay试剂盒，根据制造商的方案和说明书测定。简言之，AML-12 (1X104细胞/孔)接种于96-孔澄清的板(VWR)和在含有10% FBS、1X ITS和40 ng/mlDex的DMEM/F12培养基中培养过夜。然后细胞用含对照(水)或化合物的无ITS DMEM/F12培养基(含有10% FBS和40 ng/ml Dex)处理48小时。
培养的细胞用AQueous One solution (100 ul/孔)在37℃孵育1小时和通过Bio-Tek微板阅读器测定各样品在OD490 nm的吸光度。培养的细胞的细胞成活力通过培养的细胞的OD490 nm减去空白培养基(未接种细胞)的OD490 nm来确定。对于上述分析检查8个样品/处理。数据显示为8个样品的平均值 ± SEM。
RNA和蛋白分析的细胞处理
对于胰岛素受体(Insr)、胰岛素样生长因子受体(Igf1r)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)的RNA分析，让AML-12细胞在含有ITS、Dex和FBS的DMEM/F12培养基中扩增，和在24-孔(6.7 X 104细胞/孔)板上在10% FBS无ITS DMEM/F12培养基(含或不含Dex)中培养过夜。这些细胞用对照(水)或各种化合物(稀释于10% FBS无ITS DMEM/F12培养基，含或不含Dex)处理6小时、24小时或48小时。
在一些实验中，化合物处理24小时后AML-12细胞用PBS洗涤两次，然后用硒化合物(150或300 ppb的各化合物)在存在或不存在胰岛素(10或100 nM)、0.1 mM 8-CPT (Sigma)或0.5 μM Dex的情况下在补充有20 mM乳糖和2 mM丙酮酸盐和15 mM HEPES的无血清、葡萄糖/无酚红DMEM培养基(葡萄糖-生产培养基)中孵育另外6小时。处理后，收集细胞培养基和使用Abcam葡萄糖测定试剂盒根据制造商的方案进行葡萄糖测定法。细胞裂解和收集用于RNA分离和G6pc、Insr和Igf1r的PCR分析。
对于蛋白表达研究，将AML-12细胞在含ITS、Dex和FBS的DMEM/F12培养基中扩增，和在6-孔(3.33 X 105细胞/孔)板上在10% FBS无ITS DMEM/F12培养基(含或不含Dex)中培养过夜。这些细胞用对照(水)或各种化合物在含血清(10% FBS无ITS DMEM/F12培养基，补充Dex)或无血清(无ITS/Dex DMEM/F12培养基)中处理6小时和24小时。此外，人成神经细胞IMR-32细胞在10% FBS EMEM培养基中培养，然后用对照(水)、硒化合物和它们的硫类似物在相同的含血清培养基中处理6小时和24小时。
RNA分离和实时PCR分析
使用Trizol (Invitrogen)根据制造商的方案自这些细胞分离总RNA，然后用DNase I孵育以除去任何可能污染的基因组DNA。RNA样品使用Applied-Bioscience的RT试剂盒和预设计的Taqman探针(Invitrogen)进行实时PCR分析，如之前所述(Lan等，EMBO J2003)。在各处理组中分析3-6个样品。数据通过各样品中的肌动蛋白B (Actb) mRNA水平标准化和显示为3-6个样品的平均值 ± SEM。
蛋白制备和蛋白质印迹分析
AML-12肝细胞或IMR-32神经元细胞接种于6-孔板和然后用溶媒和各种化合物处理6小时和24小时，如本文所述的。处理后，细胞用冰冷的PBS漂洗，和在含有完全蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo-Fisher Scientific，Waltham，MA)的冰冷的RIPA缓冲液中在冰上裂解30 min。细胞裂解物使用细胞刮刀和移液管收集，然后以12000x g在4℃离心30 min以除去DNA沉淀和获得蛋白提取物。这些细胞裂解物的上清液中的蛋白水平使用Pierce Micro-BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific-Piece Biotechnology，Rockford，IL)根据制造商的方案检测。
对于蛋白质印迹分析，对来自对照-和化合物(s)-处理的细胞的5微克的总蛋白进行SDS-PAGE凝胶分离，然后转移至PVDF膜，如之前所述(Reddy，Liu等，2008 Science)。膜用含有5% (w/v)的牛血清白蛋白(Sigma，St. Louis，MO)的磷酸盐-缓冲盐水(PBS)封闭和用特异性的第一抗体孵育。然后将膜用HRP-缀合的抗-小鼠或抗-兔第二抗体(1:5000稀释，Cell Signaling，Inc.)孵育。
除了Actb (Li-COR，Lincoln，Nebraska)、Elf2bε和pElf2bε (Abcam，Cambridge，MA)，所有第一抗体购自Cell Signaling Inc。膜印迹上的阳性信号使用Amersham的增强型化学发光蛋白质印迹最佳检测试剂(GE healthcare Lifescience，Pittsburgh，PA)检测。膜印迹上的发光信号的图像使用LI-COR Odyssey Fc图像系统(Lincoln，Nebraska)捕获。相同的膜印迹切成条状，和按GE WB ECL最佳检测方案(GE healthcare Lifescience，Pittsburgh，PA)中所述用另一抗体再次印迹。蛋白质印迹中的蛋白条带强度使用Li-CORImage studio软件或NIH ImageJ软件测定，和然后通过各样品中的Actb水平标准化。数据显示为三个样品/各组的平均值 ± SEM。
统计分析
适当时，使用学生t检验以p值小于0.05，来确定盐水-处理组和化合物CDE-处理组之间的差异的统计显著性。
结果和讨论：
化合物CDE对AML-12细胞的成活力的影响
为测试是否硒化合物对AML-12细胞的存活存在任何毒性作用，在肝细胞上进行细胞成活力测定法。将AML-12细胞用水对照或150 ppb的单独的化合物C、化合物D、化合物E、化合物H、化合物I和化合物J；化合物I和J的组合(“化合物IJ”)；化合物D和化合物E的组合(“化合物DE”)；和化合物C、化合物D和化合物E的组合(“化合物CDE”)处理48小时。
与对照组相比，包括单一化合物和化合物组合在内的化合物处理无一引起AML-12细胞的细胞成活力的显著降低(通过OD490 nm表示) (图1)。这些结果证实，硒化合物CDE对AML-12细胞的存活或成活力不具有任何负面影响。
在含FBS-和Dex-而无ITS的培养基中培养的AML-12细胞中化合物CDE抑制G6pc mRNA表达
肝是产生葡萄糖以维持血流中的正常葡萄糖水平的主要器官。葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基(G6pc)是用于肝中糖原异生的重要的酶。为了研究化合物CDE在肝中的可能的功能，通过QRT-PCR分析检查在本文所述的各种条件下培养的AML-12细胞中的G6pc表达。
推荐AML-12细胞应在含有血清-、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠补充剂(ITS)和地塞米松(Dex)的培养基中培养或扩增。为排除ITS中的胰岛素和亚硒酸钠可干扰测试的硒化合物在AML-12细胞中的作用的可能性，研究在无ITS但含有FBS和Dex的培养基中培养的AML-12细胞中的G6pc表达。简言之，AML-12细胞在完全扩增培养基(10% FBS、含有ITS-和Dex-的DMEM/F12)中培养/扩增，接种于培养板，和在无ITS含有FBS-和Dex-的培养基中培养过夜。这些细胞用对照(水)、单独的硒化合物：化合物C、化合物D、化合物E (各化合物剂量为150ppb)和单独的硫化合物：化合物H、化合物I、化合物J处理。化合物CDE的组合和化合物HIJ的组合也在细胞上测试48小时。这些处理后，收集细胞和进行QRT-PCR分析。
如图2A所示，用化合物CDE组合而非化合物HIJ硫类似物组合处理AML-12肝细胞，在实验条件下引起肝细胞中的G6pc表达的非常显著(大约50%)降低。此外，用所有单独的化合物处理后，进一步在AML-12细胞中检查G6pc表达(见图2B)。未观察到G6pc表达的显著改变(例如增加或降低)。数据显示为4个样品的平均值 ± SEM。
在使用不同批次的细胞的三次重复实验中，观察到在响应化合物CDE组合时G6pc表达降低的作用(数据未显示)。该作用不归因于硒化合物对细胞存活的可能的毒性作用，因为在相同的实验条件下化合物CDE不影响AML-12细胞的成活力(见图1)。这些结果证实，组合的化合物CDE而非单独的化合物或它们的硫类似物，在培养基中存在FBS和Dex的情况下可抑制AML-12细胞的G6pc表达。
在无ITS-和Dex-含FBS的培养基中24小时，接着在无血清培养基中6小时，化合物CDE的组合抑制AML12细胞的G6pc表达
已报道，Dex可调节肝中的G6pc表达。研究在无ITS/Dex-培养条件下化合物CDE在AML-12细胞中的作用。在无血清条件下培养24小时和48小时的肝AML-12细胞显示一定的异常细胞形态。然而，在无血清培养基中培养6小时后，未观察到AML-12细胞中总体形态学变化（gross morphological changes）(数据未显示)。因此，AML-12细胞用化合物CDE在含血清但无ITS/Dex-的培养基中预处理24小时，接着在无血清/ITS/Dex-的培养基中用这些化合物再处理6小时，以进一步研究化合物CDE对G6pc表达的作用。
简言之，AML-12细胞用150或300 ppb化合物CDE组合(稀释于10% FBS但无ITS/Dex-的培养基)处理24小时。然后细胞用PBS洗涤两次，以除去残留的FBS和用相同剂量的这些硒化合物在存在或不存在10或100 nM胰岛素(稀释于无FBS/ITS/Dex-培养基)的情况下孵育6小时。包括胰岛素单独处理用于比较化合物CDE作用的功效和化合物CDE和胰岛素之间的可能的加和或协同作用。
如图3所示，两个剂量的胰岛素(10和100 nM)处理显著抑制G6pc表达，这是预期的。剂量150 ppb的化合物CDE单独处理引起G6pc表达降低的趋势(图3)。更显著的是，剂量300 ppb的化合物CDE处理引起在这些AML12肝细胞中G6pc表达的稳健和显著降低，功效至少与100 nM胰岛素相当(图3)。此外，当与对照相比，胰岛素处理与150或300 ppb化合物CDE的测试的组合也导致G6pc mRNA表达显著降低(图3)。结果清楚显示，化合物CDE可模拟胰岛素抑制在AML-12细胞中的G6pc表达并且有效剂量300 ppb化合物CDE与100 nM胰岛素相当。
在模拟糖尿病条件下(通过cAMP和Dex两者刺激)培养的AML-12细胞中，化合物CDE抑制G6pc表达和改进胰岛素在调节G6pc表达中的作用
