CN101469334A - 人β-防御素-2植物高效表达载体 - Google Patents

Abstract

本发明为人β－防御素－2基因重组植物高效表达载体，涉及基因重组领域，蔡绍辉等在《四川大学学报》上发表重组hBD2植物表达载体含有报告基因，影响hBD2的一级结构和正确空间结构的形成。为此本发明提供了一种人β－防御素－2基因重组植物高效表达质粒载体，含有启动子、人β－防御素－2基因、终止子和筛选标记基因，在pCAMBIA1300植物表达载体的基础上，用基因重组的方法连接Nos终止子和一个CaMV 35S启动子，并将人β－防御素－2基因插入CaMV 35S启动子和Nos终止子之间，得到重组人β－防御素－2植物表达载体rp1300－hBD2，该基因表达载体含有两个CaMV 35S启动子，两个筛选基因：卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因。具有空间结构与天然hBD－2完全一致、抗菌活性高的有益效果。

Description

人β-防御素-2植物高效表达载体

技术领域

本发明涉及重组基因工程领域，尤其涉及人β-防御素基因重组植物高效表达载体。

背景技术

防御素最重要的生物学活性就是其广谱高效的抗菌和抗病毒活性，并且未发现有耐药菌株产生，从进化角度看，动物应用这些分子来对抗微生物感染历经千百万年仍显出强大的效力，是一类天然有效的抗感染物质。因此，人们把防御素看作了一个对付细菌耐药的可能的突破口对其投入了较大的关注，其中最引人注目的就是β-防御素。

人β-防御素-2(Human Beta-Defensin-2，hBD-2)在机体粘膜防御中具有重要的作用，由于来自人体本身，作为药用不易引起过敏反应，因此hBD-2作为新型抗感染药物资源的潜在开发价值日益受到重视。但因其在机体细胞内表达甚微，难以通过直接分离纯化大量获得；人工合成不仅价昂贵且空间结构难以与天然hBD-2完全一致；而且在原核细胞中表达往往会引起宿主菌“自杀”性死亡，一般原核生物不适为其生物反应器等原因导致hBD-2规模化生产的研究进程缓慢。

转基因植物生物发生器是利用分子生物学技术把重组的目的基因导入植物，并使植物能够大量表达重组蛋白的一类生物技术。越来越多证据表明：应用转基因植物或农作物作为生物反应器规模化生产高附加值的药用重组蛋白质，其技术可行、成本低廉、效益显著，具有广阔的应用开发前景。本研究拟在前期工作的基础上，应用植物转基因技术，构建高效表达hBD-2的植物生物反应器，以解决在体外规模化生产具有生物活性的hBD-2的新途径。

目前蔡绍辉等2003年在《四川大学学报》34(3)：385—389上发表的重组人β-防御素—2的植物表达载体的建立是在pCAMBIA1304植物表达载体的基础上构建，其构建的表达载体中目的基因连接了六个组氨酸(His)作为报告基因，便于表达产物的检测和分离，但该报告基因影响了表达产物人β防御素-2的一级结构和正确空间结构的形成，而人β防御素-2必须形成正确的空间结构才具有抗菌生物功能。

pCAMBIA1300是带有的花椰菜花病毒(CaMV)35S RNA启动子的植物表达载体，可用于农杆菌介导的转化或直接转化，载体中T-DNA左右边界内带有多克隆位点和筛选标记Hyg基因，Hyg基因是植物转化试验中广泛使用的标记基因，编码潮霉素磷酸转移酶，适于植物转化后用化学试剂潮霉素进行筛选转化体、多克隆位点处可插入外源基因，在农杆菌介导的转化中，植物表达载体T-DNA左右边界内的序列，包括外源基因和筛选标记基因部分，发生转移并进入植物细胞内，用筛选试剂潮霉素可有效筛选出整合有外源基因的转化体。

发明内容

本发明的目的之一是将人β—防御素—2构建成植物表达载体质粒，再将该载体质粒导入植物中，旨在植物体中生产空间结构与天然hBD—2完全一致、抗菌活性高的防御素，然后从转基因植物中提取hBD—2，以降低hBD—2的生产成本。

本发明的目的之二是利用人hBD—2基因构建植物表达载体质粒，再将该载体质粒通过转化技术导入植物中，使植物具有抗细菌、病毒及(或)真菌的特点，从而培育出作物、林木、果蔬以及花卉等植物抗病新品种，为农林果木业生产以及减少农药污染作出贡献。

