CN106811473B - 一种重组博落回防御素功能蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，包括以下步骤：构建含博落回防御素功能蛋白编码基因的重组表达载体；将上述得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌；重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得博落回防御素功能蛋白。本发明采用重组菌（含有核苷酸为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所述博落回防御素功能蛋白编码基因片段的重组菌）表达得到的发酵产物抗菌活性高，将所生产的发酵液上清，直接用于体外抗菌实验，具有抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的能力，可用于制备抗菌饲料添加剂，工艺步骤简单，成本低廉，具有良好的工业应用前景。

Description

一种重组博落回防御素功能蛋白及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种植物防御素的重组表达方法，尤其是涉及一种重组博落回防御素功能蛋白，以及利用酿酒酵母表达重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，以及博落回防御素的应用研究。
背景技术
防御素是一种遍布于动植物中的阳离子抗菌肽，是生物体长期进化的自身防御体系的重要组成部分，其大小约为5kDa，含有6个或者8个保守半胱氨酸残基，能直接作用于病原菌，是生物先天免疫系统中的重要物质。根据分子结构和来源的不同，可分为五类：哺乳动物α-防御素，β-防御素，θ-防御素，昆虫防御素和植物防御素。
植物防御素是一类阳离子肽，是植物内免疫系统的主要成分之一，参与了多种植物生理生化活动。植物防御素含8个保守半胱氨酸，形成4对链内二硫键来稳定其3条反向平行的β折叠片和1个α螺旋，构成所谓的Csαβ模体结构。植物防御素具有抑制真菌和细菌生长、抑制酶的活性、抑制癌细胞增殖和作为离子通道阻断剂等功能。
博落回属于罂粟科草本植物，是我国传统中草药，具有抑菌杀虫的功效。由于罂粟科植物大多富含生物碱而备受关注。目前关于罂粟科植物的研究也主要集中在其生物碱，博落回的研究亦是如此。
朱鹏程于2013年发表的“博落回叶片cDNA文库的构建及EST分析” ([D]. 湖南农业大学, 2013.)，公开了构建博落回叶片cDNA文库的构建以及初步的EST分析，但未报道博落回防御素的相关基因；李赛于2014年发表的《博落回叶cDNA文库表达序列标签分析和防御素重组表达》（[D]. 湖南农业大学, 2014.），公开了对博落回防御素基因的分析以及对预测的五种防御素前体中的McDef1和McDef5的基因序列，并采用大肠杆菌原核重组表达和毕赤酵母真核重组表达，其中包含的目的蛋白片段是前体蛋白去掉信号肽，包括中间肽和成熟肽；对表达产物进行蛋白质电泳，毕赤酵母表达产物未见相应的目的蛋白，仅采用pET32表达的产物有明显的含目的基因产物的蛋白，是融合蛋白，还需进一步采用蛋白酶酶切才能产生目的蛋白分子；大肠杆菌表达和毕赤酵母表达均未表达得到有活性的重组博落回防御素功能蛋白。以上重组表达方法中，由于博落回防御素的中间肽和成熟肽之间的剪切位点尚未明确，将两者一起同时表达时，中间肽的存在可能对表达产物的活性产生了负面影响。
因此，鉴于博落回防御素的优良性能和广泛的应用市场，亟需准确确定中间肽和成熟肽的分割位点，并在此基础上提供一种高效的博落回防御素功能蛋白的重组表达方法，并进一步对博落回防御素重组菌发酵工艺的优化以及发酵产物的应用研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种博落回防御素功能蛋白，以及高效表达博落回防御素功能蛋白、操作简单、易于产业化的重组博落回防御素功能蛋白的制备方法；确定采用重组菌大量表达博落回防御素的发酵工艺，以及发酵产物的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1）构建含博落回防御素功能蛋白编码基因的重组表达载体；
2）将步骤1）得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌；
3）重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得博落回防御素功能蛋白。
进一步，所述博落回防御素功能蛋白编码基因，由核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述博落回防御素功能蛋白，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示的McDef1和/或McDef2，编码McDef1、McDef2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述博落回防御素功能蛋白的重组表达载体为酿酒酵母表达载体pVT102U/α。
