CN114891083B

CN114891083B - 甜菜孢囊线虫Hs8H07蛋白、编码基因及其应用

Info

Publication number: CN114891083B
Application number: CN202210448128.9A
Authority: CN
Inventors: 彭焕; 姚珂; 彭德良; 坚晋卓; 孔令安; 黄文坤; 刘世名
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-04-26
Filing date: 2022-04-26
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2042-04-26
Also published as: CN114891083A

Abstract

本发明公开了甜菜孢囊线虫Hs8H07蛋白、编码基因及其应用，涉及生物技术领域。所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明还提供一种编码该蛋白的基因。本发明提供的编码该蛋白的基因Hs8H07，在甜菜孢囊线虫食道腺表达；亚细胞定位实验结果表明Hs8H07蛋白定位于烟草叶片细胞的细胞核和细胞膜上。利用寄主介导的RNAi沉默处理沉默Hs8H07基因后，甜菜孢囊线虫的白雌虫量与对照野生型植株相比，显著降低。而在拟南芥中过表达Hs8H07基因，甜菜孢囊线虫的白雌虫量与对照野生型植株相比，显著增加。表明该基因在甜菜孢囊线虫寄生致病过程中具有重要作用，可作为植物抗线虫工程的靶标基因。

Description

甜菜孢囊线虫Hs8H07蛋白、编码基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及甜菜孢囊线虫Hs8H07蛋白、编码基因及其应用。

背景技术

植物寄生线虫对全世界农业生产造成了严重损失，每年造成的经济损失至少有800 亿美元(Nicol JM,Turner SJ,Coyne DL,Nijs Ld,Hockland S,Maafi ZT.Currentnematode threats to world agriculture Edited by John Jones,Godelieve Gheysenand Carmen Fenoll,in Genomics and Molecular Genetics ofPlant-NematodeInteractions.2011:21-43.)。目前，造成甜菜生产减产的危害有90％以上来自甜菜孢囊线虫(BCN,Heterodera Schachtii)(Biancardi E,McGrath JM,Panella LW,Lewellen RT,Stevanato P.Sugar Beet.Edited by JE Bradshaw,in Root and Tuber Crops,Handbook of Plant Breeding,New York.2010,7:173-219)。甜菜孢囊线虫主要危害甜菜、菠菜、油菜、花椰菜等藜科与十字花科作物，侵染寄主植株的地下根部。受害植株表现为黄化、萎蔫、光合效率降低、生长缓慢、发育不良。严重地块会出现死苗现象。受害甜菜侧根及须根增多，根系簇须状，局部坏死，贮藏根会开裂分支，产量及糖含量下降(Polychronopoulos AG,Lownsbery BF.Effect of Heterodera schachtii on sugarbeet seedings under monoxenic conditions. Nematologica.1968,14:526-534.)。由于缺乏有效、迅速、经济的防治措施，如若甜菜孢囊线虫病暴发，将会对甜菜产量造成严重损失。因此，从分子水平解析甜菜孢囊线虫与寄主互作的分子机理，对采取科学合理的措施防控甜菜孢囊线虫的爆发，具有十分重要的理论价值和实用意义。

发明内容

本发明的目的是提供甜菜孢囊线虫Hs8H07蛋白、编码基因及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，实验表明该蛋白基因与甜菜孢囊线虫的生长发育有关，可以利用该基因或蛋白进行生物防控。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种甜菜孢囊线虫蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种编码上述的蛋白的基因。

进一步地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供一种沉默如SEQ ID NO.2所示基因的RNAi，所述RNAi的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。