为了进一步研究化合物CDE对G6pc表达的作用，检查用可细胞渗透的8-(4-氯苯基硫代) cAMP (8-CPT)和地塞米松(Dex)共处理的AML-12细胞中的G6pc mRNA表达。环状AMP(8-CPT)和Dex是肝中众所周知的G6pc表达和葡萄糖产生的刺激物，其体内模拟糖尿病病况。简言之，AML-12肝细胞用水(对照)或150 ppb或300 ppb的化合物CDE组合在10% FBS但无ITS/Dex-的培养基中预处理24小时。在该起始处理之后，用这些硒化合物在存在或不存在10 nM或100 nM胰岛素、0.1 mM 8-CPT和0.5 μM Dex的情况下在无血清培养基中再处理6小时。在这些处理之后，收集细胞和进行QRT-PCR分析。图4中数据显示为4个样品的/各组的平均值 ± SEM。图4中不同的字母(a与b、a’与b’与c’、a”与b”与c”)意指这些两个组之间显著的差异。
如图4中所示，用8-CPT/Dex处理的AML-12肝细胞显示G6pc mRNA表达极大增加。用两个剂量的胰岛素处理显著降低AML-12细胞中8-CPT/Dex-诱导的G6pc表达(与8-CPT/Dex组相比，图4中的柱状图)。更重要的是，剂量为150 ppb的化合物CDE也显著削弱8-CPT/Dex-诱导的G6pc表达。在8-CPT/Dex和较高剂量(300 ppb)的化合物CDE的组合处理后，在AML-12细胞中G6pc表达的平均水平进一步降低，即使由于在该处理组中G6pc表达高变异导致的P值大于0.05 (与8-CPT/Dex组相比)。无论如何，这些研究证实，与胰岛素一样，测试剂量下的化合物CDE单独可抑制8-CPT/Dex-诱导的G6pc表达(与8-CPT/Dex组相比，降低约40-48%)。
此外，与10 nM胰岛素和8-CPT/Dex组相比，150 ppb剂量的化合物CDE与10 nM胰岛素以及8-CPT/Dex组合处理，进一步抑制AML-12细胞中的G6pc表达(通过图4的柱状图中的a’与b’指示)。此外，在用10 nM胰岛素、8-CPT/Dec和更高剂量的化合物CDE处理后，在AML-12细胞中G6pc mRNA水平的平均水平更低(10 nM胰岛素/8-CPT/Dex/300 ppb化合物CDE组与10 nM胰岛素/8-CPT/Dex/150 ppb化合物CDE组)。然而，在这两个组之间不存在统计学差异。
更显著的是，如插入的柱状图所示，与100 nM胰岛素和8-CPT/Dex组相比，用300ppb的化合物CDE与100 nM胰岛素以及8-CPT/Dex组合处理，进一步显著抑制AML-12细胞中的G6pc表达(通过图4的柱状图中的a”与b”与c”指示)。此外，在100 nM胰岛素、8-CPT/Dex和300 ppb的化合物CDE处理后，AML-12细胞中的G6pc mRNA水平显著低于100 nM胰岛素/8-CPT/Dex/150 ppb化合物CDE组的那些(见图4中的插入图)。
总之，这些结果证实，胰岛素和化合物CDE的组合比单独的胰岛素或单独的化合物CDE甚至更加有效地抑制由于8-CPT/Dex处理导致的G6pc表达增加。
在上述处理后还对AML-12细胞的培养基进行葡萄糖分析。不幸的是，甚至在8-CPT/Dex刺激后，AML-12细胞产生的葡萄糖的水平太低而不能通过灵敏的荧光葡萄糖测定法(Abcam)检测(数据未显示)。
概括言之，在上述培养条件下培养的AML-12细胞上的这些结果证实，在正常和病理或糖尿病病况的体外模型(例如用8-CPT/Dex处理细胞)两者下化合物CDE可模拟胰岛素抑制G6pc表达。此外，化合物CDE可在模拟糖尿病病况下培养的AML-12细胞中改进胰岛素作用以抑制G6pc表达。这些结果提供化合物CDE具有在I型和/或II型糖尿病中抑制过量葡萄糖产生的潜力的分子证据。
用化合物CDE处理后AML-12细胞中的Insr和Igf1r的表达上调
胰岛素受体(Insr)和胰岛素-样生长因子1受体1 (Igf1r)对于胰岛素和IGF1在肝中控制G6pc表达和随后葡萄糖产生的作用是重要的。为检查化合物CDE组合是否可在肝细胞中以受体依赖性方式调节胰岛素或IGF1敏感性，通过QRT-PCR分析测定胰岛素和IGF1受体的表达。
AML-12细胞首先用水对照(对照，n=4)、硒化合物CDE和它们的硫类似物化合物HIJ(n=4)在含FBS-/Dex-但无ITS-的培养基中处理24小时，然后进行Insr和Igf1r的QRT-PCR分析。如图5A中所示，在化合物CDE处理后Insr mRNA水平稳健增加2.78倍。类似地，Igf1r表达也显著受到化合物CDE刺激达约2.2倍增加(见图5B)。然而，硫类似物化合物HIJ不影响AML-12细胞中的Insr和Igf1r表达(见图5A和5B)。
为进一步验证化合物CDE可提高Insr和Igf1r表达，AML-12细胞用两个剂量的化合物CDE在含FBS-但无ITS/Dex-的培养基中处理24小时。然后细胞用相同剂量的化合物CDE在存在或不存在8-CPT/Dex的情况下在无FBS/ITS/Dex-的培养基中再处理6小时。此外，这些细胞用胰岛素处理6小时，以观察胰岛素和化合物CDE之间在控制Insr和Igf1r表达方面是否存在任何差异。
如图5C和5D所示，与对照(即，0 ppb CDE/无胰岛素和无8-CPT/Dex组)相比，在没有8-CPT/Dex共处理的情况下150 ppb和300 ppb两个剂量的化合物CDE处理显著提高AML-12细胞的Insr和Igf1r表达。然而，胰岛素单独不增加AML-12细胞的Insr和Igf1r表达(见图5B和5C)。类似地，剂量300 ppb的化合物CDE而非胰岛素处理也显著提高用8-CPT/Dex共处理的AML-12细胞的Insr和Igf1r表达(见图5C和5D中的黑色柱)。
这些结果证实，在测试的条件下化合物CDE可刺激AML-12细胞中的Insr和Igf1r表 达。此外，这些数据显示，在胰岛素和化合物CDE调节AML-12细胞中的基因表达的作用之间存在差异。此外，结果表明化合物CDE通过提高胰岛素灵敏性可有助于治疗I型和II型糖尿病。
总之，上述基因表达研究(图2A- 2B、3、4)证实，化合物CDE而非单独的化合物或它们的硫类似物可模拟胰岛素以显著削弱G6pc表达，从而代表了一种降低肝葡萄糖输出的新方式。这些数据还提供甚至在存在葡萄糖产生的刺激物例如8-CPT/Dex的情况下，化合物CDE可以类似于胰岛素抑制小鼠肝细胞中的G6pc表达的方式起作用的分子证据(图3-4)。
此外，组合的化合物CDE还在8-CPT/Dex-刺激的AML-12细胞中提高胰岛素作用以进一步抑制G6pc表达(图4)。组合的化合物CDE可刺激Insr和Igf1r表达(图5A-5D)，其也促进降低用于在肝中产生葡萄糖的G6pc表达，以及提高胰岛素/Igf1灵敏性和葡萄糖运输。此外，组合的化合物CDE对肝细胞的成活力不具有毒性作用(图1)。简言之，这些结果证实组合的化合物CDE模拟胰岛素在小鼠肝AML-12细胞中抑制G6pc表达，并且还提高胰岛素在该过程中的作用，这可能是通过刺激Insr和/或Igf1r的表达，而对细胞存活或成活力无毒性作用。
实施例5：化合物CDE靶向AML-12细胞中的Foxo3和Foxo4磷酸化
Forkhead转录因子家族亚类O (FOXO)在肝中的新陈代谢、糖原异生和胰岛素敏感性方面起关键作用。FOXO基因的胞内活性通过翻译后修饰而紧密调节。具体而言，FOXOs的磷酸化将其从核中排除，从而阻断其接近其靶基因。在胰岛素抗性或糖尿病个体中，没有用以从核中排除FOXOs的信号，因此其保持存在于核中，并刺激G6pc的转录。增加的G6pc表达驱动糖原异生，导致高血糖症。胰岛素-样生长因子(IGF)也可调节胰岛素控制FOXO-介导的用于在肝中产生葡萄糖的G6pc表达的作用。
如早先所述，AML-12肝细胞表明组合的化合物CDE可模拟胰岛素抑制G6pc表达的作用和可提高胰岛素在该过程中的作用。因为FOXOs是肝中的糖原异生和胰岛素灵敏性的主要的信号转导分子，检查了化合物CDE是否像胰岛素一样会靶向AML-12细胞中的FOXOs和其它相关的信号转导分子的问题。
在含血清培养基中培养的AML12细胞中化合物CDE靶向Foxo3和Foxo4磷酸化
为了确定化合物CDE的组合是否可调节在肝中的FOXO磷酸化，AML-12细胞用对照和150 ppb的硒化合物CDE和它们的硫类似物，150 ppb的化合物HIJ在含血清和Dex-但无ITS的培养基中处理6小时。对处理的细胞进行蛋白质印迹分析。蛋白质印迹中蛋白表达的定量数据表示为3个样品的平均值 ± SEM。柱状图中的不同的字母意指在这两个组之间显著差异(P < 0.05)。
图6A表明在用水和150 ppb的化合物HIJ和150 ppb的化合物CDE (稀释于含血清-和Dex-的培养基(但无ITS))处理6小时后，AML-12细胞中的各种信号转导分子包括磷酸化Foxo3T32 (苏氨酸32; pFoxo3T32)、磷酸化Foxo T28 (苏氨酸28; pFoxo4T28)、磷酸化PDK1 (pPDK1)、磷酸化AKT T308 (苏氨酸308; pAKTT308)、磷酸化AKT S473 (丝氨酸473;pAKTS473)、AKT、磷酸化Gsk3a S21 (丝氨酸21; pGsk3bS21)、磷酸化Gsk3b S9 (丝氨酸9;pGsk3bS9)、Gsk3a、Gsk3b、磷酸化4EBP1 T37/46 (苏氨酸37和苏氨酸46; p4EBP1T37T46)、磷酸化Elf2bεS539 (丝氨酸530; pElf2bεS530)和Elf2bε的蛋白表达。在用化合物CDE而非化合物HIJ处理6小时后，发现磷酸化形式的Foxo3 (例如在苏氨酸32处的pFoxo3，pFoxo3T32)和Foxo4 (例如在苏氨酸28处的pFoxo4，pFoxo4T28)蛋白在AML-12细胞中明显提高(图6A)。定量分析表明，在化合物CDE处理的AML-12细胞中pFoxo3T32大约2.5倍增加，和pFoxo4T28约3.2倍增加(图6B和6C)。我们还测试了几种磷酸化Foxo1 (pFoxo1)抗体，但通过这些抗体在蛋白质印迹上未检出特异性pFoxo1蛋白条带(数据未显示)。这些结果表明，AML-12细胞中的pFoxo1表达可能非常低。
在上述相同的处理后，进行AML-12细胞中的Foxo1、Foxo3和Foxo4蛋白水平的QRT-PCR分析。未观察到Foxo1、3或4 mRNA表达的任何明显改变(数据未显示)，而观察到的磷酸化Foxo3和Foxo4的增加(见图6A-6C)不是由于AML-12细胞中通过化合物CDE的Foxo3/4蛋白表达的可能增加所导致。事实上，在无血清条件中培养的AML-12细胞中的总Foxo3和Foxo4蛋白水平不受化合物CDE影响(见图7A)。
此外，测试了AML-12细胞中各自为150 ppb剂量的单独的化合物C、化合物D和化合物E以确定在相同培养条件下(在含血清培养基中) 6小时和24小时对Foxo3/4磷酸化的影响。用单独的化合物C、化合物D或化合物E处理后未观察到pFoxo3T32和pFoxo4T28蛋白水平的变化(数据未显示)，表明在导致在AML-12细胞中Foxo3和Foxo4磷酸化的化合物C、化合物D和化合物E的组合中存在协同作用。
总之，这些结果证实，当在含血清培养基中培养时，化合物CDE而非单独的化合物或它们的硫类似物可提高AML-12细胞中的Foxo3和Foxo4磷酸化。因为FOXOs的磷酸化导致这些转录因子的核排除，这些结果表明化合物CDE在AML-12肝细胞中起Foxo3和Foxo4失活剂的作用。