进一步，所述博落回防御素功能蛋白的重组菌为酿酒酵母S78。
进一步，所述步骤1）中构建重组表达载体的具体操作，包括引物设计、PCR扩增、获得目的片段和构建重组表达载体。
进一步，所述引物设计根据表达载体pVT102U/α上的酶切位点，上游引物设计时添加了Xba I 酶切位点，在Xba I 酶切位点前加有保护性碱基；下游引物设计在基因末端，并加上Hind Ⅲ 酶切位点，在Hind Ⅲ酶切位点前加有保护性碱基，所设置的博落回McDef1和McDef2基因上游引物、下游引物分别为：
博落回防御素McDef1基因上游引物：
5’-CGTCTAGATAAGAGAGAAGAAATGGGACCTAAAATGGTTG-3’Xba I 酶切位点，
博落回防御素McDef1基因下游引物：
5’-CCGAAGCTTATTCTCTTCACCTTCTCTACAT-3’ Hind III 酶切位点，
博落回防御素McDef2基因上游引物：
5’-CCGctcgag aaaagagaggctgaagctttatgtgagaaggctagccag-3’Xba I 酶切位点，
博落回防御素McDef2基因下游引物：
5’- GCTCTAGActaacattgggagaagtagcag-3’ Hind III 酶切位点。
进一步，所述PCR扩增：以cDNA文库中测序的相应单克隆质粒为模板，加入Taq DNA聚合酶、博落回防御素McDef1 上/下游引物、 dNTPs进行扩增反应，PCR 的反应体系为：10×Taq Buffer 2.5μL， 4× dNTPs 2.0μL，浓度均为10pmol/μL 的防御素McDef1或McDef2上/下游引物各1.0μL，模板为博落回cDNA1μL，ddH2O 17μL，浓度为1U的Taq DNA 聚合酶0.5μL，10×PCR Buffer 包含0.5mmol/L MgCl2、 50mmol/L KCl、 10mmol/L Tris·HCl、4×dNTPs 包含用量均为2.5mmol/L 的dATP、 dTTP、dCTP、 dGTP，反应过程依次为：a、95℃处理1min ；b、依次94℃处理40s、60℃处理30s、72℃处理30s ；反应过程进行25 个循环；c、72℃延伸10min ；即获得博落回防御素McDef1和McDef2基因编码的功能蛋白的PCR 产物。
进一步，所述重组表达载体：取合成的McDef1和McDef2，通过Xba I/ Hind III位点克隆到酿酒酵母表达载体pVT102U/α上,得到重组表达载体pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2。
进一步，所述步骤2）中构建重组菌的具体操作为：取重组表达载体pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2，热击转化酿酒酵母，采用YSD营养缺陷筛选培养基进行营养缺陷筛选，其操作为：将重组表达载体质粒DNA 1.0 μg；carrier DNA，10 μg；上述菌悬液，20μL；PEG 溶液（10×TE，1 M LiAC,50% PEG 4000,以1:1:8 的体积比混合)1.5 mL 加入10mL 无菌管中，混合，30℃，200 rpm，培养30 min；42℃热击15 min 后，5000 g，离心5min；弃上清，细胞沉淀用200 μL 1×TE 洗涤，5000 g，离心5min；弃上清，细胞沉淀悬浮于200 μL1×TE 溶液中；细胞悬浮液涂YSD 板，30℃培养4-6天。
进一步，所述YSD营养缺陷筛选培养基，其配方如下： YNB（无氨基酵母氮源） 6.7g/L，葡萄糖 20 g/L，亮氨酸 200 mg/L，腺嘌呤 100 mg/L，肌醇 200 mg/L， 琼脂15 g/L。
进一步，所述步骤3）中重组菌发酵培养表达的具体操作为：挑取2~4个3~5mm的重组菌于3mL YSD液体培养基中， 28~32℃，220~280rpm，培养12~16h；按1:20~50的比例将制备的种子液接种入50mL YSD液体培养基中，28~32℃，220~280rpm，培养12~16h；再按1:20~50的比例将制备的种子液接种入1.0 L YSD液体培养基中，28~32℃，220~280rpm，培养60~72h。
优选，挑取2~4个3~5mm的重组菌于3mL YSD液体培养基中， 30℃，250rpm，培养12h；按1:25的比例将制备的种子液接种入50mL YSD液体培养基中，30℃，250rpm，培养12h；再按1:25的比例将制备的种子液接种入1.0 L YSD液体培养基中，30℃，250rpm，培养72h。
