CN106770774B - 一种莲必治注射液的质量测定方法 - Google Patents

一种莲必治注射液的质量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种莲必治注射液的质量测定方法。所述莲必治注射液的质量测定方法具体包括以下步骤：1)配制供试品溶液；2)配制对照品溶液；3)取步骤2)制得的所述对照品溶液注入液相色谱仪中，记录对照品溶液色谱图，调节检测灵敏度；4)取步骤1)制得的所述供试品溶液，注入所述液相色谱仪，记录供试品溶液色谱图；5)比对所述对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图，判断所述待测莲必治注射液的质量。本发明的莲必治注射液的质量测定方法操作简单，重现性好，峰纯度高，准确度高，各峰分离度良好，峰形良好，能准确检测出穿心莲内酯杂质，为亚硫酸氢钠穿心莲内酯后续的一些研究工作开展创造有利条件。

Description

一种莲必治注射液的质量测定方法
技术领域
本发明涉及药物检测技术领域，具体涉及一种莲必治注射液的质量测定方法。
背景技术
莲必治注射液的主要有效成分为亚硫酸氢钠穿心莲内酯，其为一种抗菌消炎药物，已有产品上市销售。
中国新药杂志2005年14卷7期中报道了一种用HPLC检测亚硫酸氢钠穿心莲内酯有关物质的方法，若采用该方法检测并使用DAD检测器进行全波长扫描，可发现其主峰的峰纯度不高，显示有杂质峰包含在主峰内，因此，采用文献已报道的有关物质测定方法检测，结果不准确。同时，文献报道的方法检测时间较长。
所述的有关物质即亚硫酸氢钠穿心莲内酯制备过程中残留在成品中的类似物，异构体，中间体等杂质成分，一般难以分离除去，也难以通过常规方法检测到，为控制产品质量，提高产品纯度，检测有关物质的含量和分离去除有关物质是必要的，因此本发明在于寻找一种快速，准确，适合工业化的检测方法。
目前的执行的测定方法中没有订入已知杂质穿心莲内酯，且分析方法无法检出穿心莲内酯，杂质峰形较差，且分离度不好，主峰里包含杂质未分离出来。
发明内容
为解决上述问题，本发明经过筛选，找到一种灵敏度高、杂质和主成分亚硫酸氢钠穿心莲内酯的分离度高的高效液相色谱检测法。
为实现上述目的，本发明提供一种莲必治注射液的质量测定方法，具体地，该方法包括以下步骤：
1)配制供试品溶液：精密量取待测莲必治注射液，加流动相A制成亚硫酸氢钠穿心莲内酯的浓度为1±0.1mg/ml的溶液；
2)配制对照品溶液：精密量取步骤1)制得的所述供试品溶液，加流动相A制成亚硫酸氢钠穿心莲内酯的浓度为0.01±0.001mg/ml的溶液；
3)取步骤2)制得的所述对照品溶液注入液相色谱仪中，以0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇为流动相A，所述流动相A中，0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇的体积比为68±2:32±2，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，记录对照品溶液色谱图，调节检测灵敏度；
4)取步骤1)制得的所述供试品溶液，注入所述液相色谱仪，按照与步骤3)相同的条件进行梯度洗脱，记录供试品溶液色谱图；
5)比对所述对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图，判断所述待测莲必治注射液的质量。
其中，所述莲必治注射液的规格为常规市售产品中常见的规格，例如5ml:0.25g。优选地，所述流动相A中，0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇的体积比为68±1:32±1，更优选为68:32。该流动相能够很好的洗脱杂质，使主峰中杂质峰得到有效分离。
优选地，以体积百分比计，所述梯度洗脱条件为：
0-5min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
5-15min，所述流动相A减少到75％，所述流动相B增加到25％；
15-20min，所述流动相A 75％，所述流动相B 25％；
20-25min，所述流动相A增加到100％，所述流动相B减少到0％；
25-30min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％。
更优选地，以体积百分比计，所述梯度条件为：
该梯度洗脱方式能够使杂质峰分离效果及峰形良好，能够准确检测出穿心莲内酯杂质峰。
优选地，色谱条件为：色谱柱为：C18柱，4.6mm×150mm，5μm；流速：1.0±0.1ml/min；检测波长：220nm；柱温：30℃±5℃(优选为30℃)；所述对照品溶液以及所述供试品溶液的注入量为10μl。该色谱条件下能够在相对较短时间内准确对供试液进行测试。