因为磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/磷酸肌醇-依赖性蛋白激酶1 (PDK1)/蛋白激酶B(AKT)是用于肝中胰岛素–介导的葡萄糖产生控制的FOXOs的上游的主要信号转导途径，评价了在这些化合物处理的AML-12细胞中是否存在磷酸化PDK1 (pPDK1)和AKT (pAKT)的水平的任何变化。令人惊讶的是，在测试6小时处理时化合物CDE不影响PDK1和AKT的磷酸化或总AKT水平(图6A)。这可能是因为化合物CDE对在较早时间点(在所检查的测试6小时时间点之前)发生在AML-12细胞中的PDK1和AKT的活化的可能的瞬时作用。
此外，直接受AKT控制的两种其它下游信号转导分子磷酸化GSk3a和GSK3b的水平，未观察到在它们的蛋白水平上具有任何变化(图6A)。对于胰岛素-驱动的蛋白合成或翻译重要的磷酸化4EBP1 (AKT/mTOR信号转导的下游分子靶标)和pelf2Bε S539 (Gsk3的下游分子靶标)的水平也未受到影响(见图6A)。这些结果提供另外的直接分子证据：化合物CDE对AML-12细胞增殖或存活不具有毒性作用，如较早所述的(图1)。
总之，这些结果表明，在AML-12细胞中在培养基中存在血清的情况下，除了上述Foxo3和Foxo4之外，化合物CDE不影响几种AKT-直接或-间接的下游信号转导分子，例如Gsk3a、Gsk3b、p4EBP1和pElf2bε S539。换句话说，化合物CDE可通过提高在AML-12肝细胞中FOXOs的磷酸化而选择性地将它们失活。
在无血清条件下培养的AML-12细胞中，化合物CDE靶向Foxo3/4磷酸化
如较早所述，AML-12细胞可在无血清培养基中培养一段短的时间(即，6小时)而无明显的形态学缺陷(数据未显示)。因此，检查了在无血清条件下培养的AML-12细胞的磷酸化Foxo3和Foxo4蛋白的蛋白水平。
简言之，AML-12细胞用对照(水)、化合物CDE (各化合物中150 ppb的硒)、化合物CE (各化合物中150 ppb的硒)或化合物DE (各化合物中150 ppb的硒)在无血清、无ITS和无Dex培养基中处理6小时和进行蛋白质印迹分析和定量分析。定量数据通过Actb蛋白水平标准化，和表示为3个样品的平均值 ± SEM。图7B和7C的柱状图中的不同的字母意指在所述两组之间显著差异(P < 0.05)。
如图7A所示，发现在用化合物CDE和化合物CE而非化合物DE在无血清培养基中处理6小时后，Foxo3 (pFoxo3，在苏氨酸32处)和Foxo4 (pFoxo4，在苏氨酸28处)的磷酸化蛋白水平在AML-12细胞中升高。在用硒化合物处理后，总Foxo3和Foxo4蛋白水平没有明显变化(图7A)。对这些蛋白样品使用几种特异性pFoxo1抗体，未检出特异性pFoxo1条带(数据未显示)。
定量分析表明，在化合物CDE处理的和化合物CE处理的AML-12细胞中，存在pFoxo3T32水平大约1.8倍增加(图7B)和pFoxo4T28水平约6倍增加(图7C)。化合物CDE未明显改变所有其它测试的分子例如pPdk1、pAkt、pGsk3a、pGsk3b和p4ebp1 (见图7A)。通过化合物CDE自在无血清条件下培养的AML-12细胞获得的以上结果与自在含血清培养基中培养的AML-12细胞的发现(图6A-6C)一致。化合物CDE提高AML-12细胞中的Foxo3和Foxo4磷酸化总体上不依赖于FBS、生长因子或胰岛素，因为在本实验中胰岛素或FBS未添加至细胞培养基中。换句话说，化合物CDE可绕过胰岛素或生长因子灭活肝细胞中的Foxo3和Foxo4。
简言之，这些结果证实，化合物CDE可特异性靶向在含血清(图6A-6C)和无血清培养基(图7A-7C)中培养的AML-12细胞中的Foxo3和Foxo4磷酸化。因此，从这些研究可得出结论，化合物CDE是新的FOXO失活剂和在小鼠肝细胞中通过化合物CDE失活这些FOXO分子是胰岛素-、FBS-和其它生长因子-非依赖性的。
为测试在AML-12肝细胞中观察到的FOXO4磷酸化增加是否是化合物CDE组合在哺乳动物细胞中的普遍作用，我们检查了在非-肝IMR-32神经元细胞系中的pFOXO4水平，所述测试在与AML-12肝细胞相同时间和相同的实验条件下进行。如图8所示，在化合物CDE处理的IMR-32神经元细胞中未观察到FOXO4磷酸化增加。还检查了磷酸化FOXO1和FOXO3的蛋白水平，发现在IMR-32细胞中通过FOXO1和FOXO3的特异性抗体，几乎不能检出磷酸化FOXO3，并且不能检出磷酸化FOXO1 (数据未显示)。无论如何，在IMR-32细胞中缺少通过化合物CDE增加的FOXO4磷酸化(图8)表明，组合的化合物CDE对神经元细胞可能没有毒性作用。因此，我们可得出结论，通过化合物CDE提高FOXO磷酸化可能是肝细胞特异性的。
总之，这些结果表明，化合物CDE而非单独的化合物或它们的硫类似物，将起新的肝细胞特异性FOXO失活剂的作用，和在小鼠肝细胞中通过化合物CDE失活这些FOXO分子不依赖于胰岛素和任何其它生长因子。
本文所述的之前数据证实，在AML-12细胞中化合物CDE可模拟胰岛素作用来抑制G6pc表达和改进胰岛素作用来进一步抑制G6PC表达(图3-4)。后者(图4)，如较早所述，还可促进Insr和Igf1r表达提高(图5A-5D)。所有这些事件可能是因为通过化合物CDE导致的Foxo3和Foxo4的胰岛素/生长因子/FBS-非依赖性失活(图6A-6B、7A-7C)，因为G6pc是人肝中众所周知的FOXO靶基因，而Insr和Igf1r由于在它们的基因启动子中存在许多Foxo结合基序，它们是两种潜在的Foxo3/4靶基因(数据未显示)。通过化合物CDE提高Insr和Igf1r表 达(图5A-5D)将进一步提高胰岛素的作用或改进胰岛素敏感性，来进一步刺激Foxo3/4磷酸化以抑制G6pc表达。
无论如何，这些结果表明，化合物CDE的组合可特异性地用作在AML-12肝细胞中的有效的胰岛素-非依赖性或其它生长因子-非依赖性FOXO失活剂，以减少G6pc表达和可能降低肝葡萄糖输出。此外，在控制G6pc表达以降低肝葡萄糖输出的情况下，给予化合物CDE可能将减轻肝细胞变为胰岛素-抗性的生理学后果。总的来说，化合物CDE绕过胰岛素来提高FOXO磷酸化，同时仍能够通过调节FOXO-介导的G6pc表达来控制葡萄糖稳态，开启了治疗糖尿病的许多治疗可能性。因此，糖尿病治疗变得不那么依赖于单边给予外源性胰岛素，或者胰岛素受体发挥正确功能。
实施例6
组合的化合物CDE在原代小鼠肝细胞中提高胰岛素抑制G6pc表达和葡萄糖产生的作用和绕过胰岛素以调节Pdk1/Akt/Foxo1/3/4信号转导，而对细胞无毒
三种合成的含硒有机化合物的组合，化合物CDE，在原代小鼠肝细胞的细胞培养中组合检验了对葡萄糖产生、G6pc表达和Foxo1/3/4磷酸化的作用。
材料和方法
原代小鼠肝细胞分离和化合物
原代小鼠肝细胞购自Triangle Research Labs，LLC (Research Triangle Park，North Carolina)。这些原代小鼠肝细胞在Triangle Research Labs (TRL)中自成年健康正常C57BL6小鼠分离，在胶原包被的12-孔或24孔板上培养24小时和然后运输至我们的实验室用于实验。
化合物C (5’-甲基硒代腺苷)、D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和E (γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸)在Chemistry Laboratory of Alltech，Inc合成。所有测试的化合物的纯度经验证为≥ 99%，如通过质谱法所测定。
细胞培养和处理
在从小鼠新分离肝细胞后第3天，自Triangle Research Lab (TRL)收到在12-或24-孔胶原包被的培养板上生长的原代小鼠肝细胞，并根据TRL建议的程序(ResearchTriangle Park、NC)，在肝细胞维持培养基(TRL)中在5% CO2培养箱中37℃培养，以允许肝细胞适应8小时或过夜。
过夜适应的肝细胞用PBS洗涤两次(以除去在TRL肝细胞维持培养基中的任何残留的FBS和其它添加剂)，用对照(水)或硒化合物CDE (150或300 ppb的各硒化合物)在补充10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养基中预处理24 hr。这些细胞然后用PBS洗涤两次和用相同剂量的硒化合物CDE (150或300 ppb)在存在或不存在胰岛素(10或100 nM，Sigma)、0.1mM 8-CPT (Sigma)或0.5 μM Dex (Sigma)的情况下在补充有20 mM乳糖(Sigma)和2 mM丙酮酸盐(Sigma)和15 mM HEPES (Sigma)的无血清和无葡萄糖DMEM培养基(Invitrogen)中孵育另外6小时。在处理后，收集细胞培养基，和进行葡萄糖测定和乳酸脱氢酶(LDH)的毒理学研究，和收集细胞用于RNA和蛋白分析。
对于在原代小鼠肝细胞中在完全无血清培养条件下的化合物CDE的研究，肝细胞在肝细胞维持培养基(TRL)中适应8小时，用PBS洗涤两次(以除去在培养皿中任何残留的FBS和其它添加剂)，然后在无血清DMEM/F12培养基中饥饿过夜。这些血清-饥饿的肝细胞中的一些用对照(水)、硒化合物(150或300 ppb的各化合物)在存在或不存在胰岛素(10或100nM)、0.1 mM 8-CPT (Sigma)或0.5 μM Dex (Sigma)的情况下在补充有20 mM乳糖和2 mM丙酮酸盐和15 mM HEPES的无血清和无葡萄糖/酚红DMEM培养基中处理6小时。在6小时处理后，收集培养基用于葡萄糖分析和监测LDH活性的毒理学研究，和培养的细胞经分离用于蛋白分析。此外，一些血清-饥饿的肝细胞用化合物CDE (300 ppb的各化合物)在单纯的DMEM/F12培养基（plain DMEM/F12 media）中处理0、5、30、60、120和180分钟，和收集细胞用于各种信号转导分子的时程蛋白分析。
RNA分离和实时PCR分析
使用Trizol (Invitrogen)根据制造商的方案，自这些细胞分离总RNA，然后用DNase I孵育以除去任何可能污染的基因组DNA。然后使用Applied-Bioscience的RT试剂盒和预设计的Taqman探针(Invitrogen)，对RNA样品进行实时PCR分析，如之前所述(Lan等，EMBO J 2003)。在各处理组中分析3-4个样品。数据通过在各样品中的Actb mRNA水平标准化和表示为3-4个样品的平均值± SEM。
蛋白制备和蛋白质印迹分析
在上述处理后，原代小鼠肝细胞用冰冷的PBS漂洗，和在含有完全蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Thermo-Fisher Scientific，Waltham，MA)的冰冷的RIPA缓冲液中在冰上裂解30min。使用细胞刮刀和移液管收集细胞裂解物，然后以12000 x g在4℃离心30 min以除去DNA沉淀和获得蛋白提取物。使用Pierce Micro-BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific-Piece Biotechnology，Rockford，IL)根据制造商的方案，测定在这些细胞裂解物的上清液中的蛋白水平。
