CN103834665A

CN103834665A - 抗真菌性防御素的用途

Info

Publication number: CN103834665A
Application number: CN201310601139.7A
Authority: CN
Inventors: N·L·范德威尔登; M·A·安德森
Original assignee: HIRSCHMAN CO Ltd
Current assignee: HIRSCHMAN CO Ltd; Hexima Ltd
Priority date: 2012-11-23
Filing date: 2013-11-25
Publication date: 2014-06-04
Also published as: AU2013260696A1

Abstract

本发明涉及保护植物免于病原体。具体地，本发明公开了一种用于产生具有对植物致病性真菌的抗性的植物的方法，所述方法包括将编码防御素的核酸分子引入到植物细胞，所述防御素包括选自由SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66组成的列表的成熟结构域氨基酸序列。因此，本发明使得使用防御素作为抗病原性真菌的剂成为可能。

Description

抗真菌性防御素的用途

领域

本公开内容涉及保护植物免于病原体。本公开内容使得使用防御素（defensin）作为抗病原性真菌的剂成为可能。

背景

在本说明书中作者所引用的出版物的著录细节被按字母排序汇总在说明书结尾。

在本说明书中引用任何现有技术不得且不应被视作承认或以任何形式表明该现有技术形成在任何国家的公知常识的一部分。

真菌病原体具有毁坏作物导致重大经济损失的可能。大约300,000个开花植物物种全部对植物致病性真菌易感。此类病原体往往局限于某些植物物种或类型。尽管传统选择育种已在开发对植物病原体具有抗性的植物栽培种中成功，这种抗性一般局限于选定的病原体的物种或菌株且开发时间太漫长以致不能应对流行病的突然开始。

开发具有期望特性的植物的分子途径提供了加强产生表达这些性状的栽培种的开发时间的手段。

对使用这些技术开发对植物致病性真菌具有抗性的植物和开发抗植物致病性真菌的局部组合物（topical composition）存在需要。

概述

贯穿本说明书，除非上下文另外要求，否则词“包括（comprise）”或变化形式如“包括（comprises）”或“包括（comprising）”将被理解为暗示包含叙述的要素或整体（integer）或方法步骤或者要素或整体或方法步骤的组但不排除任何要素或整体或方法步骤或者要素或整体或方法步骤的组。

如在本说明书中所用的，单数形式“一种（a）”、“一种（an）”和“该（the）”包括单数和复数方面，除非上下文另外清楚地指明。因此，例如，提到“一种防御素”包括一种单一的防御素，和两种或更多种不同的防御素；提到“一种剂”包括一种单一的剂，和两种或更多种剂；提到“本发明”包括被本公开内容教导的一个或多个方面。本文公开的方面被术语“发明”涵盖。使本发明的所有方面能够在权利要求的宽度之内。

用序列标识符编号（SEQ ID NO）提及核苷酸和氨基酸序列。SEQ IDNO与序列标识符<400>1(SEQ ID NO:1)、<400>2(SEQ ID NO:2)等数字上对应。表1和表2中提供了序列标识符的概述，分别按防御素命名的数字次序和序列标识符的数字次序列出。在权利要求之后提供了序列表。

本公开内容教导了防御素和编码防御素的基因分子在具有对植物致病性真菌的抗性或减少的敏感性的植物的产生中的用途。使用包括防御素的组合物来局部控制植物致病性真菌的侵袭在本文也成为可能。提到“防御素”包括其人工和天然变体。人工变体包括被工程化以承载来自包括嵌合和杂合的防御素的不同防御素的结构域和环的防御素。防御素可单独或与其他抗病原体剂联合使用，其他抗病原体剂包括但不限于透化防御素（permeabilizing defensin）和/或蛋白酶抑制剂或其前体形式。

本文教导了表达编码防御素的核酸分子的稳定的、基因转化的植物细胞和自其再生的植物和植物的子代的产生，其中所述植物细胞在基因转化之前不产生防御素。核酸分子的表达导致促进对植物致病性真菌的抗性的防御素的产生。

表现出对植物致病性真菌的抗性或减少的敏感性的转化的植物细胞、自其再生的植物和植物的子代在本文成为可能。在本文还成为可能的是能够产生表现出对植物致病性真菌的抗性或减少的敏感性的植物的种子和再生材料（reproductive material）和繁殖部分。

本文还教导了包括一种或多种防御素或包括防御素与另一种抗植物病原体剂的组合物，另一种抗植物病原体剂包括透化防御素和/或蛋白酶抑制剂。组合物可用于局部施加到植物的叶、茎、花、种子、根和周围土壤。

本文中成为可能的是用于产生具有对植物致病性真菌的抗性的植物的方法，该方法包括将编码防御素的核酸分子引入到植物细胞，所述防御素包括选自由SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66组成的列表的成熟结构域氨基酸序列。

本文考虑使用的防御素的实例包括由选自由SEQ ID NO:1到3组成的列表的成熟结构域氨基酸序列限定的防御素。

本文考虑使用的防御素的实例包括由选自由SEQ ID NO:4到6、16、63和64组成的列表的成熟结构域氨基酸序列限定的防御素。

本文考虑使用的防御素的实例包括由选自由SEQ ID NO:7到15和65和66组成的列表的成熟结构域氨基酸序列限定的防御素。

本文考虑使用的防御素的实例包括由选自由SEQ ID NO:17到20和62组成的列表的成熟结构域氨基酸序列限定的防御素。

提到植物包括玉米（corn）（玉蜀黍（maize））、大豆（soybean）、小麦（wheat）、棉花（cotton）、芸薹（canola）、苜蓿（alfalfa）、香蕉（banana）、大麦（barley）、蓖麻（castor bean）、菊花（chrysanthemum）、三叶草（clover）、可可（cocoa）、咖啡（coffee）、棉籽（cottonseed）、海甘蓝（crambe）、蔓越莓（cranberry）、黄瓜（cucumber）、石斛（dendrobium）、薯蓣（dioscorea）、桉树（eucalyptus）、羊茅（fescue）、亚麻（flax）、剑兰（gladiolus）、百合（liliacea）、亚麻子（linseed）、谷子（millet）、甜瓜（muskmelon）、燕麦（oat）、油棕（oil palm）、油菜（oilseed rape）、木瓜（papaya）、花生（peanut）、菠萝（pineapple）、观赏植物（ornamental plants）、菜豆（Phaseolus）、马铃薯（potato）、油菜籽（rapeseed）、水稻（rice）、黑麦（rye）、黑麦草（ryegrass）、红花（safflower）、芝麻（sesame）、高粱（sorghum）、甜菜（sugarbeet）、甘蔗（sugarcane）、向日葵（sunflower）、草莓（strawberry）、烟草（tobacco）、番茄（tomato）、草坪草（turfgrass）和蔬菜作物（vegetable crop）如莴苣（lettuce）、芹菜（celery）、青花菜（broccoli）、花椰菜（cauliflower）、葫芦（cucurbits）、葱属植物（onions）（包括大蒜（garlic）、大葱（shallots）、韭葱（leeks）和细香葱（chives））；水果树和坚果树，如苹果树（apple）、梨树（pear）、桃树（peach）、桔子树（orange）、葡萄柚树（grapefruit）、柠檬树（lemon）、酸橙树（lime）、扁桃树（almond）、美洲山核桃树（pecan）、胡桃树（walnut）、榛子树（hazelnut）；藤本植物，如葡萄（grape）、猕猴桃（kiwifruit）、啤酒花（hop）；灌木果树（fruit shrubs）和树莓（brambles），如覆盆子（raspberry）、黑莓（blackberry）、醋栗（gooseberry）；林木（foresttree），如白蜡木（ash）、松树（pine）、冷杉（fir）、枫树（maple）、橡树（oak）、栗树（chestnut）和白杨（poplar）。

