CN106755081A - 一种棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法。以陆地棉中发现的GhbZIP1为目的基因，采用转基因方法获得细胞质雄性不育种质，继而与同源或异源保持系或品种(系)进行核置换回交，即可选育出质核同源或质核异源的雄性不育系。因本发明所得雄性不育系的细胞核源于非转基因的保持系或品种(系)，因而不含转基因质粒载体，与非转基因植物无异，不存在安全风险和市场风险；所得雄性不育系的细胞质源于栽培品种(系)，有利于组配出强优势杂交组合；由此可创造出多种细胞质雄性不育种质，从而避免了农业生产上由于单一细胞质杂交种的大面积推广和长期利用可能导致的某一病害大流行的潜在风险，具有极为广阔的应用前景。

Description

一种棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法
技术领域
本发明涉及育种方法，具体地说，涉及棉花转GhbZIP1基因创制细胞质雄性不育系的方法。
背景技术
棉花，锦葵科棉属，是世界上最主要的农作物之一。它既是最重要的纤维作物，又是重要的油料作物，也是含高蛋白的粮食作物，还是纺织、精细化工原料和重要的战略物资。棉花表现出强大的杂种优势，其杂种优势率高达20％-30％。长期以来，棉花杂种优势利用是国内外棉花育种的重要内容。
棉花既可利用细胞核雄性不育系、也可利用细胞质雄性不育系生产杂交种子。虽然细胞核雄性不育系的利用易于找到恢复系和组配出强优势杂交组合，但不育系的繁殖存在问题，一般利用细胞核雄性不育两用系中分离出的雄性不育株(基因型为msms)与育性基因杂合的可育姊妹株(基因型为Msms)杂交的方法保持，从不育株上收的种子繁殖后代仍然表现不育株与可育株的1：1分离，因此，杂交制种田必须每年拔除母本区50％左右的雄性可育株，工作量集中，劳动强度大；且因群体中可育株与不育株分布的不均匀性，往往存在连续拔除多株可育株的问题，既浪费了土地空间，又增加了种子生产成本。
为解决此问题，四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所和四川诺亚生物科技有限公司，根据棉花在热带地区的多年生特性，于2007年申请了1项国家发明专利，发明名称为“利用棉花雄性不育系和恢复系进行宿根再生的杂交制种方法”(申请号：200710049843.0)。该发明指出棉花植株能够越冬的制种区是冬季最低温度≧10℃，年日照时数1700-2100小时，日照百分率为50-60％，全年降雨量为800-1200mm的地区。从温度条件看，应属于中热带地区(盛承禹等编著.中国气候总论.科学出版社，1986，第406页)，但热带有旱季和雨季之分，雨季多台风，不利于棉花的杂交制种，所以，又要求其降雨量小于1200mm。因此，满足上述所有条件的地区是很少的，可能只有云南或云南与四川交界的部分地区具有这种小气候特征，而这些地区，大多比较偏远，交通不便，不利于棉花的规模化杂交制种。而且，该发明还没有解决不育系的繁殖问题，只是利用了不育系在热带地区可多年生长的特性。但由于一年生棉花根系入土浅，易早衰，就是在最适合生长的温度条件下一般也只能宿根栽培2-3年，又需要重新播种。
为解决棉花的宿生栽培问题，广西大学周瑞阳发明了“一年生棉花的多年生杂交制种方法”(ZL200910078533.0)。其首先鉴定一年生棉花杂交亲本的自然越冬能力；对于不能自然越冬的一年生棉花杂交亲本，以棉属中能够自然越冬的多年生棉花种质资源为砧木进行嫁接，并宿根栽培所得嫁接植株；对于能够自然越冬的一年生棉花杂交亲本，直接种植并宿根栽培其实生植株，或以上述方法嫁接后宿根栽培；然后利用上述实生植株和/或嫁接植株进行杂交制种。本发明的杂交制种方法不需每年播种，不需每年耕整土地，不需每年去杂去劣，降低了雄性不育系的繁殖成本，简化了杂交种子生产程序，并可提高杂交制种的产量。但该发明存在嫁接大量用工的问题，且只能在华南南部实现多年生栽培，存在地域限制。
利用细胞质雄性不育系与保持系回交的方法虽能保持雄性不育特性，但前人选育的细胞质雄性不育系多数具哈克尼西棉细胞质，其恢复系较少，且恢复系和杂交种对高温敏感，在夏季的高温条件下，恢复系和杂交种散粉困难，难以在生产上大面积推广应用。