本发明的技术方案为：本发明是人β—防御素-2植物高效表达质粒载体，含有启动子、人β—防御素-2基因、终止子和两个筛选基因：卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，在pCAMBIA1300植物表达载体的基础上，用基因重组的方法连接Nos终止子和一个CaMV35S启动子，并将人β—防御素-2基因插入CaMV 35S启动子和Nos终止子之间，得到重组人β—防御素-2植物表达载体rp1300-hBD2，该基因表达载体含有两个CaMV35S启动子。

rp1300-hBD2经序列测定连接是正确的。为该重组基因能有效地转化根癌农杆菌，进而被导入植物细胞并高效表达奠定了基础。

本发明的重组人β-防御素-2植物表达载体rp1300-hBD2含有两个CaMV 35S启动子，能高效表达目的基因，即高效地在各种类型的植物细胞中启动基因的表达；载体中含有卡那霉素抗性基因，可对转化的农杆菌阳性克隆进行筛选；含有潮霉素抗性基因，适于植物转化后用化学试剂潮霉素进行阳性转化体筛选。由于不含报告基因可表达具有正确空间结构和生物活性的人β防御素-2。

重组人β防御素-2植物表达载体rp1300-hBD2的具体结构见图1。

本发明将重组人β防御素-2植物表达载体rp1300-hBD2转入烟草后，经PCR、RT-PCR以及Northern-Blot检测证实，人β防御素-2基因已进入烟草，并在mRNA水平正确表达；经Western-Blot检测证实，转化烟草能够正确表达人β防御素-2蛋白；转化烟草叶的上清液对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌都具有较强的抗菌活性，说明转化烟草不仅能表达人β防御素-2而且还具有较强抗菌生物活性，完全可用于具有生物活性的人β防御素-2的规模化生产和纯化，具有广阔的应用前景。

本发明的有益效果为：

1、重组人β—防御素-2植物表达载体rp1300-hBD2含有两个CaMV 35S启动子，能高效地在各种类型的植物细胞中启动基因的表达。

2、不含报告基因可表达具有正确空间结构和生物活性的人β防御素-2。

3、rp1300-hBD2空间结构与天然hBD—2完全一致、抗菌活性高。

4、由于原核细胞和真核细胞的结构，尤其是膜结构的差异，rp1300-hBD2只会毒杀微生物而不会毒杀植物本身。

4、生产成本低，可用于具有生物活性的人β防御素-2的规模化生产和纯化，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明重组人β—防御素-2植物表达载体rp1300-hBD2的结构示意图

图2为人β-防御素-2基因的分子克隆策略示意图

图3为重组植物表达载体rp1300-hBD-2的构建策略示意图

图4为三个宫颈癌患者的新鲜肿瘤组织总RNA电泳检测结果图

图5为RT-PCR产物电泳检测结果图

图6为重组质粒pGEM-T Easy-hBD-2限制性酶切分析结果图

图7为人β-防御素hBD-2 cDNA测序图

图8为重组质粒rp1300-hBD-2的限制性酶切分析结果图

图9为转化人β-防御素2(hBD2)烟草的PCR产物电泳结果图

图10为转化人β-防御素2(hBD2)烟草RT-PCR产物电泳结果图

图11为Northern Blot检测结果

图12为Western-Blot检测转化植株hBD-2蛋白表达结果

图13为人β-防御素2(hBD2)杀菌活性结果图

图14a为Kirby-Bauer纸片扩散法检测抗金黄色葡萄球菌活性

图14b为Kirby-Bauer纸片扩散法检测抗铜绿假单胞菌活性

具体实施方式

1.材料

1.1 植物材料

实验材料选用烟草(Nicotiana tabacum L.)，由兰州大学细胞生物研究所提供。烟草无菌苗生长在常规组织培养间，温度20℃，16小时光照以及8小时黑暗。转化苗和对照苗移入土后置于玻璃室温，生长条件相同。

1.2 质粒

A.pGEM-T easy克隆质粒购自promega公司。

B.pWEN142质粒由兰州大学细胞生物研究所提供。

C.pCAMBIA1300质粒由兰州大学细胞生物研究所提供。

1.3 菌株

A.大肠杆菌DH5α由兰州大学病理生理研究所提供。

B.LBA4404由兰州大学细胞生物研究所提供。

C.金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、绿脓杆菌(ATCC 27853)标准菌株由兰州大学病理生理研究所提供。

1.4 人体组织 宫颈癌患者新鲜肿瘤组织由兰州大学第一医院妇产科提供。

2.方法

2.1 人β-防御素-2基因的分子克隆

克隆策略如下图示见图2。

2.1.1 组织 宫颈癌患者新鲜肿瘤组织由兰州大学第一医院妇产科提供。

2.1.2 设计引物 根据GeneBank中hBD₂cDNA核苷酸序列(登录号：NM-004942)设计特异性引物P1：5’→3’TGAAGCTCCCAGCCATCAGCCAT P2：5’→3’TGGACACCATAGTTTAATTTGG，产物长311bp。引物由TaKaRa公司合成。

2.1.3 宫颈癌组织总RNA提取

取人宫颈新鲜组织80mg，在DEPC处理的PBS缓冲液中冲洗三次，剪碎后分别置匀浆管中，加入1ml TRIZOL试剂(Gibco公司)，在冰浴中匀浆一分钟，将匀浆液倒入1.5ml离心管，室温放置10分钟；加0.2ml氯仿，剧烈摇动15秒，室温放置5分钟，10400转/分4℃离心15分钟；转移上清液至另一新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，摇匀，室温置10分钟，4℃ 10400转/分离心10分钟；弃上清加1ml 75％乙醇，涡旋振荡片刻，4℃ 8000转/分离心5分钟；弃上清，干燥10分钟，加50μl经DEPC处理的双蒸水溶解，取3μl在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，检测所提取RNA，其余贮存于-20℃备用。