编码被选自SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66的序列涵盖的防御素的基因构建体在本文也能够用于基因修饰植物细胞来产生防御素。在一个实施方案中，基因构建体是如美国专利申请第11/753,072号中描述的多基因表达载体（multi-gene expression vehicle，MGEV），且该专利申请通过引用被整体并入本文。在一个实施方案中，MGEV包括含2到8个结构域区段的多核苷酸，每个结构域编码功能蛋白，其中至少一个蛋白是选自SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66的防御素，每个结构域通过编码接头肽的接头区段在线性序列中与下一个结构域连接，结构域和接头区段在同一个阅读框中。在一个实施方案中，其他结构域中的至少一个编码蛋白酶抑制剂或其前体形式。在一个实施方案中，接头序列以SEQ IDNO:61列出。

接头肽序列包括X₁X₂X₃X₄X₅(SEQ ID NO:61)，其中：

X₁=E或D

X₂=E或D

X₃=K或R

X₄=K或R

X₅=N或Q。

表1

序列标识符的概述（按照防御素命名）

表2

序列标识符的概述（按照SEQ ID NO）

附图简述

图1是防御素HXL001、002、004、005、007、008和009针对禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum，Fgr）的抗真菌活性的图示。

图2是显示空载体转化（pHXLE）的玉米植物相比于用pHXL49转化并表达大于0.9百万分率（ppm）SBI6（HXL013）的植物的平均禾谷镰刀菌病变面积的图示。在接种后10天计算平均面积。当pHXLE植物与表达大于0.9ppm SBI6（HXL013）的植物相比时病变面积存在63%的减少。

详述

本公开内容使得表现出对植物致病性真菌的抗性的基因修饰的植物的产生成为可能。术语“抗性”包括减少的敏感性。一般地说，抗性的水平是相对于没有被这样基因修饰的植物测量的。另外成为可能的是包含单独或与一种或多种其他活性成分一起的防御素的组合物，其他活性成分如透化防御素和/或蛋白酶抑制剂或其前体。

本文教导了使用防御素在植物中诱导对植物致病性真菌的抗性或通过局部施加包含防御素的组合物积极地治疗植物致病性真菌的感染。

据此，在本文成为可能的是用于产生具有对植物致病性真菌的抗性的植物的方法，所述方法包括将编码防御素的核酸分子引入到植物细胞，所述防御素包括选自由SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66组成的列表的成熟结构域氨基酸序列。

适合的防御素的实例包括由选自由SEQ ID NO:1到3组成的列表的成熟结构域氨基酸序列限定的防御素。

适合的防御素的实例包括由选自由SEQ ID NO:4到6、16、63和64组成的列表的成熟结构域氨基酸序列限定的防御素。

适合的防御素的实例包括由选自由SEQ ID NO:7到15和65和66组成的列表的成熟结构域氨基酸序列限定的防御素。

适合的防御素的实例包括由选自由SEQ ID NO:17到20和62组成的列表的成熟结构域氨基酸序列限定的防御素。

适合的防御素的实例包括衍生自SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66中任一个的防御素，如其变体、杂合或嵌合形式。

提到“1到3”表示1、2或3。提到“4到6”表示4、5或6。提到“7到15”表示7、8、9、10、11、12、13、14或15。提到“17到20”表示17、18、19或20。提到“1到20”表示1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。提到“62到66”表示62、63、64、65或66。

真菌包括锈菌（rust）。

防御素的“变体、杂合或嵌合形式”包括如下的防御素：选自SEQ IDNO:1到20和SEQ ID NO:62到66但包括一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加；包括来自另一种防御素的结构域取代现有的结构域；包括来自另一种防御素的环区域取代现有的环区域；包括与另一种防御素的融合。

此外，本公开内容扩展到与SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66中的任何一个或多个具有至少70%的氨基酸序列相似性的防御素。

提到“至少70%”表示在最佳比对或最佳拟合分析之后70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列相似性。

在本文另外成为可能的是编码选自SEQ ID NO:1到20和SEQ IDNO:62到66的防御素的分离的核酸分子，如分别选自SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59和SEQ ID NO:72到76的核苷酸序列或在最佳比对或最佳拟合分析后与SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59和SEQ ID NO:72到76具有至少70%同一性的核苷酸序列或在限定的严格性条件(包括低、中或高严格性条件)下与SEQ ID NO:21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59和SEQ ID NO:72到76的互补序列杂交的核酸。

提到与核苷酸序列同一性相关的“至少70%”包括在最佳比对或最佳拟合分析之后70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。表达“72到76”表示72、73、74、75或76。

如本文使用的术语“相似性”包括在被比较的序列之间在核苷酸或氨基酸水平上的精确的同一性。在核苷酸水平上存在非同一性的情况下，“相似性”包括产生在结构、功能、生化和/或构象水平上仍彼此相关的不同的氨基酸的在序列之间的差异。在氨基酸水平上存在非同一性的情况下，“相似性”包括在结构、功能、生化和/或构象水平上仍彼此相关的氨基酸。在一个实施方案中，核苷酸和序列比较在同一性而非相似性的水平上进行。

用来描述在两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性”、“百分比序列相似性”、“百分比序列同一性”、“基本上相似（substantially similar）”和“基本的同一性”。“参考序列”长度为至少12个但通常15至18个且常常至少25个或以上，如30个单体单元，包括核苷酸和氨基酸残基。因为两个多核苷酸可各自包含（1）在这两个多核苷酸之间相似的序列（即，仅完整多核苷酸序列的一部分）和（2）在这两个多核苷酸之间有差异的序列，在两个（或更多个）多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”比较这两个多核苷酸的序列进行以识别和比较局部区域的序列相似性。“比较窗口”是指与参考序列比较的通常12个连续残基的概念上的区段。比较窗口可包括与参考序列（其不包括添加或缺失）相比约20%或更少的添加或缺失（即空位）以进行这两条序列的最佳比对。通过算法的计算机化实施（在Wisconsin遗传学软件包Release7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA），或者通过目测可进行用于比对比较窗口的序列的最佳比对，并通过所选的各种方法中的任一种产生最佳比对（即，在比较窗口产生最高百分比同源性）。还可以参考例如由Altschul等人(1997)Nucl.Acids.Res.25:3389公开的BLAST家族程序。序列分析的详细讨论可见于Ausubel等人(1994-1998)In:Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons Inc的19.3单元。

本文使用的术语“序列相似性”和“序列同一性”是指序列在核苷酸对核苷酸（nucleotide-by-nucleotide）基础或氨基酸对氨基酸（aminoacid-by-amino acid）基础上在比较窗口上相同或在功能或结构上相似的程度。因此，“序列同一性的百分比”的计算例如通过在比较窗口比较两条最佳比对的序列，确定相同的核酸碱基（例如，A、T、C、G、I）或相同的氨基酸残基（例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met）在两个序列中都存在的位置的数目以得出匹配的位置的数目，用匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目（即窗口大小），并且将结果乘以100以得出序列同一性的百分比。为了本发明的目的，“序列同一性”将被理解为表示通过DNASIS计算机程序（用于windows的版本2.5；可获自HitachiSoftware engineering Co.,Ltd.,South San Francisco,California,USA）使用该软件带有的参考指南中利用的标准缺省值计算的“匹配百分比”。关于序列相似性应用相似的注释。

本文提到的关于杂交条件的低严格性包括并涵盖用于杂交的至少约0到至少约15%v/v甲酰胺和至少约1M到至少约2M的盐，以及用于洗涤条件的至少约1M到至少约2M的盐。一般地说，低严格性是约25-30℃至约42℃。温度可改变且更高的温度用来代替甲酰胺和/或给予可选的严格性条件。可选的严格性条件可在需要时应用，如中度严格性，其包括并涵盖用于杂交的至少约16%v/v到至少约30%v/v甲酰胺和至少约0.5M到至少约0.9M的盐，以及用于洗涤条件的至少约0.5M到至少约0.9M的盐，或高严格性，其包括并涵盖用于杂交的至少约31%v/v到至少约50%v/v甲酰胺和至少约0.01M到至少约0.15M的盐，以及用于洗涤条件的至少约0.01M到至少约0.15M的盐。一般地说，如下进行洗涤T_m=69.3+0.41(G+C)%(Marmur和Doty(1962)J.Mol.Biol.5:109)。然而，随着错配碱基对的数目每增加1%，双链DNA的T_m降低1℃(Bonner和Laskey(1974)Eur.J.Biochem.46:83)。甲酰胺在这些杂交条件中是任选的。据此，特别优选的严格性水平被限定如下：低严格性是在25°-42℃6x SSC缓冲液，0.1%w/v SDS；中度严格性是在20℃到65℃范围内的温度2x SSC缓冲液，0.1%w/v SDS；高严格性是在至少65℃的温度0.1x SSC缓冲液，0.1%w/v SDS。