对于蛋白质印迹分析，对来自对照-和化合物-处理的细胞的5微克的总蛋白进行SDS-PAGE凝胶分离，然后转移至PVDF膜，如之前所述(Reddy等，2008 Science)。膜用含有5%(w/v)的牛血清白蛋白(Sigma，St. Louis，MO)的磷酸盐-缓冲盐水(PBS)封闭和用特异性的第一抗体孵育，接着用HRP –缀合的抗-小鼠或抗-兔第二抗体(1:5000稀释，CellSignaling Inc.)孵育。除了Actb (Li-COR，Lincoln，Nebraska)之外，所有第一抗体购自Cell Signaling Inc。膜印迹上的阳性信号使用Amersham的增强型化学发光蛋白质印迹最佳检测试剂(GE Healthcare Lifescience，Pittsburgh，PA)检测。在膜印迹上的这些发光信号的图像使用LI-COR Odyssey Fc图像系统捕获(Lincoln，Nebraska)。将相同的膜印迹切成条状，并按GE WB ECL-最佳-检测方案(GE healthcare Lifescience，Pittsburgh，PA)中所述用另一抗体再次印迹。蛋白质印迹中的蛋白条带强度使用NIH ImageJ软件测定，然后通过在各样品中的Actb水平标准化。数据表示为3个样品/各组的平均值± SEM。
葡萄糖产生的分析
收集来自上述处理的细胞培养基和以300 x g离心5分钟，以除去任何可能除去的（dislodged）肝细胞，和使用比色葡萄糖测定试剂盒(Abcam)按照制造商的方案进行葡萄糖分析。通过Bio-Tek微板阅读器测定样品和各种浓度的葡萄糖标准品中OD570 nm的吸光度，和各样品的培养基中的葡萄糖浓度自葡萄糖标准曲线获得，和然后通过使用PierceMicro-BCA蛋白测定试剂盒(Thermo Scientific-Piece Biotechnology，Rockford，IL)根据制造商的方案测定的在附着的细胞中的其蛋白水平而标准化。各处理组中的葡萄糖水平除以对照组(没有化合物CDE、胰岛素、8-CPT和Dex的处理)的平均水平，以获得相对葡萄糖水平。数据表示为3-4个样品的平均值± SEM。
通过检查培养基中的LDH水平的毒理学研究
类似于上述的葡萄糖测定，收集来自上述处理的细胞培养基，和以300 x g离心5分钟以除去任何可能除去的肝细胞，和使用比色葡萄糖测定试剂盒(Abcam)根据制造商的方案进行LDH分析。简言之，每两分钟直至40分钟用LDH底物孵育后的LDH标准品和培养基样品的OD450 nm的吸光度通过Bio-Tek微板阅读器测定。根据制造商的方案，在各样品的培养基中的LDH浓度通过减去在吸光度的线性范围内的OD450读数(substracting the OD450reading within the linear range of absorbance)，接着使用LDH标准曲线获得。在各样品的培养基中获得的LDH水平然后通过附着的细胞中的其蛋白水平标准化。各处理组中的LDH水平通过对照组(没有化合物CDE、胰岛素、8-CPT和Dex处理)的平均值进一步标准化，以获得各组的相对LDH水平。数据表示为3-4个样品的平均值± SEM。
统计学分析
如果合适的话，进行学生t检验以确定两组之间的统计学差异。P-值小于0.05被认为是显著的。
结果和讨论
组合的化合物CDE抑制原代小鼠肝细胞中的葡萄糖产生和G6pc表达
本文所述的在AML-12细胞中的之前研究证实，化合物CDE可模拟胰岛素以抑制G6pc表达(图3-4)但对AML-12细胞成活力没有毒性作用(图1)。然而，未确定化合物CDE是否可控制AML-12细胞中的葡萄糖产生，因为AML-12细胞产生的培养基中的葡萄糖水平太低而不能通过灵敏的荧光葡萄糖测定试剂盒检出(Abcam，数据未显示)。因此，原代小鼠肝细胞用于研究化合物CDE是否可模拟胰岛素以抑制葡萄糖产生，和进一步证实在AML-12细胞中观察到的化合物CDE对G6pc表达的抑制作用，但对细胞存活的无毒性作用。
类似于对AML-12细胞的研究，原代小鼠肝细胞用对照(水)或150 ppb和300 ppb剂量的硒化合物CDE在含血清DMEM/F12培养基中预处理24小时。该处理之后，用这些硒化合物在存在或不存在胰岛素(10和100 nM)的情况下或用单独的胰岛素再处理6小时。此外，还加入可细胞渗透的cAMP、8-CPT和Dex至一些对照-预处理的肝细胞达6小时，以验证在响应在肝细胞中产生葡萄糖的这些众所周知的刺激物时原代小鼠肝细胞是否有功能。在上述处理后，收集细胞培养基用于葡萄糖测定和毒理学分析(通过测量LDH水平)。对附着的细胞进行蛋白分析以确定各孔中的蛋白水平，其反映了样品中的总细胞。然后在培养基中获得的葡萄糖水平通过各样品中的蛋白水平标准化。数据表示为4个样品的平均值± SEM。在图9A-9B中，* P < 0.05，与溶媒处理组(图中第一个柱)相比。在图9C中，所有处理组对比对照处理组(图中第一个柱)，无显著增加。
如图9A所示，8-CPT/Dex处理导致在原代肝细胞中葡萄糖产生的显著增加，表明即使从它们自小鼠肝最初开始分离起在经处理、运输和培养5天后，这些原代肝细胞是生物学上有功能的。为进一步支持这一发现，用10 nM和100 nM剂量的单独的胰岛素处理导致葡萄糖产生显著降低(与水处理的对照组相比约25-30%降低；见图9A)。
更重要的是，用两个剂量(150 ppb和300 ppb)的化合物CDE处理以与水处理的对照组相比降低约20-28%，显著减少葡萄糖产生(见图9A)。化合物CDE与胰岛素共处理也以在测试的处理中与对照组相比降低约32-38%，显著抑制葡萄糖产生(见图9A)。
这里应该强调的是，两个测试剂量的化合物CDE导致的葡萄糖产生的降低程度与胰岛素(10或100 nM)是相当的，表明测试剂量的化合物CDE与浓度100 nM的胰岛素同样有效地抑制葡萄糖产生。我们的数据还表明，在这些肝细胞中通过胰岛素、化合物CDE或两者导致的葡萄糖产生的最大可得降低为约20-38%。无论如何，我们的数据证实，化合物CDE可模拟胰岛素抑制在原代小鼠肝细胞中的葡萄糖产生。
G6pc对于肝中的葡萄糖产生是必需的。因此我们检查了相同处理后在相同批次的肝细胞中的G6pc表达。简言之，两组重复的原代肝细胞用对照(水)或剂量为150和300 ppb的硒化合物CDE在含血清DMEM/F12培养基中预处理，接着用这些硒化合物在存在或不存在胰岛素(10和100 nM)的情况下再处理6小时。在这些处理后，收集肝细胞和进行RNA分离，接着G6pc和Actb的QRT-PCR分析。
如图9B所示，单独的胰岛素或在存在两个剂量的化合物CDE的情况下显著抑制G6pc表达。150 ppb的化合物CDE也导致G6pc表达降低(约31%降低，图9B)，尽管可能因有限的样品数所致其在统计学上不显著。然而，在用300 ppb的单独的化合物CDE处理后，在肝细胞中观察到G6pc mRNA水平的显著降低(42%降低) (图9B)。这些结果证实，化合物CDE也可模拟胰岛素，虽然效率与剂量100 nM的胰岛素相比略微较低地抑制原代小鼠肝细胞中的G6pc表达。这些发现与上文所述的由化合物CDE在原代小鼠肝细胞中削弱葡萄糖产生(图9A)和在AML12细胞中抑制G6pc表达(图3)一致。
为研究在肝细胞中的化合物毒性，乳酸脱氢酶(LDH)广泛用于药物开发。通过化合物处理导致的培养基中LDH水平增加(在通过培养的细胞中的蛋白水平标准化后)表明，化合物会对肝细胞有毒，因为细胞破坏或细胞膜渗漏而释放细胞溶质LDH至培养基中。为了研究化合物CDE是否对原代小鼠肝细胞有毒，和观察到的通过化合物CDE导致的葡萄糖产生和G6pc表达降低(图9A和9B)是否由于毒性，如在上文葡萄糖测定法中所述，检查用化合物CDE处理后在原代小鼠肝细胞的培养基中的LDH水平。
简言之，原代小鼠肝细胞用对照(水)或剂量为150和300 ppb的硒化合物CDE在含血清DMEM/F12培养基中预处理，接着用这些硒化合物在存在或不存在胰岛素(10和100 nM)的情况下再处理6小时。然后收集细胞培养基用于LDH的毒理学分析，和对附着的细胞进行蛋白分析以测定各自的蛋白水平。培养基中获得的LDH水平通过各样品中的其蛋白水平标准化。
如图9C所示，用化合物CDE、胰岛素或两者处理不引起培养基中LDH水平的显著增加。相反，用剂量为300 ppb的化合物CDE在存在或不存在胰岛素的情况下处理后，LDH水平在肝细胞中显得略微降低，表明较高剂量的化合物CDE甚至可能影响抵抗细胞破坏的保护作用。
因此，这些结果证实，化合物CDE对原代小鼠肝细胞没有毒性，这与化合物CDE对AML-12细胞的成活力无毒性影响(图1)一致。此外，这些结果还排除了以上观察到的葡萄糖产生和G6pc表达降低(图9A和9B)由用化合物CDE处理后原代小鼠肝细胞中的较不健康的肝细胞引起的可能性。
总之，以上研究证实，化合物CDE可模拟胰岛素抑制G6pc表达，以及更重要的是，抑制原代小鼠肝细胞中的葡萄糖产生而对所述细胞没有毒性。这些结果与在稳定的小鼠肝AML-12细胞中观察到的胰岛素-非依赖性抑制G6pc表达和对细胞存活无毒性(图1和图3)一致。
在模拟的糖尿病病况下(通过8-CPT和Dex两者模拟)在原代小鼠肝细胞中化合物CDE抑制葡萄糖产生和G6pc表达和提高胰岛素在这些过程中的作用
本文所述的研究证实了在8-CPT/Dex的刺激下的AML-12细胞中组合的化合物CDE可模拟胰岛素抑制G6pc表达和提高胰岛素的作用(图4)。为进一步研究化合物CDE的作用，在用cAMP和Dex (两种众所周知的肝中葡萄糖产生和G6pc表达的刺激物)共处理的原代小鼠肝细胞中检查葡萄糖产生和G6pc mRNA表达。
简言之，原代小鼠肝细胞用对照(水)或150或300 ppb化合物CDE组合在10% FBSDMEM/F12培养基中预处理24小时，接着用这些硒化合物在存在或不存在10或100 nM胰岛素、0.1 mM 8-CPT和0.5 μM Dex的情况下在无血清培养基中再处理6小时。在这些处理后，收集培养基用于葡萄糖和LDH测定，如早先所述。也对在上文所述的相同处理后的两组重复的原代小鼠肝细胞(来自相同批次的肝细胞)进行G6pc表达的QRT-PCR分析。数据表示为3-4个样品的平均值± SEM。在图10A-10B中，不同的字母(a与b、a’与b’与c’、a”与b”与c”)意指所述两组之间显著差异。在图10C中，* P < 0.05，与溶媒处理组(图中第一个柱)相比。