2.1.4 RT-PCR扩增

以所提取人宫颈组织总RNA为模板进行一步法RT-PCR扩增[TaKaRa One Step RNA PCRKit(AMV)]。按下列组成配制RT-PCR反应体系：

(1)RNase Free distilled H₂O  16μl

(2)25mM Mgcl₂  15μl

(3)10×one step RNA PCR Buffer  5μl

(4)10mM dNTP  5μl

(5)RNase Inhibitor(40units/μl)  1μl

(6)P1、P2各  2μl

(7)AMV RT XL(5units/μl)  1μl

(8)AMV-optimized Taq(5units/μl)  1μl

(9)RNA样品  2μl

反应液总体积为  50μl

按以下条件进行RT-PCR反应：50℃保温30min，使mRNA逆转录为cDNA：94℃预变性2min，然后进行30个PCR循环：94℃30s、56℃30s、68℃45s；最后68℃继续延伸7min。反应结束后，每管各取6μl扩增反应液在1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测扩增结果。

2.1.5 RT—PCR扩增产物的纯化及扩增片段的克隆

2.1.5.1 RT-PCR扩增产物的纯化

重复上述RT-PCR反应过程，获100μl扩增产物，用PCR纯化试剂盒将扩增产物纯化(按试剂盒操作说明进行)，各得50μl纯化扩增产物，取3μl样品在1.5％琼脂糖凝胶中电泳鉴定纯化效果。

2.1.5.2 扩增片段的连接

根据pGEM-T Easy载体系统产品说明书建立如下连接反应：10×T4 DNA连接反应缓冲液1μl，pGEM-T载体1μl(50ng)纯化的RT-PCR扩增片段3μl，T4DNA连接酶1μl(3U)，加双蒸水至总体积为10μl，于16℃连接2小时。

2.1.5.3 制备大肠杆菌感受态细胞

用接种环从平板上挑取大肠杆菌DH5α单个菌落接种于3ml不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜，取对数生长期的菌液0.5ml转种于50ml不含抗生素的LB液体培养基中，继续于37℃振摇4小时，然后将培养液转入50ml离心管中，冰浴10分钟，于4℃以4000转/分离心5分钟，弃培养液，用预冷CaCl₂(0.1mol/L)溶液重悬菌体，冰浴20分钟，于4℃以4000转/分离心20分钟，去上清，加1ml冰浴的CaCl₂溶液(0.1mol/L)轻轻混匀，分装到1.5ml离心管中，冰浴2小时后，放4℃贮存备用。

2.1.5.4 转化

取200μl DH5α感受态细胞菌液于1.5ml离心管中，加入2μl连接反应物，轻轻混匀，冰浴20分钟，放入42℃水浴中45秒，取出离心管迅速放入冰浴2分钟，加不含抗生素的SOC液体培养基800μl，37℃振摇(150转/分)1小时，取转化后的菌液100μl铺于LB平板上(含氨苄青霉素100μg/ml，表层铺有40μl 20mg/ml X-gal及4μl 200mg/ml IPTG)37℃培养过夜。

2.1.6 重组质粒的筛选及鉴定

2.1.6.1 α-互补及颜色筛选

将转化后37℃过夜培养的平板置于4℃4小时，使蓝白色菌落充分显现，根据质粒载体pGEM-T Easy LacZ基因α-互补特性，白色菌落可能含阳性重组质粒。

2.1.6.2 质粒DNA的提取及初步鉴定

从转化平板随机挑取白色菌落，接种于3ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振摇14小时，根据质粒提取试剂盒(UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒，上海生工)操作指南提取质粒DNA，得到50μl质粒DNA，取3μl于1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测质粒DNA。操作步骤如下：

(1)提取一个白色菌落接种于一个装有2ml含有Amp的LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜；

(2)吸取培养好的菌液1.5ml加入Eppendorf管中，12000rmp离心15s，弃上清；

(3)加入100μl的Solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌；

(4)加入200μl的Solution II，立即上下颠倒5～10次，使细菌裂解，室温放置2min；

(5)加入350μl的Solution III，立即上下颠倒5～10次，使之充分中和，室温放置2min；

(6)12000rmp离心5min；

(7)将步骤(6)中上清转移到套放于2.0ml收集管内的UNIQ-10柱中，以10000rmp室温离心15s；

(8)弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，吸取500μl的Wash Solution到UNIQ-10柱，10000rmp室温离心30s；

(9)重复步骤(8)；

(10)弃收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一支收集管中，10000rmp室温离心30s以彻底去除Wash Solution；