本公开内容扩展到在治疗植物致病性真菌侵袭的局部组合物中使用的重组形式的防御素分子及其变体、衍生物和同源物。术语“侵袭（infestation）”包括“感染（infection）”。术语“感染”还包括超越某些可接受的阈值的真菌存在水平，不论真菌的存在是否引起任何对植物的损害。

据此，在本文成为可能的是具有抗植物致病性真菌的活性的分离的多肽，该多肽包括如以上对制造抗植物致病性真菌的组合物所限定的选自SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66的氨基酸的序列。多肽的实例包括选自由SEQ ID NO:1到3，SEQ ID NO:4到6、16、63和64，SEQ IDNO:7到15以及SEQ ID NO:65和66以及SEQ ID NO:17到20以及SEQ IDNO:62组成的列表的防御素。

如以上所示，防御素多肽可以多种方式被改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于此类操作的方法一般是本领域已知的。例如，可通过在DNA中的突变制备防御素蛋白的氨基酸序列变体。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488-492；Kunkel等人(1987)Methods in Enzymol.154:367-382；美国专利第4,873,192号；Walker和Gaastra,编(1983)Techniques in Molecular Biology(Macmillan Publishing Company,NewYork)。关于不影响感兴趣的蛋白的生物活性的适当的氨基酸取代的指导可见于Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型。可利用保守取代，如将一个氨基酸更换为另一个具有相似特性的氨基酸。

“类似物”一般是化学类似物。本文考虑的主题防御素的化学类似物包括但不限于对侧链的修饰，在多肽合成期间掺入非天然氨基酸和/或其衍生物，以及交联剂和对蛋白质性分子或其类似物施加构象约束的其他方法的使用。此种类似物能够帮助增强在局部组合物中使用的稳定性。

本发明考虑的侧链修饰的实例包括氨基的修饰，如提供还原性烷基化，通过与醛反应，接着用NaBH₄还原；用甲基乙酰亚胺进行酰胺化（amidination）；用乙酸酐酰化；用氰酸盐使氨基氨甲酰化；用2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）使氨基三硝基苯甲基化；用琥珀酸酐和四氢化邻苯二甲酸酐使氨基酰化；以及用5-磷酸吡哆醛使赖氨酸吡哆醛化（pyridoxylation），接着用NaBH₄还原。

精氨酸残基的胍基可通过用试剂如2,3-丁二酮、苯乙二醛和乙二醛形成杂环缩合产物来修饰。

羧基可通过经O-酰基异脲的形成活化碳二亚胺，接着随后衍生化为例如对应的酰胺来修饰。

氢硫基（sulphydryl）可通过如下方法来修饰：如用碘乙酸或碘乙酰胺羧甲基化；过甲酸氧化成磺基丙氨酸；与其他巯基化合物形成混合的二硫化物；与马来酰亚胺、马来酸酐或其他被取代的马来酰亚胺反应；利用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸、苯基氯化汞、2-氯汞基-4-硝基酚和其他汞制剂形成汞的衍生物；用氰酸盐在碱性pH下氨甲酰化。

色氨酸残基可通过例如用N-溴代琥珀酰亚胺氧化或用2-羟基-5-硝基苄基溴或磺酰卤（sulphenyl halide）使吲哚环烷基化来修饰。另一方面酪氨酸残基可通过四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物来改变。

组氨酸残基的咪唑环的修饰可通过用碘乙酸衍生物烷基化或用焦碳酸二乙酯进行N-乙氧羰基化完成。

在肽合成期间掺入非天然氨基酸和衍生物的实例包括但不限于使用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羟基-5-苯戊酸、6-氨基己酸、叔丁基甘氨酸、正缬氨酸、苯基甘氨酸、鸟氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。

因此，本文描述的防御素和编码防御素的核苷酸序列包括天然存在的序列以及突变体或变体形式，包括化学类似物形式。

防御素多肽的生物活性（即，影响植物对病原体侵袭的防御响应）可通过本领域已知的任何方法测定（参见例如，美国专利第5,614,395号；Thomma等人(1998)Plant Biology95:15107-15111；Liu等人(1994)PlantBiology91:1888-1892；Hu等人(1997)Plant Mol.Biol.34:949-959；Cammue等人(1992)J.Biol.Chem.267:2228-2233；和Thevissen等人(1996)J.Biol.Chem.271:15018-15025）。

本文涵盖的蛋白序列的缺失、插入和取代的作用可通过常规筛选测定来评估。即，活性可通过防御素活性测定来评估。参见，例如，Lancaster等人(1994)J.Biol.Chem.14:1137-1142和Terras等人(1995)Plant Cell7:537-588。另外，在未受感染的植物与受感染的植物之间特定基因的表达的差异可利用基因表达谱（gene expression profiling）确定。

在某些情况下，给定的防御素的抑制作用在与另一种剂如透化防御素和/或蛋白酶抑制剂联合使用时可被增强。Greco等人(1995)Pharmacol Rev47:331-385已根据在不存在另一种组分的情况下测定时两种组分中的一种、两种或两种皆不具有测量活性定义了不同的协同作用种类。本文采用的定义包括所有这些情形，条件是这两种组分一同起作用的联合作用大于单独起作用的单个组分之和。应理解两个或更多个组分的协同联合仅在某些条件下可产生大于加和活性的活性，例如，当组分中的一个或多个以低于对于单个效果为最大的浓度存在时。如该术语在本文所预期的，如果存在一组条件，包括但不限于浓度，其中一同起作用的组分的联合作用大于单独起作用的单个组分之和，则组分的联合被视为协同性的。Richer(1987)Pestic Sci19:309-315描述了建立协同作用证据的数学方法。该方法利用了Richer(1987)上文定义的Limpel公式并且被Harman等人的美国专利第6,512,166号利用来证明在真菌细胞壁降解酶与影响真菌细胞膜的化合物之间在植物病原性真菌的生长上的协同作用。

“植物致病性真菌”或“真菌性病原体”是能够通过抑制植物的生长、通过损害植物的组织、通过削弱植物的免疫系统、减少植物对非生物胁迫的抗性、和/或通过引起植物的早死造成对植物的伤害的真菌。