优选地，步骤3)中，所述调节检测灵敏度为使主成分的峰高约为记录仪满量程的20％-25％。该灵敏度下，各杂质峰出峰形态好，能够清晰分辨各杂质情况。
优选地，步骤5)中比对所述对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图之前，先判断所述供试品溶液色谱图中是否有穿心莲内酯杂质峰。
本发明所述的莲必治注射液的质量测定方法依据所得的供试品溶液色谱图中是否含有穿心莲内酯杂质峰，具体分为两种情况进行判断：
第一种情况，当所述供试品溶液色谱图中存在穿心莲内酯杂质峰时，判断所述待测莲必治注射液的质量的方法如下：
当所述穿心莲内酯杂质峰的峰面积与校正因子0.43的乘积大于对照溶液色谱图中主峰面积0.2倍；则判断所述待测莲必治注射液的质量为不合格；
当所述穿心莲内酯杂质峰的峰面积与校正因子的乘积小于或等于对照溶液色谱图中主峰面积0.2倍时，执行如下补充判断条件：
当所述供试品溶液色谱图中除穿心莲内酯杂质外，任意其他杂质峰面积不大于所述对照溶液色谱图主峰面积，且所述供试品溶液色谱图中各杂质峰面积的总和不大于对照溶液色谱图主峰面积的1.5倍时，判断所述待测莲必治注射液的质量为合格；反之，即为不合格；其中，计算作为杂质的穿心莲内酯的峰面积时需乘以校正因子0.43。
第二种情况，当所述供试品溶液色谱图中不存在穿心莲内酯杂质峰时，判断所述待测莲必治注射液的质量的方法如下：
当所述供试品溶液色谱图中任意杂质峰面积不大于所述对照溶液色谱图主峰面积，且所述供试品溶液色谱图中各杂质峰面积的总和不大于对照溶液色谱图主峰面积的1.5倍时，判断所述待测莲必治注射液的质量为合格；反之，即为不合格。
优选地，所述穿心莲内酯杂质峰的相对保留时间为主峰的1.58±0.2倍。
优选地，所述莲必治注射液的质量测定方法对于穿心莲内酯杂质检测限为0.12537ng。
与现有技术相比，本发明的莲必治注射液的质量测定方法操作简单，重现性好，峰纯度高，准确度高，杂质分离度及峰形良好，能准确检测出穿心莲内酯杂质，为亚硫酸氢钠穿心莲内酯后续的一些研究工作开展创造有利条件。
附图说明
图1为实验例1所述的现有执行的莲必治注射液的质量测定方法测得的供试液的色谱图。
图2为实验例2所述的现有执行的莲必治注射液的质量测定方法测得的添加有穿心莲内酯的供试液的色谱图。
图3为本发明实验例3所述的莲必治注射液的质量测定方法得到的供试液的色谱图。
图4为本发明实验例4所述的莲必治注射液的质量测定方法得到的供试液的色谱图。
图5为实验例7中所测得的酸破坏的莲必治注射液的色谱图。
图6为实验例7中所测得的碱破坏的莲必治注射液的色谱图。
图7为实验例7中所测得的氧化破坏的莲必治注射液的色谱图。
图8为实验例7中所测得的光破坏的莲必治注射液的色谱图。
图9为实验例7中所测得的高温破坏的莲必治注射液的色谱图。
图10为实施例1中所测得的对照品溶液色谱图。
图11为实施例1中所测得的供试品溶液色谱图。
图12为实施例2中所测得的对照品溶液色谱图。
图13为实施例2中所测得的供试品溶液色谱图。
图14为实施例3中所测得的对照品溶液色谱图。
图15为实施例3中所测得的供试品溶液色谱图。
图16为实施例4中所测得的对照品溶液色谱图。
图17为实施例4中所测得的供试品溶液色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例使用的原料及装置均为常规市售产品，例如：
实验仪器与试剂：
色谱仪：Agilent1260高效液相色谱仪；
综合药品稳定性试验箱：SHH-SSGD；
水浴锅：DK-S22型电热恒温水浴锅；
天平：梅特勒MS204S分析天平、METTLER TOLEDO XS105DU分析天平；
亚硫酸氢钠穿心莲内酯：中国食品药品检定研究院111655-201503含量：100％；
穿心莲内酯：中国食品药品检定研究院110797-201108含量：98.7％；
莲必治注射液：江苏九旭药业有限公司；规格5ml:0.25g；以下简称为样品；
甲醇、乙腈均为色谱纯；磷酸二氢钾、盐酸、氢氧化钠、双氧水均为分析纯。
实验例1
现有的莲必治注射液标准有两个：国家药品监管局标准(试行)WS-811(Z-224)-2002、国家食品药品监管局标准YBZ04452006，这两个标准对于质量测定方法是一致的。本实验例提供了上述现有执行的莲必治注射液的质量测定方法，具体地，该方法如下：
供试品溶液的制备：精密量取莲必治注射液2ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
对照溶液的制备：精密量取供试品溶液2ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法：精密量取对照溶液10μl，注入液相色谱仪，调节检测器的灵敏度，使主成分峰高约为满量程的20％-25％，再精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。