进一步，一种重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，还包括：
4）蛋白纯化：收集步骤3）发酵培养得到的发酵产物的上清，分离纯化。
所述蛋白纯化的具体操作为：将发酵产物的上清和预先用0.05M NH4AC (pH7.5)平衡过的DEAE 凝胶混合，室温放置0.5~1 h，然后用抽滤瓶抽滤，所得到的滤液， pH 值调至4.1~4.3后，直接上预先用0.1M CH3COONa （pH4.1~4.3）平衡好的CM-sepharose 阳离子交换柱（3cm x 30cm），然后用0.1M CH3COONa 洗脱色素，再分别用含0.1M, 0.3M, 0.5M,1.0M NaCl 的0.1M CH3COONa 缓冲液进行洗脱，收集每个洗脱峰进一步脱盐反相纯化，低温冻干。
优选，所述蛋白纯化的具体操作为：将发酵产物的上清和预先用0.05M NH4AC(pH7.5)平衡过的DEAE 凝胶混合，室温放置0.5 h，然后用抽滤瓶抽滤，所得到的滤液， pH值调至4.2 后直接上预先用0.1M CH3COONa （pH4.2）平衡好的CM-sepharose 阳离子交换柱（3cm x 30cm），然后用0.1M CH3COONa 洗脱色素，再分别用含0.1M, 0.3M, 0.5M, 1.0MNaCl 的0.1M CH3COONa 缓冲液进行洗脱，收集每个洗脱峰进一步脱盐反相纯化，低温冻干。
一种博落回防御素重组菌的发酵产物，如上述方法制得的发酵产物。
一种重组博落回防御素功能蛋白的应用，上述蛋白或者发酵产物在抗菌饲料添加剂、果蔬种子的保存或者制备抗菌药物中的应用。
本发明一种重组博落回防御素功能蛋白的制备方法的有益效果：采用重组菌（含有核苷酸为SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所述博落回防御素功能蛋白编码基因片段的重组菌）表达得到的发酵产物抗菌活性高，将所生产的发酵液上清，直接用于体外抗菌实验，具有抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的能力，可用于制备抗菌饲料添加剂，工艺步骤简单，成本低廉，具有良好的工业应用前景。
附图说明
图1—为从cDNA文库中克隆McDef1、McDef2基因片段的检测结果；
泳道M：DNA分子量，泳道1-3：克隆的目的片段McDef1，泳道4~6：克隆的目的片段McDef2。
图2—为重组阳性转化子的PCR扩增检测结果；
（A）泳道M：DNA分子量，泳道1：阴性克隆子，泳道2~3：阳性克隆子pVT102U/α-McDef1；
（B）泳道M：DNA分子量，泳道1：阴性克隆子，泳道2~3：阴性克隆子，泳道4~5：阳性克隆子pVT102U/α-McDef2。
图3—为发酵产物的上清通过离子交换和反相液相纯化后用Tricine-SDS- PAGE检测结果；
泳道M：蛋白分子量，泳道1：重组表达的McDef1，泳道2、3：阴性对照，泳道4：重组表达的McDef2；
图4—为发酵产物上清对大肠杆菌（DH5α）抑菌圈实验结果；
1号孔为阴性对照，为含空质粒的S78的发酵未浓缩液；2号孔为McDef1发酵产物未浓缩发酵液对猪沙门氏菌的抑菌效果，3号孔为McDef2发酵产物未浓缩发酵液对猪沙门氏菌的抑菌效果，4号孔为McDef1和McDef2发酵产物未浓缩发酵液按体积比1：1的混合物对猪沙门氏菌的抑菌效果；各加样孔的加样量为10μl；
图5—为发酵产物上清对金黄色葡萄球菌抑菌圈实验结果；
1号孔为阴性对照，为含空质粒的S78的发酵未浓缩液；2号孔为McDef1发酵产物未浓缩发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，3号孔为McDef2发酵产物未浓缩发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，4号孔为McDef1和McDef2发酵产物未浓缩发酵液按体积比1：1的混合物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果；各加样孔的加样量为10μl；
图6—为发酵产物上清对猪沙门氏菌抑菌圈实验结果；
1号孔为阴性对照，为含空质粒的S78的发酵未浓缩液；2号孔为McDef1发酵产物未浓缩发酵液对猪沙门氏菌的抑菌效果，3号孔为McDef2发酵产物未浓缩发酵液对猪沙门氏菌的抑菌效果，4号孔为McDef1和McDef2发酵产物未浓缩发酵液按体积比1：1的混合物对猪沙门氏菌的抑菌效果；各加样孔的加样量为10μl。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种重组博落回防御素功能蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1）构建含博落回防御素功能蛋白编码基因的重组表达载体：
包括引物设计、PCR扩增、获得目的片段和构建重组表达载体；