提到“植物致病性真菌”或“真菌性病原体”包括但不限于：禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、尖孢镰刀菌萎蔫专化型（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum(Fov)）、禾生刺盘孢（Colletotrichum graminicola）、斑点小球腔菌（Leptosphaeria maculans）、甘蓝链格孢（Alternaria brassicicola）、互格链格孢（Alternaria alternata）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、甜菜生尾孢（Cercospora beticola）、玉蜀黍尾孢（Cercospora zeae maydis）、异旋孢腔菌（Cochliobolus heterostrophus）、大斑突脐孢菌（Exserohilum turcicum）、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、尖孢镰刀菌石竹专化型（Fusariumoxysporum f.sp.dianthi）、尖孢镰刀菌番茄专化型（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、小麦冠腐病菌（Fusariumpseudograminearum）、轮孢镰刀菌（Fusarium verticilloides）、禾顶囊壳小麦变种（Gaeumannomyces graminis var.tritici）、芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、玉蜀黍狭壳柱孢（色二孢）（Stenocarpella(Diplodia)maydis）、根串珠霉（Thielaviopsisbasicola）、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）、玉蜀黍黑粉菌（Ustilago zeae）、高粱柄锈菌（Puccinia sorghi）、菜豆壳球孢（Macrophomina phaseolina）、大豆茎褐腐病菌（Phialophora gregata）、菜豆间座壳（Diaporthephaseolorum）、大豆尾孢（Cercospora sojina）、大豆疫霉（Phytophthorasojae）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、豆薯层锈菌（Phakopsorapachyrhizi）、大孢链格孢（Alternaria macrospora）、棉尾孢（Cercosporagossypina）、孔状短小茎点霉（Phoma exigua）、乱子草柄锈菌（Pucciniaschedonnardii）、Puccinia cacabata、Phymatotrichopsis omnivora、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）、芸薹链格孢（Alternaria brassicae）、萝卜链格孢（Alternaria raphani）、禾谷白粉菌（Erysiphe graminis）（禾本科布氏白粉菌（Blumeria graminis））、小麦壳针孢（Septoria tritici）、颖枯壳针孢（Septoria nodorum）、玉米球腔菌（Mycosphaerella zeae）、禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）、小麦散黑粉菌（Ustilago tritici）、禾柄锈菌（Pucciniagraminis）、小麦叶锈菌（Puccinia triticina）、印度腥黑粉菌（Tilletia indica）、小麦网腥黑粉菌（Tilletia caries）和小麦矮腥黑粉菌（Tilletia controversa）

植物致病性真菌的实例包括禾谷镰刀菌(Fgr)、尖孢镰刀菌、轮孢镰刀菌(Fve)和禾生刺盘孢(Cgr)。

提到关于植物的“真菌抗性”其意在表示植物避免作为真菌与植物相互作用的结果的疾病症状。即，防止病原体引起疾病和伴随的疾病症状，或可选地，由病原体引起的疾病症状被最小化或减弱。如以上所示，例如，植物病原体在植物表面、植物根或周围土壤上的水平可通过本文公开的方法被减小到预定的可接受的水平。

“病原体抑制”包括通过与对照相比病原体生长的减少（或活力损失）所测量的杀病原和抑病原活性（pathogenistatic activity）。病原体生长可通过本领域已知的许多不同方法测量。测量丝状真菌的生长的常用方法要求在适合的生长介质中使孢子萌发，培养足以达到可测量的生长的时间，并在指定的培养时间后测量该培养物中增加的光密度。光密度随生长的增加而增加。通常，真菌生长对于致病是必要的。因此，真菌生长的抑制提供了保护免于真菌疾病的适合的指示物，即抑制越大，保护越有效。

在本上下文中的“防止感染”表示通过本文成为可能的方法治疗的植物当与不表达防御素转基因或未用防御素治疗的植物相比时避免病原体感染或疾病症状或以上的全部，或表现出减少的或最小化的或频率更低的病原体感染或疾病症状或以上的全部，病原体感染或疾病症状是植物-病原体相互作用的自然结果。也就是说，病原体被阻止或减少而免于造成疾病和/或伴随的疾病症状。与没有用本文教导的方法治疗的植物相比，感染、侵袭和/或症状被减少至少约10%、20%、30%、40%、50、60%、70%或80%或更大。在可选的方案中，本文描述的系统导致对防御素敏感的植物病原体的孢子形成减少。

所以，防御素表现出抑制真菌病原体的生长、复制、感染和/或保持以及其他抑制活性。这种活性在防御素与另一种剂如透化防御素和/或蛋白酶抑制剂联合使用时可被增强。

植物保护（疾病抵抗或减少）可通过本领域已知的方法评估。参见，Uknes(1993)Molecular Plant Microbe Interactions6:680-685;Gorlach等人(1996)Plant Cell8:629-643；Alexander等人(1993)Proc Natl Acad Sci USA90:7327-7331。本领域技术人员将认识到用于确定由植物病原体造成的植物感染和疾病的方法取决于被测试的病原体和植物。

在一个实施方案中，编码防御素的核酸与启动子可操作地连接并且被引入植物细胞的基因组中。在适当条件下，启动子使得核酸分子能够表达产生mRNA，mRNA随后被翻译成防御素蛋白。使用植物细胞再生植物，该植物被称为“基因修饰的植物”。基因修饰是引入可表达的核酸分子以使能够产生防御素，防御素进而赋予该植物的细胞对真菌性病原体侵袭的抗性。

当这种“基因修饰的植物”的子代包含表达异源防御素并具有减少的对真菌性病原体的敏感性时这种子代在本文被涵盖。

核酸序列在植物细胞中被表达。本领域技术人员知晓可用于表达编码防御素蛋白的核酸的许多表达系统。没有尝试详细描述已知用于在植物细胞中表达蛋白的各种方法。

如本文所用，提到核酸“异源”是起源于与核酸的预定的接受植物不同的植物物种或植株的核酸。例如，可将异源核苷酸序列引入与获得该核苷酸序列的植物细胞不同的植物细胞。

提到“植物细胞”表示包含异源核酸序列的细胞。

防御素序列一般被提供在表达盒或DNA构建体中以用于在感兴趣的植物中表达。表达盒包括与本发明的防御素序列可操作地连接的5’和3’调节序列。提到“可操作地连接”表示在启动子与第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列旨在起动并介导与第二序列对应的DNA序列的转录。一般地说，可操作地连接表示被连接的核酸序列是连续的且在必须连接两个蛋白编码区时，是紧邻且在同一个阅读框中的。表达盒可另外包含至少一个待被共转化到生物体中的另外的基因。可选地，另外的基因可被提供在多个表达盒上。

这种表达盒设有用于将防御素序列插入在调节区的转录调节之下的多个限制酶切位点。表达盒可另外包含选择性标记基因。

表达盒按5’-3’转录方向包括转录和翻译起始区，本文公开的防御素DNA序列，以及在植物中有功能的转录和翻译终止区。转录起始区、启动子对于植物宿主可以是固有的或类似的或外来的或异源的。另外，启动子可以是天然序列，或可选的合成序列。提到“外来的”意指在引入转录起始区的天然植物中没有发现该转录起始区。如本文所用，嵌合基因包括与对于编码序列来说异源的转录起始区可操作地连接的编码序列。

尽管使用异源启动子表达序列可能是有用的，还可以使用固有启动子序列。

终止区可以对于转录起始区是固有的，可以对于可操作地连接的感兴趣的DNA序列是固有的，或者可衍生自另外的来源。方便的终止区可获自根癌农杆菌（A.tumefaciens）的Ti质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.262:141-144；Proudfoot(1991)Cell64:671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.5:141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell2:1261-1272；Munroe等人(1990)Gene91:151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891-7903；和Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.15:9627-9639。

在适当时，基因可以被优化以用于在被转化的植物细胞上提高表达。即，基因可利用植物偏爱的密码子被合成以改善表达。参见，例如，Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92:1-11讨论了宿主偏爱的密码子使用。方法是合成植物偏爱的基因的领域可获得的。参见，例如，美国专利第5,380,831、5,436,391号和Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。

另外的序列修饰已知增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除编码虚假聚腺苷酸化信号（spurious polyadenylation signals）、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复序列的序列、及其他此类可能对基因表达有害的被充分表征的序列。序列的G-C含量可被调整到对于给定细胞宿主平均的水平，如通过参考在宿主细胞中表达的已知基因所计算的。当可能时，对序列进行修饰以避免预测的发夹二级mRNA结构。

表达盒可在表达盒构建体中另外包含5’前导序列。此类前导序列可起增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的且包括：小RNA病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5'非编码区)(Elroy-Stein等人(1989)PNAS USA86:6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导序列，例如，TEV前导序列(烟草蚀斑病毒)[Allison等人(1986)；MDMV前导序列(玉米矮化花叶病毒)；Virology154:9-20]，和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)，[Macejak等人(1991)Nature353:90-94]；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导序列[Jobling等人(1987)Nature325:622-625]；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人(1989)在Molecular Biology of RNA,ed.Cech(Liss,New York),pp.237-256中)；和玉米萎黄病毒前导序列(MCMV)[Lommel等人(1991)Virology81:382-385]。还参见，Della-Cioppa等人(1987)PlantPhysiol.84:965-968。还可以利用其它已知的增强翻译的方法，例如，内含子，等等。