本发明还提供一种重组表达载体，包含上述的RNAi。

本发明还提供一种重组微生物，包含上述的RNAi或重组表达载体。

本发明还提供一种重组植物组织，包含上述的RNAi、重组表达载体或重组微生物。

本发明还提供上述的蛋白、基因、RNAi、重组表达载体、重组微生物或重组植物组织在防治甜菜孢囊线虫中的应用。

本发明还提供一种防治甜菜孢囊线虫的方法，通过抑制上述的蛋白的表达来防治甜菜孢囊线虫。

进一步地，所述方法包括：设计沉默所述的基因的RNAi，使甜菜孢囊线虫摄入所述RNAi。

含有上述RNAi的重组表达载体、干扰载体、超表达载体、转基因植物组织、重组菌、重组基因表达盒均属于本发明的保护范围。

含有上述RNAi的重组表达载体包括双元农杆菌载体，病毒载体，细菌表达载体及酵母表达载体等，具体可以为pDGR，pGDR，pGADT7等。含有上述RNAi的载体在构建过程中，可以单独或者多个组合使用诱导型、增强型、组成型、组织特异型启动子。载体可以包括抗生素或抗化学试剂的抗性筛选标记，也可以含有产生颜色变化的酶，比如GUS，或者荧光标记蛋白，例如红色或绿色荧光蛋白。构建的载体可以转化细菌，真菌及单双子叶植物，具体可以为大肠杆菌，酵母，烟草及拟南芥。

抑制Hs8H07基因的表达为本发明的保护范围，本发明还保护用于抑制Hs8H07基因表达的物质在制备产品中的应用。所述产品功能为抑制孢囊线虫对植物的寄生和/或抑制孢囊线虫对植物的致病和/或抑制孢囊线虫的发育。用于抑制Hs8H07基因表达的物质具体可以为抑制Hs8H07基因表达的dsRNA，干扰载体，以及病毒载体。所述植物可以为单子叶植物或双子叶植物，具体可以为烟草，拟南芥，甜菜等。

本发明保护Hs8H07蛋白在抑制孢囊线虫对植物的寄生与危害，和/或抑制孢囊线虫对植物的致病性，和/或抑制孢囊线虫发育中的应用。

本发明还保护用于抑制Hs8H07蛋白活性的物质在制备产品中的应用。所述产品功能为抑制孢囊线虫对植物的寄生和/或抑制孢囊线虫对植物的致病和/或抑制孢囊线虫的发育。所述植物可以为单子叶植物或双子叶植物，具体可以为烟草，拟南芥，甜菜等。

本发明还保护Hs8H07蛋白在植物中的表达，所述寄主植物具体可以为烟草和拟南芥，例如本氏烟。

本发明公开了以下技术效果：

植物内寄生线虫的食道腺由两个亚腹食道腺细胞和一个背食道腺细胞组成，能够编码和表达分泌蛋白，并通过口针释放到植物体内，在线虫侵染寄主、建立并维持取食位点的过程中起重要作用。本发明提供的Hs8H07基因，在甜菜孢囊线虫食道腺表达，在侵染后2龄幼虫中表达量最高；亚细胞定位实验结果表明Hs8H07蛋白定位于烟草叶片细胞的细胞核和细胞膜上。利用寄主介导的RNAi沉默处理沉默Hs8H07基因后，甜菜孢囊线虫的白雌虫量与对照野生型植株相比，显著降低。而在拟南芥中过表达 Hs8H07基因，甜菜孢囊线虫的白雌虫量与对照野生型植株相比，显著增加。表明该基因在甜菜孢囊线虫寄生致病过程中具有重要作用，可作为植物抗线虫工程的靶标基因。本发明对于甜菜孢囊线虫致病机理研究以及抗线虫植物制备具有重大价值，为解析甜菜孢囊线虫效应蛋白与寄主的互作机制提供理论基础，为开发防控新技术提供新的策略。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例2中Hs8H07基因在甜菜孢囊线虫2龄幼虫中组织定位分析的结果；其中，A为正链探针杂交结果为负对照；B为反链探针杂交结果表明Hs8H07基因由食道腺细胞分泌；SVG：亚腹食道腺细胞；S：口针；M：中食道腺；标尺为50μm；

