CN100509845C

CN100509845C - 美洲商陆抗菌肽、其前体肽及多核苷酸与应用

Info

Publication number: CN100509845C
Application number: CNB2008100658608A
Authority: CN
Inventors: 彭永鹤; 苏向东; 李永新; 黄毓茂; 皮灿辉
Original assignee: SHENZHEN SUNSMILE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SHENZHEN SUNSMILE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2008-03-17
Filing date: 2008-03-17
Publication date: 2009-07-08
Anticipated expiration: 2028-03-17
Also published as: CN101289501A

Abstract

本发明为一种美洲商陆抗菌肽、其前体肽及多核苷酸与应用。本发明的美洲商陆抗菌肽为美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05，或为其C末端酰胺化修饰物。本发明的美洲商陆抗菌肽的前体肽具有序列表中SEQID NO：2所述的氨基酸序列。本发明的美洲商陆抗菌肽应用于制备抗病菌类产品，如饲料添加剂、兽药、防腐剂、医药产品如抗菌药物等。

Description

美洲商陆抗菌肽、其前体肽及多核苷酸与应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种美洲商陆抗菌肽、其前体肽、编码该前体肽的多核苷酸以及美洲商陆抗菌肽的应用。

背景技术

抗菌肽(antimicrobial peptides)是一类具有抗菌活性的天然小分子蛋白。自1975年瑞典科学家Boman等从蚕蛹身上分离得到第一个抗菌肽天蚕素(Cecropin)以来，人们又在昆虫、两栖类、水产动物，以及包括人在内的哺乳动物甚至植物及细菌等广泛的生物谱中发现了至少900余种抗菌肽。这种内源性的抗菌肽经诱导而合成，在机体抵抗病原入侵方面起着重要的作用，是机体非特异性免疫的重要组成部分。抗菌肽与传统的抗生素相比具有分子量小、抗菌谱广、热稳定性好、抗菌机理独特等优点。而且对细菌、真菌、寄生虫、病毒、癌细胞等都有较强的杀伤作用。

目前对植物多肽抗生素的研究十分活跃，在分离纯化、抗菌特性、细胞毒性、理化性质以及转基因等许多方面的研究进展很快。现已发现了150多种理化性质和抗菌特性各异的植物抗菌素，其中以植物防御素的来源最广，数量多达80种。此外，人们从小麦、大麦、甘蓝、萝卜等作物中发现了硫堇、转脂蛋白等抗菌多肽。近2～3年又发现了荠菜素、环肽、蜕皮素及植物防御素等，大大丰富了植物多肽抗生素家族的类型。绝大多数的植物多肽抗生素富含半胱氨酸(Cys)，而且所有的Cys都形成分子内二硫键，这可能是植物多肽抗生素对热非常稳定的原因。几乎所有的植物抗菌多肽都是以前体(precursor)形式合成的，前体一般都至少包含信号肽和成熟肽。植物抗菌肽的作用机理与动物抗菌肽可能不同，如植物防御素没有和质膜上的磷脂直接作用，但通过一些膜上的高亲和位点介导形成离子通道，破坏膜内外的电势差和膜的通透性。

美洲商陆(Phytolacca americana)原产地于北美，现世界各地引种和归化，中国分布广泛。其作为药用植物常用于利水消肿，解毒杀虫等。Nilgun等从美洲商陆的不同组织或不同生长阶段分离得到多种抗病毒蛋白(pokeweed antiviral proteins，PAPs)。它属于I型核糖体失活蛋白(ribosomeinactivating proteins，RIP)，由于这类蛋白具有抗病毒活性而受到广大研究者的关注。

发明人将本发明的抗菌肽全序列氨基酸结构经蛋白质数据库搜寻比较，未发现有任何相同多肽。发明人将本发明的抗菌肽编码基因经基因数据库进行搜寻比较，也未发现有任何相同基因。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种美洲商陆抗菌肽。