因此，尽管人工去雄存在投入大、成本高等问题，但由于没有更好的棉花杂交种子生产方法，几年前仍以人工去雄杂交制种为主，为降低种子生产成本，一般利用F2代。但由于劳动力成本的不断上升，棉花杂交种子生产企业已不堪重负，生产上已基本没有棉花杂交种推广应用。
在农业生产中，由单一细胞质雄性不育系组配的杂交种的大面积推广和长期利用可能成为某一病害生理小种的哺育品种，从而存在某一病害大流行的风险。解决这一问题的基本途径是获得多种细胞质来源的雄性不育系，而不同细胞质来源的雄性不育系的选育源于细胞质雄性不育种质的遗传多样性。但迄今为止，植物细胞质雄性不育种质一般源于自然突变或采用远缘杂交的方法获得，而自然突变几率很低，远缘杂交又难以成功，因此，许多作物因雄性不育种质的缺乏至今尚未选育出细胞质雄性不育系。若能采用转基因方法创造细胞质雄性不育种质将具有极其重要的科学意义和广阔的利用前景。
本团队长期致力于植物雄性不育种质创新及其分子基础的研究工作。2010年，周瑞阳指导的博士研究生刘冬梅应用illumina的短reads测序技术，以陆地棉“洞A”(引自四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所)为材料，取不育株和可育株小孢子单核早期花药进行转录组测序，分析了不育株和可育株花药转录组差异。2013年，周瑞阳指导的博士研究生李敏结合RACE技术与hiTAIL-PCR技术克隆得到1个棉花bZIP转录因子的cDNA序列，暂命名为GhbZIP1。该基因包含1个完整的拥有471bp的开放阅读框，编码156个氨基酸。GhbZIP1蛋白具有典型的bZIP保守结构域，与拟南芥等植物bZIP1蛋白的保守区相似性较高，此外，qPCR分析表明GhbZIP1基因在“洞A”可育株花药的4个主要时期(小孢子单核早期、小孢子单核期、双核期及花粉形成期)的表达均明显高于不育株。由此提示，GhbZIP1基因可能与棉花雄性不育相关，但与雄性不育可能有关的基因与细胞质雄性不育系的创制是两个完全不同的问题。
经过多年的探索性研究发现，采用花粉管通道法转陆地棉“洞A”的GhbZIP1基因，成功创造出了陆地棉细胞核雄性不育种质，继而转育成陆地棉和海岛棉细胞质雄性不育系。对此，国内外均未见报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种棉花转GhbZIP1基因创制细胞质雄性不育系的方法。
为了实现本目的，本发明的技术方案如下：
一种棉花转GhbZIP1基因创制细胞质雄性不育系的方法，包括如下步骤：
S1、构建可超量表达目标基因的重组表达载体；
目标基因如SEQ ID No.1所示；
S2、将上述重组表达载体采用花粉管通道法导入棉花栽培品种(系)中，收获T0代种子；
S3、播种上述T0代种子获得T1代植株，在T1代植株中筛选鉴定出花药不开裂的雄性不育株，即为转基因雄性不育种质；
S4、以上述转基因雄性不育种质为母本，与同一品种来源的非转基因植株进行核置换回交；或者以其与异源保持系(或品种/系)杂交或任一回交后代中的雄性不育株为母本，与转基因供体为同一品种来源的品种/系为父本，进行核置换回交；获得质核同源细胞质雄性不育系；
或将上述雄性不育种质与异源保持系杂交，并与异源保持系核置换回交，获得质核异源细胞质雄性不育系。
其中，所述异源保持系是指与转基因材料没有亲缘关系的雄性不育保持系或常规品种(系)。
以上述选育的所有转基因质核同源和质核异源细胞质雄性不育系为母本，以同源或异源保持系为父本，重复S4步骤，又可选育出新的质核同源和质核异源细胞质雄性不育系。
作为优选，S2中，将重组表达载体采用花粉管通道法导入棉花品种(系)中，如陆地棉品种G-4(由“中棉16”与“金刚王”杂交F5代选育而成，其中“中棉16”引自中国农业科学院，棉花研究所，“金刚王”从湖北省种子公司购入)。
作为优选，所述重组表达载体含有CaMV35S启动子，用于使所述基因序列超量表达。
作为优选，在回交的同时，每个世代选择性状与父本相似，且花药不开裂的雄性不育株继续回交，同时父本套袋自交，回交不低于5～6代。
本发明涉及到的原料均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
更为具体地，本发明所述方法涉及步骤如下：
1、GhbZIP1基因cDNA的克隆