图2为实施例3通过qRT-PCR检测Hs8H07基因在6个发育阶段中的发育表达的结果；相对表达分析的方法为2^-ΔΔCt法，内参基因为ACTIN，卵(egg)的RQ＝1；egg：卵； preJ2：侵染前2龄幼虫；parJ2：侵染后2龄幼虫；J3：3龄幼虫；J4：4龄幼虫；femal：雌成虫；

图3为实施例4的亚细胞定位结果，通过亚细胞定位显示Hs8H07蛋白定位于烟草叶片细胞的细胞核和细胞膜上；

图4为实施例5中平均每各处理甜菜孢囊线虫在接种3天时根中线虫数量的统计结果；

图5为实施例5中平均每各处理甜菜孢囊线虫在接种30天后白雌虫数量的统计结果；

图6为实施例6中平均每各处理甜菜孢囊线虫在接种3天时根中线虫数量的统计结果；

图7为实施例6中平均每各处理甜菜孢囊线虫在接种30天后白雌虫数量的统计结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例中，pMD19-T载体购买自北京六合通经贸有限公司，pGDR载体为中国农业科学院植物保护研究所的宁约瑟研究员馈赠，RNAi载体为中国农业科学院植物保护研究所保存，PDT7载体为湖南大学于峰老师馈赠，EHA105农杆菌感受态购买自华越洋公司。

实施例1Hs8H07蛋白以及Hs8H07基因的发现

1、收集甜菜孢囊线虫2龄幼虫(约5000头)，使用DEPC处理水洗2-3次，转入1.5mL离心管，加入1mL Trizol(Invitrogen)，液氮中速冻30s，37℃水浴30s，重复冻融4-5 次，然后在室温下静置5min，提取总RNA，采用DNA-free^TMDNA Removal Kit试剂盒去除总RNA中残存的DNA，反转录获得cDNA。

2、以cDNA为模板，采用引物Hs8H07-F和Hs8H07-R进行PCR扩增，具体序列如下：

上游引物Hs8H07-F：5’-ATGCTGAGGATTGTTCTACTC-3’(SEQ ID NO.3)，

下游引物Hs8H07-R：5’-TTACTGCTGATGTTCCTGCTG-3’(SEQ ID NO.4)；

扩增体系为10×PCR Ex Buffer(Mg²⁺)，5μL；dNTP(10mM)，4μL；上游引物(10mM)，下游引物(10mM)各1μL；Ex Taq，0.5μL；cDNA第一链模板，1μL；去离子水，35.5μL，总体积50μL。扩增程序94℃变性5min；接下来34个循环的94℃，30sec，54℃，30sec， 72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳分离鉴定。

3、将pMD19-T载体与步骤2中的PCR扩增产物连接，得到Hs8H07基因克隆载体，然后转化DH5α大肠杆菌感受态细胞中，测序。测序结果表明，扩增产物中具有如SEQ ID NO.2所示的开放阅读框，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。将如SEQ ID NO.1所示的蛋白质命名为Hs8H07蛋白，将如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列命名为Hs8H07基因。

SEQ ID NO.1：

MLRIVLLNSILALFGDCMDMGKRKAGGISINEPIVNQIKEKTFAATSRKGKEKVG EKINVMDTTEHIAQMDIAQDKDKMDICVKPKHTEQETPTISLKCADDVEVEVELDRNIFRFSTTLDTMMEDLEMYNAEGKKQKLPVSNVSSTVMRKVIEWCEHHRNDPSIEPI YEEIDLDVPTGKDAEASTSNVQEGEVAEESASKAKPKEPANIEKRLVFPSWDDKFLD KEWPELAEIILAANYLNIKLLLTFATTMVYNKWVKGKRPEEIRKTFGVEEPYPPGHPEWERVEKENEWEESDEEREARHAKEREEEEERERKEEQKRKEAEAERLRQEQLQQQ NQEQEHQQEHQQ。