本发明的第二个目的在于提供编码本发明美洲商陆抗菌肽的前体肽。

本发明的第三个目的在于提供编码本发明美洲商陆抗菌肽的前体肽的多核苷酸。

本发明的第四个目的在于将本发明的美洲商陆抗菌肽应用于制备抗病菌类产品。

本发明所述的美洲商陆(Phytolacca americanaL.)采自中国湖南岳阳市郊区。

本发明用构建cDNA文库的方法，从美洲商陆种子中克隆得到抗菌肽成员。

美洲商陆种子cDNA文库的构建：首先从美洲商陆种子提取总RNA。取总RNA进行反转录合成cDNA第一链产物。再取cDNA用于连接反应，转化液分别涂板，其余用于摇总库菌液，从平板上挑取单克隆保种。

本发明通过对以上重组克隆随机挑取克隆进行序列测定并将所测定的序列进行BLAST检索，得到1条EST序列编码美洲商陆抗菌肽。申请人将之命名为美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05。美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05由38个氨基酸组成，含有6个半胱氨酸，根据抗菌肽的特征，形成三对二硫键。美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05的分子量为4193.8道尔顿，等电点为9.3，呈碱性。美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05具有典型的抗菌肽一级结构特征和物理化学特性，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示，具体如下：

Ala Gly CysIle Lys Asn Gly Gly Arg Cys Val Ala Ser Gly Gly

1 5 10 15

Pro Pro Tyr Cys Cys Ser Asn Tyr Cys Tyr Arg Gln Val Gly Trp

20 25 30

Ala His Arg Tyr Cys Lys Asn Arg

35

本发明的美洲商陆抗菌肽，为如下(a)或(b)所述的多肽：

(a)为序列表中SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列，即美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05；

(b)为(a)所述多肽的C末端酰胺化修饰物。

本发明的美洲商陆抗菌肽可以是通过化学合成、基因重组表达获得的产物。

本发明的美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05的前体肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，具体如下：

Met Ala Lys Val Ser Ser Ala Tyr Leu Lys Phe Ala Leu Val Met

1 5 10 15

Ile Leu Leu Leu Ser Val Ile Ser Ala Val Met Ser Ala Gly Cys

20 25 30

Ile Lys Asn Gly Gly Arg Cys Val Ala Ser Gly Gly Pro Pro Tyr

35 40 45

Cys Cys Ser Asn Tyr Cys Tyr Arg Gln Val Gly Trp Ala His Arg

50 55 60

Tyr Cys Lys Asn Arg

65

编码美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05的前体肽的多核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，具体如下：

1 aaaagaaagt aggctaaacc ctttgataaa taatcatcaa catggctaag gtttcatctg

61 cctacctgaa atttgctctc gtcatgattc tcttattaag cgtaatatca gctgttatgt

121 cagcgggatg catcaagaat ggaggaaggt gtgttgcaag tggaggtccc ccatactgtt

181 gctctaacta ctgttaccgt caggttggat gggctcatcg ctattgcaaa aaccgctaat

241 aaacaacaat acatgctgta aagtatgggg gatagactcc catactatat tatgttagag

301 caaaagcctc acttcttatg ttagtgtgtt ttatgttacc ttc-ttatat gtcaaagaag

361 gtatattgaa taagaggctt tatgatatat tgtaagcttt ttaacaatga tatttatata

421 taaaaaaaaa aaaaa

本发明的多核苷酸，为编码美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05的前体肽的多核苷酸。

本发明的多核苷酸，优选为序列表中SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列的多核苷酸。

本发明获得的美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05具有生物活性，具有抗菌作用。分离纯化的Pa-AMP05在100nM时即能抑制部分致病细菌和真菌。因此，本发明的美洲商陆抗菌肽可应用于制备抗病菌类产品，抗病菌类产品包括饲料添加剂、兽药、防腐剂、医药产品如抗菌药物等。

附图说明

图1是本发明的美洲商陆种子cDNA文库重组质粒的菌落PCR电泳图谱；

图2为美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05重组表达产物的SDS-PAGE实验的结果图；