色谱条件与系统适用性试验：色谱柱为：C18柱，4.6mm×250mm，5μm；填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶；以0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液-乙腈-甲醇(70:20:10)为流动相；流速1.0ml/min；柱温30℃；检测波长为220nm。理论板数按亚硫酸氢钠穿心莲内酯峰计算应不低于2000。
其测得的供试液色谱图如图1所示。
供试品溶液色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积0.75倍(即供试品溶液的色谱图的主峰的面积的1.5％)。
实验例2
本实验例提供了现有执行的莲必治注射液的质量测定方法，与实验例1相比，区别仅在于本实验例中的供试品溶液中添加有穿心莲内酯，并且所述穿心莲内酯在供试液中相对主成分亚硫酸氢钠穿心莲内酯的浓度约为0.2％；具体地，供试品溶液的制备：准确移取2ml莲必治注射液于100ml量瓶中，加入适量穿心莲内酯溶液，加流动相A稀释至刻度，得到含亚硫酸氢钠穿心莲内酯1.0mg/ml，含穿心莲内酯0.002mg/ml，其余色谱条件和测定方法均与实验例1相同。
经测定，得到的供试液色谱图如图2所示。
实验例3
本实验例提供了一种莲必治注射液的质量测定方法，所述方法包括以下步骤：
1)配制供试品溶液：精密量取待测莲必治注射液2ml，加流动相A稀释至100ml，即得；
2)配制对照品溶液：精密量取步骤2)制得的所述供试品溶液1.0ml，加流动相A稀释至100ml，即得；
3)取步骤2)制得的所述对照品溶液10μl注入液相色谱仪中，其中，色谱柱为：C18柱，4.6mm×150mm，5μm；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；柱温：30℃；以0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇为流动相A，所述流动相A中，0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇的体积比为68:32，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱条件为：
0-5min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
5-15min，所述流动相A减少到75％，所述流动相B增加到25％；
15-20min，所述流动相A 75％，所述流动相B 25％；
20-25min，所述流动相A增加到100％，所述流动相B减少到0％；
25-30min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
记录对照品溶液色谱图，调节检测灵敏度使主成分的峰高约为记录仪满量程的20％-25％；
4)取步骤1)制得的所述供试品溶液10μl，注入所述液相色谱仪，按照与步骤3)相同的条件进行梯度洗脱，记录供试品溶液色谱图；
5)比对所述对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图，判断所述待测莲必治注射液的质量。
本实验例所测得的供试液色谱图如图3所示。
实验例4
本实验例提供了一种莲必治注射液的质量测定方法，与实验例3相比，区别仅在于本实验例中的供试品溶液中添加有穿心莲内酯，并且所述穿心莲内酯在供试液中相对主成分亚硫酸氢钠穿心莲内酯的浓度约为0.2％；具体地，供试品溶液的制备：准确移取2ml莲必治注射液于100ml量瓶中，加入适量穿心莲内酯溶液，加流动相A稀释至刻度，得到含亚硫酸氢钠穿心莲内酯1.0mg/ml，含穿心莲内酯0.002mg/ml，其余色谱条件和测定方法均与实验例3相同。
经测定，得到的供试液色谱图如图4所示。
通过上述实验例1-4以及图1-4可以看出，现有执行标准没有订入已知杂质穿心莲内酯，且其测定方法无法检出穿心莲内酯杂质；并且得到的杂质峰形较差，分离度不好，主峰中包含杂质未分离出来；而本发明方法能够检出穿心莲内酯杂质峰，并且得到的各杂质峰形好，分离度良好，能够更真实准确反应莲必治注射液的质量情况。
实验例5亚硫酸氢钠穿心莲内酯含量的测定
本实验例提供亚硫酸氢钠穿心莲内酯含量的测定方法，所述方法具体为：
1)配置对照品溶液：精密称取亚硫酸氢钠穿心莲内酯对照品约25mg，置25ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度制成亚硫酸氢钠穿心莲内酯浓度为1mg/ml的溶液，作为对照品溶液；
2)配置供试品溶液：精密量取待测莲必治注射液2ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