SEQ ID NO.2：

ATGCTGAGGATTGTTCTACTCAACTCCATTTTGGCACTGTTTGGTGATTGCAT GGACATGGGAAAAAGAAAAGCGGGAGGAATAAGTATTAATGAGCCAATTGTAAATCAAATCAAAGAAAAAACATTCGCCGCAACAAGCAGAAAAGGCAAAGAAAAAG TCGGCGAAAAAATAAACGTTATGGACACAACTGAACACATTGCTCAAATGGACATTGCCCAAGACAAAGATAAAATGGACATCTGTGTCAAACCCAAACATACTGAGCA AGAAACTCCAACCATATCCCTTAAATGCGCGGACGACGTGGAAGTGGAAGTAGAGCTCGATCGTAATATTTTTCGTTTTTCCACTACGCTCGACACTATGATGGAAGATCT TGAAATGTACAATGCTGAAGGAAAAAAACAGAAATTGCCGGTTTCAAATGTCAGTAGTACGGTGATGCGAAAAGTGATTGAATGGTGCGAACATCACAGAAACGATCCTT CAATCGAACCAATTTATGAGGAAATTGATTTGGATGTGCCAACTGGTAAAGATGC GGAGGCATCAACTTCAAATGTTCAAGAGGGAGAAGTTGCGGAGGAATCTGCATCAAAAGCCAAACCAAAAGAACCGGCTAATATCGAAAAACGTCTCGTCTTTCCGAG CTGGGATGACAAATTTTTGGATAAGGAGTGGCCTGAACTAGCTGAGATAATTTTGGCAGCCAACTATTTGAACATCAAACTTTTGCTTACCTTCGCGACCACAATGGTTTA TAATAAATGGGTCAAGGGCAAAAGACCGGAGGAAATTCGCAAGACATTCGGCGTCGAAGAACCGTACCCGCCGGGACATCCCGAATGGGAACGCGTTGAGAAGGAGAA CGAGTGGGAAGAATCGGACGAGGAACGTGAGGCACGCCATGCAAAGGAACGAGAGGAGGAAGAGGAGCGTGAGAGAAAGGAAGAACAGAAGCGTAAGGAAGCGGA AGCAGAACGCCTCCGTCAGGAACAATTGCAACAACAGAATCAGGAACAGGAACATCAGCAGGAACATCAGCAGTAA。

实施例2Hs8H07基因的组织定位分析

1、以实施例1得到的Hs8H07基因克隆载体为模板通过常规PCR扩增靶标序列，采用上游引物Hs8H07-yw-F：5’-GAAGTTGCGGAGGAATCTG-3’(SEQ ID NO.5)和下游引物Hs8H07-yw-R：5’-CTTCGACGCCGAATGTCTTG-3’(SEQ ID NO.6)，进行 PCR反应，体系如下10×PCR Ex Buffer(Mg²⁺)，2.5μL；dNTP(10mM)，4μL；上游引物(10mM)，下游引物(10mM)各1μL；Ex Taq，0.3μL；质粒模板，1μL；去离子水， 16.2μL，总体积25μL。扩增程序94℃变性5min；接下来34个循环的94℃，30sec， 57℃，30sec，72℃延伸30sec；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳分离纯化。

2、以单引物PCR合成地高辛标记的正链探针和反链探针。以Hs8H07-yw-F或Hs8H07-yw-R为引物，以步骤1回收的目的片段为模板进行PCR扩增扩增，得到反链探针/正链探针。体系如下10×PCR Ex Buffer(Mg²⁺)，2.5μL；地高辛标记的dNTP mix(10 mM)，1μL；Hs8H07-yw-F或Hs8H07-yw-R(10mM)，1μL；Ex Taq，0.3μL；PCR产物 (上步骤获得)，1μL；去离子水，19.2μL，总体积25μL。扩增程序94℃变性5min；接下来34个循环的94℃，30sec，57℃，30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min， 4℃保存。按原位杂交试验步骤进行原位杂交实验。结果见图1。结果显示，反链探针有杂交信号，杂交信号位于亚腹食道腺，表明Hs8H07基因为亚腹食道腺细胞表达基因。