图3为美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05离子交换分离洗脱图；

图4为美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05抑制大肠杆菌生长的实验组实验结果；

图5为美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05抑制大肠杆菌生长的对照组实验结果。

具体实施方式

实施例一：美洲商陆种子cDNA文库的构建及EST序列分析

总RNA的提取和cDNA合成：取美洲商陆种子加液氮磨碎，参照Gibco BRL公司的TRIZOL LS试剂说明书进行总RNA提取。文库构建采用Clontech公司Smart cDNA Library Construction Kit试剂盒，并利用试剂盒本身附带的引物、载体、限制性内切酶等进行实验。取1μg美洲商陆种子总RNA以SMART III寡聚核苷酸片断(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’)和CDSIII/3’PCR引物(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)₃₀N_-1N-3’)进行逆转录合成第一链，得到10μl cDNA第一链产物。取2ul第一链产物以5’PCRprimer(5’-AAGCAGTGGTATAACGCAGAGT-3’)，CDSIII/3’primer(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)₃₀N-₁N-3’)进行扩增，将二链蛋白酶K消化并纯化后用限制性内切酶sfiI进行酶切处理，用T4DNA连接酶连接到以相同限制性内切酶sfiI酶切处理过的文库构建载体质粒上。转化1μl连接产物，取转化液稀释到合适浓度后涂板。随机挑取200个单克隆，摇菌、保种、提取质粒(重组质粒的菌落PCR结果如图1所示)、T7引物单向测序，手工使用BLASTN和BLASTX在线同源比对，SEQTOOL、ClustalX1.83程序分析测序结果。结果显示有两个克隆为美洲商陆抗菌肽基因。

实施例二：美洲商陆抗菌基因Pa-AMP05序列的测定和分析

南海美洲商陆抗菌基因Pa-AMP05的序列来自实施例一美洲商陆种子cDNA文库中所克隆到的2条高度同源的EST序列，对该序列进行生物信息学分析显示其cDNA序列长度为435bp。利用工具软件SEQTOOL对其碱基序列进行分析，并获得其最大开放读码框，长度195bp(不包含终止密码子)，编码65个氨基酸残基的前体肽，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所述，65个氨基酸残基的前体肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所述。进一步分析显示，该前体肽的第1-27位氨基酸残基为其信号肽区域，将前体肽的前导肽和成熟肽部分分开，故确定Pa-AMP05成熟肽的氨基酸序列为AGCIKNGGRCVASGGPPYCCSNYCYRQVGWAHRYCKNR，即序列表中SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列。该成熟肽含有6个半胱氨酸，这6个半胱氨酸在已经发现的美洲商陆抗菌肽中高度保守，并形成三对二硫键构成一致密结构，且后续的实验证明其具有抗菌活性，故美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05为新的植物抗菌肽成员。

实施例三：美洲商陆抗菌肽基因Pa-AMP05的重组表达

本实验采用组氨酸缺陷型毕赤酵母GS115作为宿主菌，采用分泌性表达载体pPICZαA构建重组表达系统。选择SacI内切酶线性化重组载体pPICZαA，然后将通过分子克隆手段使之带有相应酶切位点的抗菌肽Pa-AMP05基因通过T4DNA连接酶与线性化载体连接，再将其转化到大肠杆菌DH5α中，利用Zeocin抗性的低盐LB平板筛选阳性转化子。挑单菌落接种培养，抽提质粒进行酶切验证和测序。整个实验的详细方法参见Sam brook J.编著的《分子克隆试验室手册》。

制备毕赤酵母菌株GS115的感受态细胞。取80ml感受态细胞与10ug SacI单酶切线性化的重组表达质粒混匀，进行电击转化。30℃温育1h后，将菌液涂在含有100ug/ml Zeocin抗生素的YPD固体培养基平板上。30℃恒温培养2~4天，筛选出阳性菌落。同时，将Sacl线性化的pPICZαA空白质粒转化酵母GS115菌株作为空白对照。

将鉴定得到的阳性重组酵母菌分别加入到10ml YPDA培养基中，在30℃恒温培养，进而利用甲醇作为诱导物，对重组目的蛋白Pa-AMP05进行诱导表达。图2显示了分别取未诱导、诱导表达产物和诱导表达产物的上清进行SDS-PAGE实验的结果图。