在制备表达盒时，可操作多种DNA片段，以便以正确的方向以及适当时以正确的阅读框提供DNA序列。为此目的，可采用衔接子或接头来连接DNA片段或可利用其他操作来提供便利的限制酶切位点，多余DNA的移除，限制酶切位点的移除等等。为这个目的，可利用体外诱变、引物修复（primer repair,）、限制、退火、再取代（resubstitution），例如转换和颠换。

一般地说，表达盒包括用于选择被转化的细胞的选择性标记基因。利用选择性标记基因选择被转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，如编码的新霉素磷酸转移酶II（NEO）和潮霉素磷酸转移酶（HPT）的基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，除草化合物如草甘膦（glyphosate）、草铵膦（glufosinate ammonium）、溴苯腈（bromoxynil）、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸酯(2,4-D)。大体参见，Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506-511；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:6314-6318。

选择性标记基因的以上列表并非意在限制。可使用任何选择性标记基因。

许多启动子可用来产生表达构建体。可基于期望的结果选择启动子。即，核酸可与组成型、组织偏爱的或其他启动子联合以用于在感兴趣的宿主细胞中表达。此类组成型启动子包括例如在WO99/43838和美国专利第6,072,050号中公开的Rsyn7启动子和其他组成型启动子的核心启动子；核心CaMV35S启动子(Odell等人(1985)Nature313:810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等人(1990)PlantCell2:163-171)；泛素(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.12:619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18:675-689)；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.3:2723-2730)；ALS启动子(美国专利第5,659,026号)，等等。其他组成型启动子包括例如在美国专利第5,608,149;5,608,144；5,604,121；5,569,59；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611号中公开的启动子。这些参考文献通过引用并入本文。

编码被选自SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66的序列涵盖的防御素的基因构建体在本文也能够用于基因修饰植物细胞来产生防御素。在一个实施方案中，基因构建体是多基因表达载体（MGEV），如美国专利申请第11/753,072号所述并通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，MGEV包括含2到8个结构域区段的多核苷酸，每个结构域编码功能蛋白，其中至少一种蛋白是选自SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66的防御素，每个结构域通过编码接头肽的接头区段在线性序列中与下一个结构域连接，结构域和接头区段在同一个阅读框中。在一个实施方案中，其他结构域中的至少一个编码蛋白酶抑制剂或其前体形式。在一个实施方案中，接头序列以SEQ ID NO:61列出。

接头肽序列包括X₁X₂X₃X₄X₅(SEQ ID NO:61)，其中：

X₁=E或D

X₂=E或D

X₃=K或R

X₄=K或R

X₅=N或Q。

转化/转染的方法对于本公开内容不是关键性的；各种转化或转染方法是目前可用的。当更新的方法可用于转化作物或其他宿主细胞时，它们可被直接应用。据此，开发多种多样的方法将DNA序列插入宿主细胞的基因组中来获得在生物体中实现表型改变的序列的转录和/或翻译。因此，可利用提供有效转化/转染的任何方法。

转化方案以及用于将核苷酸序列引入植物的方案可根据被转化所靶向的植物或植物细胞的类型即单子叶植物或双子叶植物而改变。将核苷酸序列引入植物细胞并随后插入到植物基因组中的适合的方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques4:320-334)，电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606,农杆菌介导的转化(Townsend等人,美国专利第5,563,055号；Zhao等人,美国专利第5,981,840号)，直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.3:2717-2722)，和弹道粒子加速（ballistic particle acceleration）(参见，例如，Sanford等人,美国专利第4,945,050号；Tomes等人,美国专利第5,879,918号；Tomes等人,美国专利第5,886,244号；Bidney等人,美国专利第5,932,782号；McCabe等人(1988)Biotechnology6:923-926)；和Lec1转化(WO00/28058)。还参见Weising等人(1988)Ann.Rev.Genet.22:421-477；Sanford等人(1987)ParticulateScience和Technology5:27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；McCabe等人(1988)上文(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P:175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.96:319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology8:736-740(水稻)；Klein等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人(1988)Biotechnology6:559-563(玉蜀黍)；Tomes,美国专利第5,240,855号；Buising等人,美国专利第5,322,783和5,324,646号；Tomes等人(1995)"Direct DNA Transferinto Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment,"于Plant Cell,Tissue,and Organ Culture:Fundamental Methods,编辑Gamborg(Springer-Verlag,Berlin)(玉蜀黍)；Klein等人(1989)Plant Physiol.91:440-444(玉蜀黍)；Fromm等人(1990)Biotechnology8:833-839(玉蜀黍)；Hooykaas-VanSlogteren等人(1984)Nature(London)311:763-764；Bowen等人,美国专利第5,736,369号(谷类)；Bytebier等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:5345-5349(百合)；De Wet等人(1985)于The Experimental Manipulationof Ovule Tissues,编辑Chapman等人(Longman,N.Y.)，pp.197-209(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports9:415-418和Kaeppler等人(1992)Theor.Appl.Genet.84:560-566(触须介导的转化（whisker-mediatedtransformation）)；D'Halluin等人(1992)Plant Cell4:1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports12:250-255和Christou和Ford(1995)Annals of Botany75:407-413(水稻)；Ishida等人(1996)Nature Biotechnology14:745-750(玉蜀黍，经农杆菌)。这些参考文献通过引用并入本文，包括USSN2010-0095408。

已被转化的细胞可根据常规方式生长在植物中。参见，例如McCormick等人.(1986)Plant Cell Reports5:81-84。然后这些植物可以生长，且用同一转化植株或不同植株授粉，且所得杂合体具有鉴定的期望表型特征的组成型表达。可栽培两代或更多代以确保期望表型特征的表达被稳定保持和遗传，然后收获种子以确保实现期望表型特征的表达。

本公开内容对任何植物物种的转化是指导性的，植物物种包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物的实例包括但不限于：玉米(玉蜀黍（Zea mays）)，大豆(Glycine max)，小麦(普通小麦（Triticum aestivum）)，棉花(海岛棉（Gossypium barbadense），陆地棉（Gossypium hirsutum）)，芸薹，芸薹属的种（Brassica sp.）(例如欧洲油菜（B.napus），芜菁（B.rapa），芥菜（B.juncea）)，尤其是那些可用作种子油的来源的芸薹属的种，苜蓿(紫苜蓿（Medicago sativa）)，水稻(稻（Oryza sativa）)，黑麦(Secale cereale)，高粱(Sorghum bicolor,Sorghum vulgare)，谷子(例如御谷（pearl millet）(Pennisetum glaucum)，稷（proso millet）(Panicum miliaceum)，粱（foxtailmillet）(Setaria italica)，穇子（finger millet）(Eleusine coracana))，向日葵(向日葵丈菊（Helianthus annuus）)，红花(Carthamus tinctorius)，烟草(Nicotiana tabacum)，马铃薯(阳芋（Solanum tuberosum）)，花生(落花生（Arachis hypogaea）)，甘薯(番薯（Ipomoea batatas）)，木薯（cassava）(Manihot esculenta)，咖啡(Coffea spp.)，椰子(Cocos nucifera)，菠萝(凤梨（Ananas comosus）)，酸橙树（citrus trees）(柑橘Citrus spp.)，可可(Theobromacacao)，茶(Camellia sinensis)，香蕉(芭蕉Musa spp.)，鳄梨(Perseaamericana)，无花果(Ficus casica)，番石榴(Psidium guajava)，芒果(杧果（Mangifera indica）)，橄榄(木犀榄（Olea europaea）)，番木瓜(Caricapapaya)，腰果(Anacardium occidentale)，澳洲坚果（macadamia）(全缘叶澳洲坚果（Macadamia integrifolia）)，扁桃(甜扁桃（Prunus amygdalus）)，甜菜(Beta vulgaris)，甘蔗(甘蔗Saccharum spp.)，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物，和针叶树。

蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)，莴苣(例如，莴苣（Lactucasativa）)，菜豆(Phaseolus vulgaris)，利马豆(Phaseolus limensis)，豌豆(山黧豆Lathyrus spp.，豌豆Pisum spp.)，和黄瓜属（Cucumis）成员如黄瓜(C.sativus)，硬皮甜瓜(C.cantalupensis)，和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(杜鹃Rhododendron spp.)，八仙花(绣球（Hydrangea macrophylla）)，木槿(朱槿（Hibiscus rosasanensis）)，玫瑰(蔷薇Rosa spp.)，郁金香(郁金香Tulipa spp.)，水仙(水仙Narcissus spp.)，牵牛花(矮牵牛（Petunia hybrida）)，康乃馨(香石竹（Dianthus caryophyllus）)，一品红(Euphorbia pulcherrima)，和菊花。可用于实践本发明的针叶树包括例如，松树如火炬松(Pinus taeda)，湿地松(Pinus elliotii)，西黄松(Pinus ponderosa)，小干松(Pinus contorta)，和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西部铁杉(Tsugacanadensis)；西加云杉(Picea glauca)；红木(北美红杉（Sequoiasempervirens）)；冷杉（true firs）如银杉(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abiesbalsamea)；和柏如美国西部侧柏（Western red cedar）(北美乔柏（Thujaplicata）)和阿拉斯加花柏(Chamaecyparis nootkatensis)。方便地，植物是农作物(例如，玉米、苜蓿、向日葵，芸薹，大豆，棉花，红花，花生，高粱，小麦、谷子、烟草等等)。

所以，提到植物包括玉米（玉蜀黍）、大豆、小麦、棉花、芸薹、苜蓿、香蕉、大麦、蓖麻、菊花、三叶草、可可、咖啡、棉籽、海甘蓝、蔓越莓、黄瓜、石斛、薯蓣、桉树、羊茅、亚麻、剑兰、百合、亚麻子、谷子、甜瓜、燕麦、油棕、油菜、木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆、马铃薯、油菜籽、水稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、番茄、草坪草和蔬菜作物如莴苣、芹菜、青花菜、花椰菜、葫芦、葱属植物（包括大蒜、大葱、韭葱和细香葱）；水果树和坚果树，如苹果树、梨树、桃树、桔子树、葡萄柚树、柠檬树、酸橙树、扁桃树、美洲山核桃树、胡桃树、榛子树；藤本植物，如葡萄、猕猴桃、啤酒花；灌木果树和树莓，如覆盆子、黑莓、醋栗；林木，如白蜡木、松树、冷杉、枫树、橡树、栗树和白杨。

本文考虑使用的防御素可按“HXL”编号或序列标识符称谓。可参考表1和表2的示例性防御素。表1按数字命名的次序列出防御素且表2按序列标识符编号的次序列出防御素。

在本文成为可能的是表现出对植物病原体的抗性的基因修饰的植物，其中该基因修饰的植物或其子代由于基因修饰的结果产生选自由SEQ IDNO:1到20和SEQ ID NO:62到66组成的列表的防御素。

本公开内容教导了选自SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66的防御素在制造表现出对植物致病性真菌的抗性的植物中的用途。

一方面，本公开内容教导了用于保护植物免于真菌性病原体相关的疾病的方法，且防治或治疗导致对杀真菌剂治疗植物或植物部分的需要降低，从而降低材料、劳动成本和环境污染，或延长这些植物的产品（例如，果实，种子等等）的货架期。该方法要求基因修饰植物以表达如以上限定的由SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66所限定的防御素或局部应用这些防御素。术语“植物”包括完整的植物及其部分，包括但不限于，发芽的营养器官/结构（shoot vegetative organs/structures）（例如，叶、茎和块茎），根，花和花似器官/结构（例如，苞、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠），种子（包括胚、胚乳和种皮）以及果实（成熟子房），植物组织（例如，维管组织、基本组织（ground tissue）等等）和细胞（例如，保卫细胞、卵细胞等等），及植物的子代。

如以上所示，防御素可被局部应用。使用农艺学可接受的载体配制本文公开的化合物来实践本方法适于系统和表面施用的用量在本文是可能的且在本领域技术人员的一般技术之内。利用正确选择的载体和适合的制造实践，组合物如配制为溶液的组合物可施用至植物表面，包括地上部分和/或根，或作为包衣施加至种子表面。

适合用于本文公开的系统中的农艺学有用的组合物包括其中活性成分被以达到预期目的的有效量包含的组合物。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力之内，尤其是根据本文提供的公开内容。

除了活性成分，用于抗真菌方法的这些组合物可包含帮助将活性化合物加工成可用于田地、温室或实验室设施中的制剂的适合的农艺学可接受的载体，包括赋形剂和助剂。

抗真菌制剂包括水溶形式的活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的悬浮液可被制备为适当的油性悬浮液。适合的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水注射悬浮液可包含增加该悬浮液的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可以包含适合的稳定剂或提高化合物的溶解性以容许制备高浓缩溶液的剂。另外的组分可包括增粘剂（viscosifier）、凝胶、湿润剂、紫外防护剂以及其他。

用于表面应用的制剂可通过以下方式获得：将活性化合物与固体赋形剂组合，任选地研磨所得混合物，并在添加适合的助剂（如果必要）之后加工混合物的颗粒，以获得直接应用或在喷到待保护的植物上之前溶解的粉末。适合的赋形剂特别是填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纤维素或淀粉制剂，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠，和/或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。如果必要，可添加崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，藻酸或其盐，如藻酸钠。

实施例

现在通过以下非限制性实施例描述本文考虑的实施方案。

方法

纯化来自巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）的防御素

PichiaPink(商标)表达系统是熟知的且是从Invitrogen(Carlsbad,CA；参见供货商的PichiaPink(商标)表达手册，该手册公开了pPINK表达载体的序列)可商购获得的。

使用单个pPINK-防御素巴斯德毕赤酵母PichiaPink(商标)菌株1菌落接种在250mL烧瓶中的25mL的BMG培养基（描述于Invitrogen的毕赤酵母表达手册）并将其在30℃振荡的培养箱（140rpm）中培养经2-3天。用培养物接种在1L三角烧瓶中的200mL的BMG中，将三角烧瓶放置在30℃振荡的培养箱（140rpm）中过夜。通过离心（2,500x g,10分钟,4℃）收集细胞并重悬在5L三角烧瓶中的1L的BMG中并放置在28℃振荡的培养箱中培养3天。在t=24小时和48小时时诱导培养物。通过离心(6000rpm,20分钟)将表达培养基与细胞分离。将培养基调整到pH3.0然后将其应用至用100mM磷酸钾缓冲液，pH6.0预平衡的SP琼脂糖柱（1cm x1cm,Amersham Biosciences）。然后用100mL的100mM磷酸钾缓冲液，pH6.0洗涤柱，并将结合的蛋白在包含500mMNaCl的10x10mL的100mM磷酸钾缓冲液中洗脱。使用离心柱将洗脱的蛋白浓缩减至1mL并用无菌milli Q超纯水洗涤5x。使用二喹啉甲酸（BCA）蛋白测定（Pierce Chemical Co.）以牛血清白蛋白（BSA）作为蛋白标准确定毕赤酵母表达的防御素的蛋白浓度。

转基因植物细胞和/或组织的产生

用于在植物细胞和/或组织中引入和选择异源DNA的存在的技术和剂是熟知的。容许在植物细胞中选择异源DNA的基因标记（genetic marker）是熟知的，例如携带对抗生素如卡那霉素、潮霉素、庆大霉素或博莱霉素的抗性的基因。标记允许对生长在包含适当抗生素的培养基中的被成功转化的植物细胞的选择，因为这些细胞将携带相应的抗性基因。在大多数情况下，被插入到植物细胞中的异源DNA包含编码选择性标记如抗生素抗性标记的基因，但这不是强制性的。示例性的药物抗性标记是由Rogers等人.(1988)Methods for Plant Molecular Biology描述的其表达导致卡那霉素抗性的基因，即，该嵌合基因包含胭脂碱合成酶启动子，Tn5新霉素磷酸转移酶II和胭脂碱合成酶3’非翻译区。