实施例3Hs8H07基因的发育表达分析

在甜菜根部大量接种甜菜孢囊线虫2龄幼虫，通过控制接种时间结合酶裂解处理分离获得6种不同发育阶段的甜菜孢囊线虫(侵染前2龄幼虫、侵染后2龄幼虫、3龄幼虫、4龄幼虫、雌虫和卵)。采用磁珠法分别提取6个龄期的mRNA，反转录成第一链cDNA作为模板，采用primer 5.0软件设计Hs8H07基因特异性上游引物Hs8H07-q-F： 5’-CCACTACGCTCGACACTATG-3’(SEQ ID NO.7)，和下游引物Hs8H07-q-R： 5’-CATCCCAGCTCGGAAAGACG-3’(SEQ ID NO.8)。采用Real time PCR相对定量技术检测靶基因在不同龄期的表达量，以actin基因(deAlmeida Engler,J.D.,Van Poucke,K.,Karimi,M.,De Groodt,R.,Gheysen,G.and Engler,G.(2004)Dynamic cytoskeleton rearrange-ments in giant cells and syncytia ofnematode-infected roots.Plant J.38,12–26)作为内参基因，采用

Select Master Mix试剂盒(Takara)，在ABI7500荧光定量 PCR仪上进行Real-time RT-PCR检测，分别进行三次生物学重复实验，采用2^-△△Ct法分析结果，从而明确Hs8H07基因在甜菜孢囊线虫不同发育阶段表达情况。

反应体系(20μL)：SYBR Premix Ex TaqⅡ，10μL；ROX Refence DyeⅡ，0.4μL；上游引物(10μM)和下游引物(10μM)各1μL；模板，1μL；ddH₂O补足。反应程序：50℃/2min， 95℃/2min；95℃/15s，58℃/15s，72℃/30s，40个循环；95℃/15s，60℃/1min，95℃/30s， 60℃/15s。结果见图2。相对于卵时期的表达量，Hs8H07基因在侵染后2龄幼虫中表达量最高。结果显示Hs8H07基因主要在甜菜孢囊线虫侵染和寄生初期表达。

实施例4Hs8H07基因的亚细胞定位

1、以Hs8H07基因cDNA为模板通过常规PCR扩增靶标序列，扩增去信号肽的片段(Hs8H07-SP)。引物具体序列如下：

上游引物Hs8H07-NSP-F： 5’-GGGCTGCAGGAATTCATGGACATGGGAAAAAGAAAAG-3’(SEQID NO.9)，

下游引物Hs8H07-NSP-R：5’-CTTGATATCGAATTCCTGCTGATGTTCCTGCTGA-3’ (SEQ IDNO.10)；

PCR反应体系为：10×PCR Ex Buffer(Mg²⁺)，2.5μL；dNTP(10mM)，2μL；上游引物(10mM)，下游引物(10mM)各0.5μL；Ex Taq，0.5μL；cDNA模板，3μL；去离子水，16μL，总体积25μL。扩增程序94℃变性5min；接下来34个循环的94℃/30sec， 60℃/30sec，72℃/1.5min；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳分离纯化，并对扩增片段进行回收、连接、转化、测序。

2、以pGDR为载体(Goodin M M,Dietzgen R G,Schichnes D,Ruzin S,JacksonAO.pGD vectors:versatile tools for the expression ofgreen and red fluorescentprotein fusions in agroinfiltratedplant leaves[J].Plant Journal,2002,31(3):375-383.)，以Hs8H07-SP为插入片段，构建了Hs8H07^-SP-GFP(去信号肽)重组载体。将重组载体采用热激法转入EHA105 农杆菌感受态细胞中，取适量摇培菌液涂布于含有Kan⁺和Rif⁺抗生素的LB平板上， 28℃下培养36-48h。