通过分析“洞A”的RNA-seq数据，并以此序列作为中间片段，设计特异引物(引物的设计均采用Primer Premier 5.0软件设计)，结合RACE技术和hi-TAIL PCR技术克隆GhbZIP1基因cDNA的全长序列。
运用RACE技术，合成反转录引物AUAP(所有引物见附表1)，锚定引物AP，合成扩增5′特异引物：SHP1和SHP2，采用巢式PCR和降落PCR技术，经过两轮扩增挖取符合要求条带进行克隆、测序与中间片段进行拼接，得到长度为194bp的序列，与GhbZIP1中间序列重复81个碱基，新增序列长度为113bp，得到5′端序列。
表1运用RACE技术合成反转录所有引物AUAP
采用改良hi-TAILPCR技术。本试验的简并引物AD1-AD4和通用引物AC1均引用。其中简并引物AD1与AD2简并倍数为2304；AD3与AD4简并倍数为6912。同时在同源克隆获得的保守片段的3′端约200-300bp处，分别设计3条巢式特异引物：A1、A2和A3，采用巢式PCR，经过三轮扩增挖取符合要求条带进行克隆、测序与中间片段进行拼接，得到长度为728bp的序列，与GhbZIP1中间序列重复258个碱基，新增序列长度为470bp，得到3′端序列。
将上述获得的5′端序列和3′端序列使用DNAMAN6.0进行拼接后，设计基因全长引物GF/GR，使用高保真Taq酶进行PCR扩增、回收、连接、克隆和测序(图1)。通过PlantTranscription Factor Database(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php)进行序列同源性比对搜索，发现其与雷蒙克氏棉bZIP1序列相似度为99％，位于第六号染色体，故将该基因命名GhbZIP1。
2、GhbZIP1基因的重组植物表达载体PBI121-GhbZIP1-eGFP的构建
由步骤1所述“洞A”GhbZIP1基因的开放阅读框序列与植物表达载体PBI121-eGFP构成。具体方法是：
(1)以GhbZIP1基因全长序列(去除终止子)，使用Primer Premier5.0设计引物PgS/PgA(表1)，并且在5’端加上Xba I酶切位点，在3’端加上Kpn I酶切位点；使用TakaRa高保真酶，PCR扩增并回收后，连接到T-Vector pMD-19(simple)上，摇菌，提取T-Vector pMD-19(simple)-GhbZIP1质粒，为中间载体。
PCR反应体系：Taq 0.2μL，10*Buffer 2μL，10mM dNTP 0.4μL，DNA模板0.5μL，引物PgS/PgA各0.6μL，ddH2O补至终体积20μL。
PCR反应程序：95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃40s，30个循环；72℃5min；12℃保存。
GhbZIP1基因全长序列(去除终止子)如SEQ ID No.1所示。
(2)上述步骤(1)中获得的含有GhbZIP1的全长cDNA的中间载体经过Xba I和Kpn I双酶切后获得带有酶切粘性末端的GhbZIP1基因片段。PBI121-eGFP载体(本实验室保存)也用同样的Xba I和Kpn I双酶切，回收带有CaMV35S启动子的载体片段。将GhbZIP1的全长cDNA基因片段与载体片段用连接酶连接，得到以CaMV35S启动子驱动的重组植物超量表达载体PBI121-GhbZIP1，称为PBI121-GhbZIP1-eGFP(图2)。
3.PBI121-GhbZIP1-eGFP植物重组表达载体的导入
采用花粉管通道法进行。其具体步骤是：
(1)材料选取：陆地棉品系G-4。在盛花期，第一天下午选取长势的优良的植株，将第二天要开放的花蕾，用塑料夹子将花蕾顶部夹住，以防外来花粉污染；
(2)自花授粉：第二天上午进行严格自交，自交后再用塑料夹子将花夹住；
(3)重组表达载体的微量注射：第三天下午，用经过严格消毒处理过的微量进样器，吸取浓度为100ng/μL的PBI121-GhbZIP1-eGFP植物表达载体质粒10μl，沿着花粉管垂直插入至子房中，并将质粒注入子房中即完成超表达载体的微量注射；
(4)收获：待上述注射PBI121-GhbZIP1-eGFP植物表达载体质粒的果实自然成熟后，单株上的同类种子合并编号，即获得T0代种子。
4.转基因棉花细胞质雄性不育种质资源的获得