实施例四：重组美洲商陆抗菌肽的纯化

实施例三所得到的含有重组抗菌肽的发酵上清液，经SephadexG-25柱换成平衡缓冲液(20mM PBS，pH6.0)后，上CM sepharose FF阳离子交换柱。收集穿流峰，用前述平衡缓冲液洗柱至平台期。然后，用溶液A(20mM PBS，pH8.0)和溶液B(含有1M NaCl的20mM PBS，pH8.0)的混合液线性梯度洗脱，收集各洗脱峰，用Tricine/TrisSDS-PAGE电泳(银染)分析(优化后的洗脱方案为分别用100，200，500mM NaCl的PBS溶液洗脱)。结果如图3显示，目的蛋白在含200mMNaCl的20mM PBS(pH8.0)中被洗脱下来。最后可得到纯度在95％以上的重组美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05，得率约为300ug/L培养基。

实施例五：美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05的抑菌活性实验

抗菌活性检测采用药敏纸片法，培养基为LB琼脂培养基。倒入10ml加热溶化的培养基于直径为90ml的培养皿中，使培养基在皿底均匀分布，待凝固后，取0.1ml制备好的大肠杆菌菌液涂布于其上，制成细菌浓度约为10⁶cfu/cm²的含菌平板，同时将在不同浓度抗菌肽溶液浸泡5小时的滤纸片(直径5mm)贴放于培养基上，于37℃生化培养箱中进行恒温培养，24h后测定抑菌圈的大小。所试菌种包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌，均来源于华南农业大学，试验重复三次，取几何平均值。图4和图5所示为100nM抗菌肽Pa-AMP05对大肠杆菌形成抑菌圈的实验结果。

实施例六：美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05可提高母猪猪瘟抗体水平

我们以重组表达的抗菌肽Pa-AMP05为主要活性成分，制成饲料添加剂产品后喂养母猪。实验母猪品种为长白与大白二元杂交种，小猪品种为杜长大三元杂交种。实验组按3‰的比例将汉特150添加到仔猪饲料，以同样比例将汉特150S添加到母猪饲料。试验场内设栏将试验组分隔饲养，每组均设置三次以上重复。

结果表明：在母猪和仔猪添加汉特150系列后，母猪猪瘟抗体效价在1:512以上的比率为80.34％，比对照组提高46％。实验组抗体合格率为96.6％，而对照组仅为71％。以上实验表明，抗菌肽Pa-AMP05具有提高母猪免疫力的作用。

表一抗菌肽Pa-AMP05饲料添加剂喂养母猪后猪瘟抗体水平变化

本发明的美洲商陆抗菌肽Pa-AMP05能抑制部分致病微生物，提高动物免疫力。因此，本发明的美洲商陆抗菌肽可应用于制备抗病菌类产品，如：饲料添加剂、兽药、防腐剂、抗菌药物等。

序列表

<110>深圳市圣西马生物技术有限公司

<120>美洲商陆抗菌多肽、其编码基因、其成熟肽及应用

<160>3

<170>Patent In version 3.1

<210>1

<211>435

<212>DNA

<213>美洲商陆(Phytolacca americana L.)

<400>1

<210>2

<211>65

<212>PRT

<213>美洲商陆(Phytolacca americana L.)

<400>2

<210>3

<211>38

<212>PRT

<213>美洲商陆(Phytolacca americana L.)

<400>3

Claims

1.一种美洲商陆抗菌肽，为如下(a)或(b)所述的多肽：

(a)为序列表中SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列；

(b)为(a)所述多肽的C末端酰胺化修饰物。

2.一种美洲商陆抗菌肽的前体肽，为序列表中SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。

3.一种多核苷酸，为编码权利要求2所述多肽的多核苷酸。

4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于：为序列表中SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。

5.权利要求1所述的美洲商陆抗菌肽在制备抗病菌类产品上的应用，所述抗病菌类产品包括饲料添加剂、兽药、防腐剂和医药产品。