(11)将UNIQ-10柱放入新的洁净1.5ml Eppendorf管中，加入50μl的Elution Buffer，室温放置2min后，10000rmp室温离心1min，Eppendorf管中的溶液即为所抽提的质粒DNA；

(12)取3μl于1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测质粒DNA。

2.1.6.3 重组质粒的酶切鉴定

将所得重组质粒DNA10μl，加入离心管中，加10×反应缓冲液2μl，EcoRI 1μl(10U/μl)，加纯水至20μl，37℃水浴3小时，取10μl酶切后的反应混合物于1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测酶切效果。

2.1.6.4 重组质粒的PCR鉴定

以所提重组质粒DNA为模板，以P₁、P₂为引物，进行PCR扩增。PCR反应体系如下：10×Buffer2.5μl，dNTP 2μl(0.2mM/L)，TaqDNA聚合酶2μl(1U)，重组质粒DNA 1μl，引物各1μl，加纯水至25μl。于PCR扩增仪上进行扩增，反应条件如下：94℃预变性5分钟，然后94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸45秒，30个循环，72℃继续延伸7分钟。取6μl扩增反应物于1.5％琼脂糖凝胶电泳中检测结果。

2.1.6.5 cDNA序列测定

DNA序列测定由大连TaKaRa生物技术公司应用ABI PRISM 3730 DNA自动测序仪完成。2.2重组植物表达载体rp1300-hBD-2的构建

表达载体构建策略见图3。

由于所得质粒pCAMBIA1300(图B)没有Nos terminaeor序列，需要增加该序列，将质粒pWEN142(图A)用Pst I和EcoR I双酶切得到Nos terminaeor片段和CaMV 35S启动子，同时也用Pst I和EcoR I双酶切质粒pCAMBIA1300(图C)，用T4-DNA连接酶将Nos terminaeor片段和CaMV 35S启动子插入质粒pCAMBIA1300，得到含有Nos terminaeor的质粒p1300-Nos，并鉴定重组质粒p1300-Nos(图D)。

用Xho I和Sac I酶切已测定含有hBD2正确序列的克隆载体pGEM-T-hBD2(图F)得到hBD2基因片段。同时用Xho I和Sac I酶切重组质粒p1300-Nos(图E)，用T4-DNA连接酶将hBD2基因片段插入质粒p1300-Nos，得到重组产物p1300-hBD2，鉴定重组产物p1300-hBD2，命名为rp1300-hBD2(图G)。

2.3 农杆菌感受态的制备以及重组质粒的转化

2.3.1 从28℃培养48小时的新鲜平板中挑取LBA4404单菌落，转到20mlLB液体培养基(rif100mg/L)中，于28℃ 250rpm振荡培养过夜。

2.3.2 冰浴20min，将菌液5ml离心管中，再冰浴10min。

2.3.3 4000rpm 4℃离心10min。

2.3.4 每管加入1ml预冷的20mMCaCl₂重悬菌体。

2.3.5 4000rpm4℃离心10min，弃上清。

2.3.6 每管加入300μl的20mMCaCl₂，重悬菌体并分装于1.5ml离心管中。

2.3.7 每管加入6μl重组质粒，轻轻混匀，冰浴5min，再放入液氮5min。

2.3.8 37℃5min，每管加入400μl YEB培养基于28℃温育2小时使得细菌复苏，并表达卡那霉素抗性基因。

2.3.9 取200μl转化的农杆菌均匀涂于含卡那霉素和利福平的YEB固体选择培养基平板上，室温下静置半小时后，于28℃培养。

2.3.10 设负对照，只有感受态细胞没有外源DNA，抗性平板上不生长，无抗性平板上生长。

2.4 烟草的遗传转化

2.4.1 无菌培养的烟草在1/2MS培养基上快繁。

2.4.2 YEB+Kan50mg/L+Rif100mg/L+Stre50mg/L的液体培养基中28℃振荡培养含有hBD2表达载体的LBA4404。

2.4.3 取新长出的约1-2cm²大小烟草叶子，切成0.4-0.7cm²大小，切除大的叶脉，中间用尖头镊子打孔。

2.4.4 将切好的叶片置于用MS0(MS+30g/L sucrose)稀释的农杆菌培养物中3-5分钟，中间振摇几次。

2.4.5 夹出叶片在无菌滤纸上吸干多余菌液，置于MS1(MS+30g/L sucrose+1mg/L6BA)培养基上，共培养两天。

2.4.6 将共培养两天后的叶片转至MS2(MS+30g/L sucrose+1mg/L 6BA+500mg/L CB+15mg/LHyg)上，培养20天诱导芽的生长。

2.4.7转移至MS3(MS+30g/L sucrose+1mg/L 6BA+250mg/L CB+15mg/L Hyg)上继续诱芽，待芽长至1cm大小，切下幼芽转移至MS4(MS+30g/L sucrose+250mg/L CB+15mg/L Hyg)上生根。