播种上述T0代即获得T1代植株，于开花期调查T1代植株育性，如花药不能开裂即为雄性不育株，计算雄性不育株与总植株数的比率。由此可直接获得棉花细胞质雄性不育种质资源。
5、棉花转基因细胞质雄性不育系的选育
以步骤4获得的细胞质雄性不育种质资源为材料，可选育出质核同源和质核异源细胞质雄性不育系：
(1)转基因质核同源细胞质雄性不育系的选育方法：将上述T0代发现的雄性不育株与同一品种来源的非转基因植株进行核置换核置换回交；或者以其与异源保持系杂交或其任一回交后代中的雄性不育株为母本，与转基因供体为同一品种来源的品种/系为父本，进行核置换回交。其回交父本即为雄性不育保持系。由此选育的细胞质雄性不育系，因其细胞质和细胞核均源于同一品种，故为质核同源细胞质雄性不育系。
(2)转基因质核异源细胞质雄性不育系的选育：将上述雄性不育株与异源保持系(与转基因材料没有亲缘关系的雄性不育保持系或品种/系)杂交，并与异源保持系核置换回交，即可获得具有步骤5所述雄性不育种质资源的细胞质、异源保持系细胞核的雄性不育系，该异源保持系即为该不育系的保持系。由于该类型不育系的细胞质源于转基因创造的雄性不育细胞质，细胞核源于转基因供体材料以外的异源保持系，因其细胞质和细胞核的品种来源不同，故称为质核异源细胞质雄性不育系。
以上述选育的所有转基因质核同源和质核异源细胞质雄性不育系为母本，以同源或新的异源保持系为父本，重复上述步骤，又可选育出新的质核同源和质核异源细胞质雄性不育系。
本发明在回交过程中，每个世代选择性状与父本相似，且花药不开裂的雄性不育株继续回交，同时父本套袋自交。所述核置换回交的回交世代数不低于5～6代。
本发明经过了长达7年的探索性研究，付出了巨大的创新性劳动。其创造性在于，采用转基因方法获得细胞质雄性不育种质，继而与同源保持系和异源保持系进行核置换回交，选育出了质核同源和质核异源细胞质雄性不育系。
本发明的有益效果在于：
本发明以栽培品种作为转基因供体，由此选育出的雄性不育系为栽培品种细胞质雄性不育系。由于栽培种的进化程度高于野生种，有利基因多，因此，栽培品种细胞质雄性不育系有利于组配出强优势组合，同时，也避免了农业生产上由于单一细胞质杂交种的大面积推广和长期利用可能导致的某一病害大流行的潜在风险。不仅如此，按照本发明方法选育的细胞质雄性不育系不存在转基因质粒载体，与非转基因植物无异，不存在安全风险和市场风险。因而，本发明具有极为广阔的利用前景。
附图说明
图1为本发明目标基因全长cDNA扩增、3′hi-TAIL扩增及5′RACE扩增产物的电泳图；M:DL2000；a：全长cDNA扩增产物；b：3′hi-TAIL扩增产物；c：5′RACE扩增产物。
图2为本发明重组表达载体PBI121-GhbZIP1-eGFP的构建过程。
图3为本发明所述棉花细胞质雄性不育系选育的技术路线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是：以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1超量表达载体PBI121-GhbZIP1-eGFP的构建
1、GhbZIP1基因cDNA的克隆
通过分析“洞A”的RNA-seq数据，并以此序列作为中间片段，设计特异引物(引物的设计均采用Primer Premier 5.0软件设计)，结合RACE技术和hi-TAIL PCR技术克隆GhbZIP1基因cDNA的全长序列。
运用RACE技术，合成反转录引物AUAP(所有引物见表1)，锚定引物AP，合成扩增5′特异引物：SHP1和SHP2，采用巢式PCR和降落PCR技术，经过两轮扩增挖取符合要求条带进行克隆、测序与中间片段进行拼接，得到长度为194bp的序列，与GhbZIP1中间序列重复81个碱基，新增序列长度为113bp，得到5′端序列。
采用改良hi-TAILPCR技术。本试验的简并引物AD1-AD4和通用引物AC1均引用。其中简并引物AD1与AD2简并倍数为2304；AD3与AD4简并倍数为6912。同时在同源克隆获得的保守片段的3′端约200-300bp处，分别设计3条巢式特异引物：A1、A2和A3，采用巢式PCR，经过三轮扩增挖取符合要求条带进行克隆、测序与中间片段进行拼接，得到长度为728bp的序列，与GhbZIP1中间序列重复258个碱基，新增序列长度为470bp，得到3′端序列。