3)测定：分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，其中，色谱柱为：C18柱，4.6mm×150mm，5μm；以0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇为流动相A，所述流动相A中，0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇的体积比为68:32，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱条件为：
0-5min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
5-15min，所述流动相A减少到75％，所述流动相B增加到25％；
15-20min，所述流动相A 75％，所述流动相B 25％；
20-25min，所述流动相A增加到100％，所述流动相B减少到0％；
25-30min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；柱温：30℃；记录对照品溶液色谱图以及供试品溶液色谱图；
4)比对步骤3)所得的对照品溶液色谱图以及供试品溶液色谱图，通过计算，即得。
测得所述待测莲必治注射液含亚硫酸氢钠穿心莲内酯(C20H28O4·NaHSO3)为标示量的95.0～105.0％。
实验例6校正因子
本实验例提供校正因子的测定。
穿心莲内酯贮备液：称取穿心莲内酯对照品17.41mg至50ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。
亚硫酸氢钠穿心莲内酯溶液对照品溶液的制备：取亚硫酸氢钠穿心莲内酯对照品16.93mg，精密称定，置20ml量瓶中，加流动相A溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
校正因子溶液的制备：分别精密移取穿心莲内酯贮备液5ml、亚硫酸氢钠穿心莲内酯对照品溶液2.0ml于10ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法：精密吸取上述供试液10μl注入液相色谱仪，重复进样5次，记录色谱图。
计算公式：校正因子＝(A亚×C穿)/(A穿×C亚)
其中，A亚为所的色谱图中亚硫酸氢钠穿心莲内酯溶液的峰面积；A穿为所的色谱图中穿心莲内酯溶液的峰面积；C亚为亚硫酸氢钠穿心莲内酯溶液的浓度；C穿为穿心莲内酯溶液的浓度。
结果：穿心莲内酯校正因子为0.43。
实验例7
为验证本发明所述方法对莲必治注射液质量测定的效果，本试验例提供本发明所述方法对受到不同方式和程度破坏的莲必治注射液进行测定。
溶液的制备：
测定法：分别精密吸取上述各种溶液10μL注入液相色谱仪，其中，色谱柱为：C18柱，4.6mm×150mm，5μm；以0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇为流动相A，所述流动相A中，0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇的体积比为68:32，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱条件为：
0-5min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
5-15min，所述流动相A减少到75％，所述流动相B增加到25％；
15-20min，所述流动相A 75％，所述流动相B 25％；
20-25min，所述流动相A增加到100％，所述流动相B减少到0％；
25-30min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；柱温：30℃；记录色谱图，所得色谱图分别为图5-9，结果见下表：
结论：莲必治注射液的各种破坏产生的杂质峰与主成分峰分离度均大于2.0。
实验例8
为验证本发明所述方法对莲必治注射液质量测定的效果，本实验例验证了本发明所述莲必治注射液的质量测定方法相关的线性与范围、检测限和定量限。
对于已知杂质，检测限(LOD)和定量限(LOQ)是根据信噪比法来确定的。把已知浓度的杂质储备溶液稀释到低浓度的试样，测出的信号与空白处的信号(基线噪音)进行比较，算出能被可靠的检测出的最低浓度或百分比。当信躁比(S/N)为10左右时为定量限，信躁比为3左右时为检测限。各定量限溶液重复进样6次，峰面积RSD不大于5％；各检测限溶液重复进2次，对于未知杂质，用亚硫酸氢钠穿心莲内酯替代考察单个未知杂质的检测限和定量限。
对于已知杂质，线性指在LOQ浓度至不低于150％指标浓度的范围内取6个浓度点进行研究。线性关系以测得的响应信号(Y轴)对被分析物浓度(X轴)的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，要求该线性回归系数R值不小于0.990，Y轴截距与100％浓度响应值的比值不大于25％。对于未知杂质，用亚硫酸氢钠穿心莲内酯替代考察单个未知杂质的线性和范围。