如图10A所示，与仅对照处理组相比用8-CPT/Dex处理引起葡萄糖产生显著增加。该数据表明培养的原代小鼠肝细胞是起作用的。与8-CPT/Dex组相比，用两个剂量的胰岛素处理在肝细胞中显著降低8-CPT/Dex-诱导的葡萄糖产生(见图10A)。重要的是，用剂量150ppb的化合物CDE处理趋于抑制肝细胞中8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生。更加显著的是，剂量300 ppb的化合物CDE显著抑制肝细胞中8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生并且葡萄糖产生降低的程度与100 nM胰岛素的作用几乎相同。这些结果表明，300 ppb的化合物CDE与浓度100 nM的胰岛素一样有效抑制原代肝细胞的葡萄糖产生，即使在类似于糖尿病病况的条件下。这些结果与在无-8-CPT/Dex-共处理的原代小鼠肝细胞中观察到的发现(图9A)一致，进一步表明组合的化合物CDE会模拟胰岛素，但以胰岛素-非依赖性方式，抑制葡萄糖产生。
此外，两个测试剂量的化合物CDE与10 nM或100 nM胰岛素组合不仅与8-CPT/Dex处理组相比显著抑制原代小鼠肝细胞中的8-CPT/Dex-诱导的葡萄糖产生，而且显示在该过程中比测试剂量的单独的化合物CDE或胰岛素更有效(图10A)。例如，在用150 ppb的化合物CDE和10 nM胰岛素的组合处理后，肝细胞中8-CPT/Dex-诱导的葡萄糖产生降低的程度比单独的150 ppb的化合物CDE或10 nM胰岛素更加显著。更加明显的是，在300 ppb的化合物CDE和100 nM胰岛素处理后，肝细胞中的葡萄糖产生进一步降低(降低至低于对照-处理的细胞组的水平)，即使单独的300 ppb的化合物CDE或100 nM胰岛素非常有效地抑制8-CPT/Dex-诱导的葡萄糖产生(图10A)。10 nM胰岛素和150 ppb或300 ppb的化合物CDE的组合和100nM胰岛素和150 ppb的化合物CDE的组合几乎完全抑制8-CPT/Dex-诱导的葡萄糖产生(降低至接近无8-CPT/Dex处理的对照细胞的水平)。这些结果证实，化合物CDE可代替或提高胰岛素作用以抑制原代小鼠肝细胞中8-CPT/Dex-诱导的葡萄糖产生。
如早先所述，发现组合的化合物CDE在AML-12细胞中可模拟胰岛素抑制8-CPT/Dex-诱导的G6pc表达和提高胰岛素在该过程中的作用(见图4)。在原代小鼠肝细胞中G6pc表达的抑制可导致葡萄糖产生的抑制。因此，小鼠肝细胞用水(对照)或150或300 ppb化合物CDE组合在10% FBS DMEM/F12培养基中预处理24小时，接着用这些硒化合物在存在或不存在10或100 nM胰岛素、0.1 mM 8-CPT和0.5 μM Dex的情况下在无血清培养基中再处理6小时。在这些处理后，收集细胞和进行G6pc表达的QRT-PCR分析。
如图10B所示，8-CPT/Dex导致G6pc mRNA表达的显著增加(约130倍增加)。这些数据进一步证实肝细胞正确地发挥作用。与8-CPT/Dex组相比(当与图10B的柱状图中的8-CPT/Dex组相比)，用两个剂量的胰岛素处理显著降低原代小鼠肝细胞中8-CPT/Dex-诱导的G6pc表达。类似于上述葡萄糖研究，剂量150 ppb的化合物CDE处理显示抑制肝细胞中的8-CPT/Dex-刺激的G6pc的趋势(尽管不显著) (见图10B)。然而，剂量300 ppb的化合物CDE显著地抑制8-CPT/Dex-诱导的G6pc mRNA表达，但这不与测试剂量的胰岛素一样有效(见图10B)。这些结果清楚地证实，化合物CDE可以胰岛素-非依赖性方式抑制8-CPT/Dex-诱导的G6pc表达，这类似于在AML-12细胞中得到的结果(图4)。
与10或100 nM胰岛素或300 ppb化合物CDE处理相比，300 ppb的化合物CDE与10nM或100 nM胰岛素组合的处理进一步显著地抑制肝细胞中8-CPT/Dex-刺激的G6pc表达。这些结果通过柱状图中的a’与b’或a”与b”显示在图10B中。这些结果表明，胰岛素和300 ppb的化合物CDE的组合甚至更加有效地抑制通过8-CPT/Dex导致的G6pc的表达增加。
上述研究证实，化合物CDE，特别是剂量为300 ppb的化合物CDE，可在原代小鼠肝细胞中模拟胰岛素(尽管效率低于胰岛素)抑制8-CPT/Dex-诱导的G6pc表达并提高胰岛素在该过程中的作用。这些结果部分地与AML-12细胞中观察到的发现(图4)一致。因为G6pc是葡萄糖产生所必需的，以上观察到的化合物CDE抑制8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生(图10A)至少部分上是由于它们对原代小鼠肝细胞中G6pc表达的下调(图10B)。
检查上述处理的肝细胞的培养基中的LDH水平以进一步研究化合物CDE是否对在存在8-CPT/Dex的情况下培养的原代肝细胞具有毒性，和以上观察到的化合物CDE导致的葡萄糖产生和G6pc表达的降低(图10A-B)是否是由于化合物CDE在肝细胞中的潜在的毒性(通过培养基中的LDH水平升高指示)。
如图10C所示，与溶媒对照相比，在不存在或存在胰岛素的情况下8-CPT/Dex处理略微提高LDH水平。然而，在不存在或存在胰岛素的情况下用8-CPT/Dex以及两个测试剂量的化合物CDE处理后，肝细胞中的LDH水平没有显著增加(见图10C)。此外，通过用两个测试剂量的化合物CDE共处理，未观察到在用8-CPT/Dex和胰岛素处理后肝细胞中略微增加的LDH水平(见图10C)。
这些结果进一步表明，化合物CDE对在存在8-CPT/Dex的情况下培养的原代肝细胞没有毒性。此外，这些结果排除了上文观察到的8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生和G6pc表达的降低(见图10A和10B)由在化合物CDE处理后原代小鼠肝细胞中的较不健康的肝细胞引起的可能性。
总结的说，以上研究证实，化合物CDE可在原代小鼠肝细胞中模拟胰岛素抑制葡萄糖产生和G6pc表达并提高胰岛素在这些过程中的作用，并且没有毒性，即使在类似于糖尿病病况(由8-CPT/Dex刺激)的条件下。
化合物CDE抑制葡萄糖产生(上述)在用本公开内容的化合物在含血清培养基中预处理的原代小鼠肝细胞中表征。为进一步证实化合物CDE可以胰岛素-非依赖性和其它生长因子-非依赖性方式模拟胰岛素抑制葡萄糖产生，采用完全无血清培养条件以除去任何可能的痕量胰岛素或FBS中的其它生长因子。检查了化合物CDE对在无血清条件下培养的原代小鼠肝细胞的葡萄糖产生的作用以及其可能的毒性作用(即，培养基中的LDH水平)。
简言之，原代小鼠肝细胞经血清饥饿过夜。然后细胞用对照(水)或150 ppb或300ppb的化合物CDE在存在或不存在胰岛素、8-CPT和Dex的情况下在完全无血清培养基中处理一段短的时间(即，6小时)。然后收集培养基，和进行葡萄糖和LDH分析，和收集培养的细胞进行蛋白分析用于标准化葡萄糖产生和LDH水平。数据表示为3个样品的平均值± SEM。在图11A中，# P < 0.05，与基础对照组(图中第一个柱)相比，和* P < 0.05，与8-CPT/Dex处理组(图中第一个实心柱)相比。
研究了在无8-CPT/Dex的共处理的情况下，化合物CDE对小鼠肝细胞中葡萄糖产生的作用(见图11A-11B)。如图11A所示，两个剂量的胰岛素单独处理在原代小鼠肝细胞中以约40-47%降低显著地抑制葡萄糖产生。这些结果表明，该批次的原代小鼠肝细胞是在生物学上发挥功能的。
更重要的是，用150 ppb的化合物CDE处理导致在原代小鼠肝细胞中与100 nM胰岛素一样有效地显著降低葡萄糖产生，而300 ppb的化合物CDE甚至比100 nM胰岛素更加有效地抑制葡萄糖产生(见图11A)。用化合物CDE和胰岛素两者共处理也显著地抑制葡萄糖产生，即使在这些原代肝细胞中在胰岛素和化合物CDE之间没有加和或协同作用。这些结果与自用化合物CDE在含FBS的培养基中预处理的肝细胞获得结果(见图9A)一致。总之，这些结果清楚地证实，化合物CDE可模拟胰岛素，与浓度100 nM的胰岛素一样有效或甚至比其更加有效地以胰岛素-和生长因子-非依赖性方式抑制葡萄糖产生。还可得出结论，类似于胰岛素，在相对短的处理时间(即，6小时)后，化合物CDE有效抑制原代小鼠肝细胞中的葡萄糖产生。
还测试了化合物CDE以观察在小鼠肝细胞中在无血清培养条件下8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生是否受到抑制。如图11A所示，与基础对照组(溶媒处理)相比，用8-CPT/Dex处理的确导致葡萄糖产生显著增加，进一步表明该批次的原代小鼠肝细胞是在生物学上发挥功能的。用10 nM胰岛素处理显著地抑制葡萄糖产生，尽管在用100 nM胰岛素处理后在肝细胞中仅有葡萄糖产生降低的趋势。后一结果可能由于小数量的测试样品(n=3)，其中当与相同组中的其它两个样品相比时，在一个样品中葡萄糖产生相当大(数据未显示)。
更重要的是，150 ppb的化合物CDE的处理显示抑制8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生的趋势，而浓度为300 ppb的化合物CDE与10 nM的胰岛素一样有效地以胰岛素-非依赖性或其它生长因子-非依赖性方式显著抑制8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生(图11A)。应注意，浓度300 ppb的化合物CDE几乎完全废除8-CPT/Dex的刺激作用，因为在该处理组中葡萄糖水平与没有8-CPT/Dex刺激的基础对照组相当。
类似地，化合物CDE和胰岛素两者的共处理也显著地抑制8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生(见图11A)。此外，通过150 ppb化合物CDE和100 nM胰岛素的组合比单独的150 ppb化合物CDE或100 nM胰岛素，存在更加显著的8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生降低。这些结果表明，在该过程中在化合物CDE和胰岛素之间存在加和作用(图11A)。
在上述无血清培养原代小鼠肝细胞中化合物CDE抑制8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生的作用与用化合物CDE在含血清培养基中预处理的肝细胞中观察到的发现一致(图10A)。因为肝细胞经过血清饥饿和用化合物CDE在完全无血清条件下处理，这些数据清楚地证实化合物CDE可模拟胰岛素，至少与10 nM胰岛素一样有效地以胰岛素-非依赖性和生长因子-非依赖性方式抑制8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生。还可得出结论，在这些无血清培养原代小鼠肝细胞中，本文所述的化合物在相对极短的处理时间后快速地起作用以抑制8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生，类似于胰岛素作用。在化合物CDE和胰岛素之间，至少在150 ppb化合物CDE和100 nM胰岛素剂量之间，对抑制在这些无血清培养原代小鼠肝细胞中的8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生，还存在加和或协同作用(见图11A)。