3、将上述转化成功的农杆菌重新划线培养，挑取单菌落接种于含有Kan⁺和Rif⁺抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养，室温下离心4000rpm/15min，弃上清后用悬浮缓冲液(含10mM MgCl₂+10mM MES+200μMAs的无菌水)重悬菌体，并用悬浮缓冲液调节OD₆₀₀至所需量。混匀后静置3h后，用1mL注射器向烟草(本氏烟) 幼苗注射混合菌液，每棵苗注射3-4片叶(苗龄4-5叶期)，注射时先用针尖在叶片背面轻轻划出一个小伤口，再用注射器(去掉针头)平压在伤口处，然后注射，避免叶片破损和流水冲洗。3-4天后，使用Carl Zeiss蔡司激光共聚焦显微镜880观察。见图3。实施结果如图3所示，表明Hs8H07蛋白定位于烟草叶片细胞的细胞膜和细胞核上。

实施例5通过寄主介导的RNAi沉默Hs8H07基因验证其作为靶标在抗线虫中的应用

1、设计靶基因的特异引物，并将特异引物前面加上RNAi载体的同源臂序列(用下划线显示)，合成Hs8H07基因的RNAi片段(SEQ ID NO.13)并构建到RNAi载体中，具体引物序列见表1：

表1用于Hs8H07基因RNAi片段合成的引物

(带下划线的碱基序列为载体同源臂序列)

SEQ ID NO.13：

5’-GACGACGTGGAAGTGGAAGTAGAGCTCGATCGTAATATTTTTCGTTTTTCC ACTACGCTCGACACTATGATGGAAGATCTTGAAATGTACAATGCTGAAGGAAAAA AACAGAAATTGCCGGTTTCAAATGTCAGTAGTACGGTGATGCGAAAAGTGATTGAATGGTGCGAACATCACAGAAACGATCCTTCAATCGAACCAATTTATGAGGAAATTGATTTGGATGTGCCAACTGGTAAAGATGCGGAGGCATCAACTTCAAATG-3’。

2、将重组载体采用热激法转入GV3101农杆菌感受态细胞中，取适量摇培菌液涂布于含有Kan⁺和Rif⁺抗生素的LB平板上，28℃下培养36-48h。将转化成功的农杆菌重新划线培养，挑取单菌落接种于含有Kan⁺和Rif⁺抗生素的LB液体培养基中，28℃ 振荡培养，室温下离心4000rpm/15min，弃上清后用侵染悬浮缓冲液(每500mL无菌水中含1g六水氯化镁、25g蔗糖和50μL SilwetL-77表面活性剂)重悬菌体，并用悬浮缓冲液调节OD₆₀₀至所需量。混匀后采用拟南芥花蕾期浸泡侵染的方法侵染拟南芥，收种后筛选阳性突变体植株。

3、将新孵化的甜菜孢囊线虫J2幼虫分别接种到预培养3-4周的Hs8H07-RNAi植株和野生型拟南芥Col0根部。每株接虫500头，种植30株、重复3次。3d，染色统计每株根系中侵染线虫的数量；30d后，分离、统计每株根系的孢囊数量，从而确定靶基因沉默后对BCN侵染和发育的影响。见图4、图5。结果表明Hs8H07沉默处理后， 3d时甜菜孢囊线虫的侵染数量与对照相比，显著减少；同样的，30d时甜菜孢囊线虫的孢囊量与对照相比，显著减少，可以作为线虫防控的靶标基因。

实施例6通过在拟南芥中过表达Hs8H07基因验证对线虫侵染的影响

1、设计靶基因的特异引物，并将特异引物前面加上过表达载体的同源臂序列(用下划线显示)，合成Hs8H07基因的过表达OE片段并构建到PDT7过表达载体中，具体引物序列见表1：

表1：用于Hs8H07基因过表达OE片段合成的引物

(带下划线的碱基序列为载体同源臂序列)