穿心莲内酯对照品溶液的制备：精密移取穿心莲内酯贮备液3ml，置200ml量瓶中，加流动相A使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。浓度C穿＝5.1551μg/ml。
亚硫酸氢钠穿心莲内酯对照溶液的制备：精密移取亚硫酸氢钠穿心莲内酯贮备液3ml，置100ml量瓶中，加穿心莲内酯对照品溶液稀释至刻度，摇匀，即得。浓度C亚＝25.395μg/ml，C穿＝5.1551μg/ml。
线性1：精密移取亚硫酸氢钠穿心莲内酯对照溶液6.0ml于10ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。浓度C亚＝15.237μg/ml，C穿＝3.0931μg/ml。
线性2：精密移取亚硫酸氢钠穿心莲内酯对照溶液5.0ml于10ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。浓度C亚＝12.6975μg/ml，C穿＝2.5776μg/ml。
线性3：精密移取亚硫酸氢钠穿心莲内酯对照溶液4.0ml于10ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。浓度C亚＝10.158μg/ml，C穿＝2.0620μg/ml。
线性4：精密移取线性1溶液5.0ml于10ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。浓度C亚＝7.6185μg/ml，C穿＝1.5465μg/ml。
线性5：精密移取线性3溶液5.0ml于10ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。浓度C亚＝5.079μg/ml，C穿＝1.0310μg/ml。
穿心莲内酯定量限溶液：精密移取线性3溶液1ml于50ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。C穿＝0.04124μg/ml。
穿心莲内酯检测限溶液：精密移取穿心莲内酯定量限溶液3ml于10ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。C穿＝0.01237μg/ml。
亚硫酸氢钠穿心莲内酯定量限溶液：精密移取线性3溶液1ml于100ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。C亚＝0.1016μg/ml。。
亚硫酸氢钠穿心莲内酯检测限溶液：精密移取穿心莲内酯定量限溶液3ml于10ml量瓶中，加流动相A稀释至刻度，摇匀，即得。C亚＝0.03047μg/ml。
测定法：分别精密吸取上述溶液各10μl注入液相色谱仪，各定量限溶液重复进样6次，各检测限溶液重复进2次，
其中，色谱柱为：C18柱，4.6mm×150mm，5μm；以0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇为流动相A，所述流动相A中，0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇的体积比为68:32，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱条件为：
0-5min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
5-15min，所述流动相A减少到75％，所述流动相B增加到25％；
15-20min，所述流动相A 75％，所述流动相B 25％；
20-25min，所述流动相A增加到100％，所述流动相B减少到0％；
25-30min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；柱温：30℃；记录色谱图。
结论：定量限的主峰保留时间、峰面积重复性均良好。本法能定量检出0.4124ng穿心莲内酯杂质，即0.004％的穿心莲内酯杂质能被定量检出，穿心莲内酯杂质的限度值均定为0.2％，所以本法能满足穿心莲内酯杂质定量测定的要求；本法能定量检出亚硫酸氢钠穿心莲内酯1.016ng，即0.01％的杂质能被定量检出，未知杂质的限度值定为1.0％，所以本法能满足杂质定量测定的要求。本方法穿心莲内酯杂质检测限为0.12537ng，即0.001％的穿心莲内酯杂质能被检出。
亚硫酸氢钠穿心莲内酯溶液浓度在0.10158～15.237μg/ml范围(即定量限至150％限度)内峰面积与样品量呈较好的线性关系，相关系数为0.9999，截距与100％响应值比值为0.23％，符合规定。
穿心莲内酯杂质溶液浓度在0.041784～3.1338μg/ml(即定量限至150％限度)范围内峰面积与样品量呈较好的线性关系，相关系数为0.9998，截距与100％响应值的比值为0.24％，符合规定。
实施例1
本实施例提供了一种莲必治注射液的质量测定方法。具体地，所述方法包括以下步骤：
1)配制供试品溶液：精密量取待测莲必治注射液2ml，加流动相A稀释至100ml，即得；