将上述获得的5′端序列和3′端序列使用DNAMAN6.0进行拼接后，设计基因全长引物GF/GR，使用高保真Taq酶进行PCR扩增、回收、连接、克隆和测序(图1)。通过PlantTranscription Factor Database(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/index.php)进行序列同源性比对搜索，发现其与雷蒙克氏棉bZIP1序列相似度为99％，位于第六号染色体，故将该基因命名GhbZIP1。
2、GhbZIP1基因的重组植物表达载体PBI121-GhbZIP1-eGFP的构建
由步骤1所述洞“洞A”GhbZIP1基因的开放阅读框序列与植物表达载体PBI121-eGFP构成。具体方法是：
(1)以GhbZIP1基因全长序列(去除终止子)，使用Primer Premier 5.0设计引物PgS/PgA(表1)，并且在5’端加上Xba I酶切位点，在3’端加上Kpn I酶切位点；使用TakaRa高保真酶，PCR扩增并回收后，连接到T-Vector pMD-19(simple)上，摇菌，提取T-Vector pMD-19(simple)-GhbZIP1质粒，为中间载体。
PCR反应体系：Taq 0.2μL，10*Buffer 2μL，10mM dNTP 0.4μL，DNA模板0.5μL，引物PgS/PgA各0.6μL，ddH2O补至终体积20μL。
PCR反应程序：95℃3min；95℃30s，60℃30s，72℃40s，30个循环；72℃5min；12℃保存。
GhbZIP1基因全长序列ru SEQ ID No.1所示。
(2)上述步骤(1)中获得的含有GhbZIP1的全长cDNA的中间载体经过Xba I和Kpn I双酶切后获得带有酶切粘性末端的GhbZIP1基因片段。PBI121-eGFP载体(本实验室保存)也用同样的Xba I和Kpn I双酶切，回收带有CaMV35S启动子的载体片段。将GhbZIP1的全长cDNA基因片段与载体片段用连接酶连接，得到以CaMV35S启动子驱动的重组植物超量表达载体PBI121-GhbZIP1，称为PBI121-GhbZIP1-eGFP(图2)。
实施例2棉花细胞质雄性不育系的选育
2013年2月在海南崖城中棉所基地，以G-4(由“中棉16”与“金刚王”杂交F5代选育而成，其中“中棉16”引自中国农业科学院棉花研究所，“金刚王”从湖北省种子公司购入)为材料，按照本发明的方法，于开花期用微量注射器将实施例1构建的重组表达载体PBI121-GhbZIP1-eGFP注入供试材料子房中。
2013年7月，在南宁播种的T1代群体中发现37株雄性不育株，命名为G-4S。分子鉴定表明，G-4S植株存在目标基因。至此，已获得棉花转GhbZIP1基因雄性不育种质。遂以该雄性不育种质资源为母本，与野生型的非转基因G-4及其非同源的陆地棉品种“中棉70”、“中植棉2号”、“中植棉5号”、“中植棉8号”(“中植棉”系列品种均引自中国农业科学院植物保护研究所)、“农大棉7号新系”(河北农业大学引进)及海岛棉品种“DP353”、吉扎75、吉扎77、巴2365、鲁什涅、海新86225、DP744、海辐6号(中棉系列品种及所有海岛棉品种均引自中国农业科学院棉花研究所)等34个品种/系杂交，形成的种子即为T1:2代。
2014年2月，在海南崖城中棉所基地种植的T2代植株全部表现雄性不育，表明其为细胞质遗传的雄性不育。遂继续与非转基因的G-4进行核置换回交，至2016年已回交6代。至此已成功选育出了转基因质核同源细胞质雄性不育系G-4A。其细胞质供体为G-4S,细胞核供体为非转基因的G-4，因此，非转基因的轮回亲本G-4即为该不育系的的保持系G-4B。
在进行质核同源细胞质雄性不育系选育的同时，与非同源的陆地棉品种“中棉70”等及海岛棉品种DP353等进行核置换回交。至2016年已回交6代。至此已成功选育出了转基因陆地棉质核异源细胞质雄性不育系“中棉70A”、“中植棉2号A”、“中植棉5号A”、“中植棉8号A”、“农大棉7号新系A”等，及海岛棉质核异源细胞质雄性不育系“DP353A”、吉扎75A、吉扎77A、巴2365A、鲁什涅A、海新86225A、DP744A、海辐6号A等。其细胞质供体为转基因创造的G-4S,细胞核供体为上述非转基因的陆地棉和海岛棉轮回亲本。
在回交过程中，与每个世代选择花药不开裂性状与父本相似的植株继续与轮回亲本回交。