基因工程化植物细胞和/或组织的技术，包含与异源编码序列和转录终止序列融合的诱导型启动子或嵌合启动子的表达盒通过农杆菌介导的转化、电穿孔、显微注射、粒子轰击或其他本领域已知的技术引入植物细胞或组织。表达盒有利地还包含容许对植物细胞中的异源DNA的选择的标记，例如携带对抗生素如卡那霉素、潮霉素、庆大霉素或博来霉素的抗性的基因。

携带植物可表达的基因或其他感兴趣的DNA的DNA构建体可通过任何适合的方法插入植物的基因组中。此类方法可包括例如，使用脂质体、电穿孔、扩散、粒子轰击、显微注射、基因枪、提高游离DNA摄取的化学物质例如磷酸钙共沉淀、病毒载体和其他本领域中实践的技术。适合的植物转化载体包括从根癌农杆菌的Ti质粒衍生的载体，如由Herrera-Estrella等人.(1983)EMBO J2:987-995;Bevan等人.(1983)NucleicAcids Res11(2):369-385;Klee等人.(1985)Bio/Technology3:637-642和EPO公布120,516(Schilperoort等人,欧洲专利公布120,516)公开的载体。除了从农杆菌的Ti质粒或根诱导型（Ri）质粒的植物转化载体之外，可使用可选方法来将本发明的DNA构建体插入到植物细胞中。

如本领域熟知的，其中感兴趣的DNA被可操作地连接的载体的选择直接取决于期望的功能特性，例如，复制、蛋白表达和待转化的宿主细胞，这些是构建重组DNA分子的领域固有的限制。载体期望地包括原核复制子，即在被引入原核宿主细胞如细菌宿主细胞时具有指导重组DNA分子在染色体外的自发复制和保持的能力的DNA序列。此类复制子是本领域熟知的。此外，包括原核复制子的优选实施方案还包括当被引入到这些转化的细胞中时其表达赋予对细菌宿主细胞的选择性优势如药物抗性的基因。典型的细菌药物抗性基因是赋予对氨苄西林或四环素以及其他选择剂的抗性的基因。新霉素磷酸转移酶基因具有在真核细胞以及原核细胞中表达的优势。

包括原核复制子的这些载体典型地还包括用于插入本发明的重组DNA分子的便利的限制酶切位点。典型的此类载体质粒是从BioRadLaboratories(Richmond,CA)可获得的pUC8、pUC9、pBR322、和pBR329和从Pharmacia(Piscataway,NJ)可获得的pPL、pK和K223，可从Stratagene(La Jolla,CA)可获得的pBLUESCRIPT tm和pBS。本发明的载体还可以是本领域已知的λ噬菌体载体或λZAP载体(从Stratagene La Jolla,CA可获得)。另一种载体包括例如pCMU(Nilsson等人.(1989)Cell58:707)。其他适当的载体还可以根据已知方法合成，例如，用在本文各种应用中的载体pCMU/Kb和pCMUII是pCMUIV的修饰(Nilsson等人(1989)上文)。

能够在植物细胞中表达重组核酸序列和能够指导在宿主植物细胞内的稳定整合的典型表达载体包括衍生自根癌农杆菌的肿瘤诱导型（Ti）质粒的载体。

可通过本领域已知的任何标准手段产生转基因植物，包括但不限于根癌农杆菌介导的DNA转移，优选用卸甲的T-DNA载体，电穿孔，直接DNA转移和粒子轰击。用于将DNA引入单子叶植物及双子叶植物中的技术是本领域熟知的，用于培养此类植物组织和再生这些组织的技术也是本领域熟知的。

实施例1

HXL防御素的抗真菌活性

基本上按照Broekaert等人,(1990)FEMS Microbiol Lett69:55-59所描述的，测量每种HXL防御素对禾谷镰刀菌（玉蜀黍赤霉菌（Giberella zea））（Fgr,Pioneer Hybrid International(PHI)分离株73B1A）、尖孢镰刀菌萎蔫专化型(Fov,自棉花分离的澳洲分离株VCG01111；来自Farming SystemsInstitute,DPI,Queensland,Australia)或禾生刺盘孢(Cgr,PHI分离株Carroll-1A-9)的生长的抑制作用。

从生长在合成的养分贫乏的琼脂（Fgr）、V8琼脂(Cgr)或1/2强度马铃薯葡萄糖肉汤琼脂(Fov)的孢子形成真菌分离孢子。通过添加1/2强度马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）将孢子从平板移出。使用血球计（haemocytometer）测量孢子浓度。

在无菌水中制备每种防御素的10x储液。使用Tecan液体操作机器人系列稀释每种防御素并将一式三份的20μl每种浓度转移到96孔微量滴定板中。将孢子添加到每个板，在1/2强度PDB中80ul5x10⁴个孢子/ml。在25℃培养板。通过使用微量滴定板阅读仪(SpectraMax Pro M2;MolecularDevices)测量595nm处的光密度(A595)测定真菌生长。容许生长进行直到在任何测试防御素都不存在的情况下真菌的光密度(OD)达到0.2的OD。每个测试一式四份进行。

图1和表3中提供了植物真菌抑制的结果。

表3

实施例2

表达SBI6 (HXL013)的转基因玉米植物的产生

通过农杆菌介导的转化或粒子轰击使用标准方案产生转基因玉米植物，标准方案如在美国专利第5,981,840号；美国专利第7,528,293号；美国专利第7,589,176号美国专利第7,785,828号；Frame等人.(2002)PlantPhysiology129:13-22中描述的那些。将包含GAT作为选择性标记、用于组成型表达的泛素启动子和在组成型泛素启动子的控制下的编码SBI6的密码子优化的序列的二元载体(pHXL49)通过电穿孔转移到根癌农杆菌菌株中。不成熟的玉米胚经浸入在农杆菌悬液中被感染，接着在固体培养基上共培养一段时间。然后使胚任选地“休息”，在此期间胚被培养在存在抑制农杆菌生长的至少一种抗生素的存在下。接下来通过在包含抑制非转化细胞生长的草甘膦的固体培养基上培养受感染的胚获得被转化的愈伤组织。然后被转化的愈伤组织能够使用标准方法被再生成植物。

通过ELISA筛选确定SBI6表达水平。使用以下描述的生物测定将以>0.9ppm表达SBI6的植物评定为对禾谷镰刀菌的抗性增加。

禾谷镰刀菌接种物的制备：

禾谷镰刀菌分离株(73B1A)自玉米（Zea maize）分离且由PioneerHi-Bred International,Inc.,Johnston,Iowa,USA提供。从生长在SNP琼脂大约2-3周的孢子形成培养物分离孢子。通过在无菌水中刮板的表面收集禾谷镰刀菌的孢子。使用血球计测量孢子浓度。

禾谷镰刀菌接种

在玉米叶鞘的对侧做出两个2.0mm长的伤口。用在1X10⁶个禾谷镰刀菌孢子/mL中浸过的6mm纸盘（paper discs）覆盖伤口。然后用GladPress'n'Seal密封伤口三天。通过在接种后10天的数码照像测量感染面积。

结果

空载体（pHXLE）转化的玉米的禾谷镰刀菌的平均病变面积与用pHXL49转化并表达大于0.9百万分率（ppm）SBI6的植物进行比较。接种后10天计算平均面积。以>0.9ppm表达SBI6的植物当与用空载体转化的植物比较时显示病变面积降低63%（图2）。

本领域技术人员将理解本文描述的公开内容可容许除具体描述的变化形式和修改之外的变化形式和修改。应理解本公开内容考虑所有此类变化形式和修改。本公开内容还使得在本说明书中个别或共同提到或指出的所有的步骤、特征、组合物和化合物以及步骤或特征或组合物或化合物中的任何两个或更多个的任何和所有组合成为可能。