最后，测试化合物CDE以确定对在无血清条件下培养的原代小鼠肝细胞的任何毒性。检查了上述处理后原代小鼠肝细胞的培养基中的LDH水平，然后通过它们的蛋白水平标准化。如图11B所示，与含有水溶媒-处理组的基础对照组(即，图11B中的第一个柱)相比，在所有上述处理后肝细胞中的LDH水平无显著增加。这些结果表明，在暴露于化合物CDE后肝细胞中无细胞损伤或细胞膜渗漏。相反，在用300 ppb高剂量的化合物CDE处理后，在肝细胞中观察到LDH水平显著降低(见图11B)。因此，结果表明化合物CDE对原代肝细胞没有毒性，相反在高剂量下对这些细胞中的细胞膜渗漏可能具有一定的保护作用。此外，这些结果排除了以上观察到的对基础和8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生的抑制(见图11A)是由化合物CDE处理后原代小鼠肝细胞中较不健康的肝细胞引起的可能性。
结论是，对无血清培养原代小鼠肝细胞的以上研究证实，化合物CDE可模拟胰岛素，以FBS-非依赖性的方式，更具体而言是胰岛素-和生长因子-非依赖性方式抑制基础和8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生两者。此外，这些结果进一步表明，化合物CDE对肝细胞不具有毒性。
在原代小鼠肝细胞中化合物CDE：胰岛素-非依赖性活化PI3K/Pdk1/Akt信号转导以提高Foxo1/3/4磷酸化
我们早先对AML-12细胞的研究表明，化合物CDE可模拟胰岛素以提高Foxo3和Foxo4磷酸化，导致用于葡萄糖产生的G6pc表达的抑制(图6A-6C、7A-7C)。已充分证明，胰岛素在肝细胞中快速起作用以活化PI3k/Pdk1/Akt信号转导，以失活Foxo1、Foxo3和Foxo4转录因子，这非常快速地降低葡萄糖产生。
为进一步研究化合物CDE是否会模拟胰岛素，但以胰岛素-非依赖性方式起作用以活化Pdk1/Akt信号转导，随后提高FOXO磷酸化用于抑制葡萄糖产生，在两种不同的培养/处理条件下在原代小鼠肝细胞中研究对糖原异生重要的这些信号转导分子的磷酸化状态。
在含血清培养基中用化合物CDE预处理24小时接着在无血清培养基中处理6小时的原代小鼠肝细胞中，化合物CDE靶向Foxo1/3/4磷酸化
为了确定化合物CDE的组合是否可模拟胰岛素以调节PI3k/Pdk1/Akt/Foxo1/3/4信号转导，原代小鼠肝细胞用对照(水)或剂量为150和300 ppb的硒化合物CDE在含血清DMEM/F12培养基中预处理24小时。该处理之后，用这些硒化合物在无血清培养基中再处理6小时。对照-预处理的肝细胞也用100 nM胰岛素孵育6小时。在这些处理后，收集培养基用于葡萄糖和LDH分析，如图9A-9C所详述。收集细胞和进行蛋白分析以确定总蛋白水平，用于各种PI3k/Pdk1/Akt/Foxo1/3/4信号转导分子的蛋白质印迹分析。这些信号转导分子的蛋白表达水平通过Actb蛋白水平标准化和在图12B-F中表示为3个样品的平均值± SEM。图12B-F的柱状图中的不同的字母意指在所述两组之间显著差异(P < 0.05)。
如图12A所示，胰岛素处理导致磷酸化形式的Pdk1、在丝氨酸残基473处磷酸化形式的Akt、在苏氨酸24处磷酸化形式的Foxo1 (pFoxo1T24)、在苏氨酸32处磷酸化形式的Foxo3 (pFoxo3T32)而非在丝氨酸9处磷酸化形式的Gsk3b (pGsk3bS9)的显著增加，而在胰岛素处理后这些细胞中在苏氨酸28处磷酸化的Foxo4 (pFoxo4T28)的水平几乎不能检出。这些结果表明，在这些肝细胞中在上述实验条件下胰岛素的确可调节PI3k/Pdk1/Akt信号转导以失活Foxo1和Foxo3。更重要的是，在这些肝细胞中在两个剂量的化合物CDE处理后pPdk1、pAktS473、pFoxo1T24和pFoxo3T32而非pGsk3bS9的蛋白水平明显提高(图12A)。此外，在肝细胞中在300 ppb的化合物CDE处理后，pFoxo4T28水平也稳健增加(图12A)。
定量分析表明，在化合物CDE-处理的原代小鼠肝细胞中存在pPdk1的大约1.5倍增加、pAktS473的2.2-3倍增加、pFoxo1T24的3-4倍增加、pFoxo3T32的约3倍增加，但pGsk3bS9无增加(图12B-F)。在原代小鼠肝细胞中通过化合物CDE的pFoxo3T32和pFoxo4T28的表达提高与我们早先在AML-12细胞中的观察结果(图6A-6C、7A-7C)一致，尽管在AML-12细胞中在化合物CDE处理6小时时未观察到提高的pPdk1和pAkt(图6A-6C、7A-7C)。
在这些肝细胞中由胰岛素和两个测试剂量的化合物CDE导致的提高的pPdk1和pAktS473蛋白水平的确表明，像胰岛素一样，化合物CDE可活化Pdk1/Akt信号转导。尽管化合物CDE导致的pAkt/Foxo1/3的磷酸化提高的程度不与100 nM胰岛素一样强，但在相同实验条件下两个测试剂量的化合物CDE与100 nM胰岛素一样有效抑制原代小鼠肝细胞中的葡萄糖产生(图9A)。因此，似乎化合物CDE导致的pFoxo1T24和pFoxo3T32的大约3-4倍增加(图12D-E)足以失活Foxo1和Foxo3，导致在这些原代小鼠肝细胞中G6pc表达和葡萄糖产生的抑制。我们的结果清楚地证实，在原代小鼠肝细胞中在上述培养和处理条件下，化合物CDE可模拟胰岛素以活化PI3K/Pdk1/Akt信号转导，提高Foxo1/3/4磷酸化。
在原代肝细胞中在无血清条件下，化合物CDE快速起作用以随后活化Pdk1/Akt信号转导，提高Foxo1/3磷酸化
为进一步研究化合物CDE是否可模拟胰岛素以活化PI3K信号转导，提高Foxo1/3磷酸化，在原代小鼠肝细胞中在无血清条件下进行这些信号转导分子的时程表达研究。简言之，原代小鼠肝细胞经血清饥饿过夜，然后用剂量为300 ppb的硒化合物CDE在无血清DMEM/F12培养基中孵育0分钟、5分钟、30分钟、1小时、2小时和3小时。处理后，收集肝细胞和进行蛋白质印迹分析。
如图13A-B所示，在用化合物CDE处理后5分钟，在这些无血清培养肝细胞中磷酸化Pdk1水平趋于增加。化合物CDE处理30分钟后，在这些肝细胞中pPdk1水平稳健和显著增加(图13A-B)。这些结果表明，在这些肝细胞中化合物CDE可快速活化PI3k/Pdk1信号转导。Pdk1活化后，在化合物CDE处理30分钟时在肝细胞中存在向pAktT308水平增加的趋势，以及更重要的是，化合物CDE处理1小时后存在稳健和显著的pAktT308增加(图13A、C)。这些结果表明化合物CDE可随后活化Akt。
pFoxo1T24和pFoxo3T32两者(活化的PI3k/Pdk1/Akt信号转导的下游靶标)的水平，在孵育30分钟之前在肝细胞中不受化合物CDE的影响(图13A、D)。在用化合物CDE处理1小时时，在肝细胞中存在向Foxo1和Foxo3的磷酸化增加的趋势(图13D)。在处理2和3小时时，在无血清条件下培养的这些原代小鼠肝细胞中化合物CDE显著地提高Foxo1和Foxo3两者的磷酸化(图13A、D)。因此，在这些肝细胞中化合物CDE连续活化Pdk1和Akt，接着提高Foxo1和Foxo3磷酸化，这些事件在用化合物CDE处理后少于2小时时以非常类似于胰岛素作用的方式发生。考虑到在单纯的DMEM/F12培养基中不存在胰岛素或生长因子，和在这些实验中无FBS添加至培养基中，在这些肝细胞中通过化合物CDE提高Pdk1、Akt、Foxo1和Foxo3的磷酸化不依赖于FBS、生长因子或胰岛素。换句话说，在原代小鼠肝细胞中化合物CDE可绕过胰岛素或生长因子作用，快速活化PI3k/Pdk1/Akt信号转导和随后失活Foxo1和Foxo3(提高Foxo1/3磷酸化)。
概述
我们的研究证实，在原代小鼠肝细胞中化合物CDE可模拟胰岛素以胰岛素-非依赖性方式抑制葡萄糖产生，而对肝细胞无毒性。从在三种不同条件下培养的原代小鼠肝细胞的研究中清楚地证实了这些发现。首先，发现通过用化合物CDE在含血清培养基中预处理24小时接着用这些化合物在无血清培养基中再处理6小时显著降低葡萄糖产生，其效率与剂量100 nM的胰岛素相当(图9A)。接着，还发现在原代小鼠肝细胞中通过用化合物CDE在含血清培养基中预处理24小时接着用这些化合物在无血清培养基中在存在8-CPT/Dex (葡萄糖产生的刺激物，以模拟糖尿病病况)的情况下再处理6小时，葡萄糖产生显著地受到抑制，和在该过程中300 ppb的化合物CDE的效率与浓度为100 nM的胰岛素相当(图10A)。最后，我们采用无血清培养技术并证明在短处理时间(6小时处理)后化合物CDE可模拟胰岛素以FBS-非依赖性方式，或者更具体地，胰岛素-和生长因子-非依赖性方式抑制基础和8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生两者(图11A)。此外，化合物CDE在抑制葡萄糖产生中的效率与至少剂量为10 nM的胰岛素相当(图11A)。此外，用化合物CDE处理对在上述三种不同条件下培养的原代小鼠肝细胞的健康不具有毒性作用(例如引发细胞膜渗漏)，因为化合物CDE处理后在培养基中无LDH的显著增加(图9C、10C、11B)。
在这些研究中观察到的葡萄糖产生减少至少部分地归因于原代小鼠肝细胞中由化合物CDE导致的G6pc表达的抑制。发现300 ppb的化合物CDE引起肝细胞中G6pc mRNA水平的显著降低(42%降低)，而向G6pc表达降低(降低约31%，尽管统计学上并不显著)的趋势还在用150 ppb化合物CDE处理后的肝细胞中观察到(图9B)。类似的结果也在通过8-CPT/Dex刺激的原代小鼠肝细胞中得到(图10B)。因此，这些结果清楚地证实，化合物CDE可模拟胰岛素以胰岛素-非依赖性方式抑制在原代小鼠肝细胞中的G6pc表达，即使在存在8-CPT/Dex的情况下。这些结果与在AML-12细胞中观察到的发现(图3-4)一致。
应注意，在原代小鼠肝细胞中在上述两种培养条件下(即，有或无8-CPT/Dex共处理)，较高测试剂量的化合物CDE导致的G6pc表达减少的程度小于胰岛素(10 nM)，而化合物CDE与至少剂量为10 nM的胰岛素一样有效地抑制肝细胞中的基础和8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生(图9A、10A、11B)。因此，有可能的是，除了G6pc之外，化合物CDE可调节其它分子以降低在培养的小鼠肝细胞中的葡萄糖水平。无论如何，我们的结果表明，在原代小鼠肝细胞中化合物CDE抑制葡萄糖产生至少部分地由于它们抑制G6pc表达。
此外，结果还证实，在原代小鼠肝细胞中在模拟的糖尿病病况下(使用8-CPT/Dex)，化合物CDE可提高或增大胰岛素作用以抑制葡萄糖产生和G6pc表达(图10A-B、11A)。这些得到以下观察结果的支持：
(1) 在肝细胞中通过150 ppb化合物CDE和10 nM胰岛素的组合比单独的150 ppb化合物CDE或10 nM胰岛素导致8-CPT/Dex-诱导的葡萄糖产生的更加显著降低(图10A)；
(2) 在肝细胞中通过300 ppb的化合物CDE和100 nM胰岛素的组合比单独的300ppb的化合物CDE或100 nM胰岛素导致8-CPT/Dex-诱导的葡萄糖产生的进一步降低(图10A)；