2)配制对照品溶液：精密量取步骤2)制得的所述供试品溶液1.0ml，加流动相A稀释至100ml，即得；
3)取步骤2)制得的所述对照品溶液10μl注入液相色谱仪中，其中，色谱柱为：C18柱，4.6mm×150mm，5μm；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；柱温：30℃；以0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇为流动相A，所述流动相A中，0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇的体积比为66:34，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，以体积百分比计，所述梯度洗脱条件为：
0-5min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
5-15min，所述流动相A减少到75％，所述流动相B增加到25％；
15-20min，所述流动相A 75％，所述流动相B 25％；
20-25min，所述流动相A增加到100％，所述流动相B减少到0％；
25-30min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
记录对照品溶液色谱图，如图10所示，调节检测灵敏度使主成分的峰高约为记录仪满量程的20％-25％；
4)取步骤1)制得的所述供试品溶液10μl，注入所述液相色谱仪，按照与步骤3)相同的条件进行梯度洗脱，记录供试品溶液色谱图，如图11所示；
5)比对所述对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图，判断所述待测莲必治注射液的质量。
经对比，所得供试品溶液色谱图中不存在穿心莲内酯杂质峰，所述供试品溶液色谱图中任意杂质峰面积均不大于所述对照溶液色谱图主峰面积，且所述供试品溶液色谱图中各杂质峰面积的总和为对照溶液色谱图主峰面积的0.53倍。
由上述比对结果可知，该待测莲必治注射液中不含穿心莲内酯杂质，且不存在单一的含量大于1％的杂质，并且所有杂质的总和在待测莲必治注射液中的含量为0.53％，小于1.5％；因此认定该待测莲必治注射液合格。以现有测定方法测定本实施例所用待测莲必治注射液，同样得到合格的结论。
即所述方法能够准确测定莲必治注射液的质量。
实施例2
本实施例提供了一种莲必治注射液的质量测定方法。具体地，所述方法包括以下步骤：
1)配制供试品溶液：精密量取待测莲必治注射液2ml，加流动相A稀释至100ml，即得；
2)配制对照品溶液：精密量取步骤2)制得的所述供试品溶液1.0ml，加流动相A稀释至100ml，即得；
3)取步骤2)制得的所述对照品溶液10μl注入液相色谱仪中，其中，色谱柱为：C18柱，4.6mm×150mm，5μm；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；柱温：30℃；以0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇为流动相A，所述流动相A中，0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇的体积比为68:32，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，以体积百分比计，所述梯度洗脱条件为：
0-5min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
5-15min，所述流动相A减少到75％，所述流动相B增加到25％；
15-20min，所述流动相A 75％，所述流动相B 25％；
20-25min，所述流动相A增加到100％，所述流动相B减少到0％；
25-30min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
记录对照品溶液色谱图，如图12所示，调节检测灵敏度使主成分的峰高约为记录仪满量程的20％-25％；
4)取步骤1)制得的所述供试品溶液10μl，注入所述液相色谱仪，按照与步骤3)相同的条件进行梯度洗脱，记录供试品溶液色谱图，如图13所示；
5)比对所述对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图，判断所述待测莲必治注射液的质量。
经对比，所得供试品溶液色谱图中存在穿心莲内酯杂质峰，所述穿心莲内酯杂质峰的面积与校正因子0.43的乘积为对照溶液色谱图中主峰面积0.05倍；所述供试品溶液色谱图中任意杂质峰面积均不大于所述对照溶液色谱图主峰面积，且所述供试品溶液色谱图中各杂质峰面积的总和(其中，计算作为杂质的穿心莲内酯的峰面积时已乘以校正因子0.43)为对照溶液色谱图主峰面积的1.1倍。