2、将重组载体采用热激法转入GV3101农杆菌感受态细胞中，取适量摇培菌液涂布于含有相应抗生素(包括质粒抗性Kan⁺和农杆菌抗性Rif⁺)的LB平板上，28℃下培养 36-48h。将转化成功的农杆菌重新划线培养，挑取单菌落接种于适量LB液体培养基中 (含相应的抗生素)，28℃振荡培养，室温下离心4000rpm/15min，弃上清后用侵染悬浮缓冲液(每500mL无菌水中含1g六水氯化镁、25g蔗糖和50μL SilwetL-77表面活性剂)重悬菌体，并用悬浮缓冲液调节OD₆₀₀至所需量。混匀后采用拟南芥花蕾期浸泡侵染的方法侵染拟南芥，收种后筛选阳性突变体植株。

3、将新孵化的甜菜孢囊线虫J2幼虫分别接种到预培养3-4周的Hs8H07-OE植株和野生型拟南芥Col0根部。每株接虫500头，种植30株、重复3次。3d，染色统计每株根系中侵染线虫的数量；30d后，分离、统计每株根系的孢囊数量，从而确定靶基因过表达后对BCN侵染和发育的影响。见图6、图7。结果表明Hs8H07在拟南芥中过表达后，3d时甜菜孢囊线虫的侵染数量与对照相比，显著增加；同样地，30d时甜菜孢囊线虫的孢囊量与对照相比，显著增加。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 甜菜孢囊线虫Hs8H07蛋白、编码基因及其应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 350

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Leu Arg Ile Val Leu Leu Asn Ser Ile Leu Ala Leu Phe Gly Asp

1 5 10 15

Cys Met Asp Met Gly Lys Arg Lys Ala Gly Gly Ile Ser Ile Asn Glu

20 25 30

Pro Ile Val Asn Gln Ile Lys Glu Lys Thr Phe Ala Ala Thr Ser Arg

35 40 45

Lys Gly Lys Glu Lys Val Gly Glu Lys Ile Asn Val Met Asp Thr Thr

50 55 60

Glu His Ile Ala Gln Met Asp Ile Ala Gln Asp Lys Asp Lys Met Asp

65 70 75 80

Ile Cys Val Lys Pro Lys His Thr Glu Gln Glu Thr Pro Thr Ile Ser

85 90 95

Leu Lys Cys Ala Asp Asp Val Glu Val Glu Val Glu Leu Asp Arg Asn

100 105 110

Ile Phe Arg Phe Ser Thr Thr Leu Asp Thr Met Met Glu Asp Leu Glu

115 120 125

Met Tyr Asn Ala Glu Gly Lys Lys Gln Lys Leu Pro Val Ser Asn Val

130 135 140

Ser Ser Thr Val Met Arg Lys Val Ile Glu Trp Cys Glu His His Arg

145 150 155 160

Asn Asp Pro Ser Ile Glu Pro Ile Tyr Glu Glu Ile Asp Leu Asp Val

165 170 175

Pro Thr Gly Lys Asp Ala Glu Ala Ser Thr Ser Asn Val Gln Glu Gly

180 185 190

Glu Val Ala Glu Glu Ser Ala Ser Lys Ala Lys Pro Lys Glu Pro Ala

195 200 205

Asn Ile Glu Lys Arg Leu Val Phe Pro Ser Trp Asp Asp Lys Phe Leu

210 215 220

Asp Lys Glu Trp Pro Glu Leu Ala Glu Ile Ile Leu Ala Ala Asn Tyr

225 230 235 240

Leu Asn Ile Lys Leu Leu Leu Thr Phe Ala Thr Thr Met Val Tyr Asn

245 250 255

Lys Trp Val Lys Gly Lys Arg Pro Glu Glu Ile Arg Lys Thr Phe Gly

260 265 270

Val Glu Glu Pro Tyr Pro Pro Gly His Pro Glu Trp Glu Arg Val Glu

275 280 285

Lys Glu Asn Glu Trp Glu Glu Ser Asp Glu Glu Arg Glu Ala Arg His

290 295 300

Ala Lys Glu Arg Glu Glu Glu Glu Glu Arg Glu Arg Lys Glu Glu Gln

305 310 315 320

Lys Arg Lys Glu Ala Glu Ala Glu Arg Leu Arg Gln Glu Gln Leu Gln

325 330 335

Gln Gln Asn Gln Glu Gln Glu His Gln Gln Glu His Gln Gln

340 345 350

<210> 2

<211> 1053

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgctgagga ttgttctact caactccatt ttggcactgt ttggtgattg catggacatg 60