a）博落回McDef1和McDef2基因上游引物、下游引物设计: 根据合成的博落回McDef1和McDef2基因核苷酸序列经多重比较后设计而成，上游引物设计在该基因起始端，并根据表达载体pVT102U/α上的酶切位点，上游引物设计时添加了Xba I 酶切位点，在XbaI 酶切位点前加有保护性碱基；下游引物设计在基因末端，并加上Hind Ⅲ 酶切位点，在Hind Ⅲ酶切位点前加有保护性碱基，所设置的博落回McDef1和McDef2基因上游引物、下游引物分别为：
博落回防御素McDef1基因上游引物：
5’-CGTCTAGATAAGAGAGAAGAAATGGGACCTAAAATGGTTG-3’Xba I 酶切位点，
博落回防御素McDef1基因下游引物：
5’-CCGAAGCTTATTCTCTTCACCTTCTCTACAT-3’ Hind III 酶切位点，
博落回防御素McDef2基因上游引物：
5’-CCGctcgag aaaagagaggctgaagctttatgtgagaaggctagccag-3’Xba I 酶切位点，
博落回防御素McDef2基因下游引物：
5’- GCTCTAGActaacattgggagaagtagcag-3’ Hind III 酶切位点。
b）PCR扩增：以cDNA文库中测序的相应单克隆质粒为模板，加入Taq DNA 聚合酶、博落回防御素McDef1和McDef2的上/下游引物、 dNTPs分别进行扩增反应。
PCR扩增的反应体系为：10×Taq Buffer 2.5μL， 4× dNTPs 2.0μL，浓度均为10pmol/μL 的防御素McDef1或McDef2上/下游引物各1.0μL，模板为博落回cDNA1μL，ddH2O17μL，浓度为1U的Taq DNA 聚合酶0.5μL，10×PCR Buffer 包含0.5mmol/L MgCl2、50mmol/L KCl、 10mmol/L Tris·HCl、4×dNTPs 包含用量均为2.5mmol/L 的dATP、 dTTP、dCTP、 dGTP；其反应过程依次为：a、95℃处理1min ；b、依次94℃处理40s、60℃处理30s、72℃处理30s ；反应过程进行25 个循环；c、72℃延伸10min ；即获得博落回防御素McDef1和McDef2基因编码的功能蛋白的PCR 产物。
PCR扩增的结果如图1所示，从cDNA文库中克隆得到的McDef1和McDef2目的基因，大小约为140bp~150bp。
c）获得目的片段：
如图2所示的PCR扩增结果，阴性转化子中无目标基因片段，阳性转化子中含有目标基因片段McDef1和McDef2，说明本发明得到了含有目标片段McDef1和McDef2的阳性转化子。
d）构建重组表达载体：
取合成的McDef1和McDef2，通过Xba I/ Hind III位点克隆到酿酒酵母表达载体pVT102U/α上,得到重组表达载体pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2。DNA的重组操作依据《分子克隆实验手册》进行。
2）将步骤1）得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌：
取步骤3重组载体pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2，热击转化酿酒酵母，采用YSD营养缺陷筛选培养基进行营养缺陷筛选，具体步骤和条件：将表达载体质粒DNA，1.0μg；carrier DNA，10 μg；上述菌悬液，20 μL；PEG 溶液（10×TE, 1 M LiAC,50% PEG 4000,以1:1:8 的体积比混合)1.5 mL 加入10 mL 无菌管中，混合， 30℃，200 rpm，培养30 min；42℃热击15 min 后，5000 g，离心5min；弃上清，细胞沉淀用200 μL 1×TE 洗涤，5000 g，离心5min；弃上清，细胞沉淀悬浮于200 μL 1×TE 溶液中；细胞悬浮液涂YSD 板，30℃培养4-6天。
YSD营养缺陷筛选培养基，其配方如下： YNB（无氨基酵母氮源） 6.7 g/L，葡萄糖20 g/L，亮氨酸 200 mg/L，腺嘌呤 100 mg/L，肌醇 200 mg/L， 琼脂15 g/L，其余为水。
）重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得博落回防御素功能蛋白：
取步骤2）中得到的工程菌（阳性转化子），挑取2~4个3~5mm的重组菌于3mLYSD液体培养基中，30℃，250rpm，培养12h；按1:25的比例将制备的种子液接种入50mLYSD液体培养基中，30℃，250rpm，培养12h；再按1:25的比例将制备的种子液接种入1.0 L YSD液体培养基中，30℃，250rpm，培养72h。
）蛋白纯化：收集步骤3）发酵培养得到的发酵产物的上清，分离纯化：