按照本领域的表述惯例，所选育成功的细胞质雄性不育系一般在被转育的原品种上加后缀“A”，其保持系(即轮回亲本)加后缀“B”表示。
上述选育成功的所有转基因质核同源和质核异源细胞质雄性不育系又可作为下一步选育质核同源和新的质核异源细胞质雄性不育系的供体材料。
分子鉴定表明，由此选育的细胞质雄性不育系不存在载体质粒序列，这是因为轮回亲本为非转基因保持系，由转基因所得G-4S的细胞核已被轮回亲本置换所致。
选育转GhbZIP1基因陆地棉细胞质雄性不育系的技术路线见图3。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 广西大学
<120> 一种棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法
<130> KHP161119325.4
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 467
<212> DNA
<213> GhbZIP1
<400> 1
atgtcgaatg ttccggggat gatgagctcc gggtccgaac ccgatgctca aggcgttaac 60
gtggacgaga aaaaacgaaa gaggatgata tcgaaccgag aatcagccca acgatcacgg 120
atgaagaagc aaaagctttt ggaagatttg gtcacggaag ttgcttcgtt gaaggttcaa 180
attcataaca acactaacaa atatgaagct ttgatgcaaa agattgtggt tttggaatca 240
gaaaacaatg ctttgaaggt tcaacaaatg gaattggctc aatacttaaa aaaccttcaa 300
ctgatgcaaa ctcaaatgga attgttggaa ttcaatttga tgaatcagcc tggaagaacc 360
ctttgtgaca taattgtgga cattaatgaa cccccaaaag ttcagtcttg gcaatgcatg 420
gttcaaatca gcctgcaatt atggcctcta ctgaaatgtt gaactat 467

Claims (5)

1.一种棉花转基因创制细胞质雄性不育系的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、构建可超量表达目标基因的重组表达载体；
目标基因如SEQ ID No.1所示；
S2、将上述重组表达载体采用花粉管通道法导入棉花栽培品种(系)中，收获T0代种子；
S3、播种上述T0代种子获得T1代植株，在T1代植株中筛选出花药不开裂的雄性不育株，即为转基因雄性不育种质；
S4、以上述转基因雄性不育种质为母本，与同一品种来源的非转基因植株进行核置换回交；或者以其与异源保持系(或品种/系)杂交或其任一回交后代中的雄性不育株为母本，与转基因供体为同一品种来源的品种(系)为父本，进行核置换回交；获得质核同源细胞质雄性不育系；
或将上述雄性不育种质与异源保持系杂交，并与异源保持系核置换回交，获得质核异源细胞质雄性不育系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2中，将重组表达载体采用花粉管通道法导入棉花品种(系)中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，S4中，以所选育的质核同源细胞质雄性不育系或质核异源细胞质雄性不育系为母本，以同源保持系或新的异源保持系为父本，进行核置换回交，又可选育出新的质核同源细胞质雄性不育系或质核异细胞质雄性不育系。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体含有CaMV35S启动子。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在回交的同时，每个世代选择性状与父本相似，且花药不开裂的雄性不育株继续回交，同时父本套袋自交，回交不低于5～6代。
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