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Claims

1.一种用于产生具有对植物致病性真菌的抗性的植物的方法，所述方法包括将编码防御素的核酸分子引入到植物细胞，所述防御素包括选自由SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66组成的列表的成熟结构域氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述防御素选自由SEQ ID NO:1到3组成的列表。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述防御素选自由SEQ ID NO:4到SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:63和64组成的列表。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述防御素选自由SEQ ID NO:7到SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:65和66组成的列表。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述防御素选自由SEQ ID NO:17到20和SEQ ID NO:62组成的列表。

6.如权利要求2所述的方法，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25。

7.如权利要求3所述的方法，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:73和SEQ IDNO:74。

8.如权利要求4所述的方法，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76。

9.如权利要求5所述的方法，其中所述核苷酸序列是SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:72。

10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，还包括将编码透化防御素和/或蛋白酶抑制剂或其前体形式的核酸分子引入到植物细胞。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述真菌选自包括以下的列表：禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）、尖孢镰刀菌萎蔫专化型（Fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum(Fov)）、禾生刺盘孢（Colletotrichumgraminicola）、斑点小球腔菌（Leptosphaeria maculans）、甘蓝链格孢（Alternaria brassicicola）、互格链格孢（Alternaria alternata）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、甜菜生尾孢（Cercospora beticola）、玉蜀黍尾孢（Cercospora zeae maydis）、异旋孢腔菌（Cochliobolus heterostrophus）、大斑突脐孢菌（Exserohilum turcicum）、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、尖孢镰刀菌石竹专化型（Fusarium oxysporum f.sp.dianthi）、尖孢镰刀菌番茄专化型（Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici）、茄病镰刀菌（Fusariumsolani）、小麦冠腐病菌（Fusarium pseudograminearum）、轮孢镰刀菌（Fusarium verticilloides）、禾顶囊壳小麦变种（Gaeumannomyces graminisvar.tritici）、芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae）、核盘菌（Sclerotiniasclerotiorum）、玉蜀黍狭壳柱孢（色二孢）（Stenocarpella(Diplodia)maydis）、根串珠霉（Thielaviopsis basicola）、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）、玉蜀黍黑粉菌（Ustilago zeae）、高粱柄锈菌（Puccinia sorghi）、菜豆壳球孢（Macrophomina phaseolina）、大豆茎褐腐病菌（Phialophora gregata）、菜豆间座壳（Diaporthe phaseolorum）、大豆尾孢（Cercospora sojina）、大豆疫霉（Phytophthora sojae）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、豆薯层锈菌（Phakopsora pachyrhizi）、大孢链格孢（Alternaria macrospora）、棉尾孢（Cercospora gossypina）、孔状短小茎点霉（Phoma exigua）、乱子草柄锈菌（Puccinia schedonnardii）、Puccinia cacabata、Phymatotrichopsisomnivora、燕麦镰刀菌（Fusarium avenaceum）、芸薹链格孢（Alternariabrassicae）、萝卜链格孢（Alternaria raphani）、禾谷白粉菌（Erysiphe graminis（禾本科布氏白粉菌（Blumeria graminis））、小麦壳针孢（Septoria tritici）、颖枯壳针孢（Septoria nodorum）、玉米球腔菌（Mycosphaerella zeae）、禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）、小麦散黑粉菌（Ustilago tritici）、禾柄锈菌（Puccinia graminis）、小麦叶锈菌（Puccinia triticina）、印度腥黑粉菌（Tilletia indica）、小麦网腥黑粉菌（Tilletia caries）和小麦矮腥黑粉菌（Tilletia controversa）。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述真菌是锈菌。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述植物来自包括以下的列表:玉米（玉蜀黍）、大豆、小麦、棉花、芸薹、苜蓿、香蕉、大麦、蓖麻、菊花、三叶草、可可、咖啡、棉籽、海甘蓝、蔓越莓、黄瓜、石斛、薯蓣、桉树、羊茅、亚麻、剑兰、百合、亚麻子、谷子、甜瓜、燕麦、油棕、油菜、木瓜、花生、菠萝、观赏植物、菜豆、马铃薯、油菜籽、水稻、黑麦、黑麦草、红花、芝麻、高粱、甜菜、甘蔗、向日葵、草莓、烟草、番茄、草坪草和蔬菜作物如莴苣、芹菜、青花菜、花椰菜、葫芦、葱属植物（包括大蒜、大葱、韭葱和细香葱）；水果树和坚果树，如苹果树、梨树、桃树、桔子树、葡萄柚树、柠檬树、酸橙树、扁桃树、美洲山核桃树、胡桃树、榛子树；藤本植物，如葡萄、猕猴桃、啤酒花；灌木果树和树莓，如覆盆子、黑莓、醋栗；林木，如白蜡木、松树、冷杉、枫树、橡树、栗树和白杨。

14.如权利要求1所述的方法，其中所述植物选自包括以下的列表：农作物、饲料作物、油料作物、谷物作物、水果作物、蔬菜作物、纤维作物、香料作物、坚果作物、草地作物、糖作物、饮料作物和林木作物。

15.如权利要求1所述的方法，其中所述植物是玉米、大豆、小麦、棉花或芸薹。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述植物是玉米。

17.通过权利要求1至16中任一项的方法制备的基因修饰的植物或所述植物的子代，其中由于基因修饰的结果所述植物或其子代对植物致病性真菌具有抗性。

18.来自权利要求17所述的植物的分离的种子、果实或再生材料。

19.一种表现出对植物致病性真菌的抗性的基因修饰的植物，其中所述基因修饰的植物或其子代由于基因修饰的结果产生选自由SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66组成的列表的防御素。

20.如权利要求19所述的基因修饰的植物，其中所述防御素选自由SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:3组成的列表。

21.如权利要求19所述的基因修饰的植物，其中所述防御素选自由SEQ ID NO:4到SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:63和64组成的列表。

22.如权利要求19所述的基因修饰的植物，其中所述防御素选自由SEQ ID NO:7到SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:65和66组成的列表。

23.如权利要求19所述的基因修饰的植物，其中所述防御素选自由SEQ ID NO:17到20和SEQ ID NO:62组成的列表。

24.如权利要求20所述的基因修饰的植物，包括表达选自由SEQIDNO:21、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:25组成的列表的核苷酸序列的细胞。

25.如权利要求21所述的基因修饰的植物，其中所述核苷酸序列选自由SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:51、SEQID NO:73和SEQ ID NO:74组成的列表。

26.如权利要求22所述的基因修饰的植物，其中所述核苷酸序列选自由SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:75和SEQ ID NO:76组成的列表。

27.如权利要求23所述的基因修饰的植物，其中所述核苷酸序列选自由SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59和SEQID NO:72组成的列表。

28.来自权利要求17至27中任一项所述的基因修饰的植物或其子代的分离的细胞、种子、果实或再生材料。

29.选自由SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66组成的列表的防御素在制造抗植物致病性真菌的植物或抗植物致病性真菌的组合物中的用途。

30.一种人工创建的以多基因表达载体（MGEV）形式的基因构建体，包括具有2到8个结构域区段的多核苷酸，其中每个结构域编码功能蛋白，其中至少一个结构域编码选自SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66的防御素，每个结构域通过接头肽在线性序列中与下一个结构域连接，所述结构域和接头区段全部在同一个阅读框中。

31.如权利要求30所述的基因构建体，其中其他结构域中的至少一个编码蛋白酶抑制剂或其前体形式。

32.如权利要求30或31所述的基因构建体，包括氨基酸序列X₁X₂X₃X₄X₅(SEQ ID NO:61)；其中：

X₁是E或D；

X₂是E或D；

X₃是K或R；

X₄是K或R；和

X₅是N或Q。

33.一种具有抗病原性真菌活性的农学组合物，所述农学组合物包括选自SEQ ID NO:1到20和SEQ ID NO:62到66的防御素。