收集步骤3）的发酵菌液，将发酵产物上清和预先用0.05M NH4AC (pH7.5)平衡过的DEAE 凝胶混合，室温放置0.5 h，然后用抽滤瓶抽滤，所得到的滤液， pH 值调至4.2 后直接上预先用0.1M CH3COONa （pH4.2）平衡好的CM-sepharose 阳离子交换柱（3cm x30cm），然后用0.1M CH3COONa 洗脱色素，再分别用含0.1M, 0.3M, 0.5M, 1.0M NaCl 的0.1M CH3COONa 缓冲液进行洗脱，收集每个洗脱峰，0.3M NaCl洗脱时，有大的洗脱峰，进一步脱盐反相纯化，低温冻干。
反相纯化后浓缩液用Tricine-SDS- PAGE 电泳图如图3所示，分别有一条大小约为5~6 kDa的蛋白条带，与目的蛋白大小相吻合，表明目的基因已经得到表达，即重组博落回防御素功能蛋白McDef1和McDef2蛋白已经生产出来。
实施例2
一种重组博落回防御素功能蛋白的应用，包括以下几方面：
本发明抑制细菌活性的测定均采用如下方法：
1 .原理
本法基于待测物质的杀菌抑菌能力，利用在特定条件下一定浓度的待测物质在含有微生物的培养基内扩散并形成固定大小的抑菌区域的原理进行测定。
参考文献及标准
《中华人民共和国兽药典》2010版——抗生素微生物鉴定法（QB2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素）
3.试剂
3.1 LB固体培养基：胰蛋白胨1.0g，酵母提取物0 .5g，NaCl 1.0g，加水至100mL，琼脂1 .5g，pH7.0，121℃，灭菌 25 min。
3.2 LB液体培养基：胰蛋白胨1.0g，酵母提取物0 .5g，NaCl 1.0g，加水至100mL，pH7.0，121℃，灭菌 25 min。
3.3指示菌：购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心，大肠埃希氏菌CICC编号10389，金黄色葡萄球菌，猪沙门氏菌。
分析步骤
4.1指示菌的活化
按照试剂3 .2的配方，配置50mL的培养液，挑取一个指示菌菌落于50mL液体培养基放入摇床，150 rpm，37℃，培养12 h。取出培养好的指示菌菌悬液，600nm下用无菌液体LB培养基调零，测定其OD值，如果OD值介于1 .5-2 .0，菌悬液的加入量为200微升每10mL LB固体培养基，如果OD值在2 .0-2 .5之间，菌悬液加入量为100微升每10mL固体培养基。
4.2待测物质供试品
准确称取待测物质100 mg，并溶于1.0mL的无菌水中，混匀，2000rpm，离心10min，留上清液作为高剂量浓度，并将其稀释10倍，使之配成高低剂量两个浓度梯度溶液。
4.3平板的制备
加热融化试剂3 .1LB固体培养基，待其冷却置50℃时（刚好不烫手的温度），按步骤4 .1指定量加入大肠杆菌悬液和金黄色葡萄球菌悬液，摇匀后置于50℃恒温水浴锅中，用无菌10mL移液管每次精确移取10mL试剂3.1已融化的LB固体培养基迅速轻放于水平操作台上至冷却，保证琼脂胶凝后培养基平面的平整度。
4.4上样
用直尺将平板划分为均匀的四份，在每个制备好的平板中以等距离打4个孔。分别加入80微升样品和阳性对照溶液。上样完成后，放入培养箱，37℃，大肠杆菌和猪沙门氏菌培养8 h，其中金黄色葡萄球菌培养24h；且每个样做3个平行样。
4.5检测结果与分析
检测结果为三个平行样的平均值。
测试样品对大肠杆菌的抑菌效果如图4所示，培养72h的发酵液，1号孔为阴性对照，2号孔为McDef1发酵产物未浓缩发酵液对大肠杆菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为2.3±0.1 cm，3号孔为McDef2发酵产物未浓缩发酵液对大肠杆菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为2.6±0.1 cm，4号孔为McDef1和McDef2发酵产物未浓缩发酵液混合物对大肠杆菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为4.2±0.2 cm。McDef2发酵产物未浓缩发酵液对大肠杆菌的抑菌作用稍大于McDef1发酵产物对大肠杆菌的抑菌作用，且McDef1和McDef2混合的发酵产物对大肠杆菌的抑菌作用明显强于两者的单独抑菌作用，说明McDef1和McDef2博落回防御素对大肠杆菌的抑菌作用相互之间存在协同效应。