2.4.8 将转基因烟草幼苗两天后转入土中，继续生长。

2.5 转化植株的鉴定

2.5.1 PCR鉴定

2.5.1.1 烟草的DNA提取方法如下：

①取材(三株转化、三株野生)置于液氮中充分研磨，加入lysis buffer 0.6ml，lysis buffer的组成为：50mMtris-Cl，pH8.0；42gUrea；10ml 20％Sarkosyl(十二烷基肌氨酸钠)；10ml0.5M EDTA。42℃水浴10min。

②37℃摇10min，加入酚：氯仿：异戊醇(100：100：1)混匀30sec，37℃摇10min。

③10000×g离心10min，取上清，每500μl上清液中加入50μl NaAc(pH5.0)和600μl异丙醇。

④混匀，离心1min，弃上清，加入500μl 70％乙醇。

⑤离心30sec，弃上清，加入30μl TE重悬沉淀，储存于-20℃。

2.5.1.2 PCR鉴定用引物为：P1：5’→3’TGAAGCTCCCAGCCATCAGCCAT P2：

5’→3’TGGACACCATAGTTTAATTTGG；按以下条件进行PCR反应：94℃预变性2min，然后进行30个PCR循环，94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸45sec，最后72℃延伸5min。

2.5.2 转化植株的mRNA表达检测

2.5.2.1 烟草总RNA的提取

取转化烟草叶片50mg，在DEPC处理的PBS缓冲液中冲洗三次，剪碎后置匀浆管中，加入1ml TRIZOL试剂，在冰浴中匀浆一分钟，将匀浆液倒入1.5ml离心管，室温放置10分钟；加0.2ml氯仿，剧烈摇动15秒，室温放置5分钟，10400转/分4℃离心15分钟；转移上清液至另一新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，摇匀，室温置10分钟，4℃ 10400转/分离心10分钟；弃上清加1ml 75％乙醇，涡旋振荡片刻，4℃ 8000转/分离心5分钟；弃上清，干燥10分钟，加50μl经DEPC处理的去离子水溶解，贮存于-20℃备用。

2.5.2.2 RT-PCR扩增

以上述所提取组织总RNA为模板进行一步法RT-PCR扩增。按下列组成配制RT-PCR反应液：

(1)RNase Free distilled H₂O 16μl

(2)25mM Mgcl₂ 15μl

(3)10×one step RNA PCR Buffer 5μl

(4)10mM dNTP 5μl

(5)RNase Inhibitor(40units/μl)1μl

(6)上游引物、下游引物各2μl

(7)AMV RT XL(5units/μl)1μl

(8)AMV-optimized Taq(5units/μl)1μl

(9)RNA 样品 2μl

反应液总体积为 50μl

按以下条件进行RT-PCR反应：50℃保温30min，使mRNA逆转录为cDNA：94℃预变性2min，然后进行30个PCR循环：94℃30s，68℃45s；最后68℃继续延伸7min.反应结束后，每管各取6μl扩增反应液在1.5％琼脂糖凝胶中电泳检测扩增结果。

2.5.2.3 Northern Blot

2.5.2.3.1 甲醛-琼脂糖凝胶电泳

(1)用36ml DEPC处理H₂O溶解0.75克琼脂糖，冷却至60℃，加5ml 10×MOPS电泳缓冲液(0.4mol/L MOPS，pH7.4，0.5mol/L NaAc，0.01mol/L EDTA)和9ml 12.3mol/L甲醛。

(2)铺制凝胶，加入足够的1×MOPS电泳缓冲液使能淹没凝胶面1mm左右。

(3)在3个EP管中各加入：5μl 10×MOPS电泳缓冲液，9μl 12.3M甲醛，25μl甲酰胺；第一管、第二管分别加入所提取转化烟草RNA 11μl，第三管加入野生株烟草RNA 11μl。混匀，短暂离心，在55℃保温15分钟。

(4)加入10μl甲醛加样缓冲液[1mmol/L EDTA，pH8.0，0.25％(w/v)溴酚蓝，0.25％(w/v)二甲苯青，50％(v/v)甘油]。

(5)每孔加样60μl，在5V/cm电压下电泳2小时。

(6)取出凝胶用20×SSC(3mol/L NaCl，0.3mol/L柠檬酸三钠，pH7.0)洗两次，每次15分钟。

(7)取大小合适的尼龙膜，用DEPC处理的水浸泡5分钟。

(8)用真空转移仪转移RNA：于真空转移仪上依次放置滤纸、尼龙膜、凝胶，排除气泡，加20×SSC，转移3小时(真空负压10cmHg)。

(9)将膜取出，置120℃烤箱中烤30分钟后，4℃保存。

2.5.2.3.2 cDNA探针标记

(1)模板cDNA的纯化取RT-PCR扩增产物100μl用PCR纯化试剂盒将扩增产物纯化(按试剂盒操作说明进行)，各得50μl纯化产物，取3μl样品在1.5％琼脂糖凝胶中电泳鉴定纯化效果，并估计cDNA浓度。