ggaaaaagaa aagcgggagg aataagtatt aatgagccaa ttgtaaatca aatcaaagaa 120

aaaacattcg ccgcaacaag cagaaaaggc aaagaaaaag tcggcgaaaa aataaacgtt 180

atggacacaa ctgaacacat tgctcaaatg gacattgccc aagacaaaga taaaatggac 240

atctgtgtca aacccaaaca tactgagcaa gaaactccaa ccatatccct taaatgcgcg 300

gacgacgtgg aagtggaagt agagctcgat cgtaatattt ttcgtttttc cactacgctc 360

gacactatga tggaagatct tgaaatgtac aatgctgaag gaaaaaaaca gaaattgccg 420

gtttcaaatg tcagtagtac ggtgatgcga aaagtgattg aatggtgcga acatcacaga 480

aacgatcctt caatcgaacc aatttatgag gaaattgatt tggatgtgcc aactggtaaa 540

gatgcggagg catcaacttc aaatgttcaa gagggagaag ttgcggagga atctgcatca 600

aaagccaaac caaaagaacc ggctaatatc gaaaaacgtc tcgtctttcc gagctgggat 660

gacaaatttt tggataagga gtggcctgaa ctagctgaga taattttggc agccaactat 720

ttgaacatca aacttttgct taccttcgcg accacaatgg tttataataa atgggtcaag 780

ggcaaaagac cggaggaaat tcgcaagaca ttcggcgtcg aagaaccgta cccgccggga 840

catcccgaat gggaacgcgt tgagaaggag aacgagtggg aagaatcgga cgaggaacgt 900

gaggcacgcc atgcaaagga acgagaggag gaagaggagc gtgagagaaa ggaagaacag 960

aagcgtaagg aagcggaagc agaacgcctc cgtcaggaac aattgcaaca acagaatcag 1020

gaacaggaac atcagcagga acatcagcag taa 1053

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgctgagga ttgttctact c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttactgctga tgttcctgct g 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaagttgcgg aggaatctg 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttcgacgcc gaatgtcttg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccactacgct cgacactatg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

catcccagct cggaaagacg 20

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gggctgcagg aattcatgga catgggaaaa agaaaag 37

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cttgatatcg aattcctgct gatgttcctg ctga 34

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcgagctcg aattccatgg acgacgtgga agtggaag 38

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggggtaccg aattccattt gaagttgatg cctc 34

<210> 13

<211> 265

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gacgacgtgg aagtggaagt agagctcgat cgtaatattt ttcgtttttc cactacgctc 60

gacactatga tggaagatct tgaaatgtac aatgctgaag gaaaaaaaca gaaattgccg 120

gtttcaaatg tcagtagtac ggtgatgcga aaagtgattg aatggtgcga acatcacaga 180

aacgatcctt caatcgaacc aatttatgag gaaattgatt tggatgtgcc aactggtaaa 240

gatgcggagg catcaacttc aaatg 265

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgtgacctcg agactagtat ggacatggga aaaagaaaag 40

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccgtcgcacc atactagtct gctgatgttc ctgctga 37

Claims

1.下列任一项所述的物质在防治甜菜孢囊线虫中的应用：

(1)一种沉默如SEQ ID NO.2所示的基因的RNAi，所述RNAi的核苷酸序列如SEQ IDNO.13所示；所述SEQ ID NO.2所示的基因为植物内寄生线虫亚腹食道腺细胞表达基因；

(2)一种重组表达载体，包含物质(1)所述的RNAi；

(3)一种重组微生物，包含物质(1)所述的RNAi或物质(2)所述的重组表达载体。

2.一种防治甜菜孢囊线虫的方法，其特征在于，包括使甜菜孢囊线虫摄入RNAi的步骤，所述RNAi的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。