由上述比对结果可知，虽然该待测莲必治注射液中含穿心莲内酯杂质，但其含量为0.05％，在0.2％以内，且不存在单一的含量大于1％的杂质，并且所有杂质的总含量为1.1％，在1.5％以内，因此认定该待测莲必治注射液合格。以现有测定方法测定本实施例所用待测莲必治注射液，同样得到合格的结论，然而现有测定方法无法测出穿心莲内酯杂质。
即所述方法能够准确测定莲必治注射液的质量，并且能够测出穿心莲内酯杂质。
实施例3
本实施例提供了一种莲必治注射液的质量测定方法。本实施例所用待测莲必治注射液为浙江九旭药业有限公司在售规格5ml:0.25g的产品，然而，其生产日期距本实施例的测定时间为2.5年，即已经超过保质期1年。具体地，所述方法包括以下步骤：
1)配制供试品溶液：精密量取待测莲必治注射液2ml，加流动相A稀释至100ml，即得；
2)配制对照品溶液：精密量取步骤2)制得的所述供试品溶液1.0ml，加流动相A稀释至100ml，即得；
3)取步骤2)制得的所述对照品溶液10μl注入液相色谱仪中，其中，色谱柱为：C18柱，4.6mm×150mm，5μm；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；柱温：30℃；以0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇为流动相A，所述流动相A中，0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇的体积比为66:34，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，以体积百分比计，所述梯度洗脱条件为：
0-5min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
5-15min，所述流动相A减少到75％，所述流动相B增加到25％；
15-20min，所述流动相A 75％，所述流动相B 25％；
20-25min，所述流动相A增加到100％，所述流动相B减少到0％；
25-30min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
记录对照品溶液色谱图，如图14所示，调节检测灵敏度使主成分的峰高约为记录仪满量程的20％-25％；
4)取步骤1)制得的所述供试品溶液10μl，注入所述液相色谱仪，按照与步骤3)相同的条件进行梯度洗脱，记录供试品溶液色谱图，如图15所示；
5)比对所述对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图，判断所述待测莲必治注射液的质量。
经对比，所得供试品溶液色谱图中不存在穿心莲内酯杂质峰，所述供试品溶液色谱图中5.355min处杂质峰面积为所述对照溶液色谱图主峰面积的1.1倍，且所述供试品溶液色谱图中各杂质峰面积的总和为对照溶液色谱图主峰面积的2.2倍。
由上述比对结果可知，虽然该待测莲必治注射液中不含穿心莲内酯杂质，但存在5.355min处杂质含量为1.1％，大于1％，且所有杂质的总含量为2.2％，大于1.5％，因此，认定该待测莲必治注射液不合格。以现有测定方法测定本实施例所用待测莲必治注射液，同样得到不合格的结论。
即所述方法能够准确测定莲必治注射液的质量。
实施例4
本实施例提供了一种莲必治注射液的质量测定方法。本实施例所用待测莲必治注射液为浙江九旭药业有限公司规格5ml:0.25g的产品，然而，由于该批制剂所用原料中穿心莲内酯杂质较大，制成注射液后穿心莲内酯不合格，故最终产品按不合格品处理。具体地，所述方法包括以下步骤：
1)配制供试品溶液：精密量取待测莲必治注射液2ml，加流动相A稀释至100ml，即得；
2)配制对照品溶液：精密量取步骤2)制得的所述供试品溶液1.0ml，加流动相A稀释至100ml，即得；
3)取步骤2)制得的所述对照品溶液10μl注入液相色谱仪中，其中，色谱柱为：C18柱，4.6mm×150mm，5μm；流速：1.0ml/min；检测波长：220nm；柱温：30℃；以0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇为流动相A，所述流动相A中，0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇的体积比为66:34，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，以体积百分比计，所述梯度洗脱条件为：
0-5min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
5-15min，所述流动相A减少到75％，所述流动相B增加到25％；
15-20min，所述流动相A 75％，所述流动相B 25％；
20-25min，所述流动相A增加到100％，所述流动相B减少到0％；
25-30min，所述流动相A 100％，所述流动相B 0％；