(2)cDNA探针标记取纯化cDNA 15μl(含DNA约3μg)煮沸变性10分钟，立即置冰上；加入以下试剂：2μl hexanucleotide mix，2μl dNTP Mixture，1μl Klenow enzyme；混匀稍离心，置37℃60分钟；加2μl 0.2M EDTA(PH8.0)终止反应；加2.5μl 4M LiCl和75μl预冷乙醇，混匀沉淀标记DNA；置-20℃2小时；10000转/分离心15分钟，弃上清，用50μl预冷乙醇洗涤、干燥，溶于50μl TE中备用。

2.5.2.3.3 预杂交将尼龙膜放入杂交袋，加入5ml杂交液(7％SDS，50％甲酰胺，5×SSC，50mM Sodium phosphate，PH7.0，0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine，2 ％blocking reagent(试剂盒提供))，置50℃预杂交4小时。

2.5.2.3.4 杂交在3ml杂交液中加入探针25μl，排出杂交袋中气泡，杂交16小时。

2.5.2.3.5 洗膜检测取出尼龙膜，置用DEPC处理过的容器中，用洗液I(2×SSC，0.1％SDS)室温洗涤两次，每次5分钟，用洗液II(0.1×SSC，0.1％SDS)68℃洗涤两次，每次15分钟，用冲洗缓冲液[马来酸缓冲液，0.3％ Tween20(v/v)]洗涤2分钟；置尼龙膜于100ml Blockingsolution[1％(w/v)Blocking试剂溶解于马来酸缓冲液(0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH7.5)]中30分钟；取anti-DIG-AP到Blocking溶液中使其浓度达150mU/ml，将膜放在50ml含抗体的Blocking溶液中30分钟；用冲洗缓冲液洗两次，每次15分钟；置膜于检测缓冲液(0.1MTris-HCl，0.1M NaCl，50mM MgCl₂，pH9.5)中两分钟；将膜置于10ml显色溶液中(10ml检测缓冲液，200μl NBT/BCIP)，密封塑料袋置暗处；充分显色，取出浸入水中漂洗10分钟，干燥照像。

2.6.转化植株hBD2蛋白表达检测

2.6.1 植物蛋白样品制备

(1)将500mg烟草组织置于2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。

(2)加400μl单去污剂裂解液(50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX—100，100μg/ml PMSF)于匀浆器中，进行匀浆，然后置于冰上。

(3)几分钟后再碾一会儿再置于冰上，重复碾几次使组织尽量碾碎。

(4)裂解30min后，用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm离心5min，取上清分装于0.5ml离心管中并置于—20℃保存。

2.6.2 Tris—Tricine电泳

由于目的蛋白大小只有4.5kDa，用SDS—PAGE电泳得不到很好的分离效果，因此采用一种修改的缓冲系统的Tris—Tricine方法，可使SDS和多肽得到分离，从而改善分离度。

(1)检查电泳装置，清洗玻璃板。

(2)灌胶与上样

①玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。

②按以下方法配Tricine分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到所需高度时即可，然后胶上加一层水。

Tricine多肽分离凝胶配方

③当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

④按上面的方法配Tricine浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。

⑤用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。

⑥取制备好的样品至0.5ml离心管中，加入2×Tricine上样缓冲液(0.1mol/L Tris，24％甘油，8％SDS，0.2mol/LDTT，0.02％考马斯亮蓝G-250)，沸水中煮5min使蛋白变性。

⑦加足够的电泳液后上样。

阳极缓冲液的配制：

121.1g Tris碱

500ml H₂O

用浓盐酸调校至pH8.9

用H₂O稀释至5L，于4℃保存备用。

阴极缓冲液的配制：

12.11g Tris碱

17.92g Tricine

1g SDS

用H₂O稀释至1L，于4℃保存备用。

(3)电泳

电压为40V，电泳5h，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。

2.6.3 转膜

切1张6.0 x 8.0cm大小的硝酸纤维素膜置于水上浸2h，另准备6张和分离胶大小相同的滤纸。安装转移电泳槽，并加入转移缓冲液。待电泳完毕，根据电泳槽使用指南，将滤纸、分离胶和准备好的硝酸纤维素膜正确放置。在冷却条件下60V，转膜2h。转膜完毕，拆卸转膜装置，取出转印膜，并在膜上剪一小角作为定位标记，准备免疫检测。转移缓冲液的配制：

甘氨酸(MW75.07)       2.9g

Tris(MW121.14)        5.8g

SDS                   0.37g

甲醇                  200ml

蒸馏水至              1000ml

溶解后室温保存

2.6.4 免疫检测

2.6.4.1 免疫反应

(1)将膜用TBS(100mmol/L Tris·HCl pH7.5，150mmol/L NaCl)从下向上浸湿后，移至含有封闭液(含0.2％酪蛋白的TTBS缓冲液)的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。

(2)将一抗用TTBS[含0.1％(v/v)Tween20的TBS缓冲液]稀释至1∶500；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育2h后，用TTBS在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。