测试样品对金黄色葡萄球菌的效果如图5所示，培养72h的发酵液，1号孔为阴性对照，2号孔为McDef1发酵产物未浓缩发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为2.1±0.1cm，3号孔为McDef2发酵产物未浓缩发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为3.1±0.2 cm，4号孔为McDef1和McDef2发酵产物未浓缩发酵液混合物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为3.7±0.2 cm。McDef2发酵产物未浓缩发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌作用大于McDef1发酵产物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用，且McDef1和McDef2混合的发酵产物对金黄色葡萄球菌的抑菌作用明显强于两者的单独抑菌作用，说明McDef1和McDef2博落回防御素对金黄色葡萄球菌的抑菌作用相互之间存在协同效应。
测试样品对猪沙门氏菌的抑菌效果如图6所示，培养72h的发酵液，1号孔为阴性对照，2号孔为McDef1发酵产物未浓缩发酵液对猪沙门氏菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为2.4±0.3cm，3号孔为McDef2发酵产物未浓缩发酵液对猪沙门氏菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为3.1±0.2cm，4号孔为McDef1和McDef2发酵产物未浓缩发酵液混合物对猪沙门氏菌的抑菌效果，抑菌圈的直径为5.8±0.4cm，根据抑菌圈的直径可知，McDef1和McDef2发酵产物对猪沙门氏菌的抑菌作用明显大于McDef1、McDef2发酵产物抑菌作用的和，McDef1和McDef2发酵产物混合后其抑菌作用存在协同效应，相互促进。
实验结果说明，采用本发明含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述博落回防御素功能蛋白编码基因片段的重组菌——酿酒酵母发酵得到的发酵产物，其分子量为5~6KD，发酵产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的McDef1、McDef2，其抑菌活性高，尤其将两种防御素McDef1和McDef2结合使用，其抑菌效果更佳，安全，营养价值高。
本发明通过对天然博落回防御素基因的改造，用基因工程的方法重组表达得到了具有高抑菌活性的博落回防御素功能蛋白，其可以用于制备抗菌药物；采用本发明工程菌表达得到的发酵产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较高的抗菌活性，适用于制备抗菌饲料添加剂，以及果蔬种子的保存或者添加至制备抗菌药物中，工艺步骤简单，成本低廉，应用前景良好。
以上通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以上的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖南农业大学
<120> 一种重组博落回防御素功能蛋白及其制备方法与应用
<130> 2017.3.15
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atttgtgaat ccgcctctca tagatttaag ggtttgtgtg ttagaaagtc caactgtgct 60
gctgtctgcc aaactgaagg atttcctgat ggtaagtgtc aaggtgttag aaggagatgt 120
atgtgtacca gaccatgtta a 141
<210> 2
<211> 153
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttatgtgaga aggctagcca gacttggtcc ggtaattgtg gtaatactca gcactgcgat 60
agacaatgta ttaactggga gaaggctttg catggcgcat gtcacgtcag aggaggtaaa 120
catatgtgct tctgctactt ctcccaatgt tag 153
<210> 3
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Ile Cys Glu Ser Ala Ser His Arg Phe Lys Gly Leu Cys Val Arg Lys
1 5 10 15
Ser Asn Cys Ala Ala Val Cys Gln Thr Glu Gly Phe Pro Asp Gly Lys
20 25 30
Cys Gln Gly Val Arg Arg Arg Cys Met Cys Thr Arg Pro Cys
35 40 45
<210> 4
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Leu Cys Glu Lys Ala Ser Gln Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn Thr