记录对照品溶液色谱图，如图16所示，调节检测灵敏度使主成分的峰高约为记录仪满量程的20％-25％；
4)取步骤1)制得的所述供试品溶液10μl，注入所述液相色谱仪，按照与步骤3)相同的条件进行梯度洗脱，记录供试品溶液色谱图，如图17所示；
5)比对所述对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图，判断所述待测莲必治注射液的质量。
经对比，所得供试品溶液色谱图中存在穿心莲内酯杂质峰，所述穿心莲内酯杂质峰的面积与校正因子0.43的乘积为对照溶液色谱图中主峰面积0.22倍；所述供试品溶液色谱图中任意杂质峰面积均不大于所述对照溶液色谱图主峰面积，然而所述供试品溶液色谱图中各杂质峰面积的总和(其中，计算作为杂质的穿心莲内酯的峰面积时已乘以校正因子0.43)为对照溶液色谱图主峰面积的0.70倍。
由上述比对结果可知，虽然该待测莲必治注射的总杂质含量为0.7％，小于1.5％，然而，其穿心莲内酯杂质含量达到0.22％，即超过了0.2％，因此，认定该待测莲必治注射液仍认定不合格。由于现有测定方法无法检测出穿心莲内酯杂质，因此，现有测定方法得出了合格的结论，这可能导致不合格的产品流入市场，对可能接受注射治疗的患者产生更多不良反应，产生不利影响。
因此，所述方法能够准确测定莲必治注射液的质量，并且能够测出穿心莲内酯杂质。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (3)

1.一种莲必治注射液的质量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)配制供试品溶液：精密量取待测莲必治注射液，加流动相A制成亚硫酸氢钠穿心莲内酯的浓度为1±0.1mg/ml的溶液；
2)配制对照品溶液：精密量取步骤1)制得的所述供试品溶液，加流动相A制成亚硫酸氢钠穿心莲内酯的浓度为0.01±0.001mg/ml的溶液；
3)取步骤2)制得的所述对照品溶液注入液相色谱仪中，以0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液-甲醇为流动相A，所述流动相A中，0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液与甲醇的体积比为68±2:32±2，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，记录对照品溶液色谱图，调节检测灵敏度；所述调节检测灵敏度为使主成分的峰高为记录仪满量程的20％-25％；
4)取步骤1)制得的所述供试品溶液，注入所述液相色谱仪，按照与步骤3)相同的条件进行梯度洗脱，记录供试品溶液色谱图；
5)判断所述供试品溶液色谱图中是否有穿心莲内酯杂质峰，然后比对所述对照品溶液色谱图和供试品溶液色谱图，判断所述待测莲必治注射液的质量；
其中，以体积百分比计，所述梯度洗脱条件为：
0-5min，所述流动相A100％，所述流动相B0％；
5-15min，所述流动相A减少到75％，所述流动相B增加到25％；
15-20min，所述流动相A75％，所述流动相B25％；
20-25min，所述流动相A增加到100％，所述流动相B减少到0％；
25-30min，所述流动相A100％，所述流动相B0％；
色谱条件为：色谱柱为：C18柱，4.6mm×150mm，5μm；流速：1.0±0.1ml/min；检测波长：220nm；柱温：30℃±5℃；
其中，当所述供试品溶液色谱图中存在穿心莲内酯杂质峰时，判断所述待测莲必治注射液的质量的方法如下：
当所述穿心莲内酯杂质峰的峰面积与校正因子0.43的乘积大于对照溶液色谱图中主峰面积0.2倍；则判断所述待测莲必治注射液的质量为不合格；
当所述穿心莲内酯杂质峰的峰面积与校正因子的乘积小于或等于对照溶液色谱图中主峰面积0.2倍时，执行如下补充判断条件：
当所述供试品溶液色谱图中除穿心莲内酯杂质外，任意其他杂质峰面积不大于所述对照溶液色谱图主峰面积，且所述供试品溶液色谱图中各杂质峰面积的总和不大于对照溶液色谱图主峰面积的1.5倍时，判断所述待测莲必治注射液的质量为合格；反之，即为不合格；其中，计算作为杂质的穿心莲内酯的峰面积时需乘以校正因子0.43；
当所述供试品溶液色谱图中不存在穿心莲内酯杂质峰时，判断所述待测莲必治注射液的质量的方法如下：
当所述供试品溶液色谱图中任意杂质峰面积不大于所述对照溶液色谱图主峰面积，且所述供试品溶液色谱图中各杂质峰面积的总和不大于对照溶液色谱图主峰面积的1.5倍时，判断所述待测莲必治注射液的质量为合格；反之，即为不合格。
2.根据权利要求1所述的质量测定方法，其特征在于，所述穿心莲内酯杂质峰的相对保留时间为主峰的1.58±0.2倍。
3.根据权利要求1或2所述的质量测定方法，其特征在于，所述方法对于穿心莲内酯杂质检测限为0.12537ng。
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