(3)同上方法准备二抗稀释液(1∶5000)并与膜接触，室温下孵育2h后，用TTBS在室温下脱色摇床上洗两次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，进行化学发光反应。

一抗(羊抗人β-defensin2，sc-10854，为Santa Cruz产品)

二抗(抗羊IgG-HRP，sc-2020，为Santa Cruz产品)

2.6.4.2 化学发光，显影，定影

(1)将A和B两种试剂(购自北京中山公司，为Santa Cruz产品)在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。

(2)在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X—光片，用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm)；打开X-光片夹，把X—光片放在膜的蛋白面上，关上X-光片夹，开始计时；曝光时间为15min；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影时间为2min(20～25℃)；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。

2.6.4.3 将胶片扫描照相。

2.7 生物活性检测

2.7.1 样品提取

取转染hBD2和野生新鲜烟草的叶片，在研钵中研磨后，4℃，5000rpm离心10min，取上清于4℃保存备用。

2.7.2 杀菌活性检测

2.7.2.1 琼脂糖弥散法测定杀菌活性

将细菌(金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌)于37℃大豆胰蛋白胨肉汤培养基(TSB)中培养过夜，取50μl该菌液接种到50ml新鲜TSB中，37℃培养3h，以获得中度对数期生长的细菌。将该菌液于4℃，900×g离心10min，然后用预冷的磷酸盐缓冲液(NAPB)清洗后，再重悬于该缓冲液中，使细菌浓度达到10⁷个/ml。取该菌液100μl于10ml含10mM NAPB的已灭菌并42℃温浴的TSB培养基液中，混匀，使菌浓度为10⁵个/ml。倒该培养基于培养皿中(胶厚为1.25mm)，待凝固后，在培养基上打直径为3mm的孔，分别加野生烟草上清液、转化烟草上清液、两倍浓缩转化烟草上清液各50μl于含有金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌培养基的三个孔中。37℃孵育3h后，倒入顶层培养基(含6％TBS，1％琼脂糖，消毒并42℃孵育)，待胶凝固后置37℃培养18小时。测量加样孔周围细菌清除环的直径，清除环的直径以单位表示(0.1mm为1个单位)。

2.7.2.2 Kirby-Bauer纸片扩散法检测抗菌活性

分别取野生烟草上清液、转化烟草上清液、两倍浓缩转化烟草上清液，将灭菌6mm滤纸片放入上述液体中浸泡12h备用。采用Kirby-Bauer纸片扩散法检测重组hBD-3的抗菌活性，操作过程简述如下：将金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)标准菌株室温解冻后涂布于LB平板上，37℃孵育过夜。次日，分别挑取LB平板上的单菌落1个，接种于LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养10h。然后用PBS洗涤细菌，并使其浓度达到10⁵/ml，均匀涂布到LB平板。放置10min待平板表面稍干后放置上述细胞培养上清液浸泡过的滤纸。37℃过夜孵育，次日观察和记录抑菌环大小。

3.实验结果

3.1 组织总RNA的提取

提取的三个宫颈癌患者新鲜肿瘤组织(A、B、C)总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测有三个明显条带(28s、18s和5.8s)，基本无降解，无DNA残留(图4)。

3.2 β-防御素基因的RT-PCR扩增

以提取RNA为模板用设计的特异引物进行RT-PCR扩增，所获得的RT-PCR产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳出现约310bp大小的条带，与预计扩增片段大小相符，表明引物设计合乎要求，可扩增出相应hBD-2cDNA片段(图5)。图中A：hBD-2、B：DL-2000DNA标记。

3.3 重组质粒的筛选及鉴定

PGEM-T Easy与hBD2cDNA的连接产物转化感受态细胞DH5α后，在氨卞青霉素和IPTG及X-gal的选择平板上培养过夜，出现16个白色菌落，挑选白色菌落，于LB液体培养基(含氨卞青霉素)培养过夜，提取质粒。经限制性内切酶EcoR I酶切图谱分析证实，含有插入的目的片段(图6)。以重组质粒为模板行PCR扩增，结果显示得到的基因片段与目的片段大小相符(图6)。图中A：pGEM-TEasy-rBD-1的hBD-2PCR扩增产物、B：EcoRI酶切后的pGEM-TEasy-hBD-2、C：pGEM-T Easy-hBD-2、M：DL-2000DNA标记。

3.4 DNA序列测定

所提质粒送大连TaKaRa公司做DNA序列测定，测序结果显示，所获得的克隆重组体中含有hBD-2cDNA序列，与Genebank中报道的结果完全一致，序列覆盖hBD-2cDNA全长，能够用于构建植物表达载体(图7)。

3.5 重组植物表达载体的筛选与鉴定

重组植物表达载体rp1300-hBD-2经限制性内切酶Sac I和xho I酶切图谱分析证实，含有插入的目的片段(图8)。以重组质粒为模板行PCR扩增，结果显示得到的基因片段与目的片段大小相符(图8)。图中A：rp1300-hBD-2的PCR扩增产物、B：Sac I和xho I酶切后的rp1300-hBD-2、C：p1300-hBD-2、M：PCR标记。