(3) 在肝细胞中在无血清条件下通过150 ppb的化合物CDE和100 nM胰岛素的组合比单独的150 ppb的化合物CDE或100 nM胰岛素导致8-CPT/Dex-刺激的葡萄糖产生的更加显著降低(图11A)；和
(4) 通过300 ppb的化合物CDE和胰岛素(10和100 nM)的组合比单独的300 ppb的化合物CDE、10或100 nM胰岛素导致8-CPT/Dex-诱导的G6pc表达的更加显著降低(图10B)。
在AML-12细胞中也观察到，通过化合物CDE和胰岛素的组合比单独的化合物CDE或胰岛素导致8-CPT/Dex-诱导的G6pc表达的更加显著抑制(图4)。总之，我们的结果证实，在原代小鼠肝细胞中化合物CDE可提高胰岛素作用以抑制8-CPT/Dex-诱导的葡萄糖产生和G6pc表达。
此外，信号转导分子的分析证实，在原代小鼠肝细胞中化合物CDE可模拟胰岛素以快速活化PI3K/Pdk1/Akt信号转导，提高Foxo1、3和4的磷酸化。在用化合物CDE在含血清培养基中预处理24小时接着用这些化合物在无血清培养基中再处理6小时(图12A-12F)的小鼠肝细胞中或在用这些化合物在完全无血清条件下处理5-180分钟的短的时间(图13A-13D)的小鼠肝细胞中，这些分子的磷酸化蛋白的蛋白质印迹分析支持该结论。
在AML-12细胞中我们还发现，化合物CDE可靶向Foxo3/4以提高它们的磷酸化，尽管在测试的时间段内(化合物CDE处理后6小时)在AML-12细胞中未观察到Pdk1和Akt的磷酸化增加(图6A-6C、7A-7C)。后一结果可能是由于化合物CDE导致的Pdk1/Akt的可能的瞬时活化，其可在较早时间点发生(6小时之前)。
无论如何，在原代小鼠肝细胞中的研究清楚地证实，化合物CDE可绕过胰岛素或任何生长因子以快速活化PI3k/Pdk1/Akt信号转导和随后提高Foxo1/3/4磷酸化。因为在肝中FOXO蛋白、特别是Foxo1，对G6pc表达和葡萄糖产生的调节是重要的，上文观察到的在原代小鼠肝细胞中化合物CDE抑制葡萄糖产生和G6pc表达最可能由因为Pdk1/Akt信号转导的胰岛素-非依赖性活化和随后的Foxo1/3/4磷酸化提高导致的Foxo1/3/4的失活引起。此外，在上述过程中胰岛素作用的提高也可能归因于化合物CDE和胰岛素导致的Foxo1/3/4磷酸化提高的加和作用。
简言之，我们已经揭示了一种硒化合物组合，其在原代小鼠肝细胞中，即使在存在葡萄糖产生的糖尿病刺激物的情况下可绕过胰岛素作用以抑制葡萄糖产生和G6pc表达，并且对肝细胞无毒性。此外，该化合物组合，化合物CDE，可在原代小鼠肝细胞中提高胰岛素作用以进一步抑制糖尿病刺激物-诱导的葡萄糖产生和G6pc表达。此外，该化合物组合还可在肝细胞中模拟但绕过胰岛素，以快速活化PI3k/Pdk1/Akt信号转导和随后提高Foxo1/3/4磷酸化。因此，该化合物组合可不仅用作有效的胰岛素-代替药物，而且用作胰岛素-增强药物，用于治疗I型和II型糖尿病两者。组合的化合物CDE可通过Foxo1/3/4的胰岛素-非依赖性失活、Foxo-介导的G6pc表达的抑制绕过胰岛素以减少肝葡萄糖输出和/或在肝中在这些过程中提高胰岛素作用而用于治疗肥胖，或经给予以预防肝细胞成为胰岛素抗性的。
实施例7：在胰岛素-抗性和糖尿病瘦蛋白受体(Lepr)自发无效突变体小鼠中，在响应用化合物CDE的组合处理时，减少血流中的葡萄糖水平和改善葡萄糖耐受
材料和方法
化合物
化合物C (5’-甲基硒代腺苷)、化合物D (Se-腺苷-L-高半胱氨酸)和化合物E(γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸)在Chemistry Laboratory of Alltech，Inc合成。所有测试的化合物的纯度经验证为≥ 99%，如通过质谱法所测定。
动物和处理
成年杂合糖尿病自发突变(瘦蛋白受体突变) Lepr db/+ 小鼠(C57BL/6J品系)购自The Jackson Laboratory (Bar Harbor，Maine)，然后杂交产生纯合Lepr db/db 小鼠(通过小鼠基因分型确定)。根据The Jackson Laboratory的方案，在断奶时(在出生后第21天进行小鼠尾部基因分型。在出生后第27天这些Lepr db/db 小鼠经腹膜内注射生理盐水(0.09%NaCl)或化合物CDE。化合物CDE包含化合物C、化合物D和化合物E的组合(各化合物5 μg 硒/千克体重，等同于5 ppb的各硒化合物/注射)，每隔一天，直至3.5月龄，然后进行葡萄糖分析和葡萄糖-耐受测定。上述处理的小鼠的体重每周使用天平记录，并且每天监测任何明显异常的动物总体形态学和行走行为。
另外的5周龄雄性Lepr db/db 小鼠购自Jackson Laboratory和每天经腹膜内注射生理盐水(0.09% NaCl)或化合物CDE。化合物CDE包含化合物C、化合物D和化合物E的组合(各化合物5 μg硒/千克体重，用无菌生理盐水稀释)，在出生后第38天开始，持续28天。本实验经设计以测试这些化合物作为急性糖尿病治疗的潜在用途(> 35日龄的Lepr db/db 小鼠患有或不久将发生高血糖症)。测试已经注射较长的时间的更幼的小鼠，意欲进一步评价所述化合物作为前驱糖尿病或有风险的受试者的预防性制剂。此外，上述处理的小鼠的体重每周使用天平记录，每天监测任何明显异常的动物总体形态学和行走行为。
血糖测定
在最后一次注射生理盐水或化合物CDE后，小鼠禁食过夜。然后通过剪去小鼠尾尖从这些小鼠收集一小滴血，和使用具有600 mg/dL的最大葡萄糖测量能力的血糖仪测定血液葡萄糖水平。
葡萄糖耐受测试和曲线下面积的定量(AUC)
葡萄糖耐受测试按之前所述进行(Li等，Int J Biol Sci 2008; 4:29-36)。简言之，过夜禁食的Lepr db/db 小鼠在盐水或化合物CDE处理后经腹膜内注射2克/kg体重的20% D-葡萄糖。在时间0 (紧接注射葡萄糖之前)、注射葡萄糖后0.25、0.5、1和2小时的血糖水平使用具有600 mg/dL的最大葡萄糖测量能力的血糖仪测定。因此，在我们的数据分析中超过600 mg/dL的血糖水平视为600 mg/dL。在上述葡萄糖测试测定中各小鼠的曲线下面积(AUC)的定量通过使用Microsoft Excel计算。
统计学分析
合适时，使用学生t检验确定在盐水-和化合物CDE-处理组之间的差异的统计学显著性，P值小于0.05。数据表示为图中标示的小鼠数量的平均值± SEM。
结果和讨论
Lepr db/db 小鼠缺少瘦蛋白受体基因(Lepr)的所有已知的亚型。该纯合小鼠模型是一种具有葡萄糖耐受受损、胰岛素敏感性降低、高血糖症和高胰岛素血症的侵袭性II型糖尿病小鼠模型。这些小鼠显示在大约3-4周龄时严重肥胖，在10-14天开始评价血浆胰岛素和在4-8日龄开始评价高血糖症(即，高血糖水平)(Coleman DL. 1978 Diabetologia 14:141-8)。
对本文所述的AML-12细胞和原代小鼠肝细胞的研究表明，化合物CDE可模拟胰岛素，但绕过胰岛素以在肝细胞中失活Foxo1、Foxo3和Foxo4。此外，化合物CDE可抑制Foxo-介导的G6pc表达以降低葡萄糖产生而对这些肝细胞没有毒性(图1、2A-2B、3、4、6A-6C、7A-7C、9A-9C、10A-10C、11A-11B、12A-12F、13A-13D、14A-14B、15A-15B)。此外，这些体外研究表明，化合物CDE可提高胰岛素作用以在模拟糖尿病病况下在肝细胞中降低葡萄糖产生和G6pc表达(图4、10A-10C、11A-11B)。因此，Lepr db/db 小鼠模型是研究该新化合物组合在可能降低血流中的葡萄糖和提高胰岛素敏感性和针对糖尿病的葡萄糖耐受中的用途的理想模型。
在高血糖症发作之前和之后，在给予化合物CDE后的Lepr db/db 小鼠中降低血液葡萄糖水平
采用化合物CDE的两个给药方案以研究化合物CDE在预防和治疗如Lepr db/db 小鼠中所表现出的高血糖症中的潜在作用。研究本文所述的化合物以确定它们是否在预防高血糖症的发生中具有任何作用，所述高血糖症在4-8周龄的Lepr db/db 小鼠中发生。小鼠在紧临高血糖症发作之前通过腹膜内注射化合物CDE给予治疗。
简言之，27日龄的幼年Lepr db/db 小鼠每隔一天在腹膜内注射化合物CDE (各化合物5 μg 硒/千克体重，等同于在各小鼠中5 ppb的各化合物/注射)或生理盐水，直到小鼠达到3.5月龄。在处理结束时，小鼠禁食过夜，和进行葡萄糖分析。这些处理的小鼠的体重使用天平每隔一天记录，以测试在处理期间是否存在这些化合物对体重增加的任何作用。数据表示为在图14A的柱状图中标示数量的小鼠的平均值± SEM。
发现在这些突变体小鼠中用化合物CDE处理不影响体重增加(数据未显示)，表明对于Lepr db/db 小鼠中表现出的因食物消耗而异常增加的食欲，化合物CDE可能具有很少或没有抑制作用。此外，在处理期间在盐水处理(对照)和化合物CDE处理的Lepr db/db 小鼠之间在动物总体形态和行走行为方面没有明显差异(数据未显示)。这些结果表明，测试剂量的化合物CDE对动物行为或活动没有影响。
然而，与对照相比，用化合物CDE处理导致Lepr db/db 小鼠的血流中的葡萄糖水平显著降低，减少约40% (见图14A)，即使化合物CDE-处理的Lepr db/db 小鼠的血糖水平仍高于相同年龄的正常野生型小鼠(约100 mg/dL，数据未显示)。尽管测试剂量的化合物CDE未完全阻止在Lepr db/db 小鼠中的高血糖症的发生，但这些结果清楚地证实，在此严重的II型糖尿病小鼠模型中化合物CDE可显著地降低血流中的葡萄糖水平，表明化合物CDE用于预防高血糖症的潜力。
为了进一步研究在这些糖尿病Lepr db/db 小鼠中化合物CDE在降低葡萄糖输出中的作用，采用另一给药方案以检查这些小鼠中的血糖水平，其中在Lepr db/db 小鼠中高血糖症发生之后或期间化合物CDE经腹膜内注射。简言之，38日龄的Lepr db/db 雄性小鼠每日经腹膜内注射盐水或化合物CDE (各化合物5 μg硒/千克体重)，持续28天。每日记录或监测小鼠体重和任何异常的形态学或行走行为。
在上述处理后，动物禁食过夜，然后进行血糖分析。类似于上述动物研究，在Lepr db/db 小鼠中在处理期间化合物CDE的处理不影响体重增加、动物总体形态学和行走行为(数据未显示)。然而，与盐水处理的小鼠相比，在这些Lepr db/db 小鼠中用化合物CDE处理导致血糖水平显著降低(减少约25%) (见图14B)。这些研究进一步证实，在这些严重的II型糖尿病小鼠中化合物CDE可降低葡萄糖输出，表明这些化合物用于治疗高血糖症的潜力。
总的来说，这些结果证实，在Lepr db/db 小鼠的高血糖症发作之前和之后或期间，通过腹膜内注射化合物CDE，这些化合物可降低在这些突变体动物中的葡萄糖输出。
此外，在上述注射方案下，在这些化合物处理之后，在Lepr db/db 小鼠中没有明显的形态学或行走行为改变。事实上，检查到在正常野生型C57BL/6小鼠中化合物CDE对动物健康的急性作用，但在腹膜内注射高剂量的化合物CDE后一周期间，未观察到异常总体形态学和行走行为异常(各化合物500 μg硒/千克体重，数据未显示)。因此，在这些小鼠中化合物CDE可能具有很少或没有毒性作用。