1 5 10 15
Gln His Cys Asp Arg Gln Cys Ile Asn Trp Glu Lys Ala Leu His Gly
20 25 30
Ala Cys His Val Arg Gly Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe Ser
35 40 45
Gln Cys
50

Claims (10)

1.一种核苷酸片段，其特征在于，为博落回防御素编码基因，用于编码博落回防御素功能蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.一种重组博落回防御素，其特征在于，包括博落回防御素功能蛋白McDef1和/或McDef2，所述博落回防御素功能蛋白McDef1、McDef2的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4所示，编码McDef1、McDef2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。
3.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌为含如SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的酿酒酵母表达载体pVT102U/α的酿酒酵母。
4.一种重组博落回防御素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）构建含如权利要求1所述的博落回防御素编码基因的重组表达载体；
2）将步骤1）得到重组表达载体热击转化至酿酒酵母S78构建重组菌；
3）重组菌在YSD液体培养基中发酵培养，表达获得如权利要求2所述的博落回防御素功能蛋白。
5.如权利要求4所述重组博落回防御素的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中构建重组表达载体的具体操作，包括引物设计、PCR扩增、获得目的片段和构建重组表达载体。
6.如权利要求4所述重组博落回防御素的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中构建重组菌的具体操作为：取重组表达载体pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2，热击转化酿酒酵母，采用YSD营养缺陷筛选培养基进行营养缺陷筛选，其操作为：将重组表达载体质粒DNA 1.0 μg；carrier DNA，10 μg；上述菌悬液，20 μL；PEG 溶液1.5 mL 加入10 mL 无菌管中，混合，30℃，200 rpm，培养30 min；42℃热击15 min 后，5000 g，离心5min；弃上清，细胞沉淀用200 μL 1×TE 洗涤，5000 g，离心5min；弃上清，细胞沉淀悬浮于200 μL 1×TE 溶液中；细胞悬浮液涂YSD 板，30℃培养4-6天。
7.如权利要求4所述重组博落回防御素的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中重组菌发酵培养表达的具体操作为：挑取2~4个3~5mm的重组菌于3mLYSD液体培养基中， 30℃，250rpm，培养12h；按1:25的比例将制备的种子液接种入50mLYSD液体培养基中，30℃，250rpm，培养12h；再按1:25的比例将制备的种子液接种入1.0 L YSD液体培养基中，30℃，250rpm，培养72h。
8.如权利要求4~7任一项所述重组博落回防御素的制备方法，其特征在于，所述重组博落回防御素的制备方法还包括：
4）蛋白纯化：收集步骤3）发酵培养得到的发酵产物的上清，分离纯化，
所述蛋白纯化的具体操作为：将发酵产物的上清和预先用0.05M NH4AC平衡过的DEAE凝胶混合，室温放置0.5 h，然后用抽滤瓶抽滤，所得到的滤液， pH 值调至4.2 后直接上预先用0.1M CH3COONa平衡好的CM-sepharose 阳离子交换柱，然后用0.1M CH3COONa 洗脱色素，再分别用含0.1M, 0.3M, 0.5M, 1.0M NaCl 的0.1M CH3COONa 缓冲液进行洗脱，收集每个洗脱峰进一步脱盐反相纯化，低温冻干。
9.一种博落回防御素重组菌的发酵产物，其特征在于，采用如权利要求4~8所述重组博落回防御素的制备方法制得。
10.一种重组博落回防御素的应用，其特征在于，如权利要求2所述的博落回防御素功能蛋白或者如权利要求9所述的发酵产物在抗菌饲料添加剂、果蔬种子的保存或者制备抗菌药物中的应用。
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