3.6 转化hBD-2烟草的PCR鉴定

提取3株转化rp1300-hBD-2烟草的DNA和3株未转化rp1300-hBD-2烟草的DNA，分别以这六种DNA为模板，P1、P2为引物进行PCR扩增，结果显示，3株转化rp1300-hBD-2的烟草DAN都扩增出大小约310bp的片段，而3株未转化rp1300-hBD-2的烟草DNA则未见特异条带出现。前三株转rp1300-hBD-2的烟草都含hBD2基因，说明根癌农杆菌已把hBD-2基因导入烟草细胞(图9)。图中A、C、E：转化hBD-2烟草；B、D、F：未转化hBD-2烟草；M：PCR标记。

3.7 转化植株的mRNA表达检测

提取PCR鉴定阳性的三株烟草总RNA(A、B、C)，分别为模板，以P1、P2为引物进行PT-PCR，结果显示，三个模板都扩增出大小相符的条带，并且亮度较强(图10)。说明三株转化了hBD-2的烟草都能在较高水平进行hBD-2基因的mRNA表达。图中M为DL—2000DNA标记。

3.8 转化植株的Northern-Blot检测

将两株转化烟草(A、B)和一株未转化烟草(C)的总RNA进行Northern-Blot检测，结果显示，两株转化的烟草RNA呈阳性，而未转化烟草RNA为阴性(图11)。进一步肯定了转化的烟草不仅将hBD-2基因导入细胞，而且都有hBD-2基因在mRNA水平的较强表达。

3.9 转化烟草的hBD-2蛋白表达检测

将两株转化烟草(A、B)和一株未转化烟草(C)的蛋白提取物进行Western-Blot检测，结果显示，两株转化烟草的蛋白提取物呈阳性反应，而未转化烟草的蛋白提取物呈阴性，说明转化烟草蛋白提取物中含有hBD-2，证实该转化hBD-2基因的烟草能够表达表达hBD-2。因此该hBD-2植物表达系统rp1300-hBD-2的构建是成功的(图12)。

3.10 琼脂糖弥散法测定hBD-2杀菌活性

将野生烟草上清液(1)、转化烟草上清液(2)、两倍浓缩转化烟草上清液(3)各50μl分别加入含有金黄色葡萄球菌(A)、绿脓杆菌(B)培养基的三个孔中，18小时培养后，加入转化烟草上清液、两倍浓缩转化烟草上清液的两个孔都出现了明显的杀菌环，而加入野生烟草上清液的孔则无杀菌环出现(图13)。经测量在含有金黄色葡萄球菌的平板上加入转化烟草上清液的杀菌环为60单位、加入两倍浓缩转化烟草上清液的杀菌环为100单位，在含有绿脓杆菌的平板上加入转化烟草上清液的杀菌环为70单位、加入两倍浓缩转化烟草上清液的杀菌环为120单位。说明该转化hBD-2基因的烟草不仅能表达hBD-2，而且表达的产物具有较强的抗菌活性。

3.11 Kirby-Bauer纸片扩散法检测抗菌活性

检测结果显示转化hBD-2的烟草上清液对金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)均可形成抑菌环，直径平均值分别为19、17mm，而未转化hBD-2的烟草上清液并无阳性抑菌环形成(<10mm均认定为阴性)(图14)。结果显示该转化hBD-2基因的烟草不仅能表达hBD-2，而且表达的产物具有较强的抗菌活性。说明我们构建的该hBD-2生物反应器不仅能高效表达hBD-2，而且能很好地完成翻译后的修饰加工，使其表达产物具有天然hBD-2的空间结构，发挥其较强抗菌活性的生物特性。

本试验结果表明：重组hBD-2基因的植物表达载体rp1300-hBD-2已构建成功并诱导根癌农杆菌LBA4404遗传转化，而且通过根癌农杆菌介导已将此组hBD-2基因的植物表达载体进入了烟草幼胚愈伤组织。该转化hBD-2基因的烟草不仅能表达hBD-2，而且表达的产物具有较强的抗菌活性。说明我们构建的该hBD-2生物反应器不仅能高效表达hBD-2，而且能很好地完成翻译后的修饰加工，使其表达产物具有天然hBD-2的特性，并能发挥其较强抗菌作用的生物活性。这为建立高效稳定hBD-2植物表达系统奠定了基础，并为进一步解决在体外规模化生产具有生物活性的人防御素提供新途径。

Claims (1)

1、人β—防御素-2植物高效表达质粒载体，含有启动子、人β—防御素-2基因、终止子和两个筛选基因：卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，其特征在于在pCAMBIA1300植物表达载体的基础上，用基因重组的方法连接Nos终止子和一个CaMV 35S启动子，并将人β—防御素-2基因插入CaMV 35S启动子和Nos终止子之间，得到重组人β—防御素-2植物表达载体rp1300-hBD2，该基因表达载体含有两个CaMV 35S启动子。

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