总之，这些结果证实，在侵袭性II型糖尿病的小鼠模型中化合物CDE可显著地降低血糖水平。这些结果表明，化合物CDE在糖尿病受试者中预防和治疗高血糖症的潜力。
在高血糖症发作之前，在给予化合物CDE后提高在糖尿病Lepr db/db 小鼠中的葡萄糖耐受
葡萄糖耐受测试鉴定在血糖高且快速升高后(例如通常在餐后)身体处理葡萄糖的方式中的异常。胰岛素不仅在抑制肝中的葡萄糖产生中，而且在肌肉、肝和脂肪细胞的葡萄糖摄取、贮存和代谢中起关键作用，这导致血流中较低的葡萄糖水平。
由于糖尿病患者不能产生胰岛素或有效响应胰岛素以保持葡萄糖稳态，他们具有极低的葡萄糖耐受。本文所述的体外研究表明，化合物CDE不仅可模拟胰岛素，而且可绕过胰岛素和提高胰岛素作用以抑制肝细胞中的葡萄糖产生和/或G6pc (一个用于葡萄糖产生的关键的基因)的表达(图2A-2B、3、4、9A-9C、10A-10C、11A-11B)。考虑到在Lepr db/db 小鼠中表现出葡萄糖耐受受损和胰岛素抗性，这些突变体小鼠是研究化合物CDE在维持葡萄糖稳态中的作用的理想的小鼠II型糖尿病模型。因此，研究了在腹膜内注射化合物CDE至27日龄至3.5月龄的小鼠后，化合物CDE在Lepr db/db 小鼠中改进葡萄糖耐受的作用。
类似于上文所述的研究，27日龄的Lepr db/db 小鼠每隔一天经腹膜内注射生理盐水或组合的化合物CDE (各化合物5 μg硒/千克体重，等同于在各小鼠中5 ppb的各化合物/注射)，直到小鼠达到3.5月龄。在处理结束时，这些小鼠禁食过夜，注射葡萄糖(2 g/kg体重)和在葡萄糖注射后0.25小时(15分钟)、0.5小时(30分钟)、1小时(60分钟)和2小时(120分钟)测量血糖水平。还记录紧临葡萄糖注射前的血糖水平(称为0时间点)。平均值± SEM。图15A中的*表示与盐水处理组相比在相同时间点，P至少< 0.05。
如图15A所示，在注射葡萄糖后在0.25小时开始和在所有之后的测试时间点，在盐水处理的Lepr db/db 小鼠中观察到血糖水平显著增加。如所述的，用于这些分析的血糖仪的葡萄糖测量限度是600 mg/dL。因此，超过该限度的葡萄糖水平仍必须记录为600 mg/dL。这样说的原因是为指出，测量，特别是对于盐水处理的动物，可充分代表了对真实血糖浓度的低估。
在葡萄糖注射之前，在化合物CDE处理的Leprdb/db小鼠中，血糖水平显著地低于盐水处理的小鼠。类似于盐水处理的小鼠，在葡萄糖注射后0.5小时和1小时，6只测试的化合物CDE-处理的小鼠中的5只的血糖水平接近或高于600 mg/dL (见图15A)。然而，在葡萄糖注射后2小时，在所有6只用化合物CDE处理后的测试的Leprdb/db小鼠中的血糖水平显著地低于盐水处理的同窝仔(见图15A)。
图15A所示的上图的曲线下面积(AUC)的定量分析证实，与盐水处理的小鼠相比，在葡萄糖注射后在化合物CDE处理的Leprdb/db小鼠中在测试时间段期间也存在血糖显著降低(见图15B)。再次，然而，由于血糖仪的测量限度，可能的是，该降低比图15B所示更加显著。无论如何，必须强调的是，所述降低仍差异显著。
注意的是，在葡萄糖注射后2小时，化合物CDE-处理的Lepr db/db 小鼠中的葡萄糖水平仍高于葡萄糖注射前的葡萄糖水平(见图15A)。这些结果表明，通过化合物CDE导致给予的葡萄糖在Leprdb/db小鼠的血流中完全清除将可能花费比本实验中使用的2小时监测期更久的时间。
简言之，以上研究证实，测试剂量的化合物CDE可显著地改进在Lepr db/db 小鼠中的葡萄糖耐受。这些化合物的作用可能通过在肝以及其它器官例如肌肉和脂肪组织中的葡萄糖清除中胰岛素敏感性的改进来介导。
概述
这些结果首次证实，在侵袭性II型糖尿病小鼠模型中化合物CDE不仅可降低禁食葡萄糖水平(图14A-14B)，而且可改进葡萄糖耐受(图15A-15B)。根据广泛的细胞培养工作，化合物CDE在这些动物中的可能作用模式是(1)绕过胰岛素以失活Foxo1、Foxo3、Foxo4，导致肝细胞中G6pc表达和葡萄糖产生降低，如在原代小鼠肝细胞和AML-12肝细胞中所证实(见图2A-2B、3、4、6A-6C、7A-7C、9A-9C、10A-10C、11A-11B、12A-12F、13A-13D)；(2)通过抑制肝中Foxo1、Foxo3、Foxo4-介导的G6pc表达和葡萄糖产生，改进胰岛素敏感性，如也通过在培养的肝细胞中的研究所指示的(图4、10A-10C、11A-11B)；和/或(3)改进胰岛素作用或绕过胰岛素以提高肝、肌肉和脂肪细胞中葡萄糖的摄取和/或代谢，如图15A-15B所示的。此外，胰岛素敏感性的改进可能由于化合物CDE导致的Insr和Igf1r表达提高，如通过在小鼠肝AML-12细胞中的研究所指示的(图5A-5D)。
无论如何，我们的研究证实，在胰岛素-抗性，糖尿病小鼠模型中化合物CDE可抑制葡萄糖输出和改进葡萄糖耐受。这些结果表明，可开发化合物CDE用于在糖尿病患者中治疗高血糖症和胰岛素-不敏感性。此外，如果在有风险的患者中在高血糖症发作之前给予，化合物CDE还可用于在前驱糖尿病受试者中通过其降低血流中葡萄糖输出的能力预防高血糖症的发生。此外，化合物CDE还可用于治疗肥胖，这是因为其降低血流中葡萄糖水平的能力。
本申请中提及的所有出版物和专利通过引用结合到本文中。在没有背离本申请的范围和精神的情况下，本申请的所述方法和组合物的各种修改和变化将对本领域技术人员而言是显而易见的。尽管本申请已经结合特定的优选实施方案进行描述，但应理解，要求保护的本申请不应过度限于这样的特定实施方案。事实上，对实施本申请的所述模式的各种修改，其对于相关领域的技术人员而言是显而易见的，意欲包括在随附权利要求的范围内。

Claims (18)

1.组合物在制备用于在受试者中代替胰岛素的药物中的用途，其中所述代替包括给予所述受试者所述组合物，所述组合物包含5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸和γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸的组合以及药学上可接受的载体，其中所述组合物包含各自至少0.033% w/v的5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸和γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸。
2.组合物在制备用于在受试者中提高胰岛素活性的药物中的用途，其中所述提高包括给予所述受试者所述组合物，所述组合物包含5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸和γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸的组合以及药学上可接受的载体，其中所述组合物包含各自至少0.033% w/v的5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸和γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸。
3.权利要求2的用途，其中所述提高进一步包括给予所述受试者胰岛素。
4.权利要求2的用途，其中所述提高进一步包括给予所述受试者速效胰岛素类似物或长效胰岛素类似物，其中所述速效胰岛素类似物选自Aspart、Glulisine和LisPro，并且所述长效胰岛素类似物选自NPH胰岛素、胰岛素detemir、Degludec胰岛素和胰岛素glargine。
5.组合物在制备用于在受试者中抑制葡萄糖产生的药物中的用途，其中所述抑制包括给予所述受试者所述组合物，所述组合物包含5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸和γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸的组合以及药学上可接受的载体，其中所述组合物包含各自至少0.033% w/v的5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸和γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸。
6.组合物在制备用于在受试者中调节葡萄糖代谢的药物中的用途，其中所述调节包括给予所述受试者所述组合物，所述组合物包含5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸和γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸的组合以及药学上可接受的载体，其中所述组合物包含各自至少0.033% w/v的5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸和γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸。
7.权利要求1的用途，其中所述组合物包含至少0.1% w/v的5’-甲基硒代腺苷。
8.权利要求2的用途，其中所述组合物包含至少0.1% w/v的5’-甲基硒代腺苷。
9.权利要求3-4中任一项的用途，其中所述组合物包含至少0.1% w/v的5’-甲基硒代腺苷。
10.权利要求5的用途，其中所述组合物包含至少0.1% w/v的5’-甲基硒代腺苷。
11.权利要求6的用途，其中所述组合物包含至少0.1% w/v的5’-甲基硒代腺苷。
12.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述组合物进一步包含胰岛素。
13.权利要求1-6中任一项的用途，其中所述组合物进一步包含速效胰岛素类似物或长效胰岛素类似物，其中所述速效胰岛素类似物选自Aspart、Glulisine和LisPro，并且所述长效胰岛素类似物选自NPH胰岛素、胰岛素detemir、Degludec胰岛素和胰岛素glargine。
14.权利要求1的用途，其中所述组合物进一步包含胰岛素敏化剂、胰岛素促分泌剂或肠降血糖素模拟物。
15.权利要求2的用途，其中所述组合物进一步包含胰岛素敏化剂、胰岛素促分泌剂或肠降血糖素模拟物。
16.权利要求3-4中任一项的用途，其中所述组合物进一步包含胰岛素敏化剂、胰岛素促分泌剂或肠降血糖素模拟物。
17.权利要求5的用途，其中所述组合物进一步包含胰岛素敏化剂、胰岛素促分泌剂或肠降血糖素模拟物。
18.一种组合物，其包含5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸和γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸的组合以及药学上可接受的载体，其中所述组合物包含各自至少0.033%w/v的5’-甲基硒代腺苷、Se-腺苷-L-高半胱氨酸和γ-谷氨酰基-甲基硒代半胱氨酸。
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